Name: Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę OLA do tworzenia monodyspersyjnych liposomów o wysokiej wydajności enkapsulacji w mikrofluidyce. Technika ta umożliwia natychmiastowe eksperymenty na chipie w biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dolf Weijers, Verze Gorelova i Markowi Roosjenowi za uprzejme udostępnienie nam YFP. S.D. dziękuje za wsparcie finansowe od Holenderskiej Rady ds. Badań Naukowych (numer grantu: OCENW. KLEIN.465).

1. Wytwarzanie płytki wzorcowej
<ol>
	<li>Weź czystą płytkę silikonową o średnicy 4 cali (10 cm) (patrz tabela materiałów). Wyczyść go dalej za pomocą sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu.</li>
	<li>Zamontuj wafel na powlekarce wirowej i delikatnie dozuj ~ 5 ml ujemnego fotorezystu (patrz Tabela materiałów) na środku płytki. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zakłócać dalszy proces drukowania płytki.</li>
	<li>Aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 10 μm, należy wirować płytkę z prędkością 500 obr./min przez 30 s z przyspieszeniem 100 obr./min w celu wstępnego rozprowadzenia, a następnie wirować przez 60 s przy 3,000 obr./min z przyspieszeniem 500 obr./min. W przypadku, gdy pożądana jest inna grubość, zmień parametry wirowania zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wafel pieczemy na płycie grzewczej przez 2 minuty w temperaturze 65 °C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Gdy wafel ostygnie, zamontuj go w komorze drukowania maszyny do litografii optycznej do bezpośredniego zapisu (patrz Tabela materiałów) i wprowadź projekt OLA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, Dodatkowy plik kodowania 1) do oprogramowania. 
	UWAGA: Projekt OLA zasadniczo składa się z dwóch kanałów OA, dwóch kanałów LO i jednego kanału IA, które łączą się, tworząc sześciokierunkowe złącze, które kontynuuje jako kanał postprodukcyjny i kończy się w studni eksperymentalnej (EW).</li>
	<li>Wydrukuj wzór(y) OLA na powlekanej płytce za pomocą lasera UV (patrz Tabela materiałów) o dawce 300 mJ/cm2.</li>
	<li>Po wydrukowaniu wzoru piecz wafel w temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>W tym momencie należy upewnić się, że kontur drukowanego urządzenia znajduje się na płytce i jest widoczny gołym okiem. Aby zmyć nieutwardzony fotorezyst, zanurz wafel w szklanej zlewce zawierającej roztwór wywoływacza (patrz tabela materiałów), aż nieutwardzony fotorezystor zostanie całkowicie usunięty. 
	UWAGA: Nadmierne traktowanie wywoływacza może mieć wpływ na rozdzielczość projektu.</li>
	<li>Umyj płytkę kolejno acetonem, izopropanolem i wodą dejonizowaną (DI), a na koniec sprężonym powietrzem/N2 za pomocą pistoletu do przedmuchiwania.</li>
	<li>Piecz wafel na twardo w temperaturze 150 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że wydrukowany wzór jest mocno przymocowany do powierzchni wafla i nie odpada w dalszym procesie wytwarzania. Płytka wzorcowa jest następnie gotowa do dalszego użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Umieść wafel wzorcowy na kwadratowym kawałku aluminium i owiń folię aluminiową wokół wafla, tworząc strukturę przypominającą dobrze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Odmierzyć 40 g polidimetylosiloksanu (PDMS) i 4 g utwardzacza (stosunek wagowy 10:1, patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i energicznie mieszać za pomocą szpatułki lub końcówki pipety przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Energiczne mieszanie PDMS i utwardzacza zatrzymuje pęcherzyki powietrza wewnątrz mieszaniny. Wiruj probówkę o masie 100 x g przez 2-3 minuty, aby usunąć większość dużych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wlać około 15-20 g mieszaniny przygotowanej w kroku 2.3 na płytkę wzorcową i odgazować za pomocą eksykatora. Zachowaj nadmiar mieszanki, aby wykonać szkiełka szklane powlekane PDMS (krok 3).</li>
	<li>Inkubować zespół w piecu w temperaturze 70 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Aby usunąć zestalony blok PDMS, usuń folię aluminiową i ostrożnie oderwij blok PDMS od krawędzi wafla. 
	UWAGA: Wafel jest delikatny i może pęknąć, dlatego ważne jest, aby wykonać ten proces ostrożnie.</li>
	<li>Po usunięciu bloku PDMS utrzymuj wzorzystą strukturę skierowaną do góry i za pomocą ostrego ostrza lub skalpela wytnij poszczególne bloki PDMS, z których każdy zawiera jedno urządzenie mikroprzepływowe.</li>
	<li>Umieść blok PDMS na ciemnej powierzchni i dostosuj kierunek światła (przydaje się do tego lampa stołowa) tak, aby wygrawerowane kanały były błyszczące, a co za tym idzie, widoczne. Wykonać otwory we wlotach i kanale wyjściowym za pomocą stempli biopsyjnych o średnicy odpowiednio 0,5 mm i 3 mm (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Użyj ostrego stempla do biopsji, aby uniknąć pęknięć w PDMS, które mogą później spowodować wyciek. Delikatnie przepchnij stempel biopsyjny przez blok PDMS i upewnij się, że przechodzi przez niego całkowicie. Aby usunąć stempel do biopsji, delikatnie go cofnij, obracając w naprzemiennych kierunkach. Blok PDMS z wygrawerowanym wzorem OLA jest teraz gotowy do oklejenia ze szkiełkiem pokrytym PDMS.</li>
</ol>
3. Wykonanie ślizgu ze szkła pokrytego PDMS
<ol>
	<li>Weź przezroczyste szklane szkiełko nakrywkowe, wlej około 0,5 ml PDMS (przygotowanego w nadmiarze w kroku 2.4) na środek szkiełka podstawowego i rozprowadź go na szkiełku nakrywkowym, delikatnie przechylając szkiełko podstawowe, zapewniając całkowite pokrycie szkiełka podstawowym metodą PDMS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko szklane na powlekarce wirowej, upewnij się, że jest umieszczone centralnie (tak, aby środek szkiełka zachodziło na środek wału dociskowego) i obracaj szkiełko z prędkością 500 obr./min przez 15 s (z krokiem 100 obr./min), a następnie z prędkością 1 000 obr./min przez 30 s (z przyrostem 500 obr./min).</li>
