Name: Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę tworzenia mikromacierzy biomembranowych z wykorzystaniem kulek krzemionkowych pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta umożliwia badanie interakcji toksyna-lipidy w neurobiologii i biofizyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla S.H.O. z National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF CAREER Award i DBI 0964216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program oraz Minnesota Partnership Award for Biotechnology and Medical Genomics. Produkcja urządzenia została przeprowadzona w University of Minnesota Nanofabrication Center (NFC), które otrzymuje wsparcie od NSF za pośrednictwem National Nanotechnology Infrastructure Network. Praca ta była również wspierana przez granty dla M.R. z National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), Applebaum, Hilton, Peterson and Sanford Foundations oraz rodziny McNeilus. Autorzy pragną podziękować Hyungsoon Im za pomoc przy ilustracjach oraz Shailabh Kumar za pomoc w skaningowej mikroskopii elektronowej.

1. Mikrofabrykacja podłoża do tablicy Microwell
<ol>
	<li>Zacznij od 4-calowej płytki krzemowej ze 100 nm termicznie wyhodowanego tlenku.</li>
	<li>Wirować fotorezystem SPR-955 0,7 na płytce z prędkością 4 000 obr./min przez 30 sek.</li>
	<li>Piec na płycie grzewczej w temperaturze 115 °C przez 90 sekund.</li>
	<li>Eksponuj fotorzyst.
	<ol>
		<li>Użyj maski, która utworzy otwory o wielkości 1 μm ułożone w sześciokątny układ z okresem 3 μm, gdzie tablica obejmuje obszar o wymiarach 2 mm x 2 mm.</li>
		<li>Naświetl płytkę w stepperze i-line, używając kroku o wielkości 6 mm i ekspozycji 200 mJ/cm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Piec na płycie grzewczej w temperaturze 115 °C przez 90 sekund.</li>
	<li>Wywołaj za pomocą wywoływacza wirowego, aby umieścić 2 kałuże CD-26 na płytce krzemowej, co daje łączny czas wywoływania 90 sekund.</li>
	<li>Dokładnie spłucz ultraczystą wodą DI i osusz N2.</li>
	<li>Wytrawiaj tlenek w wytrawiaczu jonów reaktywnych przez 6 minut z 50 sccm Ar, 25 sccm CF4 i 50 sccm CHF3 płynących pod ciśnieniem 75 mTorr.</li>
	<li>Wytrawiaj krzem w wytrawiaczu jonowym ICP do głębokich rowów przez 2 minuty z 63 sccm C4F8, 27 sccm SF6, 40 sccm Ar i 10 sccm O2 płynących pod ciśnieniem 14 mTorr.</li>
	<li>Spłucz acetonem, metanolem i izopropanolem, aby usunąć opór.</li>
	<li>Umieścić w kąpieli o natężeniu H2SO4:H2O2 1:1 na 10 min w celu oczyszczenia powierzchni.</li>
	<li>Dokładnie spłucz ultraczystą wodą DI i osusz N2.</li>
	<li>Osadzanie 1,080 A z Al2O3 przez osadzanie warstw atomowych w temperaturze 250 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ściągaczki z poli(dimetylosiloksanu)
<ol>
	<li>Jeśli to możliwe, pracuj w pomieszczeniu czystym. W przeciwnym razie pracuj w możliwie najczystszym środowisku.</li>
	<li>Zaopatrz się w plastikową szalkę Petriego (lub inny czysty pojemnik jednorazowego użytku) o bokach ≥13 mm.</li>
	<li>W tym naczyniu wlej 5 g utwardzacza PDMS, a następnie 50 g środka bazowego PDMS (lub czegokolwiek o proporcjach 1:10, co w większości wypełni szalkę Petriego). Dokładnie wymieszaj jednorazową plastikową pipetą lub prętem.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki, umieszczając zmieszany PDMS w komorze z linią próżniową, stosując próżnię, aż pęcherzyki wyjdą z mieszaniny (około 30 min).</li>
	<li>Jeśli nie znajduje się jeszcze na szalce Petriego, wlej PDMS na szalkę Petriego, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Utwardzać przez noc na płycie grzejnej w temperaturze >50 °C (działa również wyższa temperatura przez krótszy czas).</li>
	<li>Za pomocą nowej/czystej żyletki ostrożnie przytnij prostokątny kawałek o wymiarach około 2.5 x 2.5 cm, utrzymując górną powierzchnię tak czystą, jak to możliwe. Usuń czystymi kleszczami. Odetnij jedną krawędź (do 1,5 cm), naciskając żyletkę jednym ruchem, aby górna krawędź była jak najbardziej ostra (będzie to krawędź używana w procesie ściągania).</li>
	<li>Oczyść acetonem, metanolem, alkoholem izopropylowym i ultraczystą wodą DI, a następnie wysusz czystym azotem. Przechowywać na czystej szalce Petriego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pęcherzyków
<ol>
	<li>Zebrać podstawowe roztwory lipidów zawierające 25 mg/ml fosfatydylocholiny jaj (PC) i 1 mg/ml soli 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(lisaminy, rodaminy, B-sulfonylo) amonowej (Rho-DPPE) w chloroformie oraz 0,5 mg/ml roztworu podstawowego monosialogangliozydu GM1 w chloroformie/metanolu (2:1 v/v).</li>
