Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie mikromacierzy biomembranowych przy użyciu prostej metody przygotowania. Osiąga się to poprzez pierwsze pokrycie kulek krzemionki dwuwarstwowymi membranami lipidowymi. Drugim etapem procedury jest osadzenie kulek pokrytych lipidem na podłożu silikonowym microwell.

Trzecim krokiem jest usunięcie kulek znajdujących się poza mikro studzienkami za pomocą ściągaczki z polimetylu suboksanu. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie matryc kulek pokrytych lipidami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do określenia stałych wiązania interakcji toksyn lipidowych przy użyciu metody obrazowania matrycowego.

Metoda ta może być stosowana do tworzenia układów sferycznych dwuwarstw lipidowych i naturalnych cząstek błonowych pochodzących z komórek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że oprócz wytwarzania mikrostudzienek, technika ta nie wymaga chemicznej modyfikacji ani substratu, ani błon lipidowych w celu stworzenia przestrzennie zdefiniowanych macierzy biomembranowych. Zastosowania tej techniki można rozszerzyć o bezznacznikowe wykrywanie interakcji białek lipidowych za pomocą plazmy powierzchniowej i rezonansu opartego na nanometrycznych układach metalowych otworów.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje białek lipidowych, może być również stosowana do innych systemów, takich jak badania ogniskowej adhezji komórkowej, matryce mikrodołkowe i preparaty rakli są szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Ten film zaczyna się od przygotowania pęcherzyków. Najpierw w małej szklanej fiolce miesza się lipidy dla pęcherzyków.

W sumie pół miligrama lipidu znajduje się w tym roztworze pod próżnią, wysuszaj mieszaninę przez sześć godzin. Następnie przygotuj 0,1-molowy roztwór chlorku sodu i dodaj pół mililitra do wysuszonych lipidów. Pozostaw mieszaninę do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia zmieszaj mieszaninę, aby zawiesić pęcherzyki. Następnie sonikować mieszaninę przez 20 minut w kąpieli, sonikować w temperaturze pokojowej. Po sonikacji wytłacz zawiesinę przez filtr membranowy z poliwęglanu o długości 100 nanometrów.

Przepuść zawiesinę przez filtr ekstruzyjny w sumie 17 razy. Następnie przechowuj wytłaczane pęcherzyki w szklanej fiolce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przy użyciu kulek dwutlenku krzemu o średnicy 700 nanometrów.

Zrób zawiesinę 15 miliardów kulek w 0,1 molowym chlorku sodu. Zawiesinę należy zwirować, a następnie odwirować w temperaturze 1700 g przez 20 minut i wyrzucić supernatant. Powtórz pranie przez resus, zawieszając kulki w kolejnym mililitrze roztworu soli i obracając je w dół przez kolejne 20 minut.

Następnie powtórz proces po raz trzeci, aby utworzyć sferyczne podparte dwuwarstwy lipidowe lub SSB. Wymieszaj 25 mikrolitrów zawiesiny kulek dwutlenku krzemu z 200 mikrolitrami zawiesiny pęcherzyków z poprzedniej sekcji. Zwirować mieszaninę i podpalić ją, inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę później, odwirować mieszaninę w temperaturze 1700 G przez 20 minut.

Odrzucić supernatant. Granulka jest różowa do pękniętych pęcherzyków z rzędem DPPE na koralikach. Zawiesić go ponownie w 225 mikrolitrach PBS przy pH 7,4.

Powtórz dwukrotnie kroki wirowania i zawieszenia Resus, aby usunąć niepęknięte pęcherzyki i zakończyć tworzenie SSB. Podziel płytki układów mikrodołków na prostokątne kawałki z czterema do sześciu tablic każdy. Następnie odwiruj, zawiesinę SSLB z poprzedniej sekcji i przenieś 10 mikrolitrów do każdej matrycy mikrostudzienek.

