Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce
May 8th, 2014
Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie mikromacierzy biomembranowych przy użyciu prostej metody przygotowania. Osiąga się to poprzez pierwsze pokrycie kulek krzemionki dwuwarstwowymi membranami lipidowymi. Drugim etapem procedury jest osadzenie kulek pokrytych lipidem na podłożu silikonowym microwell.
Trzecim krokiem jest usunięcie kulek znajdujących się poza mikro studzienkami za pomocą ściągaczki z polimetylu suboksanu. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie matryc kulek pokrytych lipidami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do określenia stałych wiązania interakcji toksyn lipidowych przy użyciu metody obrazowania matrycowego.
Metoda ta może być stosowana do tworzenia układów sferycznych dwuwarstw lipidowych i naturalnych cząstek błonowych pochodzących z komórek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że oprócz wytwarzania mikrostudzienek, technika ta nie wymaga chemicznej modyfikacji ani substratu, ani błon lipidowych w celu stworzenia przestrzennie zdefiniowanych macierzy biomembranowych. Zastosowania tej techniki można rozszerzyć o bezznacznikowe wykrywanie interakcji białek lipidowych za pomocą plazmy powierzchniowej i rezonansu opartego na nanometrycznych układach metalowych otworów.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje białek lipidowych, może być również stosowana do innych systemów, takich jak badania ogniskowej adhezji komórkowej, matryce mikrodołkowe i preparaty rakli są szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Ten film zaczyna się od przygotowania pęcherzyków. Najpierw w małej szklanej fiolce miesza się lipidy dla pęcherzyków.
W sumie pół miligrama lipidu znajduje się w tym roztworze pod próżnią, wysuszaj mieszaninę przez sześć godzin. Następnie przygotuj 0,1-molowy roztwór chlorku sodu i dodaj pół mililitra do wysuszonych lipidów. Pozostaw mieszaninę do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej.
Następnego dnia zmieszaj mieszaninę, aby zawiesić pęcherzyki. Następnie sonikować mieszaninę przez 20 minut w kąpieli, sonikować w temperaturze pokojowej. Po sonikacji wytłacz zawiesinę przez filtr membranowy z poliwęglanu o długości 100 nanometrów.
Przepuść zawiesinę przez filtr ekstruzyjny w sumie 17 razy. Następnie przechowuj wytłaczane pęcherzyki w szklanej fiolce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przy użyciu kulek dwutlenku krzemu o średnicy 700 nanometrów.
Zrób zawiesinę 15 miliardów kulek w 0,1 molowym chlorku sodu. Zawiesinę należy zwirować, a następnie odwirować w temperaturze 1700 g przez 20 minut i wyrzucić supernatant. Powtórz pranie przez resus, zawieszając kulki w kolejnym mililitrze roztworu soli i obracając je w dół przez kolejne 20 minut.
Następnie powtórz proces po raz trzeci, aby utworzyć sferyczne podparte dwuwarstwy lipidowe lub SSB. Wymieszaj 25 mikrolitrów zawiesiny kulek dwutlenku krzemu z 200 mikrolitrami zawiesiny pęcherzyków z poprzedniej sekcji. Zwirować mieszaninę i podpalić ją, inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę później, odwirować mieszaninę w temperaturze 1700 G przez 20 minut.
Odrzucić supernatant. Granulka jest różowa do pękniętych pęcherzyków z rzędem DPPE na koralikach. Zawiesić go ponownie w 225 mikrolitrach PBS przy pH 7,4.
Powtórz dwukrotnie kroki wirowania i zawieszenia Resus, aby usunąć niepęknięte pęcherzyki i zakończyć tworzenie SSB. Podziel płytki układów mikrodołków na prostokątne kawałki z czterema do sześciu tablic każdy. Następnie odwiruj, zawiesinę SSLB z poprzedniej sekcji i przenieś 10 mikrolitrów do każdej matrycy mikrostudzienek.