	<li>W małej szklanej fiolce przygotuj mieszaninę, która daje 97% mol PC, 2 mol% GM1 i 1 mol% Rho-DPPE, dodając 18,9 μl 25 mg / ml PC, 39,6 μl 0,5 mg / ml GM1 i 7,9 μl 1 mg / ml Rho-DPPE za pomocą szklanych strzykawek.</li>
	<li>Uwaga: Materiał uzupełniający dla Nair et al.25 zawiera doskonały, konfigurowalny arkusz kalkulacyjny Excel do obliczania ilości lipidów potrzebnych do stworzenia pęcherzyków o dowolnym pożądanym składzie.</li>
	<li>Umieścić fiolkę w eksykatorze próżniowym i usunąć rozpuszczalnik, pozostawiając fiolkę w próżni na 6 godzin.</li>
	<li>Przygotować roztwór wodny o stężeniu 0,1 M NaCl. Dodać 0,5 ml 0,1 M roztworu NaCl do fiolki zawierającej wysuszony film lipidowy.</li>
	<li>Pozostaw wodną mieszaninę lipidów na noc.</li>
	<li>Krótko zmieszaj wir, aby utworzyć zawiesinę pęcherzyków, a następnie sonikuj przez 20 minut w sonikatorze do kąpieli w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wytłacz zawiesinę pęcherzyków przez membranę poliwęglanową o wielkości porów 100 nm. Przepuścić zawiesinę pęcherzyków przez filtr 17x.</li>
	<li>Przechowywać wytłaczane pęcherzyki w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C. </li>
</ol>
4. Tworzenie sferycznych dwuwarstw lipidowych
<ol>
	<li>Zbierz kulki SiO2 o średnicy 700 nm. Koraliki są dostarczane w wodzie destylowanej o stężeniu podstawowym 1,4 x 1011 kulek/ml.</li>
	<li>W probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml przygotuj zawiesinę o stężeniu 1,5 x10 10 kulek/ml, dodając 107 μl roztworu podstawowego kulek do 893 μl 0,1 M NaCl.</li>
	<li>Odwiruj zawiesinę, aby upewnić się, że jest dobrze wymieszana.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 1 700 x g przez 20 minut, a następnie odrzucić supernatant. Zawiesić kulki w 1 ml 0,1 M NaCl. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby dokładnie umyć koraliki.</li>
	<li>Aby utworzyć SSLBs, w 1,5 ml probówce Eppendorfa dodać 25 μl zawiesiny kulek SiO2 do 200 μl zawiesiny pęcherzyków o stężeniu 1 mg/ml. Zmieszaj mieszaninę i odstaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na tym etapie stężenie SSLB powinno wynosić 1,7 x 109 SSLBs/ml.</li>
	<li>Wirować przy 1 700 x g przez 20 minut w celu osadzania SSLBs. Granulka powinna wydawać się różowa z powodu pęknięcia pęcherzyków z Rho-DPPE na kulkach.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 225 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH = 7,4. Powtórz kroki 4.6-4.7 jeszcze dwa razy, aby usunąć wszelkie niepęknięte pęcherzyki z zawiesiny SSLB.</li>
</ol>
5. Montaż tablicy SSLB
<ol>
	<li>Rozszczepić płytkę z układami mikrodołków, w wyniku czego uzyskuje się prostokątne kawałki z 4-6 matrycami mikrodołków na sztukę.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę SSLB, a następnie umieść 10 μl zawiesiny SSLB na każdym układzie mikrodołków. Nie odpoczywaj przez 1 godzinę, aby SSLB mogły osiąść na powierzchni.</li>
	<li>Delikatnie umyj chip układu mikrostudzienkowego PBS z butelki do mycia, a następnie zanurz w kąpieli PBS przygotowanej w płytkim naczyniu.</li>
	<li>Po zanurzeniu delikatnie umieść ściągaczkę PDMS równo z chipem macierzy mikrodołków i delikatnie przesuń ją po powierzchni 5x, aby usunąć SSLB, które nie są unieruchomione w mikrodołkach.</li>
	<li>Chwyć chip układu mikrostudzienkowego pęsetą i delikatnie potrząśnij w kąpieli PBS, aby usunąć nadmiar SSLB.</li>
	<li>Szybko wyjmij wiór z wanny ściągaczki i umieść w świeżej kąpieli PBS do dalszego użycia. Upewnij się, że górna powierzchnia chipa pozostaje mokra, aby zachować SSLB.</li>
</ol>
Uwaga: Opisana powyżej metoda montażu może być użyta do stworzenia tablic naturalnych cząstek błony, takich jak cząsteczki mieliny wyizolowane z mózgu myszy lub pęcherzyki fosfolipidowe bez podparcia kulki SiO2. Praca ta została szczegółowo opisana w Wittenberg et al.21 i reprezentatywne wyniki przedstawiono poniżej.
6. Test wiązania toksyny
<ol>
	<li>Przygotować roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml w PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór o pożądanym stężeniu podjednostki B sprzężonej z toksyną Alexa 488 w PBS z 2 mg/ml BSA.</li>
	<li>Wyjmij chip macierzy SSLB z kąpieli PBS i odchodź większość roztworu PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Pozostaw na chipie tylko tyle PBS, aby utrzymać nawodnienie tablicy SSLB.</li>
	<li>Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, dodaj 200 μl roztworu BSA 2 mg/ml do układu macierzy SSLB. Odstaw na 1 godzinę w nawilżonym pudełku.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety usuń 200 μl roztworu z górnej części układu matrycy SSLB.</li>
