Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Protokół ten jest istotny, ponieważ może być używany do wizualizacji i badania szlaku kaspazy zapalnej na poziomie molekularnym w żywych komórkach w określonym stanie chorobowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do identyfikacji składników, wymagań i lokalizacji kompleksów aktywacyjnych kaspazy zapalnej w pierwotnych komórkach odpornościowych. Przy niewielkich optymalizacjach metoda ta może być dostosowana do innych komórek pierwotnych i szeregu białek aktywowanych przez oligomeryzację, a jej zastosowanie nie ogranicza się do metodologii mikroskopowych.

Najpierw odessać pożywkę z w pełni zróżnicowanych makrofagów na 10-centymetrowych szalkach i umyć monowarstwę komórek ciepłym pożywką RPMI-1640 wolną od surowicy, całkowicie usuwając wszystkie pożywki. Zbierz komórki, dodając dwa mililitry 0,25% ciepłego roztworu trypsyny-EDTA na 10-centymetrowe naczynie. Delikatnie odpipetować trypsynę-EDTA w górę iw dół po całym naczyniu za pomocą mikropipety P-1000, a następnie przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów ciepłej, kompletnej pożywki hodowlanej.

Sprawdź, czy komórki nie zostały oderwane pod mikroskopem jasnego pola i odłącz ponownie, jeśli to konieczne. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach 1X sterylnego PBS wstępnie podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Następnie weź podwielokrotność 20 mikrolitrów, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.

Weź od jednej do dwóch razy od 10 do piątej komórki na transfekcję i umieść je w 15-mililitrowej probówce. Doprowadzić do końcowej objętości 15 mililitrów za pomocą wstępnie podgrzanego 1X sterylnego PBS. Zassać PBS i odwirować jeszcze raz przez jedną minutę przy 250 x g.

Usunąć resztki PBS z osadu komórkowego za pomocą mikropipety P-200. Weź 1,5 mililitra sterylnej mikroprobówki na transfekcję i dodaj odpowiedni plazmid reporterowy i plazmidy kaspazy BiFC do kaptura. Umieść stację pipetową, urządzenie, końcówki, rurki do elektroporacji i pipetę w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.

Podłącz i włącz urządzenie nukleofekcyjne. Wprowadź parametry przecięcia na wyświetlonym ekranie startowym. Naciśnij Napięcie, wprowadź 1000 i naciśnij Gotowe, aby ustawić go na 1000 woltów.

Naciśnij Szerokość, wprowadź 40 i naciśnij Gotowe, aby ustawić impuls na 40 milisekund. Na koniec naciśnij Impulsy, wprowadź 2 i naciśnij Gotowe, aby ustawić liczbę impulsów elektrycznych na 2. Weź jedną z probówek do elektroporacji i napełnij ją trzema mililitrami buforu elektrolitycznego E w temperaturze pokojowej.

Włóż rurkę do elektroporacji do uchwytu na pipetę na stacji pipetowej, upewniając się, że elektroda z boku rurki jest skierowana do wewnątrz, a po włożeniu rurki słychać kliknięcie. Wziąć osad komórkowy i dodać 10 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu R do reprodukcji na każde 1 do dwóch razy 10 do piątych komórek i delikatnie wymieszać z mikropipetą P-20. Dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej probówki do transfekcji i delikatnie wymieszać z mikropipetą P-20.

Włóż końcówkę do pipety, naciskając przycisk do drugiego oporu, upewniając się, że zacisk całkowicie podnosi trzpień mocujący tłoka w końcówce. Następnie naciśnij przycisk na pipecie do pierwszego oporu i zanurz się w pierwszej probówce zawierającej mieszaninę komórek lub plazmidowego DNA, aby zassać próbkę. Ostrożnie włożyć pipetę z próbką do uchwytu na pipetę, upewniając się, że pipeta zatrzasnęła się i jest odpowiednio umieszczona.

Naciśnij start na ekranie dotykowym i poczekaj, aż zostaną dostarczone impulsy elektryczne. Powoli wyjąć pipetę ze stacji i natychmiast dodać zawiesinę przeciętych komórek do odpowiedniej studzienki z podgrzaną pożywką wolną od antybiotyków, powoli naciskając przycisk do pierwszego oporu. Delikatnie kołysz płytką z przeciętymi komórkami i inkubuj przez jedną do trzech godzin w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych, a następnie dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki.

