Name: Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji zapalnych kaspaz w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów przy użyciu reporterów BiFC. Ta technika umożliwia badanie aktywacji kompleksów kaspazowych na żywo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy byłym i obecnym członkom laboratorium LBH, którzy przyczynili się do rozwoju tej techniki. To laboratorium jest wspierane przez NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Rysunek 2 został narysowany za pomocą oprogramowania Biorender.

<ol><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+model+for+apical+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A unified model for apical caspase activation.</a> Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li>
<li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspases%3A+activation%2C+specificity%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li>
<li>Boice, A., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+apoptotic+caspases+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting apoptotic caspases in cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688(2020).</li>
<li>Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspase+regulation%3A+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li>
<li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspases%3A+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li>
<li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Viganò, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761(2015).</li>
<li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97(1992).</li>
<li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+and+IL-1%CE%B2+and+IL-18+processing+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li>
<li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC%2C+a+novel+22-kDa+protein%2C+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li>
<li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PYRIN+domain%3A+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li>
<li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li>
<li>Bürckstümmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li>
<li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li>
<li>Bolívar, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1%CE%B2+Release+and+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li>
<li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li>
<li>Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+activators+of+the+NLRP3+inflammasome+promote+IL-1%CE%B2+secretion+by+triggering+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis.</a> Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).</li>
<li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death & Disease. 6, 1813(2015).</li>
<li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).</li>
<li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li>
<li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+Isolation%2C+Freezing%2C+thawing%2C+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).</li>
<li>Perregaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1+beta+maturation%3A+evidence+that+mature+cytokine+formation+can+be+induced+specifically+by+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin.</a> The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).</li>
<li>Cheneval, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mature+interleukin-1%CE%B2+%28IL-1%CE%B2%29+secretion+from+THP-1+cells+induced+by+nigericin+is+a+result+of+activation+of+p45+IL-1%CE%B2-converting+enzyme+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased mature interleukin-1β (IL-1β) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1β-converting enzyme processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).</li>
<li>Fernandes-Alnemri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pyroptosome%3A+a+supramolecular+assembly+of+ASC+dimers+mediating+inflammatory+cell+death+via+caspase-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+Plasma+concentrations+of+hemopexin%2C+haptoglobin+and+heme+in+patients+with+various+hemolytic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases.</a> Blood. 32 (5), 811-815 (1968).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1%CE%B2processing+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li>
<li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+interfering+RNA+%28siRNA%29+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li>
<li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants%3A+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li>
<li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).</li>
<li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+the+difference+between+CD80+and+CD86%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li>
<li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+kinases+in+a+death+grip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje przebieg pracy w celu uzyskania makrofagów z monocytów wyizolowanych z próbek ludzkiej krwi oraz metodę skutecznego wprowadzania reporterów zapalnej kaspazy BiFC do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek.
Protokół ten wykorzystuje technikę BiFC35 do oznaczania zapalnych kaspaz w domenie rekrutacji kaspazy (CARD) za pomocą niefluorescencyjnych fragmentów rozszczepionego białka fluorescencyjnego Venus. Kaspazy zapalne kodują ...

Kaspazy to rodzina cysteinowych proteaz aspartatowych, które można podzielić na kaspazy inicjujące i kaspazy wykonawcze. Kaspazy wykonawcze obejmują kaspazę-3, -6 i -7. Występują one naturalnie w komórkach jako dimery i są rozszczepiane przez kaspazy inicjujące w celu przeprowadzenia apoptozy1. Do kaspaz inicjujących należą ludzkie kaspazy-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 i -12. Występują one w formie nieaktywnych zymogenów (prokaspaz), które są aktywowane poprzez indukowaną bliskością dimeryzację i stabilizowane przez autoproteolityczne rozszczepienie2,3. Kaspazy zapalne stanowią podgrupę kaspaz inicjujących2 i obejmują kaspazy-1, -4, -5 i -12 u ludzi oraz kaspazy-1, -11 i -12 u myszy4,5. Zamiast roli apoptotycznej, pełnią one centralną rolę w procesach zapalnych. Mediują one proteolityczne przetwarzanie i sekrecję prointerleukiny (IL)-1β oraz pro-IL-186,7, które są pierwszymi cytokinami uwalnianymi w odpowiedzi na patogeny8,9. Kaspaza-1 jest aktywowana po rekrutacji do swojej platformy aktywacyjnej; wielkocząsteczkowego kompleksu białkowego zwanego inflamasomem (Ryc. 1A)10. Dimeryzacja kaspazy-4, -5 i -11 zachodzi niezależnie od tych platform poprzez niekanoniczną drogę inflamasomu11,12.