	<li>Dodaj 200 μl roztworu toksyny do chipa macierzy SSLB i odstaw na 1 godzinę w wilgotnym pudełku.</li>
	<li>Delikatnie umyj chip macierzy SSLB za pomocą PBS z butelki do mycia, aby usunąć niezwiązaną toksynę.</li>
	<li>Usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Przed obrazowaniem należy przykryć chip z szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 40 mm.</li>
	<li>Matryce obrazowe za pomocą mikroskopu pionowego przy użyciu zestawów filtrów odpowiednich dla interesujących nas fluoroforów.</li>
	<li>Analizuj intensywność fluorescencji poszczególnych SSLB w macierzy za pomocą funkcji automatycznej analizy cząstek w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	<li>Skompiluj średnie intensywności fluorescencji z poszczególnych SSLB w histogramy, które podsumowują intensywności SSLB znalezionych na danej tablicy.</li>
</ol>

<ol><li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery%3A+A+Historical+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug discovery: A Historical Perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).</li>
<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Membrane+Receptor+Screening+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis.</a> J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).</li>
<li>Voskuhl, J., Ravoo, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Recognition+of+Bilayer+Besicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular Recognition of Bilayer Besicles.</a> Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Supported+Lipid+Bilayers%3A+From+Biophysical+Studies+to+Sensor+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design.</a> Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).</li>
<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Steps+of+Supported+Bilayer+Formation+Probed+by+Single+Vesicle+Fluorescence+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays.</a> Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
<li>Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+Mono-+and+Bilayer+Lipid+Membranes+on+Au+and+Hg%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg.</a> Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).</li>
<li>Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Coherent+anti-Stokes+Raman+Scattering+Imaging+of+Lipid+Distribution+in+Coexisting+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains.</a> Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).</li>
<li>Richter, R. P., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+Formation+of+Supported+Lipid+Bilayers+on+Mica%3A+A+Study+Combining+AFM%2C+QCM-D%2C+and+Ellipsometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry.</a> Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).</li>
<li>Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Surface+Plasmon+Resonance+Sensing+of+Lipid-Membrane-Mediated+Biorecognition+Events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+Lipid+Membranes+Analyzed+with+High-Resolution+Secondary+Ion+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry.</a> Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).</li>
<li>Groves, J. T., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropattern+Formation+in+Supported+Lipid+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes.</a> Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).</li>
<li>Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+and+Lipid+Bilayer+Arrays+Towards+Biosensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications.</a> Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+in+Studies+on+Immune+Cell+Adhesion+and+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication.</a> J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.</li>
<li>Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Phospholipid+Bilayer-Coated+Microchannels+for+On-Chip+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays.</a> Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).</li>
<li>Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+Fluid+Lipid+Bilayers+on+Solid+Supports%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports.</a> Science. 275 (5300), 651-653 (1997).</li>
<li>Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+Composition+Arrays+of+Supported+Lipid+Bilayers+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing.</a> Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).</li>