	<li>Umieść szkiełko pokryte PDMS (powlekaną stroną skierowaną do góry) na podniesionej platformie, takiej jak blok PDMS (1 cm x 1 cm) na przykrytej szalce Petriego i piecz w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.</li>
</ol>
4. Wiązanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Wyczyść blok PDMS (przygotowany w kroku 2), dwukrotnie przyklejając i usuwając dostępną w handlu taśmę klejącą (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że oczyszczona strona jest skierowana do góry do czasu użycia.</li>
	<li>Wyczyść szkiełko pokryte PDMS sprężonym powietrzem/N2 za pomocą pistoletu do przedmuchiwania i trzymaj czystą stronę skierowaną do góry.</li>
	<li>Umieść blok PDMS (grawerowane kanały skierowane do góry) i szkiełko pokryte PDMS (powlekaną stroną skierowaną do góry) w komorze próżniowej myjki plazmowej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Włącz próżnię i wystaw zawartość na działanie plazmy powietrznej o częstotliwości radiowej 12 MHz (wysoki tryb RF) przez 15 sekund, aby aktywować powierzchnie. Plazmę tlenową można zobaczyć w postaci różowawego odcienia.</li>
	<li>Bezpośrednio po obróbce plazmowej umieść szkiełko pokryte PDMS na czystej powierzchni stroną PDMS skierowaną do góry. Delikatnie umieść blok PDMS tak, aby wzór mikroprzepływowy był teraz skierowany w stronę szkiełka pokrytego PDMS, umożliwiając im połączenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Usunięcie powietrza uwięzionego w urządzeniu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnego klejenia.</li>
	<li>Piec połączone urządzenia w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.</li>
</ol>
5. Funkcjonalizacja powierzchni urządzenia mikroprzepływowego
UWAGA: Przed funkcjonalizacją powierzchni ważne jest, aby skalibrować pompę ciśnieniową zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów) i zmontować rurkę, aby podłączyć ją do urządzenia mikroprzepływowego.
<ol>
	<li>Podłączenie urządzenia mikroprzepływowego do pomp ciśnieniowych
	<ol>
		<li>Podłączyć ciśnieniowy regulator przepływu do zewnętrznego źródła ciśnienia (do 6 barów). Wymagane są co najmniej cztery niezależne kanały ciśnieniowe: trzy pojedyncze moduły 0-2 bar i jeden moduł -0,9-4 bar.</li>
		<li>Skalibrować pompę ciśnieniową zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przetnij rurkę (1/16 cala średnicy zewnętrznej x 0,02 cala średnicy) na cztery równe kawałki o długości około 20 cm.</li>
		<li>Włóż łączniki 23 G ze stali nierdzewnej wygięte pod kątem pod kątem pod kątem (patrz tabela materiałów) na jednym końcu każdego elementu. Koniec ten jest następnie wkładany do trzech wlotów (OA, LO i IA) urządzenia mikroprzepływowego, a czwarty służy do usuwania nadmiaru roztworu (krok 5.2.5).</li>
		<li>Włóż drugi koniec rurki do stojaka zbiornika mikroprzepływowego i uszczelnij go za pomocą złączek mikroprzepływowych, upewniając się, że rurka jest wystarczająco długa, aby dotykać dna zbiornika (probówki 1.5 ml, patrz Tabela materiałów). Zapobiega to przedostawaniu się niepożądanych pęcherzyków powietrza do urządzenia mikroprzepływowego podczas obróbki PVA/produkcji liposomów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka PVA kanału wyjściowego 
	UWAGA: Przed generacją liposomów ważne jest, aby urządzenie było częściowo hydrofilowe za złączem produkcyjnym. Odbywa się to poprzez traktowanie tych kanałów 5% (w/v) roztworem alkoholu poliwinylowego (PVA). Roztwór PVA przygotowuje się przez rozpuszczenie proszku PVA (patrz tabela materiałów) w wodzie o temperaturze 80 °C przez 3 godziny, ciągle mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Przefiltruj roztwór przed użyciem go do obróbki powierzchni. Bezpośrednio po połączeniu urządzenia, kanały mikroprzepływowe są hydrofilowe z powodu aktywacji powierzchni wywołanej plazmą i stopniowo stają się ponownie hydrofobowe. Zaleca się odczekanie 2 godzin po upieczeniu (krok 4.6) przed rozpoczęciem zabiegu PVA.
	<ol>
		<li>Dozuj 200 μl 5% w/v roztworu PVA do probówki o pojemności 1,5 ml i podłącz ją do stojaka na zbiornik mikroprzepływowy. Włożyć rurkę (tę wymienioną w kroku 5.1.3) w taki sposób, aby jeden koniec był zanurzony w roztworze PVA, a drugi koniec był podłączony do wlotu kanału OA urządzenia mikroprzepływowego. 
		UWAGA: Niższe stężenie PVA może prowadzić do niespełniającej norm funkcjonalności powierzchni.</li>
		<li>Powtórz powyższy krok bez PVA (pusta probówka 1.5 ml) i podłącz ją do kanałów LO i IA.</li>
		<li>Zwiększ ciśnienie fazy OA do 100 mbar, aby przepłynąć roztwór PVA w kanałach OA. Zwiększ ciśnienie faz IA i LO do 120 mbar, aby zapobiec cofaniu się roztworu PVA wewnątrz tych kanałów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
		UWAGA: W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie w poszczególnych kanałach, aby menisk był stabilny na styku produkcyjnym.</li>
		<li>Roztwór PVA należy przepływać w ten sposób przez około 5 minut, zapewniając pełną funkcjonalizację kanału wyjściowego.</li>
		<li>Aby usunąć roztwór PVA, należy odłączyć rurkę od wlotu OA i natychmiast zwiększyć ciśnienie w kanałach LO i IA do 2 barów. Jednocześnie użyj rurki podłączonej do kanału podciśnieniowego (−900 mbar), usuń nadmiar PVA najpierw z kanału wyjściowego, a następnie z wlotu OA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
		<li>Piecz urządzenie w temperaturze 120 °C przez 15 minut i pozwól mu ostygnąć przed użyciem. Urządzenie może być przechowywane w warunkach otoczenia przez co najmniej 1 miesiąc. 
