Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej
March 24th, 2023
Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.
Protokół ten pozwala naukowcom określić, czy aktywność kaspazy występuje w połączeniu ze śmiercią komórki, identyfikując w ten sposób różne tryby śmierci komórki. Zaletą tej techniki jest elastyczność w ocenie aktywności kaspazy w teście populacyjnym lub pojedynczym komórce. Procedurę zademonstrują Stefanie Rufli, absolwentka studiów doktoranckich, oraz Jing Tong, doktorantka wizytująca z laboratorium Wendy Wei-Lynn Wong.
Po różnicowaniu i zebraniu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego lub BMDM, jak opisano w manuskrypcie, wysiewaj je na sześciodołkowej płytce o gęstości od jednego razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Traktuj komórki mimetykiem SMAC przez 16 godzin. Aby przygotować lizat komórkowy, przenieś płytkę zawierającą leczone komórki na lód i zbierz pożywkę do hodowli komórkowych do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Wirować w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zassać pożywkę i umieścić probówkę na lodzie. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego PBS do płytki do hodowli komórkowej, aby umyć komórki.
Po odessaniu wszystkich PBS dodaj 100 mikrolitrów trypsyny do komórek. Po odłączeniu komórek od płytki zbierz je do 1,5 mililitrowej probówki. Po odwirowaniu zawiesiny komórek usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu do lizy DISC.
Inkubować próbkę na lodzie przez 20 minut, a następnie odwirować lizat w celu osadzenia frakcji nierozpuszczalnej. Przenieść 25 mikrolitrów lizatu na białą, płaskodenną 96-dołkową płytkę do oznaczania aktywności kaspazy-3/7 i 10 mikrolitrów na przezroczystą płaskodenną 96-dołkową płytkę do testu kwasu bicinchoninowego lub BCA. W celu ilościowego określenia zawartości białka należy przygotować zakres stężeń albuminy surowicy bydlęcej lub BSA jako białko wzorcowe.
Po dodaniu wzorcowego BSA do płaskodennej 96-dołkowej płytki zawierającej próbki, wymieszaj odczynniki BCA jeden i dwa w stosunku 50 do jednego i dodaj 200 mikrolitrów do każdej próbki w wzorcu. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, zmierzyć absorbancję przy 562 nanometrach na przyrządzie fluorometrycznym i określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej. Aby wykonać test populacyjny, uruchom instrument fluorometryczny i podgrzej urządzenie do 30 stopni Celsjusza.
Ustaw długość fali wzbudzenia i emisji odpowiednio na 360 i 465 nanometrów. Następnie przygotuj główną mieszaninę reakcyjną na lodzie, jak opisano w manuskrypcie, aby określić aktywność kaspazy. Dodać 75 mikrolitrów mieszaniny do każdej próbki i wzorca, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 100 mikrolitrów.
Natychmiast zmierz fluorescencję za pomocą zestawu przyrządu fluorometrycznego i rejestruj indywidualne odczyty co minutę przez 40 minut, aby określić kinetykę reakcji. Po wysianiu zbierz przylegające komórki, jak pokazano wcześniej, do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej. Następnie odwirować próbkę o sile 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.
Aby przygotować mieszankę barwiącą, weź jeden mikrolitr podłoża fluorogenicznego i rozcieńcz go 150 mikrolitrami PBS. Dodać 50 mikrolitrów mieszanki barwiącej na próbkę, inkubować w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut i mieszać co 15 minut. W tym teście populacyjnym reprezentatywne dane testu kinetycznego aktywności kaspazy-3/7 wykazały zwiększone rozszczepienie substratu przy zwiększonym stężeniu mimetycznym SMAC.
Jednak wzrost przy stężeniu 500 nanomoli był nieznaczny w oparciu o zwykłą jednokierunkową ANOVA z wieloma porównaniami. Analiza aktywności kaspazy-3/7 za pomocą cytometrii przepływowej wykazała zmianę fluorescencji dla komórek traktowanych mimetykami SMAC w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co było również widoczne w wykreślonej medianie intensywności fluorescencji, a wzrost przy stężeniu 500 nanomolowym był znaczący. Zabieg powinien być wykonywany na lodzie.