<li>Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Photochemical+Patterning+and+Refunctionalization+of+Supported+Phospholipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).</li>
<li>Kelly, C. V., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofabrication+for+the+Analysis+and+Manipulation+of+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).</li>
<li>Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Arrays+of+Submicron+Spherical+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers.</a> Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).</li>
<li>Wittenberg, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Assembly+of+Micro-+and+Nanoarrays+for+Sensing+with+Natural+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes.</a> ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).</li>
<li>Kalyankar, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arraying+of+Intact+Liposomes+into+Chemically+Functionalized+Microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells.</a> Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).</li>
<li>Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Self-Assembly+of+Single+Lipid+Vesicles+in+Nanoplasmonic+Apertures+in+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold.</a> Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).</li>
<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Patterned+Supported+Lipid+Membranes+to+Investigate+the+Role+of+Receptor+Organization+in+Intercellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling.</a> Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
<li>Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+Toxin+Binding+Affinity+and+Specificity+for+Gangliosides+Determined+by+Surface+Plasmon+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance.</a> Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).</li>
<li>Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-Sized+Supported+Lipid+Bilayer+Arrays+for+Bacterial+Toxin+Binding+Studies+Through+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).</li>
<li>Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1+Clustering+Inhibits+Cholera+Toxin+Binding+in+Supported+Phospholipid+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).</li>
<li>Gill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arrangement+of+Subunits+in+Cholera+Toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin.</a> Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).</li>
<li>Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Supported+Lipid+Bilayers+Containing+Monosialoganglioside+GM1%3A+A+QCM-D+and+FRAP+study%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study.</a> Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).</li>
<li>Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+Optic+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibre Optic Microarrays.</a> Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).</li>
<li>Bake, K. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Spectroscopic+Detections%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Spectroscopic Detections.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).</li>
<li>Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Monitoring+of+Lipid+Transfer+Between+Vesicles+and+Hybrid+Bilayers+on+Au+Nanoshells+Using+Surface+Enhanced+Raman+Scattering+%28SERS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).</a> Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).</li>
<li>Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Properties+of+Nanohole+Arrays+in+Metal-Dielectric+Double+Films+Prepared+by+Mask-on-Metal+Colloidal+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography.</a> ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).</li>
<li>Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Plasma+Membrane+Compartmentalization+with+Patterned+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).</li>
<li>Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
<li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

W tej pracy pokazujemy, że monodyspersyjne kulki SiO2 pokryte podpartymi dwuwarstwami lipidowymi mogą być układane w układy mikrodołkowe bez potrzeby celowania w ligandy na dwuwarstwach lipidowych lub powierzchni substratu, a tablice można wykorzystać do charakteryzowania interakcji toksyna-lipid. Stała dysocjacji, którą obliczyliśmy dla wiązania CTx/GM1, wypada korzystnie, biorąc pod uwagę dużą rozbieżność wartości w literaturze, z poprzednim raportem Wintera i wsp., w którym do obliczenia stałej dys...