Kanoniczne inflamasomy są cytozolowymi multimerycznymi kompleksami białkowymi, które składają się z białka sensora inflamasomu, białka adaptorowego ASC (białko apoptozy-związane, przypominające plamkę, zawierające domenę CARD) oraz białka efektorowego kaspazy-110. Najlepiej przebadanymi kanonicznymi inflamasomami są białka z rodziny receptorów NOD-podobnych zawierające domenę pyrynową (NLRP), mianowicie NLRP1 i NLRP3, białka z rodziny NLR zawierające domenę CARD (NLRC), czyli NLRC4, oraz białko AIM2 (absent in melanoma 2). Każde z nich zawiera domenę pyrynową, domenę CARD lub obie te domeny. Domena CARD pośredniczy w oddziaływaniu pomiędzy kaspazami zawierającymi domenę CARD a ich aktywatorami znajdującymi się powyżej w kaskadzie sygnałowej. W związku z tym cząsteczka rusztowania ASC, składająca się z N-końcowej domeny pyrynowej (PYD) i C-końcowego motywu CARD13,14, jest niezbędna do rekrutacji kaspazy-1 do inflamasomów NLRP110, NLRP315 oraz AIM216.
Każdy inflamasom jest nazwany od swojego unikalnego białka sensorowego, które rozpoznaje odrębne bodźce prozapalne (Rycina 1B). Aktywatory tej ścieżki określa się mianem bodźców kanonicznych. Inflamasomy służą jako sensory komponentów mikrobiologicznych oraz stresu tkankowego i montują się, aby wywołać silną odpowiedź zapalną poprzez aktywację kaspaz zapalnych17. Montaż inflamasomu inicjuje aktywację kaspazy-1, która pośredniczy w dojrzewaniu i sekrecji jej głównych substratów: pro-IL-1β oraz pro-IL-18. Proces ten zachodzi w ramach dwuetapowego mechanizmu. Najpierw bodziec inicjujący (priming) zwiększa ekspresję określonych białek inflamasomu oraz pro-IL-1β poprzez aktywację ścieżki NF-κB. Następnie wewnątrzkomórkowy (kanoniczny) bodziec indukuje montaż inflamasomu i rekrutację prokaspazy-16,7.
Kaspaza-4 i kaspaza-5 są ludzkimi ortologami mysiej kaspazy-1111. Są one aktywowane w sposób niezależny od inflamasomu przez wewnątrzkomórkowy lipopolisaryd (LPS), cząsteczkę występującą w zewnętrznej błonie bakterii Gram-ujemnych18,19,20, oraz przez zewnątrzkomórkowy hem, produkt hemolizy erytrocytów21. Przypuszcza się, że LPS wiąże się bezpośrednio z motywem CARD tych białek i indukuje ich oligomeryzację20. Aktywacja kaspazy-4 lub kaspazy-5 promuje uwalnianie IL-1β poprzez indukcję zapalnej formy śmierci komórkowej nazywanej piroptozą, co następuje poprzez rozszczepienie białka tworzącego pory, gasderminy D (GSDMD)18,19. Ponadto odpływ jonów potasu wynikający z piroptotycznej śmierci zależnej od kaspazy-4 i GSDMD indukuje aktywację inflamasomu NLRP3 i następującą po niej aktywację kaspazy-122,23. Zatem kaspazy-4, -5 i -11 są uważane za wewnątrzkomórkowe sensory LPS, które są zdolne do indukowania piroptozy i aktywacji kaspazy-1 w odpowiedzi na specyficzne bodźce11,24.
