Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Kanały jonowe w błonach biologicznych nie są statyczne. W tym miejscu przedstawiamy podejście optyczne pojedynczej cząsteczki w celu rozwikłania związku między boczną dyfuzją błony a funkcją kanału jonowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest to, że nie jest wymagane znakowanie fluorescencyjne białek, które mogą zakłócać ich ruch boczny i funkcję.

Metodę można zastosować do dowolnego kanału białka błonowego, w którym swobodna lub ograniczona dyfuzja jest ważna dla organizacji i funkcji. Na początek przenieś 380 mikrolitrów roztworu podstawowego DPhPC do szklanej fiolki i nałóż roztwór podstawowy lipidów argonem lub azotem, aby zapobiec utlenianiu lipidów. Stosować najmniejszy możliwy przepływ gazu, aby uniknąć parowania rozpuszczalnika organicznego, w którym rozpuszczają się lipidy, lub rozpryskiwania się rozpylonego rozpuszczalnika z fiolki.

Wysuszyć próbkę lipidów pod strumieniem azotu i usunąć pozostały rozpuszczalnik organiczny z próbki lipidów w próżni za pomocą bezolejowej pompy próżniowej przez noc. Rozpuść film lipidowy w sześciokątnym roztworze oleju silikonowego, dodając równe objętości heksadekanu i oleju silikonowego za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra do końcowego stężenia lipidów 9,5 miligrama na mililitr. Umieść kilka szklanych szkiełek nakrywkowych w uchwycie na szkiełko nakrywkowe ze stali nierdzewnej i wyczyść je w szklanej zlewce przez około 10 minut acetonem w myjce ultradźwiękowej.

Opłucz szkiełka nakrywkowe podwójnie dejonizowaną wodą i wysusz je pod strumieniem azotu. Następnie wyczyść i hydrofilizuj szkiełko nakrywkowe w myjce plazmowej z tlenem przez pięć minut. Zamontuj szkiełko nakrywkowe poddane obróbce plazmowej na powlekarce wirowej i pokryj szkiełko nakrywkowe warstwą agarozy o grubości submikrometra, powoli dodając 140 mikrolitrów podgrzanej 0,75% niskotopliwej agarozy za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przy 3 000 obr./min przez 30 sekund.

Natychmiast przymocuj spin-coated coverslip z cienką warstwą hydrożelu agarozowego do spodu komory PMMA. Upewnij się, że hydrożel agarozowy jest skierowany do góry. Przymocuj krawędzie szkiełka nakrywkowego do urządzenia poddanego mikroobróbce PMMA za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i umieść urządzenie na płycie grzejnej podgrzanej do 35 stopni Celsjusza.

Ostrożnie wlej 200 mikrolitrów 2,5% roztworu agarozy do wlotu komory, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Natychmiast przykryj studzienki komory PMMA około 60 mikrolitrami roztworu oleju lipidowego, aby zainicjować tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz oleju agarozowego, aby uniknąć odwodnienia agarozy pokrytej spinem w studzienkach komory PMMA. Umieść urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 35 stopni Celsjusza na około dwie godziny.

Umieść około 20 mikrolitrów lipidowego roztworu sześciokątnego oleju silikonowego w każdym z kilku mikrowytwarzanych studzienek w komorze inkubacji kropelkowej. Przygotować szklaną igłę mikrokapilarną o średnicy otworu końcówki około 20 mikrometrów za pomocą pionowego lub poziomego ściągacza do mikropipet. Napełnij igłę około pięcioma mikrolitrami wodnego roztworu do wstrzykiwań zawierającego 8,8 milimola HEPES, siedem mikromoli barwnika fluorescencyjnego, Fluo-8, 400 mikromolowy EDTA, 1,32 molowy chlorek potasu i 30 nanomolowy kompleks rdzeniowy TOM lub alternatywnie 20 nanomolowy OMPF.

Zamontuj igłę z wodnym roztworem do wstrzykiwań na nanowtryskiwaczu z napędem piezoelektrycznym i wstrzyknij od 100 do 200 nanolitrów kropelek wodnych do studzienek w komorze inkubacji kropelek wypełnionej roztworem oleju silikonowego z heksadekanem lipidowym za pomocą nanowtryskiwacza. Pozwól na utworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz oleju kropelkowego przez około dwie godziny, utrzymując komory inkubacyjne PMMA i kropelkowe na gorącej płycie podgrzanej do 35 stopni Celsjusza. Ręcznie przenieś pojedyncze kropelki wodne z dołków komory inkubacji kropel do studzienek komory PMMA za pomocą jednokanałowej pipety mikrolitrowej z jednorazową końcówką polipropylenową o pojemności 10 mikrolitrów.