Dwuwarstwowe błony lipidowe są niezbędnymi strukturami w przyrodzie. Komórkowe błony plazmatyczne i błony organelli składają się z dwuwarstw lipidowych, które zawierają szereg cząsteczek niezbędnych do życia. Wiele procesów podtrzymujących życie zachodzi na powierzchni komórek lub jest zapośredniczonych przez cząsteczki związane z błonami dwuwarstwowymi lipidów. W rzeczywistości wiele farmaceutyków ukierunkowanych na procesy lub cząsteczki znajdują się na błonach lub w błonach1,2. Dlatego konieczne jest analityczne badanie procesów, takich jak reakcje chemiczne lub niekowalencyjne wiązania, które zachodzą na powierzchniach membrany. Ponieważ naturalne membrany mogą być trudne do odizolowania i/lub współpracy z czujnikami, wielu badaczy wykorzystuje uproszczone membrany modelowe do przeprowadzania badań analitycznych. W literaturze opisano szereg modelowych systemów membranowych, począwszy od gigantycznych pęcherzyków, które mogą mieć średnicę od dziesiątek do setek mikronów, po liposomy o wymiarachw skali nano 3,4. Alternatywnie, płaskie dwuwarstwy lipidowe osadzone na stałych podłożach, tj. podparte dwuwarstwy lipidowe (SLB), mogą być tworzone na wielu różnych powierzchniach i są szeroko stosowane w zastosowaniach biofizycznych, biochemicznych i analitycznych5. Sprzężenie SLB z materiałami elektrycznymi lub optycznymi umożliwia badanie biochemii i biofizyki błon dzięki zastosowaniu różnych technik analitycznych. Mikroskopia fluorescencyjna6, elektrochemia7, spektroskopia optyczna8, mikroskopia sondy skaningowej9, powierzchniowy rezonans plazmonowy10 i spektrometria mas11 zostały wykorzystane do badania struktury i właściwości SLB.
Tablice SLB oferują dodatkową wszechstronność w projektowaniu czujników do testów multipleksowych12,13. Inne aplikacje wykorzystują macierze SLB do naśladowania połączenia, które tworzy się między komórkami odpornościowymi14. Metody przygotowania macierzy SLB były różne, od podejść mikroprzepływowych15 do tych, które wykorzystują fizyczne bariery między sąsiednimi łatami SLB. 16 Inne grupy wykorzystały metody drukowania17, wzorce fotochemiczne18 i różne podejścia nanoinżynieryjne19 do stworzenia matryc SLB.
W tym artykule i towarzyszącym mu filmie demonstrujemy metodę tworzenia tablic SLB poprzez umieszczanie pokrytych SLB kulek SiO2 w uporządkowanych układach mikrodołków20. Kulki SiO2 pokryte SLB nazywamy sferycznymi dwuwarstwami lipidowymi (SSLB). Technika ta jest rozszerzeniem wcześniejszych prac, w ramach których stworzono macierze pęcherzyków fosfolipidowych i błon biologicznych pochodzących ze źródeł naturalnych21, z których pokazujemy również przykładowe wyniki. Inne metody układania cząstek lub pęcherzyków błony biologicznej opierały się na wzorcach specyficznych ligandów docelowych na powierzchniach, które łączą się z komplementarnymi ligandami zawartymi na powierzchni pęcherzyka. Przykłady obejmują asocjację biotyny-awidyny22,23 i schematy hybrydyzacji DNA24. Nasze podejście wymaga jedynie macierzy mikrostudzienek bez konieczności celowania lub rozpoznawania. Rozmiar SSLB jest określony przez średnicę podpór kulkowych SiO2, które mają niską polidyspersyjność. Dostrajając średnicę mikrostudzienki tak, aby była nieco większa niż średnica SSLB, tylko jeden SSLB osadza się w każdej mikrostudzience. Ściągaczka z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) usuwa następnie z powierzchni wszystkie SSLB, które nie są unieruchomione w mikrostudzienkach. Mikrostudzienki i wynikowe matryce SSLB mają wysoką gęstość (~105 SSLB/mm2) z odstępami od środka do środka wynoszącymi 3 μm i okresowością heksagonalną. Poprzez szeregowe osadzanie SSLB o różnym składzie lipidowym, możliwe jest tworzenie wieloskładnikowych macierzy z losowo rozmieszczonymi SSLB. Aby zademonstrować zdolność wykrywania matryc SSLB, wykorzystaliśmy interakcję toksyny (CTx) z gangliozydem (GM1) wbudowanym w SSLB. Dzięki naturalnym cząsteczkom błony byliśmy w stanie wykryć lipidy specyficzne dla komórek w wieloskładnikowych macierzach zawierających materiał błonowy z dwóch różnych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>4-calowe wafle krzemowe</td><td>University Wafer</td><td>425</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0,7 fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td>SPR955-CM</td><td></td></tr><tr><td>Shipley