		UWAGA: Zaleca się odczekanie 1 dnia (w temperaturze pokojowej) przed przystąpieniem do stosowania OLA, aby upewnić się, że nieleczony PDMS odzyska hydrofobowość po zabiegu plazmowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zespół liposomów wspomagany oktanolem (OLA)
<ol>
	<li>Przygotowanie zapasu lipidów 
	UWAGA: W tym przypadku jako przykład stosuje się mieszaninę lipidów 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(lisaminy rodaminy B sulfonylu) (Liss Rhod PE) (patrz tabela materiałów); W podobny sposób użytkownicy powinni przygotować potrzebną kompozycję lipidową.
	<ol>
		<li>Dozować 76 μl DOPC (25 mg/ml) i 16,6 μl Liss Rhod PE (1 mg/ml) do kolby okrągłodennej za pomocą oddzielnych szklanych strzykawek.</li>
		<li>Trzymaj kolbę okrągłodenną w pozycji pionowej i użyj sprężonego pistoletu do przedmuchiwaniaN2, aby uzyskać delikatny strumień azotu w celu odparowania chloroformu i utworzenia wysuszonego filmu lipidowego na dnie kolby.</li>
		<li>Umieścić kolbę w eksykatorze na co najmniej 2 godziny w ciągłym podciśnieniu w celu usunięcia pozostałego chloroformu.</li>
		<li>Dodać 100 μl etanolu do kolby okrągłodennej, a następnie delikatnie pipetować lub wstrząsać, aby upewnić się, że lipidy rozpuściły się, tworząc 10% (w/v) zapas lipidów. 
		UWAGA: W przypadku, gdy dana kompozycja lipidowa nie jest całkowicie rozpuszczalna w etanolu, należy użyć mieszaniny etanolu i chloroformu, utrzymując objętość chloroformu tak mało, jak to możliwe.</li>
		<li>Odpipetować roztwór do fiolki z ciemnego szkła. Delikatnie przepłukać fiolkę azotem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania, aby zastąpić powietrze atmosferą obojętną. Uszczelnij pokrywkę folią parafinową i przechowuj w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Roztwór podstawowy może być używany przez okres do kilku miesięcy. Za każdym razem, gdy fiolka jest otwierana, delikatnie zastąp powietrze azotem i ponownie zamknij pokrywką z folią parafinową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów OLA
	<ol>
		<li>Sporządzić roztwory podstawowe niezbędnych składników: 20 mM dekstranu (Mw 6 000), 60% (v/v) glicerolu; bufor z wyboru. W tym przypadku przygotowano 5x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mM Na2HPO4, 9 mM KH2PO4; pH 7,4) (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Ponieważ czysty glicerol ma dużą lepkość, zaleca się wycięcie małego kawałka na końcu końcówki pipety w kierunku skośnym w celu skutecznego pipetowania.</li>
		<li>Przygotować 100 μl próbek IA, OA i roztworu wyjściowego (ES, pożądany roztwór do wypełnienia EW). Dla ułatwienia wizualizacji, w tym konkretnym przypadku do roztworu IA dodano żółte białko fluorescencyjne (YFP). Sprawdź równowagę osmotyczną między IA i OA, obliczając osmolarność zamkniętych składników i dodając odpowiednią ilość cukru lub soli do OA, jeśli to konieczne. Odbywa się to w celu zapobieżenia pękaniu lub kurczeniu się liposomów podczas produkcji. 
		UWAGA: Końcowe kompozycje trzech faz są następujące: 
		IA: 15% glicerol, 5 mM dekstran (Mw 6,000), 5,4 μM YFP, 1x PBS 
		OA: 15% glicerol, 5% F68 środek powierzchniowo czynny, 1x PBS 
		ES: 15% glicerol, 1x PBS 
		Niższe stężenie surfaktantu F68 negatywnie wpływa na wytwarzanie podwójnych emulsji.</li>
		<li>Przygotować 80 μl fazy LO, pipetując 4 μl podstawowego lipidu do 76 μl 1-oktanolu (patrz tabela materiałów). Końcowe stężenie DOPC wynosi 5 mg/ml.</li>
		<li>Odwirować próbki przy 700 x g przez 60 s w celu usunięcia wszelkich dużych agregatów przed przystąpieniem do eksperymentów mikroprzepływowych. Zapobiega to przedostawaniu się do układu mikroprzepływowego jakichkolwiek oczywistych czynników zatykających.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja liposomów
	<ol>
		<li>Dozować roztwory (IA, LO, OA) do trzech probówek o pojemności 1,5 ml, zmontować je (jak wspomniano w kroku 5.1) i podłączyć do chipa mikroprzepływowego poddanego działaniu PVA (krok 5.2.6).</li>
		<li>Zastosuj nadciśnienie na trzech kanałach: ~100 mbar na kanałach IA i LO oraz ~200 mbar na kanale OA. 
