Name: Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta pozwala badać ruchliwość boczną białek błonowych bez konieczności fluorescencyjnego znakowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Beate Nitschke za pomoc w przygotowaniu białka oraz Robin Ghosh, Michaelowi Schweikertowi (Stuttgart) i Maximilanowi Ulbrichowi (Freiburg) za wnikliwe dyskusje. Prace te były wspierane przez Centrum Badawcze Biologii Systemów w Stuttgarcie (SRCSB) oraz grant Fundacji Badenii-Wirtembergii (BiofMO-6 do SN).

Oświadczamy, że nie występujemy w przypadku konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół stanowi wprowadzenie do stosowania membran DIB do badania wzajemnych zależności między bocznym ruchem kanałów jonowych a funkcją kanału za pomocą mikroskopii TIRF pojedynczej cząsteczki. Aby uzyskać jak najlepsze dane, przygotowanie stabilnych membran DIB z jak największą liczbą dobrze oddzielonych kanałów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania szeregów czasowych pojedynczych cząstek, które można zadowalająco analizować.
Krytyczne parametry, które należy zoptymalizować, obejmują wybór lipidów, stężenie lipidów w fazie olejowej oraz stężenia białka i detergentu w kropelkach wody. Zastosowane lipidy są niezwykłe, ponieważ nie wykazują wyraźnej przemiany fazowej w niskich temperaturach. DPhPC jest powszechnie stosowanym lipidem do produkcji stabilnych systemów błonowych40. W zasadzie każdy lipid, który utrzymuje swoje płynne środowisko w niskich temperaturach, może być odpowiedni do tego zastosowania. Ponadto lipid nie powinien być wrażliwy na utlenianie. Stężenie detergentu w kropelkach powinno być jak najniższe, aby uniknąć pęknięcia membrany. Stabilne błony i dobre wskaźniki wchłaniania białek są na ogół osiągane przy stężeniach detergentów poniżej krytycznego stężenia miceli (cmc), biorąc pod uwagę, że białko błonowe nie wytrąca się.
Jeśli błony DIB nie tolerują określonych detergentów21,41 lub jeśli białka nie integrują się z roztworem o niskiej zawartości detergentu z błonami DIB, kanały białkowe mogą najpierw zostać odtworzone w małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (SUV), które są następnie łączone z błonami DIB od strony kropli, jak to z powodzeniem wykazano w przypadku E. coli MscL42. Czasami błony DIB nie powstają, ponieważ stężenie lipidów w fazie olejowej jest zbyt niskie. Aby zapobiec pękaniu membran DIB, należy również pamiętać, że ciśnienie osmotyczne między hydrożelem a kroplą musi być precyzyjnie zrównoważone, bez nadmiernego wpływu na strumień Ca2+ od cis do trans. Zoptymalizowana grubość agarozy i rozmiar oczek wydają się być kluczowe dla obserwacji dyfuzji białek błonowych. Należy unikać wysuszania warstwy agarozy. Grubość można określić za pomocą mikroskopii sił atomowych17. Zmieniając stężenie, objętość i prędkość obrotową agarozy podczas powlekania wirowego, można zoptymalizować rozmiar i grubość oczek hydrożelu. Należy jednak pamiętać, że grubość warstwy hydrożelu wpływa na kontrast obrazu. Aby wychwycić białka błonowe w DIB, hydrożel agarozowy można zastąpić specjalnie zsyntetyzowaną, nieusieciowaną, zmodyfikowaną Ni-NTA, niskotopliwą agarozą, aby uwięzić je za pomocą znacznika Hisa17. Zbyt wysokie tło fluorescencyjne jest często spowodowane pęknięciem błon DIB. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku komór wielodołkowych, ponieważ barwnik wrażliwy na Ca2+ dyfunduje do hydrożelu. W takim przypadku należy unikać sąsiednich studni. Barwienie fluorescencyjne barwnika wrażliwego na Ca2+ nad membraną nie powinno być istotnym czynnikiem ograniczającym, ponieważ jest ono wymieniane przez niewzbudzone barwniki w większości kropelki (ryc. 3A) poza polem ulotnym TIRF. Precyzja lokalizacji białka zależy od dokładności dopasowania plamek i rozmiaru piksela.