Pozwól, aby kropelki opadły na monowarstwy lipidowe na granicy faz hydrożel-olej, tworząc dwuwarstwę lipidową między kropelkami a hydrożelem agarozowym. Zamontuj komorę PMMA z dwuwarstwowymi membranami interfejsu kropelkowego lub membranami DIB na uchwycie próbki mikroskopu światła odwróconego i oceń tworzenie się membrany za pomocą obiektywu kontrastowego z 10-krotną modulacją Hoffmana. Jeśli uformowały się membrany DIB, zamontuj komorę PMMA na uchwycie próbki mikroskopu TIRF wyposażonego w konwencjonalne źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego, laser 488 nanometrów i podświetlaną kamerę CCD zwielokrotniającą elektrony, aby osiągnąć rozmiar piksela około 0,16 mikrometra.

Skoncentruj krawędź membrany DIB za pomocą obiektywu o 10-krotnym powiększeniu w oświetleniu epifluorescencyjnym za pomocą źródła światła o wysokiej intensywności za pomocą zestawu filtrów GFP. Dokładnie ustaw ostrość na tej samej krawędzi membrany DIB przy dużym powiększeniu za pomocą obiektywu TIRF ze 100x NA 1,49 oleju apochromatycznego, ponownie w oświetleniu epifluorescencyjnym źródłem światła o wysokiej intensywności przy użyciu zestawu filtrów GFP. Zmień ustawienie filtra z GFP na czterozakresowy zestaw filtrów TIRF, włącz laser 488 nanometrów i ustaw intensywność lasera na soczewce obiektywu.

Aby uwidocznić pojedyncze kanały jonowe, dostosuj kąt TIRF i wzmocnienie kamery EM CCD tak, aby otwarte kanały jonowe w membranie DIB wyglądały jak fluorescencyjne plamy o wysokim kontraście na ciemnym tle, a stosunek sygnału do tła osiągnął maksimum. Upewnij się, że plamki odpowiadające strumieniowi jonów wapnia przez pojedyncze kanały jonowe pozostają ostre i mają okrągły kształt o dużej intensywności w środku i stopniowo zmniejszają się w kierunku obrzeży. Sprawdź, czy plamki fluorescencyjne są ostre, aby upewnić się, że kanały jonowe odtworzyły się w membranach DIB i poruszają się poprzecznie w płaszczyźnie membrany.

Na koniec należy zarejestrować serię obrazów membranowych, które umożliwiają prawidłowe śledzenie położenia i monitorowanie stanu otwartego-zamkniętego poszczególnych kanałów jonowych. Aby określić rodzaj ruchomości bocznej i stan aktywności kanału, należy uzyskać odpowiednio długie i dobrze próbkowane trajektorie. Struktura Cryo EM Neurospora crassa TOM-CC jest pokazana tutaj.

Mitochondria z barwnika N.crassa zawierającego TOM 22 ze znacznikiem 6-His rozpuszczono w DDM i poddano chromatografii powinowactwa niklowo-NTA i chromatografii anionowymiennej. SDS-PAGE wyizolowanej struktury krystalicznej TOM-CC i SDS-PAGE oczyszczonego E.coli OMPF użytego do porównania pokazano tutaj. Ślad amplitudy fluorescencji w odpowiedniej trajektorii TOM-CC wskazuje, że aktywność kanału otwartego-zamkniętego TOM-CC koreluje z boczną ruchliwością błony kompleksu.

Ślad amplitudy wyświetla trzy stany przepuszczalności: stan pełnego otwarcia odpowiadający ruchomym kanałom, stan pośredniej przepuszczalności i stan zamknięty kanału odpowiadający kanałom nieruchomym. TOM-CC w stanie pośrednim chwieje się wokół swojej średniej pozycji o około plus/minus 60 nanometrów. Ślad amplitudy fluorescencji w odpowiedniej trajektorii OMPF pokazano tutaj.

OMPF ujawnia tylko jeden poziom intensywności w porównaniu do TOM-CC, niezależnie od tego, czy jest w ruchu, czy uwięziony. Odcinki trajektorii odpowiadające okresom czasu uwięzionych cząsteczek są oznaczone kolorem szarym. Jedną z ważnych rzeczy, na które należy zwrócić uwagę, jest to, że ta metoda analizuje pojedyncze białka błonowe w nienaruszonym środowisku błonowym.

Dynamika białek błonowych pozostanie horyzontem dla badań naukowych w dającej się przewidzieć przyszłości. Oczekujemy, że nasza metoda znacząco przyczyni się do rozwoju tej dziedziny.