<img alt="Bimolekularna komplementacja fluorescencji kaspazy, receptory inflamasomu, schemat oddziaływań białkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kaspazy zapalne i test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kaspazy. (A) Schemat przedstawiający system kaspazy-BiFC, w którym dwie prodomeny kaspazy-1 (C1-pro) połączone z każdym z niefluorescencyjnych fragmentów białka Venus (Venus-C lub Venus-N) są rekrutowane do platformy aktywacji NLRP3, co wymusza ponowne sfałdowanie i fluorescencję białka Venus. Kompleks ten pojawia się jako zielona plamka pod mikroskopem i służy jako odczyt bliskości indukowanej przez kaspazy zapalne, co stanowi pierwszy etap aktywacji kaspazy inicjującej. (B) Schemat przedstawiający organizację domen komponentów inflamasomu i kaspaz zapalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pomiar aktywacji specyficznych kaspaz inicjatorowych jest trudny, a dostępnych jest niewiele metod umożliwiających jego przeprowadzenie za pomocą technik obrazowania. Metoda bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kaspaz może być wykorzystana do bezpośredniej wizualizacji aktywacji kaspaz zapalnych w żywych komórkach (Rysunek 1A)25. Technika ta została niedawno dostosowana do zastosowania w makrofagach pochodzących z ludzkich monocytów (MDM)21. Caspase BiFC mierzy pierwszy etap aktywacji kaspaz zapalnych, polegający na indukowanym zbliżeniu w celu ułatwienia dimeryzacji. Wykorzystuje się ekspresję plazmidów kodujących prodomenę kaspazy zawierającą domenę CARD, połączoną z niefluorescencyjnymi fragmentami fotostabilnego żółtego białka fluorescencyjnego Venus (Venus-C [VC] oraz Venus-N [VN]). Gdy dwie prodomeny kaspaz zostaną przyciągnięte do swojej platformy aktywacyjnej lub ulegną indukowanemu zbliżeniu, dwie połowy białka Venus zostają sprowadzone w bliskie sąsiedztwo, co wymusza ich ponowne sfałdowanie i emisję fluorescencji (patrz Rysunek 1A,B). Pozwala to na odczyt aktywacji specyficznych kaspaz zapalnych w czasie rzeczywistym.
Ludzkie MDM obficie wykazują ekspresję genów inflamasomu oraz receptorów rozpoznawania wzorców, które identyfikują sygnały zagrożenia i produkty patogenów. Stanowi to idealny typ komórek do badania szlaków zapalnych kaspaz. Dodatkowo mogą być one pozyskiwane z krwi obwodowej, a nawet z próbek pobranych od pacjentów, aby ocenić aktywację zapalnych kaspaz w konkretnym stanie chorobowym. Niniejszy protokół opisuje sposób wprowadzania reporterów kaspaz BiFC do MDM za pomocą nukleofekcji, czyli metody transfekcji opartej na elektroporacji, sposób traktowania komórek w celu indukcji aktywacji zapalnych kaspaz oraz sposób wizualizacji aktywnych kompleksów kaspaz przy użyciu metod mikroskopowych. Ponadto metodologia ta może zostać dostosowana do określenia składu molekularnego tych kompleksów, ich lokalizacji subkomórkowej, kinetyki oraz rozmiaru tych wysoko uporządkowanych struktur25,26,27.