		UWAGA: Ponieważ ciśnienie w OA jest wyższe niż w przypadku innych, rozwiązanie OA będzie pierwszym, które dotrze do EW; Jest to wysoce zalecane.</li>
		<li>Gdy roztwór OA dotrze do EW, zmniejsz ciśnienie OA do 100 mbar i zwiększ LO do 200 mbar. Roztwór LO docierający do węzła produkcyjnego prawdopodobnie spowoduje powstawanie pęcherzyków powietrza z powodu wypierania powietrza z kanałów LO. Po dozowaniu pęcherzyków powietrza do EW wyreguluj ciśnienie LO na 100 mbar. Na koniec zwiększ ciśnienie IA do 200 mbar i poczekaj, aż całe powietrze w kanale IA zostanie usunięte. Idealna sekwencja dotarcia do skrzyżowania trzech faz to zatem OA, LO i IA.</li>
		<li>Po usunięciu powietrza z trzech kanałów należy wyregulować ciśnienie wszystkich kanałów do 50 mbar i odpipetować 10 μl ES do komory wyjściowej. Po odpipetowaniu ES umieścić szkiełko zakrywające w otworze wyjściowym, aby uniknąć parowania. W przypadku, gdy LO zostanie odepchnięty, stopniowo zwiększaj ciśnienie LO w krokach co 1 mbar, aż zacznie płynąć do złącza.</li>
		<li>Gdy wszystkie trzy fazy zaczną współpłynąć na skrzyżowaniu, upewnij się, że rozpoczyna się podwójna produkcja emulsji i dostosuj ją do jej jakości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A-C). Zmieniaj ciśnienie stopniowo (co 0,1-1 mbar), a nie gwałtownie, chyba że ciśnienie jest zmieniane w celu wyeliminowania niepożądanego zatkania kanału. 
		UWAGA: Kanały do regulacji zależą od tego, co dzieje się na skrzyżowaniu. Na przykład IA należy zmniejszyć, jeśli emulsje są zbyt duże; choroba zwyrodnieniowa stawów musi być zwiększona, jeśli tworzą się podwójne emulsje, które pękają, a nie zostają ściśnięte; a LO należy zmniejszyć, jeśli kieszeń oktanolu jest zbyt duża.</li>
		<li>Sprawdź, czy kropelki podwójnej emulsji przepływają w dół do EW. W miarę przepływu, kieszenie oktanolowe stają się coraz bardziej widoczne i w końcu zostają ściśnięte, tworząc liposomy (<silna klasa="xfig">Ryc. 3D-F). Upewnij się, że kanał postprodukcyjny jest wystarczająco długi, a migracja podwójnych emulsji jest wystarczająco powolna, aby można było je odwilżyć. 
		UWAGA: W ciągu kilku minut po przyzwoitej produkcji liposomy i kropelki oktanolu opuszczą kanał postprodukcyjny i trafią do EW. W rezultacie, będąc mniej gęste niż woda, kropelki oktanolu unoszą się na powierzchni ES. Ze względu na dodatek dekstranu do IA, liposomy są cięższe niż ich otoczenie i trafiają na dno komory gotowe do obserwacji i dalszej manipulacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Złożoność komórkowa sprawia, że niezwykle trudno jest zrozumieć żywe komórki, gdy są badane jako całość. Zmniejszenie redundancji i wzajemnych połączeń komórek poprzez odtworzenie kluczowych składników in vitro jest niezbędne do pogłębienia naszego zrozumienia systemów biologicznych i stworzenia sztucznych mimik komórkowych do zastosowań biotechnologicznych 22,23,24. Liposomy służą jako doskonały minimalny system do zrozumienia zjawisk komórkowych. Niewyczerpująca lista tych zjawisk obejmuje dynamikę cytoszkieletu i wynikające z niej deformacje błony25,26, czasoprzestrzenną regulację kondensatów biomolekularnych27,28 i ich interakcję z błoną29, enkapsulację szerokiej gamy biomolekuł, w tym bezkomórkowych systemów transkrypcyjno-translacyjnych30, bezkomórkową syntezę lipidów31 i ewolucję białek32, Lokal mieszkalny 33,34. Liposomy są również szeroko stosowane jako nośniki do dostarczania leków i zostały zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA) do użytku klinicznego11. Liposomy i nanocząstki na bazie lipidów są wykorzystywane jako nośniki do dostarczania leków, w tym szczepionek mRNA, takich jak niedawna szczepionka COVID-1935.
W badaniu tym opisano szczegółowy protokół dotyczący fotolitografii, montażu mikroprzepływowego i funkcjonalizacji powierzchni w celu wykonania techniki OLA w celu wygenerowania liposomów na chipie (rysunek 1 i rysunek 3). Liposomy wytwarzane za pomocą OLA są monorozproszone (współczynnik zmienności: 4%-11% średniej) i znajdują się w biologicznym zakresie wielkości komórki (zwykle o średnicy 5-50 μm) i mogą być dostrojone za pomocą odpowiednich prędkości przepływu wewnętrznych i zewnętrznych kanałów wodnych36. Na przykład populacja liposomów widoczna na rysunku 1 ma rozkład wielkości 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Przy typowej szybkości produkcji 10-30 Hz, utworzone liposomy są jednopłytkowe, co wcześniej potwierdzono przez wprowadzenie do błony pojedynczego dwuwarstwowego białka transbłonowego, alfa-hemolizyny36, a także za pomocą testu bielenia ditionianu37. OLA jest również kompatybilna z szeroką gamą kompozycji lipidowych, oferując użytkownikowi elastyczność w doborze lipidów. Co ważne, początkowo zastosowana kompozycja lipidowa znajduje odzwierciedlenie w finalnym składzie liposomowym38.
Ze względu na to, że jest to stosunkowo nowa technologia, istnieje wiele możliwości ulepszenia OLA. Na przykład funkcjonalizacja powierzchni za pomocą PVA jest kluczowa, ale żmudna do wykonania. Łatwiejszy i prostszy sposób na funkcjonalizację powierzchniową urządzenia znacznie skróciłby czas produkcji chipów, a także zmienność między chipami. Środek powierzchniowo czynny Pluronic F68 jest ważnym składnikiem zewnętrznej fazy wodnej w celu wstępnej stabilizacji podwójnych emulsji; Niemniej jednak jego użycie może być w niektórych przypadkach restrykcyjne. Zastąpienie Pluronic F68 bardziej biokompatybilnym środkiem powierzchniowo czynnym lub całkowite usunięcie środka powierzchniowo czynnego może poprawić wszechstronność systemu. Podczas migracji wytworzonych podwójnych emulsji w kanale wyjściowym mogą one pęknąć pod wpływem ścinania. Ulepszenie konstrukcji OLA w celu poprawy stabilności podwójnej emulsji i separacji kieszeni oktanolowych może w ten sposób zwiększyć przepustowość. Niemniej jednak OLA ma kilka zalet, do których należą przede wszystkim skuteczna enkapsulacja, liposomy monorozproszone i jednolamelarne oraz kontrolowane eksperymenty na chipie.