Słabe sygnały fluorescencyjne mogą być spowodowane niskim strumieniem Ca2+ przez kanał. Możliwe przyczyny to: (i) niedokładne ustawienia TIRF (np. intensywność lasera), (ii) ciśnienie osmotyczne Ca2+ na membranie lub (iii) wewnętrzna przepuszczalność Ca2+ kanałów jest zbyt niska. Aby poradzić sobie z pierwszym problemem, należy zoptymalizować intensywność lasera, kąt TIRF i wzmocnienie kamery. Te dwa ostatnie problemy można przezwyciężyć poprzez zastosowanie potencjału elektrycznego w poprzek membrany 2,43. Jednak zastosowanie napięć zewnętrznych może zniekształcić wynik, ponieważ efekty elektryczne mogą wpływać na otwarcie kanałów jonowych bramkowanych ligandem lub mechanowrażliwych, które w rzeczywistości nie są kontrolowane napięciem. Przykładami takich kanałów są mitochondrialna translokaza białkowa TOM-CC27 i jej podjednostka tworząca kanały Tom40 26,44,45,46. Na koniec należy zauważyć, że wprowadzanie białek błonowych do błon DIB w określonej orientacji w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności jest trudne, a badania ilościowe są rzadkie47,48. W niektórych przypadkach orientacja zintegrowanych białek jest przypadkowa. Jest to poważny problem w badaniu białek błonowych, ponieważ niektóre białka błonowe są aktywowane tylko po jednej stronie błony.
Mikroskopia TIRF jest potężną metodą rozwiązywania zdarzeń pojedynczych cząsteczek w błonach o podłożu płaskim49. Przykłady obejmują wyjaśnienie szlaku składania i fałdowania białek kanałowych, takich jak α-hemolizyna50, perfringolizyna O51 i OmpG52. W badaniach tych uwzględniono FRET jako technikę dodatkową. Ponadto aktywacja mechanowrażliwego kanału jonowego MscL była wcześniej badana poprzez mechaniczną stymulację wspieranych dwuwarstw DIB42 przy użyciu pomiarów prądu. Opierając się na tych pracach, przyszłe badania mogą połączyć opisaną tutaj platformę z eksperymentami z pojedynczymi cząsteczkami FRET, aby zająć się mechanowrażliwymi kanałami na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób optyczny17. Wstrzyknięcie buforu do kropli, rozciągnięcie wewnętrznej monowarstwy DIB lub ukierunkowane wiązanie poszczególnych kanałów z leżącym poniżej hydrożelem może być wykorzystane do dalszych badań nie tylko fizycznego mechanizmu mechanicznie aktywowanych kanałów, które reagują na napięcie i / lub krzywiznę błony, jak pokazano dla MscL i MscS, dwuporowej domeny K+-kanałów, TREK-1, TREK-2 i TRAAK oraz PIEZO (w celu przeglądu, patrz53), ale także lokalne wiązanie z cytoszkieletem komórkowym, jak pokazano dla wrażliwego na dotyk kanału jonowego NOMPC54,55.

Niniejszy protokół ma na celu opisanie sposobu badania korelacji między ruchliwością błony a przepuszczalnością kanałów jonowych białek błonowych w dwuwarstwowych membranach dwuwarstwowych (DIB) opartych na polimerach1,2,3.
Obecna technika uzupełnia imponujący wachlarz zaawansowanych narzędzi do analizy optycznej i powierzchniowej, takich jak śledzenie pojedynczych cząstek4,5, spektroskopia korelacji fluorescencji6,7, oraz szybka mikroskopia sił atomowych8,9,10. Dostarczają one cennych informacji na temat dynamicznego składu i struktury membran, które wpływają na reakcje oparte na błonach11,12,13. Podczas gdy ruch i dyfuzja boczna białek zależy od lokalnej gęstości białek w błonie, poszczególne cząsteczki białka mogą być również uwięzione w tratwach lipidowych14 oraz w interakcjach białko-białko15,16. W zależności od domen białkowych wystających z błony do środowiska zewnątrzkomórkowego lub cytozolu, ruchliwość białek może wahać się od wysoce ruchliwych do całkowicie nieruchomych. Jednak ze względu na złożoność błony i jej struktur obwodowych często trudno jest rozszyfrować wzajemne zależności między naturą mobilności bocznej a funkcją białka17.
Membrany DIB okazały się skuteczną platformą do biofizycznych analiz pojedynczych cząsteczek białek błonowych18,19,20,21,22. Powstają one w wyniku samoorganizacji lipidów poprzez kontakt kropelek wody z substratami hydrożelowymi w fazie lipidowo-olejowej. Podobnie jak powszechnie stosowane obsługiwane dwuwarstwy lipidowe (SLB)1,23,24,25, DIB umożliwiają lokalne dostrojenie ruchliwości bocznej poprzez tymczasowe lub stałe wiązanie białek z matrycą polimerową, gdy są funkcjonalizowane odpowiednimi ligandami17. Ten ostatni może służyć jako system modelowy dla procesów biochemicznych zachodzących w błonach komórkowych o niejednorodnym rozmieszczeniu białek10.
