Name: Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek na syntetycznych, stłoczonych dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii smTIRF. Protokół umożliwia analizę wiązania, dyfuzji i montażu biomolekuł błonowych na poziomie molekularnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Benjaminowi Schulerowi za udostępnienie plazmidu ekspresji białka ClyA. Prace te były wspierane przez Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu demonstrujemy eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB), które manifestują zatłoczone środowisko dla biomolekuł osadzonych w błonie. Zatłoczone środowisko generuje wykluczony efekt objętościowy, co prowadzi do wzmocnienia reakcji biomolekularnych 1,2,39,40. W przypadku układu PEG-lipid, w którym polimer zajmuje przede wszystkim objętość n...

Błony komórkowe to bardzo zatłoczone i złożone systemy1. Stłoczenie molekularne może mieć znaczący wpływ na dyfuzję jednostek związanych z błoną, takich jak białka i lipidy2,3,4. Podobnie, na reakcje dwucząsteczkowe na błonach lipidowych, takie jak dimeryzacja receptorów lub oligomeryzacja kompleksów błonowych, wpływa stłoczenie5,6,7. Natura, konfiguracja i koncentracja tłumów może regulować wiązanie błony, dyfuzyjność i interakcję białko-białko na kilka sposobów8,9. Ponieważ kontrolowanie stłoczenia błon komórkowych i interpretacja ich wpływu na osadzone biomolekuły jest trudne, naukowcy podjęli próbę stworzenia alternatywnych systemów in vitro10.
Popularnym podejściem do sztucznych zatłoczonych membran jest domieszkowanie dwuwarstwowych membran lipidami szczepionymi polimerem (takim jak glikol polietylenowy, PEG)11,12. Podczas wizualizacji dynamiki białek i lipidów na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB), polimery te dodatkowo osłaniają elementy osadzone w błonie przed leżącym pod spodem ujemnie naładowanym substratem (takim jak szkło), skutecznie odciągając dwuwarstwę od leżącego poniżej nośnika. Zmieniając rozmiar i stężenie polimeru, można kontrolować zakres stłoczenia molekularnego, a także jego oddzielenie od leżącego pod spodem stałego nośnika13,14. Jest to wyraźna przewaga nad dwuwarstwami lipidowymi opartymi na podłożach stałych bez poduszek polimerowych15,16, gdzie transbłonowe biomolekuły mogą stracić swoją aktywność17,18,19. Co ważniejsze, pozwala nam to na odtworzenie zatłoczonego środowiska błony komórkowej in vitro, które ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów błonowych.
Polimery szczepione powierzchniowo na membranach również ulegają zmianom w swojej konfiguracji w zależności od gęstości szczepienia12. W niskich stężeniach pozostają w entropicznie zwijanej konfiguracji, znanej jako grzyb, nad powierzchnią błony. Wraz ze wzrostem koncentracji zaczynają one wchodzić w interakcje, mają tendencję do rozwijania się i rozszerzania, ostatecznie tworząc gęstą formację przypominającą szczotkę na membranie21. Ponieważ przejście od reżimu grzybowego do szczotkowego jest wysoce niejednorodne i objawia się słabo scharakteryzowanymi warunkami polimeru, ważne jest, aby stosować dobrze scharakteryzowane warunki do stłoczenia na membranach szczepionych polimerem. W porównaniu z niedawnym badaniem20, identyfikujemy i raportujemy zatłoczone kompozycje błonowe, które utrzymują transport dyfuzyjny i aktywność transbłonowych biomolekuł.