OLA została zastosowana i zaadaptowana w różnorodnym zakresie badań, w tym we wzroście i podziale liposomów39, badaniu procesu separacji faz ciecz-ciecz27 i jego interakcji z błoną21 oraz zrozumieniu tworzenia bioproduktów wzrostu bakterii w liposomach40. Wysokoprzepustowe testy oparte na OLA są również wykorzystywane do zrozumienia transportu jonów przez błonę41 i przepuszczalności leków przez dwuwarstwę lipidową37, jako system dostarczania leków do celów terapeutycznych42, do badania wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na błonę43 oraz jako narzędzie do kapsułkowania ciekłych kryształów44. Oprócz szerokiego zakresu zastosowań technologii OLA, opracowywane są zmodyfikowane wersje OLA dostosowane do konkretnych celów 45,46,47,48,49,50. Ogólnie rzecz biorąc, biorąc pod uwagę zalety i wady, jesteśmy głęboko przekonani, że OLA jest wszechstronną platformą dla biologii syntetycznej.

Wszystkie komórki mają fizyczną granicę błony plazmatycznej, a ta błona jest zasadniczo rusztowaniem w postaci dwuwarstwy lipidowej utworzonej przez samoorganizację amfifilowych cząsteczek lipidowych. Liposomy są minimalnymi syntetycznymi odpowiednikami komórek biologicznych; Mają światło wody otoczone fosfolipidami, które tworzą dwuwarstwę lipidową, w której hydrofilowe grupy głów są skierowane w fazę wodną, a ogony hydrofobowe są zakopane do wewnątrz. Stabilność liposomów zależy od efektu hydrofobowego, a także hydrofilowości między grupami polarnymi, sił van der Waalsa między hydrofobowymi ogonami węglowymi oraz wiązań wodorowych między cząsteczkami wody a hydrofilowymi głowicami1,2. W zależności od liczby dwuwarstw lipidowych liposomy można podzielić na dwie główne kategorie, a mianowicie pęcherzyki jednowarstwowe składające się z jednej dwuwarstwy i pęcherzyki wielolamelarne zbudowane z wielu dwuwarstw. Pęcherzyki jednowarstwowe są dalej klasyfikowane na podstawie ich rozmiarów. Zazwyczaj kuliste w kształcie, mogą być produkowane w różnych rozmiarach, w tym małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV, średnica 30-100 nm), duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV, średnica 100-1000 nm) i wreszcie gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV, średnica >1000 nm)3,4. Do produkcji liposomów opracowano różne techniki, które można podzielić na techniki masowe5 i techniki mikroprzepływowe6. Powszechnie praktykowane techniki masowe obejmują rehydratację filmu lipidowego, elektroformację, transfer odwróconej emulsji i wytłaczanie7,8,9,10. Techniki te są stosunkowo proste i skuteczne, i to są główne powody ich powszechnego stosowania w społeczności biologii syntetycznej. Jednocześnie jednak mają one poważne wady związane z polidyspersyjnością rozmiaru, brakiem kontroli nad blaszkowością i niską wydajnością enkapsulacji7,11. Techniki takie jak enkapsulacja przez ciągłe kropelki (cDICE)12 oraz wystrzeliwanie kropel i filtracja rozmiaru (DSSF)13 do pewnego stopnia przezwyciężają te ograniczenia.
Podejścia mikroprzepływowe zyskują na znaczeniu w ciągu ostatniej dekady. Technologia mikroprzepływowa zapewnia kontrolowane środowisko do manipulowania przepływami płynów w mikrokanałach zdefiniowanych przez użytkownika dzięki charakterystycznemu przepływowi laminarnemu i transferowi masy zdominowanemu przez dyfuzję. Powstałe w ten sposób urządzenia typu lab-on-a-chip oferują unikalne możliwości czasoprzestrzennej kontroli cząsteczek, ze znacznie zmniejszoną objętością próbki i możliwościami multipleksowania14. Opracowano liczne metody mikroprzepływowe do wytwarzania liposomów, w tym natryskiwanie impulsowe15, szablonowanie podwójnej emulsji16, przejściowy wyrzut z membrany17, transfer emulsji kropelkowej18 i ogniskowanie hydrodynamiczne19. Techniki te wytwarzają monorozproszone, jednolamelarne liposomy wielkości komórki o wysokiej skuteczności enkapsulacji i wysokiej przepustowości.
Ten artykuł szczegółowo opisuje procedurę montażu liposomów wspomaganych oktanolem (OLA), wbudowanej w układ metody mikroprzepływowej opartej na hydrodynamicznym mechanizmie szczypania i późniejszego odwadniania rozpuszczalnikiem20 (Rysunek 1). Działanie OLA można odnieść do procesu wydmuchiwania bańki. Złącze sześciodrożne skupia wewnętrzną fazę wodną (IA), dwa strumienie organiczne przenoszące lipidy (LO) i dwa zewnętrzne strumienie wodne (OA) zawierające środki powierzchniowo czynne (OA) w jednym miejscu. W ten sposób powstają podwójne kropelki emulsji woda w wodzie (lipidy + oktanol) w wodzie. Gdy kropelki te przepływają w dół, minimalizacja energii międzyfazowej, zewnętrzny przepływ ścinający i interakcja ze ściankami kanału prowadzą do powstania dwuwarstwy lipidowej na granicy faz, gdy kieszeń rozpuszczalnika ulega odłączeniu, tworząc w ten sposób liposomy jednowarstwowe. W zależności od wielkości kieszeni oktanolowej proces odwadniania może trwać od kilkudziesięciu sekund do kilku minut. Na końcu kanału wyjściowego mniej gęste kropelki oktanolu unoszą się na powierzchni, podczas gdy cięższe liposomy (ze względu na gęstszy zamknięty roztwór) opadają na dno komory wizualizacyjnej, gotowe do eksperymentowania. Jako reprezentatywny eksperyment przedstawiono proces separacji faz ciecz-ciecz (LLPS) wewnątrz liposomów. W tym celu wymagane składniki są zamknięte w liposomach o kwaśnym pH, które zapobiega LLPS. Poprzez zewnętrzne wyzwalanie zmiany pH, a tym samym transbłonowego strumienia protonów, wewnątrz liposomów tworzą się oddzielone fazowo kropelki kondensatu. Podkreśla to skuteczne możliwości systemu OLA w zakresie enkapsulacji i manipulacji.