MICROPOSIT CD-26 deweloper</td><td>MicroChem</td><td>CD-26</td><td></td></tr><tr><td>i-line stepper</td><td></td><td>Canon</td><td>2500 i3</td></tr><tr><td>wytrawiacz jonowy reaktywny Vision 320</td><td>Advanced Vacuum</td><td>Vision 320 RIE</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiacz jonów reaktywnych do głębokich rowów</td><td>Plasma Therm</td><td>SLR-770</td><td></td></tr><tr><td>System usuwania warstw atomowych</td><td>Zestaw Cambridge NanoTech</td><td>Savannah</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 poli(dimetylosiloksan)</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>184 ZESTAW SIL ELAST 0,5 KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatydylocholina jaj</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>Sól 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina, rodamina, B, sulfonylo)amonowa</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C</td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM1</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860065P</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki krzemionkowe</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS03N/4666</td><td>Opakowanie na pojemniku na koraliki informuje, że koraliki mają średnicę 900 nm. Jednak po rozpraszaniu światła i mikroskopii elektronowej ustaliliśmy, że kulki mają średnicę około 700 nm.</td></tr><tr><td>Podjednostka B toksyny, sondogat molekularny Alexa 488</td><td></td><td>C-34775</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyoligodentrocytowe IgM O4, koniugat NorthernLights 557</td><td>R& D Systems</td><td>NL1326R</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>FM1-43</td><td>T-3136</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf MiniSpin</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-09</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Dwuwarstwowe błony lipidowe tworzą błony plazmatyczne komórek i wyznaczają granice organelli subkomórkowych. W naturze błony te są niejednorodnymi mieszaninami wielu rodzajów lipidów, zawierają białka związane z błoną i są ozdobione węglowodanami. W niektórych eksperymentach pożądane jest oddzielenie właściwości biofizycznych lub biochemicznych dwuwarstwy lipidowej od właściwości naturalnej błony. Takie przypadki wymagają zastosowania systemów modelowych, takich jak gigantyczne pęcherzyki, liposomy lub podparte dwuwarstwy lipidowe (SLB). Matryce SLB są szczególnie atrakcyjne do zastosowań detekcyjnych i naśladowania interakcji komórka-komórka. W tym miejscu opisujemy nową metodę tworzenia tablic SLB. Kulki SiO2 o średnicy submikronowej są najpierw powlekane dwuwarstwami lipidowymi, tworząc kuliste SLB (SSLB). Kulki są następnie umieszczane w szeregu mikrostudzienek o średnicy submikronowej. Technika przygotowania wykorzystuje "ściągaczkę" do czyszczenia powierzchni podłoża, pozostawiając jednocześnie SSLB, które osiadły w mikrostudzienkach. Metoda ta nie wymaga modyfikacji chemicznej substratu mikrostudzienki ani żadnych szczególnych ligandów docelowych na SSLB. Mikrostudzienki są zajęte przez pojedyncze koraliki, ponieważ średnica studzienki jest dostrojona tak, aby była nieco większa niż średnica koralików. Zazwyczaj ponad 75% studni jest zajętych, podczas gdy reszta pozostaje pusta. W buforze tablice SSLB wykazują długoterminową stabilność większą niż jeden tydzień. Wiele typów SSLB można umieścić w jednej macierzy przez osadzanie szeregowe, a tablice mogą być używane do wykrywania, co demonstrujemy, charakteryzując interakcję toksyny z gangliozydem GM1. Pokazujemy również, że pęcherzyki fosfolipidowe bez podpór kulek i błony biologiczne ze źródeł komórkowych można ułożyć w układ tą samą metodą i można zidentyfikować lipidy błonowe specyficzne dla komórki.

Gdy kulki SiO2 zostaną zmieszane z roztworem pęcherzyków składających się z fosfolipidów, lipidów fluorescencyjnych i innych lipidów, takich jak gangliozydy, pęcherzyki pękają na powierzchniach kulek SiO2, tworząc SSLB, co przedstawiono schematycznie na Rysunku 1a. Po przemyciu SSLB, kropla roztworu SSLB jest nanoszona na macierz mikroszczelin, a kulki opadają na jej powierzchnię (Rysunek 1b1). Można to również przeprowadzić z zawiesiną pęcherzyków fosfolipidowych l...

