Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

OLA to wszechstronna platforma mikroprzepływowa przydatna dla społeczności zajmującej się biologią syntetyczną, a w szczególności do bioinżynierii sztucznych komórek. Liposomy oparte na OLA mogą pomóc nam zrozumieć zasady samoorganizacji w biologii i skonstruować zespoły naśladujące komórki.

OLA wytwarza monorozproszone, jednolipoaminowe liposomy wielkości komórki w sposób wysokoprzepustowy i o doskonałej skuteczności enkapsulacji. Wymaga bardzo małych objętości próbek, rzędu 50 mikrolitrów, a uformowane liposomy są natychmiast dostępne do dalszych eksperymentów na chipie. OLA jest przydatna do badania reakcji biologicznych w mikroograniczeniach, dynamiki pęcherzyków i kondensatów biomolekularnych oraz ich interakcji z błonami.

OLA znalazła również zastosowanie jako wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych leków, na przykład do badania przepuszczalności i aktywności błonowej środków przeciwdrobnoustrojowych. Funkcjonalizacja powierzchni, która jest obróbką PV, jest krytycznym krokiem dla protokołu i musi być starannie wykonana, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu PV do wewnętrznych kanałów organicznych przenoszących lipidy. Ponadto kanał postprodukcyjny powinien być wystarczająco długi, aby oddzielenie kieszeni oktanolu utworzyło liposomy.

Ketan Ganar, doktorant z mojego laboratorium, pomoże Chang Chenowi zademonstrować tę procedurę. Na początek weź czystą płytkę silikonową o średnicy czterech cali i wyczyść ją dalej za pomocą sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu. Zamontuj wafel na powlekarce wirowej i delikatnie dozuj około pięciu mililitrów ujemnego fotorezystu w środku płytki.

Aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 10 mikrometrów, ustaw ustawienia powłoki wirowej na 500 obr./min na 30 sekund z przyspieszeniem 100 RRP na sekundę dla początkowego rozprowadzania, a następnie 60-sekundowe wirowanie przy 3 000 obr./min z przyspieszeniem 500 obr./min na sekundę. Następnie obtoczyć wafel w wirówce. Wafelek pieczemy na blasze grzewczej przez dwie minuty w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Gdy wafel ostygnie, zamontuj go w komorze drukowania bezpośredniej prawej optycznej maszyny litograficznej i wprowadź do oprogramowania zespół liposomów wspomagany oktanolem lub projekt OLA. Po wydrukowaniu wzoru piecz wafel w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez minutę, a następnie w 95 stopniach Celsjusza przez trzy minuty. Aby zmyć nieutwardzony fotorezyst, zanurz wafel w szklanej zlewce zawierającej roztwór wywoływacza, aż nieutwardzony fotorezyst zostanie całkowicie usunięty.

Piecz wafel na twardo w temperaturze 150 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby upewnić się, że wydrukowany wzór jest mocno przymocowany do powierzchni wafla i nie odpadnie w dalszym procesie produkcyjnym. Aby przygotować urządzenie mikroprzepływowe, umieść wafel wzorcowy na kwadratowym kawałku aluminium i owiń folię aluminiową wokół płytki, tworząc dobrze przypominającą strukturę. Delikatnie wylej mieszaninę PDMS na płytkę główną.

Inkubować zestaw w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Aby usunąć zestalony polidimetylosiloksan lub blok PDMS, usuń folię aluminiową, a następnie ostrożnie oderwij blok PDMS od krawędzi płytki.

Weź przezroczyste szklane szkiełko nakrywkowe, wlej około 0,5 mililitra PDMS na środek szkiełka podstawowego i rozprowadź je na szkiełku nakrywkowym, delikatnie przechylając szkiełko podstawowe, zapewniając całkowite pokrycie szkiełka podstawowym PDMS. Zamontuj szkiełko szklane na powlekarce wirowej. Upewnij się, że jest umieszczony centralnie tak, aby środek suwaka zachodził na środek wału dociskowego.

Następnie obracaj szkiełko z prędkością 500 obr./min przez 15 sekund z przyrostem 100 obr./min i 1 000 obr./min przez 30 sekund z przyrostem 500 obr./min. Umieść szkiełko pokryte PDM powlekaną stroną skierowaną do góry na podniesionej platformie, takiej jak blok PDMS na zakrytej szalce Petriego. Piecz w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Umieść blok PDMS tak, aby wygrawerowane kanały były skierowane do góry, a szkiełko pokryte PDM było stroną powlekaną skierowaną do góry, w komorze próżniowej odkurzacza plazmowego. Włącz odkurzacz i wystaw zawartość na działanie plazmy powietrznej o częstotliwości radiowej 12 megaherców przez 15 sekund, aby aktywować powierzchnie. Plazmę tlenową można zobaczyć w postaci różowawego odcienia.