W tym protokole omawiamy, jak generować pegylowane błony lipidowe i podajemy zalecenia dotyczące gęstości PEG, które naśladują stłoczenie w dwóch różnych reżimach konfiguracji polimeru (mianowicie grzyba i szczotki). Protokół opisuje również wiązanie pojedynczych cząsteczek, śledzenie cząstek oraz pozyskiwanie i analizę danych fotowybielania dla cząsteczek osadzonych w tych zatłoczonych błonach. Najpierw opisujemy dokładne etapy czyszczenia, montaż komory obrazowania i generowanie PEG-SLB. Po drugie, podajemy szczegółowe informacje na temat eksperymentów związanych z wiązaniem pojedynczych cząsteczek, śledzeniem cząstek i fotowybielaniem. Po trzecie, omawiamy i) ekstrakcję względnego powinowactwa wiązania, ii) charakteryzowanie dyfuzji molekularnej oraz iii) liczenie podjednostek w zespole białkowym z filmów pojedynczych cząsteczek na błonie.
Chociaż scharakteryzowaliśmy ten system za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek, protokół jest przydatny dla wszystkich biofizyków błon zainteresowanych zrozumieniem wpływu stłoczenia na reakcje biomolekularne na błonach lipidowych. Ogólnie rzecz biorąc, prezentujemy solidną linię produkcyjną do tworzenia zatłoczonych i podpartych dwuwarstw lipidowych, wraz z różnymi testami jednocząsteczkowymi przeprowadzanymi na nich i odpowiednimi procedurami analizy.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 2,5 ml</td><td>HMD Healthcare</td><td>Dispo Van, 2,5 ml Tuberkulina</td><td>Plastikowa strzykawka</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Finar Chemicals</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz</td><td></td><td></td> akrylowy o <td>grubości 2 mm</td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy</td><td>BigiMall</td><td></td><td>2 mm, przezroczysty</td></tr><tr><td>sonikator do kąpieli</td><td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td> wapnia<td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>528730</td><td>&nbsp; Cholesterol klasy HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>Słoik z kopiny</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>8 przesuwny słoik ze szklaną pokrywą</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm X 50 mm</td></tr><tr><td>Nić Cy3-DNA IDT</td><td></td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGGGGG-Cy3</td></tr><tr><td>Barwnik cyjaninowy (Cy3)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D3911</td><td>Dil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))Nici</td></tr> <tr><td>łącznika DNA 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T</td></tr><tr><td>Nici konektoryjne DNA 2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>Biomery</td><td></td><td>nici tokoferolu DNA</td><td>Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Wiertła 3M</td><td>LF93010LE</td><td></td></tr><tr><td>(z powłoką diamentową)</td><td></td><td></td> <td>0,5 - 1 mm</td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>Stacja robocza</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane Blue</td><td>Star</td><td></td><td>Micro Slides,</td></tr><tr><td>szklane fiolki</td>-1 <td>Sigma</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>30% roztwór,</td></tr> AR <tr><td>Grade Labolene</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>&nbsp; Laser detergentowy</td></tr><tr><td>532 nm</td><td>Koherentna</td><td>szafirowa</td><td></td></tr><tr><td>wycinarka laserowa</td><td>Uniwersalne systemy laserowe</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine DOPE</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina, rodamina, B, sulfonylo) (sól amonowa)</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Finar Chemicals</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia</td><td>plazmy Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina</td></tr><tr><td>Programowalna pompa strzykawkowa</td><td>New Era</td><td>Wysokociśnieniowa pompa strzykawkowa</td><td>NE1010</td></tr><tr><td>Nakrętki PTFE</td><td>Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>SD Chemikalia</td><td></td><td>wysokowartościowe 98%, Obiektyw TIRF klasy AR</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Błony komórkowe są bardzo zatłoczonymi środowiskami dla reakcji biomolekularnych i sygnalizacji. Jednak większość eksperymentów in vitro badających interakcje białek z lipidami wykorzystuje nagie błony dwuwarstwowe. Takie systemy nie mają złożoności stłoczenia przez białka i glikany osadzone w błonie i wykluczają związane z tym efekty objętości występujące na powierzchniach błon komórkowych. Ponadto ujemnie naładowana szklana powierzchnia, na której tworzą się dwuwarstwy lipidowe, zapobiega swobodnej dyfuzji transbłonowych biomolekuł. W tym miejscu przedstawiamy dobrze scharakteryzowaną błonę polimerowo-lipidową jako naśladownictwo zatłoczonych błon lipidowych. Protokół ten wykorzystuje lipidy sprzężone z glikolem polietylenowym (PEG) jako uogólnione podejście do włączania tłumów do obsługiwanej dwuwarstwy lipidowej (SLB). W pierwszej kolejności przedstawiono procedurę czyszczenia szkiełek mikroskopowych i szkiełek nakrywkowych do przeprowadzania eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach. Następnie omówiono metody charakteryzowania PEG-SLB i przeprowadzania jednocząsteczkowych eksperymentów wiązania, dyfuzji i składania biomolekuł za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek i fotowybielania. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak monitorować gromadzenie się nanoporów bakteryjnej toksyny tworzącej pory cytolizyny A (ClyA) na zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą analizy fotowybielania pojedynczej cząsteczki. Kody MATLAB z przykładowymi zestawami danych są również dołączane do wykonywania niektórych typowych analiz, takich jak śledzenie cząstek, wyodrębnianie zachowania dyfuzyjnego i zliczanie podjednostek.