Poczekaj godzinę, aż SSB osiągną się później. Delikatnie umyj chipy macierzy za pomocą PBS i zanurz macierz w PBS za pomocą ściągaczki, przesuwając się po powierzchni zanurzonych chipów pięć razy. Powoduje to usunięcie SLP, które nie znajdują się w mikrostudzienkach.

Następnie chwyć każdy chip macierzy pęsetą i delikatnie strząśnij PBS. Następnie przenieś go do świeżej kąpieli PBS. Górne powierzchnie wiórów muszą pozostać mokre.

Wyjmij wiór z wanny i W precz. Większość PBS z wycieraniem laboratoryjnym. Pozostaw wystarczającą ilość PBS, aby utrzymać nawodnienie macierzy.

Teraz dodaj 200 mikrolitrów roztworu BSA do tablicy, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Pozostawić tablicę do inkubacji przez godzinę. W nawilżonym pudełku później usuń BSA za pomocą mikropipety i dodaj 200 mikrolitrów roztworu toksyny.

Następnie włóż matrycę z powrotem do nawilżonej komory. Odczekaj kolejną godzinę, a następnie umyj macierz PBS i usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczki do kolan. Następnie umieść chip matrycy na standardowym szkiełku mikroskopowym i przymocuj kwadratowy szkiełko nakrywkowy o wymiarach 24 na 40 milimetrów do matrycy i kontynuuj obrazowanie.

Analizę obrazu można przeprowadzić za pomocą obrazu J.Funkcje automatycznej analizy cząstek. Następnie dla każdej tablicy podsumuj średnie intensywności poszczególnych SSB w postaci histogramów. Po zastosowaniu opisanych metod, obszar kwadratowy o wielkości 100 mikronów na tablicy pokazuje 936 SSB.

Podczas gdy dane dotyczące obłożenia zostały obliczone, a histogram intensywności fluorescencji SSLB został wygenerowany po tygodniu przechowywania. Ta sama matryca została ponownie przeanalizowana w ten sam sposób i nie zaobserwowano żadnych zmian w intensywności fluorescencji ani zajętości matrycy. Dzięki opisanym metodom możliwe było również sekwencyjne osadzanie różnych SSB z różnymi markerami identyfikacyjnymi.

Drugie SSB zostały zdeponowane w jednej dziesiątej. Koncentracja pierwszych zdeponowanych SSB. Na potrzeby eksperymentu pokazano nakładkę obu markerów.

Matryce wykonano z SSB o różnych stężeniach genetycznie zmodyfikowanego i wystawiono na działanie stałego stężenia toksyny. Przeprowadzono również odwrotność w celu wyznaczenia stałej dysocjacji równowagi. Dla GM jeden.

Macierze wiążące toksynę mogą być również wykonane z naturalnych błon biologicznych, takich jak ta matryca wykonana z cząsteczek mieliny. Jest oznaczony lipofilowym fluorem cztery FM 1 43. Tratwy lipidowe są wzbogacone w cholesterol i gangliozydy, takie jak GM.

Tak więc sprzężona toksyna Alexa 4 88 silnie wiąże się z mikromacierzami tratw lipidowych, natomiast znakowany fluorescencyjnie pozbawiony Aden nie wiąże się z tymi macierzami. Matryca została stworzona poprzez dostarczenie mieliny i tratw lipidowych do mikrostudzienek za pomocą chipa mikroprzepływowego z kanałami o długości 250 mikronów. Był znakowany anty oligodendrocytami IgM, a siarczek S znajdujący się w mielinie był znakowany, ale tratwy lipidowe nie były.

Nie Po przygotowaniu kulek pokrytych batorem lipidowym. Technika ta może być wykorzystana do przygotowania macierzy w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, po utworzeniu naturalnych matryc cząstek membranowych. Inne metody, takie jak plazma powierzchniowa nanodziur i rezonans, mogą być stosowane do bezznacznikowego wykrywania interakcji biomolekularnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć bio matryce błonowe przy użyciu kulek pokrytych lipidową warstwą żółciową i naturalnych cząstek błony.