<table><tbody><tr><td>1-Octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr 297887</td><td></td></tr><tr><td>probówki 1,5 ml</td><td>Fisher scientific</td><td>10451043</td><td>Eppendorf 3810X Polipropylenowe probówki do mikrowirówek</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr A2383</td><td></td></tr><tr><td>Stempel biopsyjny</td><td>Darwin mikrofluidyka</td><td>PT-T983-05</td><td>o średnicy 0,5 mm i 3 mm</td></tr><tr><td>Cytrynian-baza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr 71405</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 31388</td><td>Mr~6,000</td></tr><tr><td>Maszyna do litografii optycznej z bezpośrednim zapisem</td><td>Durham Magneto Optics Ltd</td><td>MicroWriter ML3 Konfiguracja i oprogramowanie dla dzieci</td><td></td></tr><tr><td>DOPC lipid</td><td>Avanti</td><td>SKU:850375C</td><td></td></tr><tr><td>F68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 24040032</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>#1, 24 x 40 mm</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. G2025</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Thermo Scientific Acros</td><td>No. 124630010</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhod PE lipid</td><td>Avanti</td><td>SKU:810150C</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P7793</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Micro resist technology GmbH</td><td>EpoCore 10</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist developer</td><td>micro resist technology GmbH</td><td>mr-Dev 600</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td>PDMS i utwardzacz</td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr P7890</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna&ndash; FITC Oznaczone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr P3543</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>nr P8136</td><td>masa cząsteczkowa 30 000&ndash; 70 000, 87%&ndash; 90% hydrolizowany</td></tr><tr><td>regulator ciśnienia</td><td>Elveflow&nbsp;</td><td>OBK1 Mk3 +</td> <td>Regulator przepływu</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>Magiczna taśma Niewidoczna taśma</td><td></td><td></td>matowa</tr><tr><td>Wafel silikonowy</td><td>Materiały silikonowe</td><td>0620R16002</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa&nbsp;</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>Model WS-650MZ-23NPP</td><td></td></tr><tr><td>Stal nierdzewna 90&deg; Gięte łączniki PDMS</td><td>Mikrofluidyka Darwin</td><td>PN-BEN-23G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 252859</td><td></td></tr><tr><td>Tygon rurki</td><td>Darwin microfluidics</td><td>1/16" OD x 0,02" ID</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Długość fali 365 nm</td></tr></tbody></table>

wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Mikrofluidyka jest szeroko stosowanym narzędziem do generowania kropelek i pęcherzyków różnego rodzaju w sposób kontrolowany i wysokoprzepustowy. Liposomy to uproszczone mimiki komórkowe składające się z wodnego wnętrza otoczonego dwuwarstwą lipidową; Są one cenne w projektowaniu komórek syntetycznych i zrozumieniu podstaw komórek biologicznych w warunkach in vitro, a także są ważne dla nauk stosowanych, takich jak dostarczanie ładunków do zastosowań terapeutycznych. W tym artykule opisano szczegółowy protokół pracy dla wbudowanej w układ techniki mikroprzepływowej, montażu liposomów wspomaganego oktanolem (OLA), w celu wytworzenia monorozproszonych, mikronowych, biokompatybilnych liposomów. OLA działa podobnie do wydmuchiwania pęcherzyków, w którym wewnętrzna faza wodna (IA) i otaczająca ją faza 1-oktanolowa przenosząca lipidy są ściskane przez zewnętrzne strumienie płynów zawierające środek powierzchniowo czynny. To łatwo generuje podwójne kropelki emulsji z wystającymi kieszeniami oktanolowymi. Gdy dwuwarstwa lipidowa gromadzi się na granicy kropel, kieszeń spontanicznie odłącza się, powodując powstanie jednowarstwowego liposomu, który jest gotowy do dalszej manipulacji i eksperymentów. OLA zapewnia kilka korzyści, takich jak stałe wytwarzanie liposomów (>10 Hz), wydajna enkapsulacja biomateriałów i monorozproszone populacje liposomów oraz wymaga bardzo małych objętości próbek (~50 μL), co może mieć kluczowe znaczenie podczas pracy z cennymi substancjami biologicznymi. Badanie zawiera szczegółowe informacje na temat mikrowytwarzania, miękkiej litografii i pasywacji powierzchni, które są potrzebne do wprowadzenia technologii OLA w laboratorium. Dowodem słuszności zasady jest również zastosowanie biologii syntetycznej poprzez indukowanie tworzenia kondensatów biomolekularnych wewnątrz liposomów za pomocą transbłonowego strumienia protonów. Oczekuje się, że ten towarzyszący protokół wideo ułatwi czytelnikom ustanowienie i rozwiązywanie problemów z OLA w ich laboratoriach.

Niniejsze badanie demonstruje tworzenie się kondensatów bezbłonowych poprzez proces rozdzielania faz ciecz-ciecz (LLPS) wewnątrz liposomów w ramach reprezentatywnego eksperymentu.