Monitorowanie wiązania białka ClyA z membranami pegylowanymi 
Po kroku 4.5 kinetykę wiązania szacuje się poprzez wykreślenie liczby cząsteczek wiążących się z powierzchnią membrany w funkcji czasu (Wideo 1). W miarę jak białko ClyA wiąże się z membraną zawierającą 5 mol% lipidów PEG2000, gęstość cząsteczek wzrasta i osiąga nasycenie (Rysunek 5). Dopasowanie funkcją wykładniczego zaniku do związanych cząsteczek (cyjanowe kółka) pozwala wyznaczyć stałą czas...

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Błony komórkowe są bardzo zatłoczone ze względu na obecność wbudowanych białek i cukrów. Demonstrujemy obrazowanie pojedynczych cząsteczek na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych z zatłoczonym nośnikiem. Platforma ta jest przydatna do badania wpływu stłoczenia na reakcje biomolekularne błony na poziomie molekularnym.Protokół wyjaśnia analizę wiązania, dyfuzji i składania biomolekuł błonowych. Powodzenie eksperymentu zależy od rygorystycznego oczyszczenia podłoża, uniknięcia uszkodzenia dwuwarstwy i utrzymania wysokiego stosunku sygnału do szumu w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek. Procedurę demonstrują ze mną Aditya Upasani i Vishwesh Haricharan Rai, absolwenci laboratorium.Zacznij od umieszczenia szkiełka akrylowego poddanego obróbce plazmowej na czystej bibułce. Odklej dwustronną taśmę wycinaną laserowo i przyklej ją do szkiełka. Za pomocą końcówki do pipet spłaszcz taśmę, aby zapobiec wyciekom z jednego kanału do drugiego.Zamknąć komorę, umieszczając szkiełko nakrywkowe poddane plazmie na zaklejonym szkiełku taśmowym. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do zaklejonych obszarów, aby kanał był wodoszczelny. Jeśli używasz szkiełek szklanych, uszczelnij krawędzie za pomocą żywicy epoksydowej.Przygotowane komory do obrazowania mikroprzepływowego należy przechowywać przez jeden do dwóch tygodni w suchych warunkach. Weź szklaną fiolkę wstępnie oczyszczoną roztworem Piranha i dodaj roztwór chloroformu POPC i DOPE-PEG(2000) o pożądanej frakcji molowej lipidów PEG 2000, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów trzy milimolowe, po dodaniu buforu. Podobnie można przygotować inne kompozycje błonowe lipidów.Następnie należy wysuszyć chloroform z fiolki za pomocą delikatnego strumienia azotu z niewielkim wirem, tak aby pożądane lipidy były równomiernie pokryte na powierzchni fiolki. Usunąć pozostałości chloroformu, trzymając fiolkę w eksykatorze próżniowym przez jedną godzinę. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do fiolki i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po całonocnej inkubacji delikatnie obracać fiolkę przez jedną do dwóch minut, aż roztwór stanie się mętny i mleczny. Teraz przenieś 100 mikrolitrów tego roztworu do małej probówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów. Aby wygenerować małe pęcherzyki jednowarstwowe o średnicy od 50 do 100 nanometrów, należy sonikować roztwór przez około godzinę w sonikatorze do kąpieli.Pod koniec sonikacji roztwór stanie się klarowny, jeśli roztwór jest nadal mętny, należy go poddać sonikacji przez dodatkowe 30 minut. Następnie dodać chlorek wapnia do sonikowanych pęcherzyków do końcowego stężenia 30 