Opisane tutaj eksperymentalne podejście opiera się na fluorescencji barwników wrażliwych na Ca2+ do pomiaru strumienia jonów Ca2+ przez poszczególne kanały w bliskiej odległości od membrany2,22 za pomocą mikroskopii TIRF. Takie podejście optyczne ogranicza oświetlenie próbki do odległości zbliżonej do membrany, co ze względu na właściwości fizyczne ulotnego światła wzbudzającego prowadzi do znacznego zmniejszenia tła fluorescencji. To ostatnie jest warunkiem wstępnym, jeśli do wykrywania pojedynczych cząsteczek wymagana jest wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa. W przeciwieństwie do klasycznych metod elektrofizjologicznych26,27, do badania strumienia jonów w poszczególnych kanałach nie są wymagane żadne napięcia membranowe. Ponadto metoda nie wymaga znakowania barwnikami fluorescencyjnymi lub cząsteczkami, które mogłyby zakłócać boczny ruch kanałów w membranie.
Metoda jest szczególnie przydatna do badania kanałów białkowych osadzonych w błonie na poziomie pojedynczej cząsteczki bez użycia klasycznej elektrofizjologii. Wykorzystanie mitochondrialnego kanału przewodzącego białka TOM-CC z Neurospora crassa28,29,30 i OmpF, który wspiera dyfuzję małych cząsteczek hydrofilowych przez zewnętrzną błonę Escherichia coli17,31, pokazujemy, w jaki sposób można badać i korelować ruchliwość błony i aktywność kanałów tych dwóch białek. Sugerujemy, że to podejście, choć zoptymalizowane pod kątem TOM-CC i OmpF, może być łatwo zastosowane do innych kanałów białkowych.

<table><tbody><tr><td>1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x Obiektyw olejowy Apochromat N.A. 1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>Mikroskop TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>10x obiektyw kontrastowy z modulacją Hoffmanna NA 0,25&nbsp;</td><td>Mikroskop Nikon</td><td></td><td>do oceny tworzenia się błony DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>10x obiektyw N.A. 0.25</td><td>Nikon</td><td>MRL00102</td><td>mikroskop TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>40-krotny obiektyw kontrastowy z modulacją Hoffmanna NA 0,55</td><td>Mikroskop Nikon</td><td></td><td>do oceny tworzenia się błony DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Laser 488 nm, 100 mW&nbsp; &nbsp;</td><td>Mikroskop Visitron</td><td></td><td>TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td><td></td> klejąca</tr> <tr><td>i Auml; KTA PURE&nbsp; &nbsp;</td><td>System oczyszczania białek</td> <td>Cytiva</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Bradford, Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Chelax 100</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do dializy Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>Komora DIB&nbsp;</td><td>Wykonana</td><td></td><td>na zamówienie komora PMMA do membran DIB</td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik mocy i konsola energetyczna</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Laserowy miernik mocy&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulftlenek dimetylu</td><td>Roth&nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie destylowany mikroskop kontrastowy H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 Hoffmann z modulacją&nbsp;</td><td>Mikroskop Nikon</td><td></td><td>do oceny tworzenia się błony DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Mikroskop iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia Ti70</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluorTM</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-362561</td><td>Ca2+-wrażliwy barwnik</td></tr><tr><td>Homogenizator komórek French Press</td><td>Igneus</td><td>Igneus 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>Filtr GFP</td><td>AHF</td><td></td><td>Przesiąkanie filtracyjne stosowane do wzbudzania membran DIB metodą epifluorescencji ze źródłem światła białego&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 40 mm x 24 mm x 0,13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 10 ml</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 100 ml</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 500 ml</td><td>Roth</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Minitube&nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth&nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>Hexadcane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>His Trap HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>kolumna Ni-NTA</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td> Powlekarka wirowa Honeywell 10314243 <td></td></tr><tr><td>KLM&nbsp;</td><td>Lista Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>medyczny pionowy ściągacz do pipet L/M-3P-A</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8 Mikroskop stereoskopowy</td><td>Wild</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz N2 NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitr 2010&nbsp;</td><td>Światowe Instrumenty Precyzyjne</td><td>Nanolitr 2010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-b-D-maltozyd</td><td>Glycon Biochemicals</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaroza, nieusieciowana</td><td>Cube