Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Protokół ten pozwala naukowcom określić, czy aktywność kaspazy występuje w połączeniu ze śmiercią komórki, identyfikując w ten sposób różne tryby śmierci komórki. Zaletą tej techniki jest elastyczność w ocenie aktywności kaspazy w teście populacyjnym lub pojedynczym komórce. Procedurę zademonstrują Stefanie Rufli, absolwentka studiów doktoranckich, oraz Jing Tong, doktorantka wizytująca z laboratorium Wendy Wei-Lynn Wong.

Po różnicowaniu i zebraniu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego lub BMDM, jak opisano w manuskrypcie, wysiewaj je na sześciodołkowej płytce o gęstości od jednego razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Traktuj komórki mimetykiem SMAC przez 16 godzin. Aby przygotować lizat komórkowy, przenieś płytkę zawierającą leczone komórki na lód i zbierz pożywkę do hodowli komórkowych do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Wirować w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zassać pożywkę i umieścić probówkę na lodzie. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego PBS do płytki do hodowli komórkowej, aby umyć komórki.

Po odessaniu wszystkich PBS dodaj 100 mikrolitrów trypsyny do komórek. Po odłączeniu komórek od płytki zbierz je do 1,5 mililitrowej probówki. Po odwirowaniu zawiesiny komórek usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu do lizy DISC.

Inkubować próbkę na lodzie przez 20 minut, a następnie odwirować lizat w celu osadzenia frakcji nierozpuszczalnej. Przenieść 25 mikrolitrów lizatu na białą, płaskodenną 96-dołkową płytkę do oznaczania aktywności kaspazy-3/7 i 10 mikrolitrów na przezroczystą płaskodenną 96-dołkową płytkę do testu kwasu bicinchoninowego lub BCA. W celu ilościowego określenia zawartości białka należy przygotować zakres stężeń albuminy surowicy bydlęcej lub BSA jako białko wzorcowe.

Po dodaniu wzorcowego BSA do płaskodennej 96-dołkowej płytki zawierającej próbki, wymieszaj odczynniki BCA jeden i dwa w stosunku 50 do jednego i dodaj 200 mikrolitrów do każdej próbki w wzorcu. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, zmierzyć absorbancję przy 562 nanometrach na przyrządzie fluorometrycznym i określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej. Aby wykonać test populacyjny, uruchom instrument fluorometryczny i podgrzej urządzenie do 30 stopni Celsjusza.

Ustaw długość fali wzbudzenia i emisji odpowiednio na 360 i 465 nanometrów. Następnie przygotuj główną mieszaninę reakcyjną na lodzie, jak opisano w manuskrypcie, aby określić aktywność kaspazy. Dodać 75 mikrolitrów mieszaniny do każdej próbki i wzorca, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 100 mikrolitrów.

Natychmiast zmierz fluorescencję za pomocą zestawu przyrządu fluorometrycznego i rejestruj indywidualne odczyty co minutę przez 40 minut, aby określić kinetykę reakcji. Po wysianiu zbierz przylegające komórki, jak pokazano wcześniej, do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej. Następnie odwirować próbkę o sile 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.

Aby przygotować mieszankę barwiącą, weź jeden mikrolitr podłoża fluorogenicznego i rozcieńcz go 150 mikrolitrami PBS. Dodać 50 mikrolitrów mieszanki barwiącej na próbkę, inkubować w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut i mieszać co 15 minut. W tym teście populacyjnym reprezentatywne dane testu kinetycznego aktywności kaspazy-3/7 wykazały zwiększone rozszczepienie substratu przy zwiększonym stężeniu mimetycznym SMAC.

Jednak wzrost przy stężeniu 500 nanomoli był nieznaczny w oparciu o zwykłą jednokierunkową ANOVA z wieloma porównaniami. Analiza aktywności kaspazy-3/7 za pomocą cytometrii przepływowej wykazała zmianę fluorescencji dla komórek traktowanych mimetykami SMAC w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co było również widoczne w wykreślonej medianie intensywności fluorescencji, a wzrost przy stężeniu 500 nanomolowym był znaczący. Zabieg powinien być wykonywany na lodzie.

Jednak w teście populacyjnym próbki nie mogą być pozostawiane na lodzie w nieskończoność. Po etapie lizy próbki należy niezwłocznie poddać dalszej obróbce lub zamrozić. Obrazowanie aktywności kaspazy za pomocą mikroskopii żywych komórek byłoby dodatkową metodą uzyskiwania informacji kinetycznych na poziomie pojedynczej komórki.