milimolów w roztworze lipidowym. Wyciąć końcówkę mikropipety, aby wstrzyknąć roztwór próbki tak, aby ściśle przylegał do otworu.Wymieszać roztwór lipidowy i wstrzyknąć go przez jeden z otworów w komorze obrazowania. Wytrzyj nadmiar roztworu, który wydostaje się z komory z wylotu, czystą chusteczką, aby zapobiec zanieczyszczeniu sąsiednich kanałów. Przygotuj komorę nawilżającą, umieszczając mokrą chusteczkę na końcu 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Umieść szkiełko w rurce i zamknij nasadkę rurki. Połóż probówkę bokiem i pozostaw ten zespół w wilgotnej komorze na 90 minut, najlepiej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dokładnie umyj komorę dużą ilością bufora PBS, zapobiegając przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do komory podczas mycia, ponieważ może to spowodować powstanie wad membrany.Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu dotyczącego mobilności i montażu, należy ustawić mikroskop TIRF, przygotowując próbkę kulek fluorescencyjnych i dodając je do kanału mikroprzepływowego w niskich stężeniach, tak aby plamki fluorescencyjne z pojedynczych kulek nie nachodziły na obrazy. Najpierw wizualizuj koraliki w trybie epifluorescencji. Gdy oświetlenie jest w trybie epifluorescencji, przesuń lustro M5 siedzące na stoliku translacyjnym tak, aby wiązka wychodząca z obiektywu zakrzywiała się, aż do osiągnięcia całkowitej konfiguracji odbicia wewnętrznego.Aby sprawdzić, czy osiągnięto oświetlenie TIR, należy sprawdzić, czy tylko koraliki na powierzchni są widoczne, gdy pole ulotne TIR oświetla próbkę koralików i nie obserwuje się swobodnie unoszących się kulek z dala od powierzchni. Na początku eksperymentu ustaw moc lasera na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu na pięć do 10 miliwatów, aby zapobiec fotozniszczeniu fluoroforów. Trzymaj szkiełko na stoliku mikroskopu i najpierw skup się na nieosłoniętej błonie, małe ślady zanieczyszczeń w błonach lipidowych wystarczą, aby uwidocznić błonę.Wstrzyknąć próbkę za pomocą mikropipety do komory obrazowania pokrytej PEG SLB. Do pomiaru kinetyki wiązania pojedynczych cząsteczek należy użyć pompy strzykawkowej, aby przepuścić znakowane biomolekuły przez otwory wlotowe do komory mikroprzepływowej z natężeniem przepływu od 50 do 500 mikrolitrów na minutę. Aby nagrać 5 000 klatek z szybkością od 25 do 50 klatek na sekundę, ustaw wymagane parametry akwizycji filmu.Rozpocznij akwizycję filmu i uzyskaj ponad 5 000 klatek pod ciągłym przepływem z pompy strzykawkowej, aż do momentu, gdy nie będzie dalszego wzrostu pojawiania się nowych plam na powierzchni membrany, a następnie przeanalizuj kinetykę wiązania zgodnie z opisem w manuskrypcie. W celu śledzenia pojedynczych cząstek dodaj znakowane biomolekuły w niskich stężeniach do kanału za pomocą mikropipety. Aby zapewnić wysoką wierność ścieżek odzyskanych ze zbiorów danych, zoptymalizuj stężenie do gęstości mniejszej niż 0,1 cząstki na mikrometr kwadratowy, tak aby poszczególne cząstki rzadko przecinały swoje ścieżki.W razie potrzeby inkubować komorę w wilgotnym środowisku i przemyć buforem przed obrazowaniem. W przypadku analizy trajektorii pojedynczej cząstki należy uzyskać od 200 do 500 klatek przy 