Biotech 124115393</td><td></td><td>Niestandardowe</td></tr><tr><td>oprogramowanie NIS-Elements AR</td><td>Nikon</td><td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>n-oktylo-polioksyetylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O2 gaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Roth&nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik fotodiody&nbsp; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>Czujnik do miernika mocy lasera&nbsp;</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Diener Electronics</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Preparatywna ultrawirówka Optima</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czterozakresowy filtr TIRF 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>Ustawienie filtra służące do wzbudzania membran DIB za pomocą lasera 488 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Zasób Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>Kolumna anionowymienna</td></tr><tr><td>Olej silikonowy AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Super LoLux</td><td>JVC</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Termowytrząsarka</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Mikroskop fluorescencyjny&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa&nbsp;</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Vacuubrand</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>Białe źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego (100 W)</td><td>Mikroskop Nikon</td><td>MBF72655</td><td>TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (tirf)

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości pokazały, że wiele kanałów jonowych nie jest statycznych, ale podlega wysoce dynamicznym procesom, w tym przejściowemu powiązaniu podjednostek tworzących pory i pomocnicze, dyfuzji bocznej i grupowaniu z innymi białkami. Jednak związek między dyfuzją boczną a funkcją jest słabo poznany. Aby podejść do tego problemu, opisujemy, w jaki sposób ruchomość boczna i aktywność poszczególnych kanałów w podpartych błonach lipidowych może być monitorowana i korelowana za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Membrany są wytwarzane na ultracienkim podłożu hydrożelowym przy użyciu techniki dwuwarstwowej granicy faz kropel (DIB). W porównaniu z innymi typami membran modelowych, membrany te mają tę zaletę, że są wytrzymałe mechanicznie i nadają się do bardzo czułych technik analitycznych. Protokół ten mierzy strumień jonów Ca2+ przez pojedyncze kanały, obserwując emisję fluorescencji barwnika wrażliwego na Ca2 + w bliskiej odległości od membrany. W przeciwieństwie do klasycznych metod śledzenia pojedynczych cząsteczek, nie są wymagane żadne fluorescencyjne białka fuzyjne ani znaczniki, które mogą zakłócać ruch boczny i funkcję w błonie. Możliwe zmiany strumienia jonów związane ze zmianami konformacyjnymi białka są spowodowane wyłącznie bocznym ruchem białka w błonie. Reprezentatywne wyniki przedstawiono przy użyciu mitochondrialnego kanału translokacji białek TOM-CC i kanału bakteryjnego OmpF. W przeciwieństwie do OmpF, bramkowanie TOM-CC jest bardzo wrażliwe na uwięzienie molekularne i naturę dyfuzji bocznej. W związku z tym obsługiwane dwuwarstwy interfejsu kropelkowego są potężnym narzędziem do scharakteryzowania związku między dyfuzją boczną a funkcją kanałów jonowych.

Optyczna rejestracja pojedynczych kanałów w czasie rzeczywistym bez użycia elektrod ujawnia wzajemne oddziaływanie między lateralnym ruchem białek a funkcją poszczególnych kanałów jonowych w błonach DIB. Rekonstytucja rdzeniowego kompleksu TOM mitochondriów (Rysunek 1A) w błonie DIB (Rysunek 4D) ilustruje silną korelację czasową między mobilnością lateralną a przepuszczalnością jonową (Rysunek 5A). Bramkowanie TOM-CC wydaje się być wrażliwe na sposób ruchu lateralnego17. Poruszające się kanały wykazują przepływ Ca2+ przez swoje pory oraz wysoką intensywność punktowej fluorescencji. Cząsteczki uwięzione, nieruchome, wykazują niską i średnią intensywność fluorescencji. W przypadku ogólnego poru importowego białek mitochondriów TOM-CC, to podejście z zastosowaniem pojedynczych cząsteczek ujawniło silną korelację czasową między mobilnością lateralną a przepuszczalnością jonową, co sugeruje, że kanał TOM-CC posiada właściwości mechanosensytywne17. Lateralne zatrzymanie swobodnie poruszających się cząsteczek TOM-CC towarzyszy częściowe lub całkowite zamknięcie kanału TOM-CC. Obrazowanie błon DIB z białkiem OmpF (Rysunek 1E oraz Rysunek 4F), które jest niemal całkowicie zanurzone w błonie, nie wykazuje efektów typu stop-and-go (Rysunek 5B). Losowe zatrzymania OmpF nie wiążą się ze zmianą intensywności, a tym samym z zamknięciem jego porów. Na podstawie sygnałów fluorescencji38 dokładność pozycjonowania poszczególnych kanałów można oszacować w zakresie od 5 do 10 nm. Należy jednak zauważyć, że dokładność ta nie może zostać osiągnięta, jeśli kanały lekko drgają z powodu mobilnego zakotwiczenia w hydrożelu agarozowym, co pokazano na przykład dla cząsteczek TOM-CC w stanie pośrednim z wartością średniokwadratowego odchylenia (root mean displacement) wynoszącą 120 nm (Rysunek 5A).