Umieść naczynie w inkubatorze i odczekaj co najmniej 24 godziny na ekspresję genów. Następnego dnia sprawdź żywotność komórek i wydajność transfekcji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Ostrożnie usuń pożywkę z komórek za pomocą mikropipety P-1000 i dodaj 500 mikrolitrów roztworu stymulującego wzdłuż boku studzienki.

Aby uruchomić nieoczyszczone studzienki kontrolne, dodaj pożywkę obrazującą bez bodźca. Aby uwidocznić komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła zgodnie z instrukcjami. Wybierz obiektyw 10 razy lub 20 razy i umieść naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu.

Znajdź komórki pod filtrem 568 nm za pomocą okularu. I skup się na komórkach wyrażających czerwone krwinki reporterowe. Policz wszystkie czerwone komórki w polu widzenia.

Będąc w tym samym polu widzenia, zmień filtry na 488 lub 512, policz liczbę czerwonych komórek, które są również zielone. Policz co najmniej 100 czerwonych komórek z co najmniej trzech pól. Oblicz procent komórek transektowanych przez Wenus dodatnio w polu widzenia i uśrednij wynikowe wartości procentowe dla każdej studni poddawanej zabiegowi, aby uzyskać odchylenie standardowe.

Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, wizualizuj obraz komórek na żywo na ekranie komputera, tak jak został uzyskany przez kamerę. Dostosuj ostrość i położenie komórek za pomocą joysticka sterującego i pokrętła ostrości. Ustaw procentową moc lasera i czas naświetlania dla laserów 512 nanometrów lub 488 nanometrów i 568 nanometrów, aby sygnał na obrazie wyglądał dobrze bez nasycenia.

Włącz przechwytywanie na żywo i sprawdź wynikowy obraz, upewniając się, że na histogramach wyświetlania dla obu kanałów widoczny jest wyraźny szczyt dla każdego piętra. Wizualizując obraz komórek na żywo, wykonaj wiele reprezentatywnych obrazów pola, które zawiera jedną lub więcej komórek wyrażających reporter mCherry lub dsRedmito dla każdej studzienki płytki. Wybrane monocyty CD-14-dodatnie inkubowane z GM-CSF przez siedem dni wykazały zmiany w morfologii komórek w trakcie okresu różnicowania, przechodząc od kulistych komórek zawiesinowych do wrzecionowatych i w pełni przyczepionych, a na końcu do bardziej rozproszonych komórek, gdy są w pełni zróżnicowane.

W pełni zróżnicowane komórki transektowano parami kaspazy BiFC VC i VN wraz z plazmidem reporterowym dsRedmito, który użyto do znakowania transektowanych komórek. Nieleczone komórki nie wykazywały fluorescencji Wenus. A w komórkach leczonych nigerycyną kaspaza-1 BiFC pojawiła się jako pojedynczy punctum o typowym kształcie plamek ASC.

Ilościowe oznaczenie MDM z dodatnim wynikiem Wenus wykazało, że najwyższy odsetek kaspazy-1 BiFC obserwuje się w grupie leczonej LPS i nigerycyną. Podczas miareczkowania plazmidu par kaspazy-1, 4 i 5 pro-BiFC, najwyższy odsetek komórek wenus-dodatnich wynikał odpowiednio z 400, 500 i 1000 nanogramów transektowanego plazmidu. Obrazy konfokalne uzyskane z 20-krotnym obiektywem pola komórek 24 godziny po transsekcji wykazały, że nieleczone transektowane komórki są żywotne, ponieważ mitochondria są nienaruszone.

Po leczeniu hemem kompleks kaspazy-1 pojawia się jako pojedynczy zielony punctum podobny do tego indukowanego przez nigerycynę. Pamiętaj, aby unikać trudnych warunków i nadmiernej manipulacji komórkami podczas różnicowania, transfekcji i leczenia, ponieważ może to spowodować spontaniczną aktywację i wysoki poziom aktywacji kaspazy w tle.