Poczekaj godzinę, aż SSB osiągną się później. Delikatnie umyj chipy macierzy za pomocą PBS i zanurz macierz w PBS za pomocą ściągaczki, przesuwając się po powierzchni zanurzonych chipów pięć razy. Powoduje to usunięcie SLP, które nie znajdują się w mikrostudzienkach.
Następnie chwyć każdy chip macierzy pęsetą i delikatnie strząśnij PBS. Następnie przenieś go do świeżej kąpieli PBS. Górne powierzchnie wiórów muszą pozostać mokre.
Wyjmij wiór z wanny i W precz. Większość PBS z wycieraniem laboratoryjnym. Pozostaw wystarczającą ilość PBS, aby utrzymać nawodnienie macierzy.
Teraz dodaj 200 mikrolitrów roztworu BSA do tablicy, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Pozostawić tablicę do inkubacji przez godzinę. W nawilżonym pudełku później usuń BSA za pomocą mikropipety i dodaj 200 mikrolitrów roztworu toksyny.
Następnie włóż matrycę z powrotem do nawilżonej komory. Odczekaj kolejną godzinę, a następnie umyj macierz PBS i usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczki do kolan. Następnie umieść chip matrycy na standardowym szkiełku mikroskopowym i przymocuj kwadratowy szkiełko nakrywkowy o wymiarach 24 na 40 milimetrów do matrycy i kontynuuj obrazowanie.
Analizę obrazu można przeprowadzić za pomocą obrazu J.Funkcje automatycznej analizy cząstek. Następnie dla każdej tablicy podsumuj średnie intensywności poszczególnych SSB w postaci histogramów. Po zastosowaniu opisanych metod, obszar kwadratowy o wielkości 100 mikronów na tablicy pokazuje 936 SSB.
Podczas gdy dane dotyczące obłożenia zostały obliczone, a histogram intensywności fluorescencji SSLB został wygenerowany po tygodniu przechowywania. Ta sama matryca została ponownie przeanalizowana w ten sam sposób i nie zaobserwowano żadnych zmian w intensywności fluorescencji ani zajętości matrycy. Dzięki opisanym metodom możliwe było również sekwencyjne osadzanie różnych SSB z różnymi markerami identyfikacyjnymi.
Drugie SSB zostały zdeponowane w jednej dziesiątej. Koncentracja pierwszych zdeponowanych SSB. Na potrzeby eksperymentu pokazano nakładkę obu markerów.
Matryce wykonano z SSB o różnych stężeniach genetycznie zmodyfikowanego i wystawiono na działanie stałego stężenia toksyny. Przeprowadzono również odwrotność w celu wyznaczenia stałej dysocjacji równowagi. Dla GM jeden.
Macierze wiążące toksynę mogą być również wykonane z naturalnych błon biologicznych, takich jak ta matryca wykonana z cząsteczek mieliny. Jest oznaczony lipofilowym fluorem cztery FM 1 43. Tratwy lipidowe są wzbogacone w cholesterol i gangliozydy, takie jak GM.
Tak więc sprzężona toksyna Alexa 4 88 silnie wiąże się z mikromacierzami tratw lipidowych, natomiast znakowany fluorescencyjnie pozbawiony Aden nie wiąże się z tymi macierzami. Matryca została stworzona poprzez dostarczenie mieliny i tratw lipidowych do mikrostudzienek za pomocą chipa mikroprzepływowego z kanałami o długości 250 mikronów. Był znakowany anty oligodendrocytami IgM, a siarczek S znajdujący się w mielinie był znakowany, ale tratwy lipidowe nie były.