<img alt="Struktura kompleksu TOM, profile elucji chromatograficznej, żel SDS-PAGE; wyniki analizy białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Izolacja TOM-CC. (A) Struktura cryo-EM TOM-CC z N. crassa30,39. Mitochondria z poziomu szczepu N. crassa zawierającego Tom22 z tagiem 6xHis zostały solubilizowane w DDM i poddane chromatografii powinowactwa Ni-NTA (B) oraz chromatografii wymiany anionowej (C). (D) SDS-PAGE wyizolowanego TOM-CC. (E) Struktura krystaliczna (PDB, 1OPF) i (F) SDS-PAGE oczyszczonego OmpF z E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu tworzenia membrany DIB z zastosowaniem hydrożelu agarozowego i mikroskopii TIRF." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat montażu komory PMMA. Krok 1: Na szklaną lamelkę nanosi się warstwę hydrożelu agarozowego metodą spin-coatingu. Krok 2: Lamelka z naniesioną warstwą zostaje zamontowana w specjalnie wykonanej komorze mikroskopowej z PMMA. Krok 3: Do portu wlotowego komory PMMA dodaje się dodatkową agarozę o niskiej temperaturze topnienia na płycie grzewczej o temperaturze 35 °C. Krok 4: Monowarstwy lipidowe tworzą się wokół kropli wodnych na granicy faz bufor/olej (po lewej) oraz na granicy faz hydrożel agarozowy/olej (po prawej). Krok 5: Pojedyncze krople wodne są pipetowane do studzienek komory PMMA, tworząc lipidową dwuwarstwę w momencie kontaktu dwóch monowarstw lipidowych. Krok 6: Formowanie membran DIB jest weryfikowane za pomocą mikroskopii kontrastowej modulacji Hofmanna. Krok 7: Za pomocą mikroskopii TIRF obrazowane są wybrane obszary membran DIB z wbudowanymi kanałami jonowymi. Zielony: 0,75% agarozy; żółty: 2,5% agarozy zawierającej jony Ca2+; magenta: faza lipid/olej; ciemnoniebieski: bufor kropli wodnej zawierający barwnik wrażliwy na Ca2+ oraz białko. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dynamika błony komórkowej, napływ wapnia (Ca²⁺) za pomocą Fluo-8, schemat spektrometrii, ruch białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Układ eksperymentalny. (A) Schematyczna reprezentacja błony DIB w studzience z PMMA. Bipowarza spoczywa na ultracienkim filmie z 0,75% agarozy, co umożliwia obrazowanie TIRF strumienia Ca2+ przez kanał jonowy w czasie, z wykorzystaniem czułego na Ca2+ barwnika fluorescencyjnego (Fluo-8) w komorze trans. (B) Strumień Ca2+ jest kontrolowany wyłącznie przez ciśnienie osmotyczne z komory cis do trans. Pozwala to na wyznaczenie zarówno pozycji w błonie, jak i stanu otwarcia/zamknięcia kanału. Przedstawiony tutaj kanał to białkowy kanał przewodzący TOM-CC z mitochondriów N. crassa30. (C) Trajektoria pojedynczego kanału TOM-CC. Kolor zielony: kanał w ruchu; kolor żółty: kanał nieruchomy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza białek w nanodyskach, mapowanie intensywności, mikroskopia fluorescencyjna, wykres intensywności widmowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4Obrazowanie TOM-CC i OmpF w błonach DIB. (A) Membrana DIB obrazowana za pomocą mikroskopii kontrastowej z modulacją Hoffmanna, przedstawiająca powierzchnię kontaktu dwuwarstwowego pomiędzy hydrożelem a kroplą. (B) Obraz uszkodzonej membrany DIB wykonany w sposób opisany w (A). Strzałka, krawędź komory z PMMA. (C) Membrana DIB obrazowana za pomocą mikroskopii TIRF bez kanałów białkowych. (D) membrana DIB z zrekonstytuowanym kompleksem TOM-CC, obrazowana za pomocą mikroskopii TIRF. Białe kwadraty zaznaczają punkty o wysokim (SH), pośredni (SI), oraz niskiej (SL) natężenia. (EDopasowanie profilu intensywności fluorescencji trzech punktów zaznaczonych w (A) do dwuwymiarowych funkcji Gaussa ujawnia położenie poszczególnych TOM-CC oraz Ca2+ przepływ przez kanał. (F) membrana DIB z zrekonstytuowanym białkiem OmpF. (G) Dopasowanie Gaussa do zaznaczonej plamki fluorescencyjnej w (F). W przeciwieństwie do dwuporowego kompleksu białkowego $\beta$-beczki TOM-CC, trójporowa $\beta$-beczka OmpF wykazuje tylko jeden stan przepuszczalności. Rozmiar piksela, 0.16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres dynamiki białek; amplituda w funkcji czasu; pokazuje TOM-CC, OmpF; wyniki eksperymentalne, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Aktywność kanału koreluje z mobilnością boczną TOM-CC. (A) Ślad amplitudy fluorescencji (góra) i odpowiadająca mu trajektoria (dół) TOM-CC wskazują, że aktywność kanału TOM-CC w stanach otwartym i zamkniętym koreluje z boczną mobilnością kompleksu w błonie. Trajektoria przedstawia trzy stany przepuszczalności. Kolor zielony: stan w pełni otwarty; żółty: stan o pośredniej przepuszczalności; czerwony: stan kanału zamkniętego; czerwona gwiazdka: TOM-CC w stanie pośrednim oscyluje wokół swojej średniej pozycji o około ±60 nm. Dokładność wyznaczenia pozycji37 na podstawie sygnałów fluorescencji w stanach w pełni otwartym i pośrednim mieści się w zakresie od 5 nm do 10 nm. (B) Ślad amplitudy fluorescencji (góra) i odpowiadająca mu trajektoria (dół) OmpF. OmpF wykazuje tylko jeden poziom intensywności, niezależnie od tego, czy jest w ruchu, czy uwięziony. Segmenty trajektorii odpowiadające okresom czasu uwięzienia cząsteczek zaznaczono na szaro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bufor </td>
			<td colspan="3">Stężenia odczynników</td>
			<td>Objętość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (m/v) n-dodecyl-β-D-maltosyd (DDM), 10% (v/v) glicerolu, 300 mM NaCl i 1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glicerolu, 1 M imidazolu i 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (m/v) DDM, 2% (v/v) dimetylosulfoksyd (DMSO)</td>
			<td>100 ml </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (m/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetylosulfoksyd (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* Odgazuj i przepuść przez 0.22 μm przefiltrować przed użyciem.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Roztwory buforowe do izolacji TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Bufor </td >
			<td colspan="3" >Stężenia reagentów</td >
			<td >Objętość</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >LB*</td >
			<td colspan="3" >1% (w/v) tryptony, 1% (w/v) NaCl oraz 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego </td >
			<td >1100 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >C1</td >
			<td colspan="3" >2 mM MgCl2, ok. 750 jednostek DNAzy oraz 50 mM Tris-HCl pH 7,5  </td >
			<td >20 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >C2</td >
			<td colspan="3" >50 mM Tris-HCl, pH 7,5</td >
			<td >50 mL </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >C3</td >
			<td colspan="3" >4% (w/v) dodecylu siarczanu sodu (SDS), 2 mM β-merkaptoetanolu oraz 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td >
			<td >50 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >C4</td >
			<td colspan="3" >2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl oraz 50 mM Tris-HCl pH 7,5</td >
			<td >50 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >C5</td >
			<td colspan="3" >0,5% (w/v) oktylo polioksyetylenu (octyl POE), 1 mM EDTA oraz 20 mM Tris pH 8,5 </td >
			<td >1000 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="5" >* Sterylizować przed użyciem.</td >
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 2: Roztwory buforowe do izolacji OmpF.

