Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej
24 marca 2023
Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.
Protokół ten pozwala naukowcom określić, czy aktywność kaspazy występuje w połączeniu ze śmiercią komórki, identyfikując w ten sposób różne tryby śmierci komórki. Zaletą tej techniki jest elastyczność w ocenie aktywności kaspazy w teście populacyjnym lub pojedynczym komórce. Procedurę zademonstrują Stefanie Rufli, absolwentka studiów doktoranckich, oraz Jing Tong, doktorantka wizytująca z laboratorium Wendy Wei-Lynn Wong.
Po różnicowaniu i zebraniu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego lub BMDM, jak opisano w manuskrypcie, wysiewaj je na sześciodołkowej płytce o gęstości od jednego razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Traktuj komórki mimetykiem SMAC przez 16 godzin. Aby przygotować lizat komórkowy, przenieś płytkę zawierającą leczone komórki na lód i zbierz pożywkę do hodowli komórkowych do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Wirować w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zassać pożywkę i umieścić probówkę na lodzie. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego PBS do płytki do hodowli komórkowej, aby umyć komórki.
Po odessaniu wszystkich PBS dodaj 100 mikrolitrów trypsyny do komórek. Po odłączeniu komórek od płytki zbierz je do 1,5 mililitrowej probówki. Po odwirowaniu zawiesiny komórek usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu do lizy DISC.
Inkubować próbkę na lodzie przez 20 minut, a następnie odwirować lizat w celu osadzenia frakcji nierozpuszczalnej. Przenieść 25 mikrolitrów lizatu na białą, płaskodenną 96-dołkową płytkę do oznaczania aktywności kaspazy-3/7 i 10 mikrolitrów na przezroczystą płaskodenną 96-dołkową płytkę do testu kwasu bicinchoninowego lub BCA. W celu ilościowego określenia zawartości białka należy przygotować zakres stężeń albuminy surowicy bydlęcej lub BSA jako białko wzorcowe.
Po dodaniu wzorcowego BSA do płaskodennej 96-dołkowej płytki zawierającej próbki, wymieszaj odczynniki BCA jeden i dwa w stosunku 50 do jednego i dodaj 200 mikrolitrów do każdej próbki w wzorcu. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, zmierzyć absorbancję przy 562 nanometrach na przyrządzie fluorometrycznym i określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej. Aby wykonać test populacyjny, uruchom instrument fluorometryczny i podgrzej urządzenie do 30 stopni Celsjusza.
Ustaw długość fali wzbudzenia i emisji odpowiednio na 360 i 465 nanometrów. Następnie przygotuj główną mieszaninę reakcyjną na lodzie, jak opisano w manuskrypcie, aby określić aktywność kaspazy. Dodać 75 mikrolitrów mieszaniny do każdej próbki i wzorca, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 100 mikrolitrów.
Natychmiast zmierz fluorescencję za pomocą zestawu przyrządu fluorometrycznego i rejestruj indywidualne odczyty co minutę przez 40 minut, aby określić kinetykę reakcji. Po wysianiu zbierz przylegające komórki, jak pokazano wcześniej, do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej. Następnie odwirować próbkę o sile 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.
Aby przygotować mieszankę barwiącą, weź jeden mikrolitr podłoża fluorogenicznego i rozcieńcz go 150 mikrolitrami PBS. Dodać 50 mikrolitrów mieszanki barwiącej na próbkę, inkubować w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut i mieszać co 15 minut. W tym teście populacyjnym reprezentatywne dane testu kinetycznego aktywności kaspazy-3/7 wykazały zwiększone rozszczepienie substratu przy zwiększonym stężeniu mimetycznym SMAC.
Jednak wzrost przy stężeniu 500 nanomoli był nieznaczny w oparciu o zwykłą jednokierunkową ANOVA z wieloma porównaniami. Analiza aktywności kaspazy-3/7 za pomocą cytometrii przepływowej wykazała zmianę fluorescencji dla komórek traktowanych mimetykami SMAC w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co było również widoczne w wykreślonej medianie intensywności fluorescencji, a wzrost przy stężeniu 500 nanomolowym był znaczący. Zabieg powinien być wykonywany na lodzie.
Jednak w teście populacyjnym próbki nie mogą być pozostawiane na lodzie w nieskończoność. Po etapie lizy próbki należy niezwłocznie poddać dalszej obróbce lub zamrozić. Obrazowanie aktywności kaspazy za pomocą mikroskopii żywych komórek byłoby dodatkową metodą uzyskiwania informacji kinetycznych na poziomie pojedynczej komórki.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody pomiaru aktywności kaspaz przy użyciu cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru, co pozwala badaczom na ocenę mechanizmów śmierci komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad apoptozą
Wstęp
- Kaspazy odgrywają kluczową rolę w procesie apoptozy.
- Zrozumienie aktywności kaspaz pomaga w identyfikacji różnych sposobów śmierci komórek.
- Niniejszy protokół zapewnia elastyczność w przypadku analiz populacyjnych lub pojedynczych komórek.