10 do 100 klatkach na sekundę i utrzymywać soczewkę obiektywu skupioną na płaszczyźnie dwuwarstwowej przy minimalnym dryfie etapu podczas akwizycji obrazu. W przypadku podjednostek pomiarowych należy dodać odpowiednie stężenie znakowanych biomolekuł do komory obrazowania mikroprzepływowego i inkubować szkiełko w komorze nawilżającej w żądanej temperaturze przez wymagany czas.Przed obrazowaniem należy umyć komorę obrazowania buforem. Umieść szkiełko pod mikroskopem i dostosuj ostrość, aby uwidocznić znakowane cząsteczki. Ustaw moc lasera na poziomie, przy którym bielenie fluoroforu następuje stopniowo.Idealnie dla każdego zmontowanego kompleksu kontroluj moc lasera, aby utrzymać tempo wybielania zdjęć w odległości od 10 do 20 klatek, jak opisano w manuskrypcie, i uzyskuj obrazy, aż wszystkie cząsteczki zostaną całkowicie wybielone fotograficznie. Wykonać pomiar montażowy zależny od czasu, rozpoczynając akwizycję filmu zaraz po wprowadzeniu próbki do komory i uzyskując nowe folie wybielania fotograficznego w ustalonych odstępach czasu po związaniu membrany z różnych segmentów PEG SLB. Wiązanie cytolizyny A z błonami lipidowymi za pomocą pięciu procent molowych DOPE-PEG (2000) wykazało zwiększoną gęstość cząstek i osiągnięte nasycenie.Funkcja rozpadu wykładniczego dopasowana do związanych cząstek daje stałą czasową wiązania błony cytolizyny A. Bez polimeru PEG w membranie, większość znaczników wykazywała ograniczoną dyfuzję na SLB. Niewielkie poziomy PEG 2000 w dwuwarstwie membrany unosiły się od leżącej pod spodem powierzchni, umożliwiając cząsteczkom znacznika dyfuzję bez ograniczeń powierzchniowych.Jednak ekstremalne uwięzienie obserwuje się przy wysokim stężeniu PEG w membranie dwuwarstwowej. Rozkład ISD2 dla dyfuzji lipofilowego znacznika DNA w dwóch różnych błonach lipidowych PEG 2000 wykazał zmniejszoną ruchliwość przy wysokich stężeniach PEG. Po inkubacji na zatłoczonej błonie dwuwarstwowej lipidów cytolizyna A wykazywała wiele wyraźnych etapów wybielania fotograficznego, co sugeruje tworzenie się różnych produktów pośrednich.Po skorygowaniu o skuteczność znakowania, końcowy rozkład oligomerów wykazał dodekameryczny gatunek cytolizyny A jako strukturę dominującą. Wiązanie białek błonowych i inne reakcje powinny być przeprowadzane w odpowiednich środowiskach stłoczenia błony. Należy zwrócić uwagę na czyszczenie komory obrazowania, unikanie przerywania dwuwarstwy i ustawienie mikroskopu TIRF.

single-molecule-diffusion-assembly-on-polymer-crowded-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Przedstawiono protokół syntezy i charakterystyki ruchu dyfuzyjnego cyklicznych polimerów na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Synteza polimerów cyklicznych i charakterystyka ich ruchu dyfuzyjnego w stanie stopionym na poziomie pojedynczej cząsteczki

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Poznaj metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek na syntetycznych, stłoczonych dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii smTIRF. Protokół umożliwia analizę wiązania, dyfuzji i montażu biomolekuł błonowych na poziomie molekularnym.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Przeglądaj więcej filmów