<table><tbody><tr><td>48-dołkowa hodowla tkankowaPłytki 2:34</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-108</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia do kultur tkankowych</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>2 Merkaptoetanol 1000x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>8-komorowa szklana osłonowa ze szkłem nakrywkowym 1,5 HP</td><td>Kolumny Cellvis</td><td>c8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-021-101</td><td>Tylko do automatycznego oddzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro AutoMACS</td></tr><tr><td>Pro Separator</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-092-545</td><td>Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS</td></tr><tr><td>Pro Roztwór myjący AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-092-987</td><td>Do automatycznego oddzielania tylko za pomocą separatora AutoMACS Pro</td></tr><tr><td>Roztwór płuczący AutoMACS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-222</td><td>Tylko do automatycznego rozdzielania za pomocą separatora AutoMACS Pro</td></tr><tr><td>AutoMacs z buforem</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-221</td><td>Do ręcznego lub automatycznego rozdzielania za pomocą separatora QuadroMACS lub AutoMACS pro</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop z napędem silnikowym Axio Observer Z1 wyposażony w wirujący dysk CSU-X1A 5000</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w moduł laserowy wyposażony w linie laserowe o długości fali 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)</td></tr><tr><td>AxioObserver A1, mikroskop odwrócony klasy badawczej</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Można zastosować dowolny mikroskop epifluorescencyjny z filtrami fluorescencyjnymi zdolnymi do wzbudzania długości fal 568 nm (RFP) i 488 lub 512 nm (GFP lub YFP)</td></tr><tr><td>MIKROKULKI CD14+</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-050-201</td><td>Do ręcznej lub automatycznej separacji za pomocą QuadroMACS lub AutoMACS pro Separator</td></tr><tr><td>DPBS bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>DsRed mito plazmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>Podobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć na Addgene</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 ml</td><td>Sigma</td><td>GE17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC2011</td><td></td></tr><tr><td>Hemin BioXtra, od świń, &ge; 96,0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>51280-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy</td><td></td><td></td> kaspazy zapalnej BiFC <td>Dostępne na żądanie w laboratorium LBH</td></tr><tr><td>LPS-EB Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-3PELPS</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-401</td><td>Tylko do ręcznej separacji za pomocą separatora QuadroMACS</td></tr><tr><td>MACS 15 mL Stojak na probówki</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-052</td><td>Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-303</td><td>Do ręcznej separacji tylko za pomocą separatora QuadroMACS</td></tr><tr><td>plazmid mCherry</td><td>Yungpeng Wang Lab</td><td></td><td>Podobne plazmidy, które mogą być używane jako reportery fluorescencyjne, można znaleźć w</td></tr><tr><td>systemie transfekcji Addgene Neon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Zawiera urządzenie do elektroporacji neonów, pipetę i stację pipet</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 10 i mikro; L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>Zawiera bufor do rezawieszania R, bufor do reszparacji T, bufor elektrolityczny E, 96 x 10 i mikro; L Neonowe końcówki i neonowe rurki do elektroporacji</td></tr><tr><td>Nigerycyna sól sodowa, gotowy roztwór</td><td>Sigma</td><td>SML1779-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P7280-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-090-976</td><td>Do ręcznej separacji za pomocą Tylko separator QuadroMACS</td></tr><tr><td>qVD-OPh</td><td>Fisher (ApexBio)</td><td>50-101-3172</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Oprogramowanie Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 (edycja niebieska)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Dowolne oprogramowanie używane do obsługi wybranego mikroskopu konfokalnego</td></tr></tbody></table>

wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Kaspazy zapalne obejmują kaspazy-1, -4, -5, -11 i -12 i należą do podgrupy kaspaz inicjujących. Kaspaza-1 jest niezbędna do zapewnienia prawidłowej regulacji sygnalizacji zapalnej i jest aktywowana przez dimeryzację indukowaną bliskością po rekrutacji do inflamasomów. Kaspaza-1 występuje obficie w linii komórek monocytowych i indukuje dojrzewanie cytokin prozapalnych interleukiny (IL)-1β i IL-18 do aktywnych wydzielanych cząsteczek. Inne zapalne kaspazy, kaspaza-4 i -5 (oraz ich mysi homolog kaspaza-11) promują uwalnianie IL-1β poprzez indukowanie piroptozy. Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji kaspazy (BiFC) jest narzędziem używanym do pomiaru bliskości indukowanej zapalną kaspazą jako odczytu aktywacji kaspazy. Prodomena kaspazy-1, -4 lub -5, która zawiera region wiążący się z inflamasomem, jest połączona z niefluorescencyjnymi fragmentami żółtego białka fluorescencyjnego Wenus (Venus-N [VN] lub Venus-C [VC]), które łączą się w celu zreformowania fluorescencyjnego kompleksu Wenus, gdy kaspazy ulegają indukowanej bliskości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić te reportery do pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) za pomocą nukleofekcji, leczyć komórki w celu wywołania aktywacji zapalnej kaspazy i mierzyć aktywację kaspazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej. Zaletą tego podejścia jest to, że można je wykorzystać do identyfikacji składników, wymagań i lokalizacji kompleksu aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach. Należy jednak rozważyć staranne kontrole, aby uniknąć pogorszenia żywotności i zachowania komórek. Technika ta jest potężnym narzędziem do analizy dynamicznych interakcji kaspazy na poziomie inflamasomów, a także do badania kaskad sygnalizacji zapalnej w żywych MDM i monocytach pochodzących z próbek krwi ludzkiej.

