Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Błony komórkowe są bardzo zatłoczone ze względu na obecność wbudowanych białek i cukrów. Demonstrujemy obrazowanie pojedynczych cząsteczek na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych z zatłoczonym nośnikiem. Platforma ta jest przydatna do badania wpływu stłoczenia na reakcje biomolekularne błony na poziomie molekularnym.

Protokół wyjaśnia analizę wiązania, dyfuzji i składania biomolekuł błonowych. Powodzenie eksperymentu zależy od rygorystycznego oczyszczenia podłoża, uniknięcia uszkodzenia dwuwarstwy i utrzymania wysokiego stosunku sygnału do szumu w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek. Procedurę demonstrują ze mną Aditya Upasani i Vishwesh Haricharan Rai, absolwenci laboratorium.

Zacznij od umieszczenia szkiełka akrylowego poddanego obróbce plazmowej na czystej bibułce. Odklej dwustronną taśmę wycinaną laserowo i przyklej ją do szkiełka. Za pomocą końcówki do pipet spłaszcz taśmę, aby zapobiec wyciekom z jednego kanału do drugiego.

Zamknąć komorę, umieszczając szkiełko nakrywkowe poddane plazmie na zaklejonym szkiełku taśmowym. Za pomocą końcówki do pipet delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do zaklejonych obszarów, aby kanał był wodoszczelny. Jeśli używasz szkiełek szklanych, uszczelnij krawędzie za pomocą żywicy epoksydowej.

Przygotowane komory do obrazowania mikroprzepływowego należy przechowywać przez jeden do dwóch tygodni w suchych warunkach. Weź szklaną fiolkę wstępnie oczyszczoną roztworem Piranha i dodaj roztwór chloroformu POPC i DOPE-PEG(2000) o pożądanej frakcji molowej lipidów PEG 2000, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów trzy milimolowe, po dodaniu buforu. Podobnie można przygotować inne kompozycje błonowe lipidów.

Następnie należy wysuszyć chloroform z fiolki za pomocą delikatnego strumienia azotu z niewielkim wirem, tak aby pożądane lipidy były równomiernie pokryte na powierzchni fiolki. Usunąć pozostałości chloroformu, trzymając fiolkę w eksykatorze próżniowym przez jedną godzinę. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do fiolki i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po całonocnej inkubacji delikatnie obracać fiolkę przez jedną do dwóch minut, aż roztwór stanie się mętny i mleczny. Teraz przenieś 100 mikrolitrów tego roztworu do małej probówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów. Aby wygenerować małe pęcherzyki jednowarstwowe o średnicy od 50 do 100 nanometrów, należy sonikować roztwór przez około godzinę w sonikatorze do kąpieli.

Pod koniec sonikacji roztwór stanie się klarowny, jeśli roztwór jest nadal mętny, należy go poddać sonikacji przez dodatkowe 30 minut. Następnie dodać chlorek wapnia do sonikowanych pęcherzyków do końcowego stężenia 30 milimolów w roztworze lipidowym. Wyciąć końcówkę mikropipety, aby wstrzyknąć roztwór próbki tak, aby ściśle przylegał do otworu.

Wymieszać roztwór lipidowy i wstrzyknąć go przez jeden z otworów w komorze obrazowania. Wytrzyj nadmiar roztworu, który wydostaje się z komory z wylotu, czystą chusteczką, aby zapobiec zanieczyszczeniu sąsiednich kanałów. Przygotuj komorę nawilżającą, umieszczając mokrą chusteczkę na końcu 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Umieść szkiełko w rurce i zamknij nasadkę rurki. Połóż probówkę bokiem i pozostaw ten zespół w wilgotnej komorze na 90 minut, najlepiej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dokładnie umyj komorę dużą ilością bufora PBS, zapobiegając przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do komory podczas mycia, ponieważ może to spowodować powstanie wad membrany.

Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu dotyczącego mobilności i montażu, należy ustawić mikroskop TIRF, przygotowując próbkę kulek fluorescencyjnych i dodając je do kanału mikroprzepływowego w niskich stężeniach, tak aby plamki fluorescencyjne z pojedynczych kulek nie nachodziły na obrazy. Najpierw wizualizuj koraliki w trybie epifluorescencji. Gdy oświetlenie jest w trybie epifluorescencji, przesuń lustro M5 siedzące na stoliku translacyjnym tak, aby wiązka wychodząca z obiektywu zakrzywiała się, aż do osiągnięcia całkowitej konfiguracji odbicia wewnętrznego.

Aby sprawdzić, czy osiągnięto oświetlenie TIR, należy sprawdzić, czy tylko koraliki na powierzchni są widoczne, gdy pole ulotne TIR oświetla próbkę koralików i nie obserwuje się swobodnie unoszących się kulek z dala od powierzchni. Na początku eksperymentu ustaw moc lasera na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu na pięć do 10 miliwatów, aby zapobiec fotozniszczeniu fluoroforów. Trzymaj szkiełko na stoliku mikroskopu i najpierw skup się na nieosłoniętej błonie, małe ślady zanieczyszczeń w błonach lipidowych wystarczą, aby uwidocznić błonę.