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Kanały jonowe w błonach biologicznych nie są statyczne. W tym miejscu przedstawiamy podejście optyczne pojedynczej cząsteczki w celu rozwikłania związku między boczną dyfuzją błony a funkcją kanału jonowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest to, że nie jest wymagane znakowanie fluorescencyjne białek, które mogą zakłócać ich ruch boczny i funkcję.Metodę można zastosować do dowolnego kanału białka błonowego, w którym swobodna lub ograniczona dyfuzja jest ważna dla organizacji i funkcji. Na początek przenieś 380 mikrolitrów roztworu podstawowego DPhPC do szklanej fiolki i nałóż roztwór podstawowy lipidów argonem lub azotem, aby zapobiec utlenianiu lipidów. Stosować najmniejszy możliwy przepływ gazu, aby uniknąć parowania rozpuszczalnika organicznego, w którym rozpuszczają się lipidy, lub rozpryskiwania się rozpylonego rozpuszczalnika z fiolki.Wysuszyć próbkę lipidów pod strumieniem azotu i usunąć pozostały rozpuszczalnik organiczny z próbki lipidów w próżni za pomocą bezolejowej pompy próżniowej przez noc. Rozpuść film lipidowy w sześciokątnym roztworze oleju silikonowego, dodając równe objętości heksadekanu i oleju silikonowego za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra do końcowego stężenia lipidów 9,5 miligrama na mililitr. Umieść kilka szklanych szkiełek nakrywkowych w uchwycie na szkiełko nakrywkowe ze stali nierdzewnej i wyczyść je w szklanej zlewce przez około 10 minut acetonem w myjce ultradźwiękowej.Opłucz szkiełka nakrywkowe podwójnie dejonizowaną wodą i wysusz je pod strumieniem azotu. Następnie wyczyść i hydrofilizuj szkiełko nakrywkowe w myjce plazmowej z tlenem przez pięć minut. Zamontuj szkiełko nakrywkowe poddane obróbce plazmowej na powlekarce wirowej i pokryj szkiełko nakrywkowe warstwą agarozy o grubości submikrometra, powoli dodając 140 mikrolitrów podgrzanej 0,75% niskotopliwej agarozy za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przy 3 000 obr./min przez 30 sekund.Natychmiast przymocuj spin-coated coverslip z cienką warstwą hydrożelu agarozowego do spodu komory PMMA. Upewnij się, że hydrożel agarozowy jest skierowany do góry. Przymocuj krawędzie szkiełka nakrywkowego do urządzenia poddanego mikroobróbce PMMA za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i umieść urządzenie na płycie grzejnej podgrzanej do 35 stopni Celsjusza.Ostrożnie wlej 200 mikrolitrów 2,5% roztworu agarozy do wlotu komory, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Natychmiast przykryj studzienki komory PMMA około 60 mikrolitrami roztworu oleju lipidowego, aby zainicjować tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz oleju agarozowego, aby uniknąć odwodnienia agarozy pokrytej spinem w studzienkach komory PMMA. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 35 stopni Celsjusza na około dwie godziny.Umieść około 20 mikrolitrów lipidowego roztworu sześciokątnego oleju silikonowego w każdym z kilku mikrowytwarzanych studzienek w komorze inkubacji kropelkowej. Przygotować szklaną igłę mikrokapilarną o średnicy otworu końcówki około 20 mikrometrów za pomocą pionowego lub poziomego ściągacza do mikropipet. Napełnij igłę około pięcioma mikrolitrami wodnego roztworu do wstrzykiwań zawierającego 8,8 milimola HEPES, siedem mikromoli barwnika fluorescencyjnego, Fluo-8, 400 mikromolowy EDTA, 1,32 molowy chlorek potasu i 30 nanomolowy kompleks rdzeniowy TOM lub alternatywnie 20 nanomolowy OMPF.Zamontuj igłę z wodnym roztworem do wstrzykiwań na nanowtryskiwaczu z napędem piezoelektrycznym i wstrzyknij od 100 do 200 nanolitrów kropelek wodnych do studzienek w komorze inkubacji kropelek wypełnionej roztworem oleju silikonowego z heksadekanem lipidowym za pomocą nanowtryskiwacza. Pozwól na utworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz oleju kropelkowego przez około dwie godziny, utrzymując komory inkubacyjne PMMA i kropelkowe na gorącej płycie podgrzanej do 35 stopni Celsjusza. Ręcznie przenieś pojedyncze kropelki wodne z dołków komory inkubacji kropel do studzienek komory PMMA za pomocą jednokanałowej pipety