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mikromacierzy błon biologicznych przy użyciu prostej metody przygotowania. Osiąga się to najpierw poprzez powlekanie kulek krzemionkowych błonami lipidowymi typu dwuwarstwy. Drugim krokiem procedury jest naniesienie kulek powleczonych lipidami na podłoże silikonowe z mikrootworami.Trzecim krokiem jest usunięcie kulek znajdujących się poza mikrootworami za pomocą ściągaczki z polidimetylosiloksanu. Ostatnim krokiem jest obrazowanie macierzy kulek pokrytych lipidami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie metodę tę można wykorzystać do wyznaczenia stałych wiązania w interakcjach toksyna-lipid z wykorzystaniem podejścia opartego na obrazowaniu macierzy.Niniejszą metodę można wykorzystać do tworzenia macierzy sferycznych wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz naturalnych cząstek błonowych pochodzących z komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że poza wykonaniem mikrootworów, technika ta nie wymaga żadnej modyfikacji chemicznej ani podłoża, ani błon lipidowych w celu stworzenia przestrzennie zdefiniowanych macierzy biomembran. Zastosowania tej techniki można rozszerzyć na bezznakową detekcję oddziaływań białko-lipid przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego w oparciu o nanometryczne macierze otworów metalicznych.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat oddziaływań białek z lipidami, można ją również zastosować do innych układów, np. w badaniach nad komórkowymi adhezjami ogniskowymi. Przygotowanie macierzy mikrodofków oraz preparatów metodą „squeegee” zostało szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Niniejsze wideo rozpoczyna się od przygotowania pęcherzyków. Najpierw w małej szklanej fiolce wymieszaj lipidy wchodzące w skład pęcherzyków.W roztworze znajduje się łącznie 0,5 mg lipidów; mieszaninę należy poddać suszeniu w desykatorze próżniowym przez sześć godzin. Następnie należy przygotować 0,1 M roztwór chlorku sodu i dodać 0,5 mL do wysuszonych lipidów. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego dnia wymieszać zawiesinę za pomocą wstrząsarki vortex, aby zawiesić pęcherzyki. Następnie sonikować mieszaninę przez 20 minut w kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej. Po sonikacji przepuścić zawiesinę przez filtr membranowy z poliwęglanu o porach 100 nm.Przepuść zawiesinę przez filtr do ekstruzji łącznie 17 razy. Następnie przechowuj ekstrudowane pęcherzyki w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C. W pierwszej kolejności użyj kulek z dwutlenku krzemu o średnicy 700 nm.Przygotować zawiesinę 15 miliardów kulek w 0,1 molarnym roztworze chlorku sodu. Zawiesinę wymieszać na wortexie, a następnie odwirować przy 1700 Gs przez 20 minut i usunąć nadsącz. Powtórzyć proces płukania, resuspendując kulki w kolejnym mililitrze roztworu soli i wirując je przez kolejne 20 minut.Następnie powtórz ten proces po raz trzeci, aby utworzyć sferyczne podparte dwuwarstwy lipidowe (SSB). Wymieszaj 25 µL zawiesiny kulek dwutlenku krzemu z 200 µL zawiesiny pęcherzyków z poprzedniej sekcji. Wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie odwiruj mieszaninę przy 1700 Gs przez 20 minut.Odlej nadsącz. Osad ma różowy kolor ze względu na pęknięte pęcherzyki z DPPE na kuleczkach. Resuspenduj go w 225 µL PBS o pH 7.4.Powtórz dwukrotnie etapy wirowania i resuspensji w buforze Resus, aby usunąć niepęknięte pęcherzyki i zakończyć proces tworzenia SSBs. Podziel płytki z matrycami mikrootworów na prostokątne fragmenty, z których każdy zawiera od czterech do sześciu matryc. Następnie wymieszał w wirówce (vortex) zawiesinę SSLB z poprzedniej sekcji i przenieś 10 µL do każdej matrycy mikrootworów.Odczekać godzinę, aż SSBs opadną. Delikatnie przemyć chipy matrycy roztworem PBS, a następnie zanurzyć matrycę w PBS, przesuwając ściągaczką po powierzchni zanurzonych chipów pięć razy. Pozwala to usunąć SLPs znajdujące się