Nie Po przygotowaniu kulek pokrytych batorem lipidowym. Technika ta może być wykorzystana do przygotowania macierzy w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, po utworzeniu naturalnych matryc cząstek membranowych. Inne metody, takie jak plazma powierzchniowa nanodziur i rezonans, mogą być stosowane do bezznacznikowego wykrywania interakcji biomolekularnych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć bio matryce błonowe przy użyciu kulek pokrytych lipidową warstwą żółciową i naturalnych cząstek błony.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę tworzenia mikrosieci membran biologicznych z wykorzystaniem wspartych dwuwarstew lipidowych. Proces polega na powlekaniu kulek krzemianowych dwuwarstew lipidową i ich deponowaniu na podłożu z silikonowych mikropłytek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Chemia analityczna
Tło
- Wspparte dwuwarstwy lipidowe naśladują właściwości membran komórkowych.
- Naturalne cząstki membran mogą być wykorzystywane w różnych strategiach analitycznych.
- Mikrosieci ułatwiają badania interakcji biomolekularnych.
- Mikroskopię fluorescencyjną stosuje się do obrazowania tablic.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody przygotowania mikrosieci membran biologicznych.
- Możliwość określenia stałych wiązania dla interakcji toksyn-lipidów.
- Zwiększenie zdolności analitycznych w badaniu dynamiki membran.
Zastosowane metody
- Powlekanie kulek krzemianowych dwuwarstew lipidową.
- Deponowanie kulek powlekanych lipidami na podłożu z silikonowych mikropłytek.
- Usuwanie kulek nienależących do mikropłytek za pomocą ściągacza z polimetylo suboksanem.
- Obrazowano tablice kul powlekanych lipidami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Udana przygotowanie tablic powlekanych dwuwarstewą lipidową.
- Wykonano obrazowanie tablic kul powlekanych lipidami.
- Potencjalne zastosowanie w badaniach interakcji lipidów z toksynami.
- Podano prostą i efektywną metodologię dla badaczy.
Wnioski
- Metoda umożliwia tworzenie funkcjonalnych mikrosieci membran biologicznych.
- Może być wykorzystywana do różnych zastosowań analitycznych w neuronauce i biologii.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć interakcje badane za pomocą tej metody.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables the creation of stable, high-density supported lipid bilayer arrays for studying biomolecular interactions without chemical modification of substrates or membranes. It supports target validation and assay development by providing a reproducible platform for quantifying ligand-receptor binding, such as cholera toxin to ganglioside GM1, with long-term stability and multiplexing capability. The approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by isolating membrane-specific interactions in a controlled, scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-protein interactions in a defined membrane environment to validate targets like ganglioside GM1.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative binding measurements using fluorescence intensity histograms.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by measuring binding constants in a disease-relevant membrane system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized SLB arrays with >75% well occupancy and consistent fluorescent readouts for reliable compound screening.
- Reproducibility: Maintains signal stability over one week, enabling longitudinal assay performance and cross-run comparison.
- Multiplexing Capability: Allows serial deposition of different SSLBs to profile multiple lipid targets in a single array format.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses natural membrane particles (e.g., myelin-derived lipid rafts) to study cell-specific membrane components in pathophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling biomarker-aligned assays, such as ganglioside enrichment in lipid rafts.
- Risk De-risking: Supports go/no-go decisions by providing predictive binding data from native-like membranes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lipid-mediated mechanisms by isolating bilayer properties from cellular complexity.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via fluorescence intensity of individual SSLBs for hit confirmation.
- Analytics: Enables binding constant determination through histogram analysis of SSB intensities under varying ligand concentrations.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by using natural membrane particles to reflect disease-relevant lipid composition.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple targets via sequential deposition without substrate re-functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions by reducing false positives from non-specific binding.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through bead-based self-assembly and squeegee purification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content screening with minimal reagent consumption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane targets based on quantitative interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation, bead functionalization, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to microfabricated microwell arrays and controlled extrusion equipment for vesicle sizing.
- Necessitates standardization of washing and blocking steps (e.g., BSA incubation) to minimize noise across arrays.
- Adaptation to different membrane systems requires optimization of bead-to-lipid ratios and incubation times.
- Practical limitation: Array occupancy is typically >75%, leaving some wells empty, which must be accounted for in data analysis.