mikrolitrowej z jednorazową końcówką polipropylenową o pojemności 10 mikrolitrów.Pozwól, aby kropelki opadły na monowarstwy lipidowe na granicy faz hydrożel-olej, tworząc dwuwarstwę lipidową między kropelkami a hydrożelem agarozowym. Zamontuj komorę PMMA z dwuwarstwowymi membranami interfejsu kropelkowego lub membranami DIB na uchwycie próbki mikroskopu światła odwróconego i oceń tworzenie się membrany za pomocą obiektywu kontrastowego z 10-krotną modulacją Hoffmana. Jeśli uformowały się membrany DIB, zamontuj komorę PMMA na uchwycie próbki mikroskopu TIRF wyposażonego w konwencjonalne źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego, laser 488 nanometrów i podświetlaną kamerę CCD zwielokrotniającą elektrony, aby osiągnąć rozmiar piksela około 0,16 mikrometra.Skoncentruj krawędź membrany DIB za pomocą obiektywu o 10-krotnym powiększeniu w oświetleniu epifluorescencyjnym za pomocą źródła światła o wysokiej intensywności za pomocą zestawu filtrów GFP. Dokładnie ustaw ostrość na tej samej krawędzi membrany DIB przy dużym powiększeniu za pomocą obiektywu TIRF ze 100x NA 1,49 oleju apochromatycznego, ponownie w oświetleniu epifluorescencyjnym źródłem światła o wysokiej intensywności przy użyciu zestawu filtrów GFP. Zmień ustawienie filtra z GFP na czterozakresowy zestaw filtrów TIRF, włącz laser 488 nanometrów i ustaw intensywność lasera na soczewce obiektywu.Aby uwidocznić pojedyncze kanały jonowe, dostosuj kąt TIRF i wzmocnienie kamery EM CCD tak, aby otwarte kanały jonowe w membranie DIB wyglądały jak fluorescencyjne plamy o wysokim kontraście na ciemnym tle, a stosunek sygnału do tła osiągnął maksimum. Upewnij się, że plamki odpowiadające strumieniowi jonów wapnia przez pojedyncze kanały jonowe pozostają ostre i mają okrągły kształt o dużej intensywności w środku i stopniowo zmniejszają się w kierunku obrzeży. Sprawdź, czy plamki fluorescencyjne są ostre, aby upewnić się, że kanały jonowe odtworzyły się w membranach DIB i poruszają się poprzecznie w płaszczyźnie membrany.Na koniec należy zarejestrować serię obrazów membranowych, które umożliwiają prawidłowe śledzenie położenia i monitorowanie stanu otwartego-zamkniętego poszczególnych kanałów jonowych. Aby określić rodzaj ruchomości bocznej i stan aktywności kanału, należy uzyskać odpowiednio długie i dobrze próbkowane trajektorie. Struktura Cryo EM Neurospora crassa TOM-CC jest pokazana tutaj.Mitochondria z barwnika N.crassa zawierającego TOM 22 ze znacznikiem 6-His rozpuszczono w DDM i poddano chromatografii powinowactwa niklowo-NTA i chromatografii anionowymiennej. SDS-PAGE wyizolowanej struktury krystalicznej TOM-CC i SDS-PAGE oczyszczonego E.coli OMPF użytego do porównania pokazano tutaj. Ślad amplitudy fluorescencji w odpowiedniej trajektorii TOM-CC wskazuje, że aktywność kanału otwartego-zamkniętego TOM-CC koreluje z boczną ruchliwością błony kompleksu.Ślad amplitudy wyświetla trzy stany przepuszczalności: stan pełnego otwarcia odpowiadający ruchomym kanałom, stan pośredniej przepuszczalności i stan zamknięty kanału odpowiadający kanałom nieruchomym. TOM-CC w stanie pośrednim chwieje się wokół swojej średniej pozycji o około plus/minus 60 nanometrów. Ślad amplitudy fluorescencji w odpowiedniej trajektorii OMPF pokazano tutaj.OMPF ujawnia tylko jeden poziom intensywności w porównaniu do TOM-CC, niezależnie od tego, czy jest w ruchu, czy uwięziony. Odcinki trajektorii odpowiadające okresom czasu uwięzionych cząsteczek są oznaczone kolorem szarym. Jedną z ważnych rzeczy, na które należy zwrócić uwagę, jest to, że ta metoda analizuje pojedyncze białka błonowe w nienaruszonym środowisku błonowym.Dynamika białek błonowych pozostanie horyzontem dla badań naukowych w dającej się przewidzieć przyszłości. Oczekujemy, że nasza metoda znacząco przyczyni się do rozwoju tej dziedziny.

single-molecule-imaging-lateral-mobility-ion-channel-activity-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta pozwala badać ruchliwość boczną białek błonowych bez konieczności fluorescencyjnego znakowania.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Przeglądaj więcej filmów