Jednak w teście populacyjnym próbki nie mogą być pozostawiane na lodzie w nieskończoność. Po etapie lizy próbki należy niezwłocznie poddać dalszej obróbce lub zamrozić. Obrazowanie aktywności kaspazy za pomocą mikroskopii żywych komórek byłoby dodatkową metodą uzyskiwania informacji kinetycznych na poziomie pojedynczej komórki.
Przegląd
Ten protokół opisuje metody pomiaru aktywności kaspaz za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorymetru, umożliwiając badaczom ocenę mechanizmów śmierci komórkowej.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Badania nad apoptozą
Tło
- Kaspazy są kluczowe w procesie apoptozy.
- Rozumienie aktywności kaspaz pomaga w identyfikacji różnych trybów śmierci komórkowej.
- Ten protokół zapewnia elastyczność dla badań opartych na populacji lub pojedynczych komórkach.
- Wykorzystuje zarówno cytometrię przepływową, jak i spektrofluorymetrię do pomiaru.
Cel badania
- Pomiar aktywności kaspazy-3/7 w odpowiedzi na traktowanie.
- Rozróżnienie między trybami śmierci komórkowej.
- Dostarczenie niezawodnej metody ilościowego określania stężenia białka.
Stosowane metody
- Pobieranie i traktowanie makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (BMDMs).
- Używanie fluorogennych substratów do badań aktywności kaspaz.
- Wykorzystywanie cytometrii przepływowej do analizy zmian fluorescencji.
- Przeprowadzanie badań BCA do ilościowego określania białka.
Główne wyniki
- Większa aktywność kaspazy została zaobserwowana przy wyższych stężeniach imitatora SMAC.
- Cytometria przepływowa wskazała znaczące zmiany fluorescencji w komórkach potraktowanych.
- Badania oparte na populacji wykazały dane kinetyczne dla aktywności kaspazy.
- Wyniki pokazały znaczenie natychmiastowego przetwarzania po lizie.
Wnioski
- Ten protokół skutecznie mierzy aktywność kaspaz w badaniach nad śmiercią komórkową.
- Zapewnia wgląd w dynamikę apoptozy.
- Mikroskopia na żywych komórkach mogłaby zwiększyć zrozumienie dynamiki kaspaz.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of caspase activity is critical for de-risking early-stage drug discovery targeting cell death pathways. This protocol enables robust assessment of apoptosis and pyroptosis mechanisms, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Reliable caspase assays inform portfolio decisions by clarifying pathway engagement and compound effects in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of apoptotic and pyroptotic pathway activation in response to candidate molecules.
- Supports functional target validation by quantifying caspase activity in relevant cell types.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between modes of cell death.
- Provides actionable data for triaging targets based on pathway engagement.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative readouts for caspase activity using fluorometric and flow cytometry platforms.
- Supports assay reproducibility and scalability for population-based and single-cell analyses.
- Enables screening of compound libraries for modulators of programmed cell death.
- Prepares validated biological systems for downstream mechanistic or phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell death pathway interrogation with disease-relevant macrophage models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of apoptosis-modulating agents.
- Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro caspase activity to translational endpoints.
- Enables biomarker development for pathway-specific cell death signatures.
Pipeline & Workflow Integration
This caspase activity assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and later-stage translational research.
- Discovery Biology: Quantifies pathway-specific caspase activation to test therapeutic hypotheses and clarify cell death mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in both bulk and single-cell formats.
- Analytics: Enables kinetic and endpoint measurements, supporting statistical comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant models and potential biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, platform-agnostic assay adaptable across cell types and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in cell death studies.
- Operational Value: Standardizes caspase measurement workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying compound effects on programmed cell death pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of apoptosis-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, flow cytometry, and fluorometric assay setup.
- Needs access to spectrofluorometers, flow cytometers, and protein quantification infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and data analysis.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Sample processing must be timely to preserve caspase activity and assay integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Seeding, Cell Treatment, and Preparation of Cell Lysate
2:10
BCA Assay for Protein Quantification
2:49
Population-Based Assay for Caspase-3/7 Activity
3:31
Single-Cell Assay for Caspase-3/7 Activity
4:07
Results: Smac Mimetic-Induced Effect on Caspase-3/7 Activity
4:50
Conclusion