poza mikrootworami.Następnie należy chwycić każdy chip macierzy pęsetą i delikatnie strząsnąć PBS. Potem należy przenieść go do nowej kąpieli z PBS. Górne powierzchnie chipów muszą pozostać wilgotne.Wyjmij chip z kąpieli i usuń większą część PBS za pomocą ręcznika laboratoryjnego. Pozostaw wystarczającą ilość PBS, aby utrzymać nawilżenie matrycy.Teraz należy dodać do matrycy 200 µL roztworu BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Pozostawić matrycę do inkubacji na jedną godzinę. Następnie, w komorze wilgotnościowej, usunąć BSA za pomocą mikropipety i dodać 200 µL roztworu toksyny cholery.Następnie należy przenieść matrycę z powrotem do komory nawilżającej. Odczekać kolejną godzinę, a następnie przemyć matrycę roztworem PBS i usunąć nadmiar PBS za pomocą chłonnej chusteczki. Następnie chip matrycy należy umieścić na standardnym szkiełku przedmiotowym, przykryć matrycę szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 na 40 mm i przystąpić do obrazowania.Analizę obrazu można przeprowadzić za pomocą funkcji automatycznej analizy cząstek w programie ImageJ. Następnie dla każdej macierzy należy zestawić średnie intensywności poszczególnych SSB w formie histogramów. Po zastosowaniu opisanych metod, obszar o wymiarach 100 µm kwadrat na macierzy wykazuje 936 SSB.Po tygodniu przechowywania obliczono dane dotyczące zajętości i wygenerowano histogram intensywności fluorescencji SSLB. Tę samą macierz poddano ponownej analizie w ten sam sposób i nie stwierdzono zmian w intensywności fluorescencji ani w zajętości macierzy. Opisane metody umożliwiły również sekwencyjne osadzanie różnych SSB z różnymi markerami identyfikacyjnymi.Drugie SSB naniesiono w stężeniu 1/10 stężenia pierwszych naniesionych SSB. Dla jednego z doświadczeń przedstawiono nałożenie obu markerów.Układy przygotowano z wykorzystaniem SSB z różnymi stężeniami GM one, które następnie poddano działaniu stałego stężenia toksyny cholerycznej. Przeprowadzono również procedurę odwrotną w celu wyznaczenia stałej dysocjacji równowagowej dla GM one.Tablice wiążące toksynę cholery mogą być również tworzone z naturalnych biomembran, jak w przypadku tej tablicy wykonanej z cząsteczek mieliny. Jest ona znakowana lipofilowym fluoroforem FM 1 43. Trąbki lipidowe są wzbogacone w cholesterol oraz gangliozydy, takie jak GM one.W ten sposób toksyna cholery sprzężona z Alexa 4 88 silnie wiąże się z mikrotablicami tratw lipidowych, podczas gdy w przeciwieństwie do niej, znakowany fluorescencyjnie stripped Aden nie wiąże się z tymi tablicami. Tablicę przygotowano poprzez dostarczenie mieliny i tratw lipidowych do mikrowydzieleń za pomocą chipu mikroprzepływowego z kanałami o szerokości 250 micron. Została ona znakowana przeciwciałem IgM przeciwko oligodendrocytom; znakowano również siarkę S obecną w mielinie, natomiast tratwy lipidowe nie zostały znakowane.Po przygotowaniu kulek powlekonych lipidami, technikę tę można wykorzystać do przygotowania macierzy w ciągu godziny, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo, po utworzeniu macierzy naturalnych cząstek błonowych. Inne metody, takie jak powierzchniowy plazmon rezonansowy z nano-otworami, mogą być stosowane do bezetykietowego wykrywania oddziaływań biomolekularnych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia macierzy biomembran z wykorzystaniem kulek pokrytych lipidową dwuwarstwą żółciową oraz naturalnych cząstek błonowych.

formation-biomembrane-microarrays-with-squeegee-based-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Formowanie mikrosieci biobłon z metodą montażu z użyciem squeegee

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Poznaj metodę tworzenia mikromacierzy biomembranowych z wykorzystaniem kulek krzemionkowych pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta umożliwia badanie interakcji toksyna-lipidy w neurobiologii i biofizyce.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Przeglądaj więcej filmów