Przygotowanie próbek 
Roztwory IA, OA, ES oraz roztwór zasilający (FS) przygotowuje się w następujący sposób:
IA: 12% glicerolu, 5 mM dekstranu, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lizyny (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lizyny znakowanej FITC (PLL-FITC), 8 mM trifosforanu adenozyny (ATP), 15 mM cytrynianu HCl (pH 4)
OA: 12% v/v glicerolu, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM cytrynianu-HCl (pH 4)
ES: 12% glicerolu, 150 mM KCl, 15 mM cytrynianu-HCl (pH 4)
FS: 12% glicerolu, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)
Tworzenie kondensatu wewnątrz liposomów 
W celu zademonstrowania zjawiska LLPS w liposomach wybrano prosty test pH-zależnej koaczerwacji kompleksowej dodatnio naładowanej poli-L-lizyny (PLL) oraz ujemnie naładowanego wielowartościowego trifosforanu adenozyny (ATP). Aby zapobiec separacji faz polilizyny i ATP podczas enkapsulacji, pH roztworu utrzymywano na poziomie 4, przy którym ATP jest obojętne. Zwiększenie pH ES poprzez dodanie FS (buforu o pH 9) ostatecznie podniosło pH wewnątrz liposomów na skutek transmembrane proton flux, co nadało ATP ładunek ujemny i wywołało jego separację fazową z dodatnio naładowaną PLL21 (Rycina 4A). Po około 2 h generowania liposomów wyłączono ciśnienia IA i LO. Ciśnienie w kanale OA utrzymano na poziomie 100 mbar, aby powoli wprowadzić pozostałe liposomy do komory obserwacyjnej. Gdy wszystkie liposomy w kanale zostały odzyskane w EW, wyłączono ciśnienia, aby zatrzymać przepływ i zapobiec przemieszczaniu się liposomów. Liposomy wygenerowane przy niższym pH wykazywały jednorodną fluorescencję (pochodzącą od enkapsulowanej fluorescencyjnej PLL-FITC) w ich lumenie (Rycina 4B,D). Krople oktanolu unoszące się na powierzchni usunięto, ostrożnie odpipetowując 5 µL roztworu z góry, aby zapobiec ich wpływowi na kolejne etapy pipetowania. Następnie do EW dodano 10 µL buforu FS, co wywołało separację faz enkapsulowanych PLL i ATP. Jednorodna fluorescencja FITC z każdego liposomu stopniowo przekształciła się w wyraźne fluorescencyjne kropelki kondensatu. Ostatecznie poszczególne kropelki połączyły się w jedną większą kroplę kondensatu, która swobodnie dyfundowała wewnątrz liposomów (Rycina 4C,E-G).
<img alt="Schemat zestawu do produkcji podwójnych emulsji; tworzenie liposomów i kieszonek w systemie mikroprzepływowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający budowę i zasadę działania OLA. Sterownik ciśnienia jest połączony z rezerwuarami zawierającymi zewnętrzne roztwory wodne, roztwór lipidów w oktanolu oraz wewnętrzne roztwory wodne. Rurki wprowadzone do rezerwuarów są połączone z odpowiednimi wlotami urządzenia OLA. Odpowiednie przepływy w trzech kanałach prowadzą do powstania podwójnych emulsji typu woda-w-(lipidy-w-oktanolu)-w-wodzie. Powstałe podwójne emulsje przemieszczają się do otworu wylotowego, podczas czego kieszonki oktanolu oddzielają się, tworząc liposomy. Powstałe liposomy są gromadzone na dnie otworu w celu wizualizacji i dalszych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces mikrofabrykacji: fotolitografia, wykonanie urządzenia, obróbka powierzchni w sekwencji schematycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie chipa OLA (fotolitografia, mikrofabrykacja, obróbka powierzchni). (A) Projekt cyfrowy przedstawiający kluczowe cechy konstrukcji OLA, w tym trzy wloty, jeden wylot i sześciodrożny węzeł produkcyjny. (B) Schemat matrycy (master wafer) pokazujący wiele projektów OLA wykonanych za pomocą litografii UV. (C) Elastomer PDMS odlany na matrycy, umieszczony w wgłębieniu wykonanym z folii aluminiowej i utwardzony poprzez wygrzewanie w 70 °C przez 2 h. (D) Urządzenie mikrofluidyczne połączone za pomocą obróbki plazmą tlenową, w którym blok PDMS zawierający strukturę OLA jest przymocowany do szkiełka przedmiotowego pokrytego PDMS. (E) Funkcjonalizacja powierzchni wykonanego chipa w celu nadania urządzeniu częściowej hydrofilowości. Odbywa się to poprzez przepływ 5% w/v PVA przez 5 min z zewnętrznego kanału wodnego w kierunku kanału wylotowego. Dodatnie ciśnienie powietrza w pozostałych kanałach zapobiega przedostawaniu się roztworu PVA do tych kanałów. (F) PVA jest usuwane poprzez zastosowanie próżni w kanale wylotowym. Urządzenie jest wygrzewane w 120 °C przez 15 min, po czym jest gotowe do użycia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Mikrofluidyczna enkapsulacja lipidów; mikroskopia w polu jasnym i fluorescencyjna; tworzenie liposomów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Demonstracja wydajnego wytwarzania monodyspersyjnych podwójnych emulsji i w konsekwencji liposomów o doskonałej enkapsulacji za pomocą metody OLA. (A) Obraz w polu jasnym pokazujący szybkie generowanie kropli podwójnej emulsji. (B) Fluorescencyjny kanał lipidowy pokazuje powstanie kieszeni oktanolowej w wyniku częściowego odwodnienia powierzchni (dewettingu). Faza lipid-w-oktanolu zawierała mieszaninę DOPC (5 mg/mL) i Lis Rhod PE w stosunku 1 000:1. (C) Wewnętrzny kanał wodny pokazujący enkapsulację żółtego białka fluorescencyjnego (YFP). Wstawki w (A-C) przedstawiają reprezentatywne powiększenia odpowiednich paneli (skala = 10 µm). (D-F) Odwodnienie powierzchni (dewetting) kieszeni oktanolowej w kanale wylotowym, prowadzące do powstania liposomu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Koacerwacja polilizyny/ATP wywołana zmianą pH; obrazy mikroskopowe, wykresy intensywności w funkcji odległości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wywołane zmianą pH rozdzielenie faz ciecz-ciecz pLL/ATP wewnątrz liposomów. (A) Schemat zależnego od pH przejścia z jednorodnego roztworu pLL i ATP zamkniętego wewnątrz liposomu (lewo) do rozdzielonych faz koacerwatów pLL/ATP (prawo). Początkowe kwaśne środowisko w liposomie sprawia, że ładunek cząsteczkowy ATP jest obojętny, co hamuje koacerwację. Gdy pH wewnątrz liposomów wyrównuje się z zewnętrznie zastosowanym wzrostem pH, ATP zyskuje ładunek ujemny, co wywołuje koacerwację. (B-C) Wykresy liniowe (odpowiadające liniom przerywanym w panelach [D] i [G], odpowiednio) pokazujące rozkład przestrzenny pLL (kanał zielony) i błony (kanał czerwony). (D-G) Obrazy z serii czasowej pokazujące tworzenie się koacerwatów pLL/ATP wewnątrz liposomów. Zewnętrzne dodanie buforu zasadowego podnosi poziom pH wewnątrz liposomów w ciągu kilku minut i inicjuje koacerwację. t = 0 min odnosi się do czasu tuż przed wystąpieniem pierwszego zdarzenia koacerwacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik kodowania uzupełniający 1: Plik CAD projektu OLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/OLA%20device%20design.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are ...