Bezpośrednio po obróbce plazmowej umieść szkiełko pokryte PDMS na czystej powierzchni stroną PDMS skierowaną do góry. Delikatnie umieść blok PDMS tak, aby wzór mikroprzepływowy był teraz skierowany w stronę szkiełka pokrytego PDMS, umożliwiając ich połączenie. Piecz połączone urządzenia w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Dozuj 200 mikrolitrów 5% alkoholu poliwinylowego lub roztworu OVA do 1,5-mililitrowej probówki i podłącz ją do stojaka na zbiornik mikroprzepływowy. Włożyć rurkę w taki sposób, aby jeden koniec był zanurzony w roztworze PVA, a drugi koniec był podłączony do wlotu zewnętrznego kanału wodnego urządzenia mikroprzepływowego. Zwiększ ciśnienie zewnętrznej fazy wodnej do 100 milibarów, aby przepłynąć roztwór PVA w zewnętrznych kanałach wodnych.

Zwiększ ciśnienie wewnętrznych wodnych i przenoszących lipidy faz organicznych do 120 milibarów, aby zapobiec cofaniu się roztworu PVA do tych kanałów. Przepływaj roztwór PVA w ten sposób przez około pięć minut, zapewniając pełną funkcjonalizację kanału wyjściowego. Zwiększ ciśnienie w organicznych i wewnętrznych kanałach wodnych przenoszących lipidy do dwóch barów, aby usunąć roztwór PVA i natychmiast odłącz rurkę od zewnętrznego wlotu wodnego.

Jednocześnie użyj rurki podłączonej do kanału podciśnieniowego, aby usunąć nadmiar PVA z kanału wyjściowego. Piecz urządzenie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 15 minut i pozwól mu ostygnąć przed użyciem. Urządzenie może być przechowywane w warunkach otoczenia przez co najmniej miesiąc.

Dozuj roztwory do trzech 1,5-mililitrowych probówek i zmontuj je. Podłącz je do chipa mikroprzepływowego poddanego działaniu PVA i zastosuj nadciśnienie na trzy kanały, około 100 milibarów na wewnętrznych wodnych i przenoszących lipidy kanałach organicznych oraz około 200 milibarów na zewnętrznym kanale wodnym. Gdy wszystkie trzy fazy zaczną współpłynąć na skrzyżowaniu, upewnij się, że rozpoczyna się podwójna produkcja emulsji i dostosuj ciśnienie do jej jakości.

W miarę przepływu podwójnych kropelek emulsji, wszystkie kieszenie oktanolu stają się coraz bardziej widoczne i w końcu zostają ściśnięte, tworząc liposomy. Pokazano tutaj obraz w jasnym polu szybkiego generowania się podwójnych kropel emulsji. Fluorescencyjny kanał lipidowy pokazuje tworzenie się całej kieszeni oktanolu w wyniku częściowego odwilżania.

Wewnętrzny kanał wodny pokazuje enkapsulację żółtego białka fluorescencyjnego. Odwilżanie kieszeni oktanolu w kanale wyjściowym, która tworzy liposom, pokazano na tym rysunku. Obraz ten przedstawia schemat zależnego od pH przejścia jednorodnego roztworu polilizyny i ATP zamkniętego w liposomie do koacerwatów polilizyny ATP z separacją fazową.

Początkowe kwaśne środowisko w liposomie sprawia, że ładunek molekularny ATP jest obojętny, hamując koacerwację. Kiedy pH wewnątrz liposomów równoważy się ze wzrostem pH zastosowanym zewnętrznie, ATP zyskuje ładunek ujemny, wywołując koacerwację. Na tym rysunku przedstawiono rozkład przestrzenny polilizyny i błony oraz obrazy poklatkowe powstawania koacerwatów polilizyny ATP w liposomach.

Zewnętrzna edycja buforu podstawowego podnosi poziom pH wewnątrz liposomów w ciągu kilku minut i inicjuje koacerwację. T równa się zero minut odnosi się do czasu tuż przed wystąpieniem pierwszego zdarzenia koacerwacji. Podczas demonstrowania procedury ważne jest, aby cierpliwie regulować ciśnienie w kanale, aby wygenerować stałą produkcję podwójnej emulsji.

OLA i jego odmiany zostały wykorzystane w różnych badaniach, na przykład nad wzrostem i podziałem liposomów, zrozumieniem dynamiki kondensatów biomolekularnych, ekspresją białka bez komórek, a także enkapsulacją bakterii. Tak więc, w kontuzjach, uważamy, że OLA jest wszechstronną platformą dla biologii syntetycznej.