Schemat przedstawiony na Ryc. 2 daje przegląd sposobu pozyskiwania, transfekcji i obrazowania ludzkich MDM. Po inkubacji wybranych monocytów CD14+ z GM-CSF przez 7 dni, morfologia komórek zmienia się w trakcie okresu różnicowania (Ryc. 3A), przechodząc od sferycznych komórek w zawiesinie do wrzecionowatych i całkowicie przylegających (dni 3 i 4), a na koniec do komórek bardziej rozpostartych po pełnym zróżnicowaniu (dzień 7). W pełni zróżnicowane komórki są nast...

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ może być używany do wizualizacji i badania szlaku kaspazy zapalnej na poziomie molekularnym w żywych komórkach w określonym stanie chorobowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do identyfikacji składników, wymagań i lokalizacji kompleksów aktywacyjnych kaspazy zapalnej w pierwotnych komórkach odpornościowych. Przy niewielkich optymalizacjach metoda ta może być dostosowana do innych komórek pierwotnych i szeregu białek aktywowanych przez oligomeryzację, a jej zastosowanie nie ogranicza się do metodologii mikroskopowych.Najpierw odessać pożywkę z w pełni zróżnicowanych makrofagów na 10-centymetrowych szalkach i umyć monowarstwę komórek ciepłym pożywką RPMI-1640 wolną od surowicy, całkowicie usuwając wszystkie pożywki. Zbierz komórki, dodając dwa mililitry 0,25% ciepłego roztworu trypsyny-EDTA na 10-centymetrowe naczynie. Delikatnie odpipetować trypsynę-EDTA w górę iw dół po całym naczyniu za pomocą mikropipety P-1000, a następnie przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów ciepłej, kompletnej pożywki hodowlanej.Sprawdź, czy komórki nie zostały oderwane pod mikroskopem jasnego pola i odłącz ponownie, jeśli to konieczne. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach 1X sterylnego PBS wstępnie podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Następnie weź podwielokrotność 20 mikrolitrów, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.Weź od jednej do dwóch razy od 10 do piątej komórki na transfekcję i umieść je w 15-mililitrowej probówce. Doprowadzić do końcowej objętości 15 mililitrów za pomocą wstępnie podgrzanego 1X sterylnego PBS. Zassać PBS i odwirować jeszcze raz przez jedną minutę przy 250 x g.Usunąć resztki PBS z osadu komórkowego za pomocą mikropipety P-200. Weź 1,5 mililitra sterylnej mikroprobówki na transfekcję i dodaj odpowiedni plazmid reporterowy i plazmidy kaspazy BiFC do kaptura. Umieść stację pipetową, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipetę w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.Podłącz i włącz urządzenie nukleofekcyjne. Wprowadź parametry przecięcia na wyświetlonym ekranie startowym. Naciśnij Napięcie, wprowadź 1000 i naciśnij Gotowe, aby ustawić go na 1000 woltów.Naciśnij Szerokość, wprowadź 40 i naciśnij Gotowe, aby ustawić impuls na 40 milisekund. Na koniec naciśnij Impulsy, wprowadź 2 i naciśnij Gotowe, aby ustawić liczbę impulsów elektrycznych na 2. Weź jedną z probówek do elektroporacji i napełnij ją trzema mililitrami buforu elektrolitycznego E w temperaturze pokojowej.Włóż rurkę do elektroporacji do uchwytu na pipetę na stacji pipetowej, upewniając się, że elektroda z boku rurki jest skierowana do wewnątrz, a po włożeniu rurki słychać kliknięcie. Wziąć osad komórkowy i dodać 10 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu R do reprodukcji na każde 1 do dwóch razy 10 do piątych komórek i delikatnie wymieszać z mikropipetą P-20. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej probówki do transfekcji i delikatnie wymieszać z mikropipetą P-20.Włóż końcówkę do pipety, naciskając przycisk do drugiego oporu, upewniając się, że zacisk całkowicie podnosi trzpień mocujący tłoka w końcówce. Następnie naciśnij przycisk na pipecie do pierwszego oporu i zanurz się w pierwszej probówce zawierającej mieszaninę komórek lub plazmidowego DNA, aby zassać próbkę. Ostrożnie włożyć pipetę z próbką do uchwytu na pipetę, upewniając się, że pipeta zatrzasnęła się i jest odpowiednio umieszczona.Naciśnij start na ekranie dotykowym i poczekaj, aż zostaną dostarczone impulsy elektryczne. Powoli wyjąć pipetę ze stacji i natychmiast dodać zawiesinę przeciętych komórek do odpowiedniej studzienki z podgrzaną pożywką wolną od antybiotyków, powoli naciskając przycisk do pierwszego oporu. Delikatnie kołysz płytką z przeciętymi komórkami i inkubuj przez jedną do trzech godzin w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych, a następnie dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki.Umieść naczynie w inkubatorze i odczekaj co najmniej 24 godziny na ekspresję genów. Następnego dnia sprawdź żywotność komórek i wydajność transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Ostrożnie usuń pożywkę z komórek za pomocą mikropipety P-1000 i dodaj 500 mikrolitrów roztworu stymulującego wzdłuż boku studzienki.Aby uruchomić nieoczyszczone studzienki kontrolne, dodaj pożywkę obrazującą bez bodźca. Aby uwidocznić komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła zgodnie z instrukcjami. Wybierz obiektyw 10 razy lub 20 razy i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.Znajdź komórki pod filtrem 568 nm za pomocą okularu. I skup się na komórkach wyrażających czerwone krwinki reporterowe. Policz wszystkie czerwone komórki w polu widzenia.Będąc w tym samym polu widzenia, zmień filtry na 488 lub 512, policz liczbę czerwonych komórek, które są również zielone. Policz co najmniej 100 czerwonych komórek z co najmniej trzech pól. Oblicz procent komórek transektowanych przez Wenus dodatnio w polu widzenia i uśrednij wynikowe wartości procentowe dla każdej studni poddawanej zabiegowi, aby uzyskać odchylenie standardowe.Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, wizualizuj obraz komórek na żywo na ekranie komputera, tak jak został uzyskany przez kamerę. Dostosuj ostrość i położenie komórek za pomocą joysticka sterującego i pokrętła ostrości. Ustaw procentową moc lasera i czas naświetlania dla laserów 512 nanometrów lub 488 nanometrów i 568 nanometrów, aby sygnał na obrazie wyglądał dobrze bez nasycenia.Włącz przechwytywanie na żywo i sprawdź wynikowy obraz, upewniając się, że na histogramach wyświetlania dla obu kanałów widoczny jest wyraźny szczyt dla każdego piętra. Wizualizując obraz komórek na żywo, wykonaj wiele reprezentatywnych obrazów pola, które zawiera jedną lub więcej komórek wyrażających reporter mCherry lub dsRedmito dla każdej studzienki płytki. Wybrane monocyty CD-14-dodatnie inkubowane z GM-CSF przez siedem dni wykazały zmiany w morfologii komórek w trakcie okresu różnicowania, przechodząc od kulistych komórek zawiesinowych do wrzecionowatych i w pełni przyczepionych, a na końcu do bardziej rozproszonych komórek, gdy są w pełni zróżnicowane.W pełni zróżnicowane komórki transektowano