Wstrzyknąć próbkę za pomocą mikropipety do komory obrazowania pokrytej PEG SLB. Do pomiaru kinetyki wiązania pojedynczych cząsteczek należy użyć pompy strzykawkowej, aby przepuścić znakowane biomolekuły przez otwory wlotowe do komory mikroprzepływowej z natężeniem przepływu od 50 do 500 mikrolitrów na minutę. Aby nagrać 5 000 klatek z szybkością od 25 do 50 klatek na sekundę, ustaw wymagane parametry akwizycji filmu.

Rozpocznij akwizycję filmu i uzyskaj ponad 5 000 klatek pod ciągłym przepływem z pompy strzykawkowej, aż do momentu, gdy nie będzie dalszego wzrostu pojawiania się nowych plam na powierzchni membrany, a następnie przeanalizuj kinetykę wiązania zgodnie z opisem w manuskrypcie. W celu śledzenia pojedynczych cząstek dodaj znakowane biomolekuły w niskich stężeniach do kanału za pomocą mikropipety. Aby zapewnić wysoką wierność ścieżek odzyskanych ze zbiorów danych, zoptymalizuj stężenie do gęstości mniejszej niż 0,1 cząstki na mikrometr kwadratowy, tak aby poszczególne cząstki rzadko przecinały swoje ścieżki.

W razie potrzeby inkubować komorę w wilgotnym środowisku i przemyć buforem przed obrazowaniem. W przypadku analizy trajektorii pojedynczej cząstki należy uzyskać od 200 do 500 klatek przy 10 do 100 klatkach na sekundę i utrzymywać soczewkę obiektywu skupioną na płaszczyźnie dwuwarstwowej przy minimalnym dryfie etapu podczas akwizycji obrazu. W przypadku podjednostek pomiarowych należy dodać odpowiednie stężenie znakowanych biomolekuł do komory obrazowania mikroprzepływowego i inkubować szkiełko w komorze nawilżającej w żądanej temperaturze przez wymagany czas.

Przed obrazowaniem należy umyć komorę obrazowania buforem. Umieść szkiełko pod mikroskopem i dostosuj ostrość, aby uwidocznić znakowane cząsteczki. Ustaw moc lasera na poziomie, przy którym bielenie fluoroforu następuje stopniowo.

Idealnie dla każdego zmontowanego kompleksu kontroluj moc lasera, aby utrzymać tempo wybielania zdjęć w odległości od 10 do 20 klatek, jak opisano w manuskrypcie, i uzyskuj obrazy, aż wszystkie cząsteczki zostaną całkowicie wybielone fotograficznie. Wykonać pomiar montażowy zależny od czasu, rozpoczynając akwizycję filmu zaraz po wprowadzeniu próbki do komory i uzyskując nowe folie wybielania fotograficznego w ustalonych odstępach czasu po związaniu membrany z różnych segmentów PEG SLB. Wiązanie cytolizyny A z błonami lipidowymi za pomocą pięciu procent molowych DOPE-PEG (2000) wykazało zwiększoną gęstość cząstek i osiągnięte nasycenie.

Funkcja rozpadu wykładniczego dopasowana do związanych cząstek daje stałą czasową wiązania błony cytolizyny A. Bez polimeru PEG w membranie, większość znaczników wykazywała ograniczoną dyfuzję na SLB. Niewielkie poziomy PEG 2000 w dwuwarstwie membrany unosiły się od leżącej pod spodem powierzchni, umożliwiając cząsteczkom znacznika dyfuzję bez ograniczeń powierzchniowych.

Jednak ekstremalne uwięzienie obserwuje się przy wysokim stężeniu PEG w membranie dwuwarstwowej. Rozkład ISD2 dla dyfuzji lipofilowego znacznika DNA w dwóch różnych błonach lipidowych PEG 2000 wykazał zmniejszoną ruchliwość przy wysokich stężeniach PEG. Po inkubacji na zatłoczonej błonie dwuwarstwowej lipidów cytolizyna A wykazywała wiele wyraźnych etapów wybielania fotograficznego, co sugeruje tworzenie się różnych produktów pośrednich.

Po skorygowaniu o skuteczność znakowania, końcowy rozkład oligomerów wykazał dodekameryczny gatunek cytolizyny A jako strukturę dominującą. Wiązanie białek błonowych i inne reakcje powinny być przeprowadzane w odpowiednich środowiskach stłoczenia błony. Należy zwrócić uwagę na czyszczenie komory obrazowania, unikanie przerywania dwuwarstwy i ustawienie mikroskopu TIRF.