- Do pomiarów wykorzystuje się zarówno cytometrię przepływową, jak i spektrofluorymetrię.
Cel badania
- Pomiar aktywności kaspazy-3/7 w odpowiedzi na zastosowane zabiegi.
- Rozróżnienie między różnymi mechanizmami śmierci komórkowej.
- Zastosowanie niezawodnej metody do ilościowego oznaczania stężenia białka.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie i traktowanie makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (BMDMs).
- Wykorzystanie substratów fluorogennych do testów aktywności kaspazy.
- Zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy przesunięć fluorescencji.
- Przeprowadzenie testów BCA w celu kwantyfikacji białek.
Główne wyniki
- Zauważono zwiększoną aktywność kaspaz przy wyższych stężeniach mimetyku SMAC.
- Cytometria przepływowa wykazała istotne przesunięcia fluorescencji w komórkach poddanych działaniu preparatu.
- Analizy populacyjne dostarczyły danych kinetycznych dotyczących aktywności kaspaz.
- Wyniki wykazały znaczenie natychmiastowego przetwarzania próbek po lizie.
Wnioski
- Niniejszy protokół pozwala na skuteczne pomiary aktywności kaspaz w badaniach nad śmiercią komórek.
- Umożliwia on uzyskanie informacji na temat kinetyki apoptozy.
- Mikroskopia żywych komórek mogłaby pogłębić zrozumienie dynamiki kaspaz.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar aktywności kaspaz jest kluczowy dla minimalizacji ryzyka na wczesnym etapie poszukiwania leków ukierunkowanych na szlaki śmierci komórkowej. Niniejszy protokół umożliwia wiarygodną ocenę mechanizmów apoptozy i piroptozy, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz badaniach mechanistycznych. Niezawodne testy aktywności kaspaz wspierają decyzje dotyczące portfolio poprzez wyjaśnienie stopnia zaangażowania szlaków sygnałowych oraz wpływu związków w układach istotnych dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę aktywacji szlaków apoptotycznych i pyroptotycznych w odpowiedzi na badane cząsteczki.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe oznaczanie aktywności kaspaz w odpowiednich typach komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie trybów śmierci komórkowej.
- Dostarcza praktycznych danych do selekcji celów na podstawie stopnia zaangażowania szlaków sygnałowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia ustandaryzowane, ilościowe wyniki aktywności kaspaz z wykorzystaniem platformy fluorometrycznej oraz cytometrii przepływowej.
- Wspiera powtarzalność i skalowalność testów w analizach populacyjnych oraz na poziomie pojedynczych komórek.
- Umożliwia przesiewowe badanie bibliotek związków chemicznych w celu wyszukiwania modulatorów programowanej śmierci komórki.
- Pozwala na przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych badań mechanistycznych lub przesiewów fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie analizy szlaków śmierci komórkowej z modelami makrofagów istotnymi dla danej jednostki chorobowej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji czynników modulujących apoptozę.
- Wspiera rozwój projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie aktywności kaspaz in vitro z punktami końcowymi badań translacyjnych.
- Umożliwia opracowanie biomarkerów dla sygnatur śmierci komórkowej specyficznych dla konkretnych szlaków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test aktywności kaspaz wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne studia mechanistyczne, jak i późniejsze badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie aktywacji kaspaz specyficznych dla danej ścieżki w celu testowania hipotez terapeutycznych i wyjaśnienia mechanizmów śmierci komórkowej.
- Przesiewy: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników do oceny związków zarówno w formacie populacyjnym, jak i pojedynczych komórek.
- Analityka: Umożliwienie pomiarów kinetycznych i punktu końcowego, co wspiera statystyczne porównywanie warunków traktowania.
- Badania translacyjne: Przeniesienie wyników uzyskanych in vitro do modeli istotnych dla chorób oraz potencjalnych strategii biomarkerowych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferowanie elastycznego, niezależnego od platformy testu, który można dostosować do różnych typów komórek i programów odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad śmiercią komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury pomiaru kaspaz w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnianie wpływu związków na szlaki programowanej śmierci komórki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów modulujących apoptozę.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, cytometrii przepływowej oraz konfiguracji testów fluorometrycznych.
- Konieczny jest dostęp do spektrofluorometrów, cytometrów przepływowych oraz infrastruktury do ilościowego oznaczania białek.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja kontroli i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych typów komórek, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych układów biologicznych.
- Przetwarzanie próbek musi być przeprowadzone bezzwłocznie, aby zachować aktywność kaspaz oraz integralność testu.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Seeding, Cell Treatment, and Preparation of Cell Lysate
2:10
BCA Assay for Protein Quantification
2:49
Population-Based Assay for Caspase-3/7 Activity
3:31
Single-Cell Assay for Caspase-3/7 Activity
4:07
Results: Smac Mimetic-Induced Effect on Caspase-3/7 Activity
4:50
Conclusion