parami kaspazy BiFC VC i VN wraz z plazmidem reporterowym dsRedmito, który użyto do znakowania transektowanych komórek. Nieleczone komórki nie wykazywały fluorescencji Wenus. A w komórkach leczonych nigerycyną kaspaza-1 BiFC pojawiła się jako pojedynczy punctum o typowym kształcie plamek ASC.Ilościowe oznaczenie MDM z dodatnim wynikiem Wenus wykazało, że najwyższy odsetek kaspazy-1 BiFC obserwuje się w grupie leczonej LPS i nigerycyną. Podczas miareczkowania plazmidu par kaspazy-1, 4 i 5 pro-BiFC, najwyższy odsetek komórek wenus-dodatnich wynikał odpowiednio z 400, 500 i 1000 nanogramów transektowanego plazmidu. Obrazy konfokalne uzyskane z 20-krotnym obiektywem pola komórek 24 godziny po transsekcji wykazały, że nieleczone transektowane komórki są żywotne, ponieważ mitochondria są nienaruszone.Po leczeniu hemem kompleks kaspazy-1 pojawia się jako pojedynczy zielony punctum podobny do tego indukowanego przez nigerycynę. Pamiętaj, aby unikać trudnych warunków i nadmiernej manipulacji komórkami podczas różnicowania, transfekcji i leczenia, ponieważ może to spowodować spontaniczną aktywację i wysoki poziom aktywacji kaspazy w tle.

visualization-inflammatory-caspases-induced-proximity-human-monocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Ten film pokazuje aktywację białek kaspazy u ludzkich makrofagów za pomocą białek reporterowych dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Prodomeny kaspazy-1 są połączone z niefluorescencyjnymi fragmentami białek Wenus, które są rekrutowane do kompleksów inflamasomowych. Bliskość inflamasomów indukuje ponowne fałdowanie i fluorescencję fragmentów Wenus, potwierdzając aktywację kaspazy w makrofagach.

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten film demonstruje metodę wykrywania aktywacji inflamasomu NLRP3 w makrofagach za pomocą fluorescencyjnych sond reporterowych. Komórki są traktowane jonoforami potasu i glicyną w celu indukcji składania inflamasomu i aktywacji kaspazy-1. Fluorescencyjne sondy reporterowe wizualizują aktywowaną kaspazę-1, a komórki są barwione barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji jąder.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje technikę badania tworzenia inflamasomu w pierwotnej makrofagach za pomocą immunofluorescencji receptorów podobnych do NOD, rodziny receptorów pirynowych, zawierających domenę 3 (NLRP3). Makrofagi są najpierw przygotowywane za pomocą bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS) w celu zwiększenia ekspresji białka NLRP3. Wystawienie makrofagów na działanie nigerycyny - jonoforu potasu - prowadzi do aktywacji NLRP3 i powstania inflamasomów, które są wizualizowane za pomocą...

Technika in vitro do badania tworzenia kompleksów inflamasomów w makrofagach

Ten film pokazuje ocenę wielokrotnych aktywacji kaspazy w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego poprzez stymulację wirusem grypy. Po lizie makrofagów, inaktywacji termicznej lizatu i odwirowaniu pobiera się kaspazy wewnątrzkomórkowe do późniejszej analizy immunologicznej.

Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Poznaj metodę wizualizacji zapalnych kaspaz w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów przy użyciu reporterów BiFC. Ta technika umożliwia badanie aktywacji kompleksów kaspazowych na żywo.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Przeglądaj więcej filmów