OLA to wszechstronna platforma mikroprzepływowa przydatna dla społeczności zajmującej się biologią syntetyczną, a w szczególności do bioinżynierii sztucznych komórek. Liposomy oparte na OLA mogą pomóc nam zrozumieć zasady samoorganizacji w biologii i skonstruować zespoły naśladujące komórki.OLA wytwarza monorozproszone, jednolipoaminowe liposomy wielkości komórki w sposób wysokoprzepustowy i o doskonałej skuteczności enkapsulacji. Wymaga bardzo małych objętości próbek, rzędu 50 mikrolitrów, a uformowane liposomy są natychmiast dostępne do dalszych eksperymentów na chipie. OLA jest przydatna do badania reakcji biologicznych w mikroograniczeniach, dynamiki pęcherzyków i kondensatów biomolekularnych oraz ich interakcji z błonami.OLA znalazła również zastosowanie jako wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych leków, na przykład do badania przepuszczalności i aktywności błonowej środków przeciwdrobnoustrojowych. Funkcjonalizacja powierzchni, która jest obróbką PV, jest krytycznym krokiem dla protokołu i musi być starannie wykonana, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu PV do wewnętrznych kanałów organicznych przenoszących lipidy. Ponadto kanał postprodukcyjny powinien być wystarczająco długi, aby oddzielenie kieszeni oktanolu utworzyło liposomy.Ketan Ganar, doktorant z mojego laboratorium, pomoże Chang Chenowi zademonstrować tę procedurę. Na początek weź czystą płytkę silikonową o średnicy czterech cali i wyczyść ją dalej za pomocą sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu. Zamontuj wafel na powlekarce wirowej i delikatnie dozuj około pięciu mililitrów ujemnego fotorezystu w środku płytki.Aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 10 mikrometrów, ustaw ustawienia powłoki wirowej na 500 obr./min na 30 sekund z przyspieszeniem 100 RRP na sekundę dla początkowego rozprowadzania, a następnie 60-sekundowe wirowanie przy 3 000 obr./min z przyspieszeniem 500 obr./min na sekundę. Następnie obtoczyć wafel w wirówce. Wafelek pieczemy na blasze grzewczej przez dwie minuty w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Gdy wafel ostygnie, zamontuj go w komorze drukowania bezpośredniej prawej optycznej maszyny litograficznej i wprowadź do oprogramowania zespół liposomów wspomagany oktanolem lub projekt OLA. Po wydrukowaniu wzoru piecz wafel w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez minutę, a następnie w 95 stopniach Celsjusza przez trzy minuty. Aby zmyć nieutwardzony fotorezyst, zanurz wafel w szklanej zlewce zawierającej roztwór wywoływacza, aż nieutwardzony fotorezyst zostanie całkowicie usunięty.Piecz wafel na twardo w temperaturze 150 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby upewnić się, że wydrukowany wzór jest mocno przymocowany do powierzchni wafla i nie odpadnie w dalszym procesie produkcyjnym. Aby przygotować urządzenie mikroprzepływowe, umieść wafel wzorcowy na kwadratowym kawałku aluminium i owiń folię aluminiową wokół płytki, tworząc dobrze przypominającą strukturę. Delikatnie wylej mieszaninę PDMS na płytkę główną.Inkubować zestaw w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Aby usunąć zestalony polidimetylosiloksan lub blok PDMS, usuń folię aluminiową, a następnie ostrożnie oderwij blok PDMS od krawędzi płytki.Weź przezroczyste szklane szkiełko nakrywkowe, wlej około 0,5 mililitra PDMS na środek szkiełka podstawowego i rozprowadź je na szkiełku nakrywkowym, delikatnie przechylając szkiełko podstawowe, zapewniając całkowite pokrycie szkiełka podstawowym PDMS. Zamontuj szkiełko szklane na powlekarce wirowej. Upewnij się, że jest umieszczony centralnie tak, aby środek suwaka zachodził na środek wału dociskowego.Następnie obracaj szkiełko z prędkością 500 obr./min przez 15 sekund z przyrostem 100 obr./min i 1 000 obr./min przez 30 sekund z przyrostem 500 obr./min. Umieść szkiełko pokryte PDM powlekaną stroną skierowaną do góry na podniesionej platformie, takiej jak blok PDMS na zakrytej szalce Petriego. Piecz w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Umieść blok PDMS tak, aby wygrawerowane kanały były skierowane do góry, a szkiełko pokryte PDM było stroną powlekaną skierowaną do góry, w komorze próżniowej odkurzacza plazmowego. Włącz odkurzacz i wystaw zawartość na działanie plazmy powietrznej o częstotliwości radiowej 12 megaherców przez 15 sekund, aby aktywować powierzchnie. Plazmę tlenową można zobaczyć w postaci różowawego odcienia.Bezpośrednio po obróbce plazmowej umieść szkiełko pokryte PDMS na czystej powierzchni stroną PDMS skierowaną do góry. Delikatnie umieść blok PDMS tak, aby wzór mikroprzepływowy był teraz skierowany w stronę szkiełka pokrytego PDMS, umożliwiając ich połączenie. Piecz połączone urządzenia w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Dozuj 200 mikrolitrów 5% alkoholu poliwinylowego lub roztworu OVA do 1,5-mililitrowej probówki i podłącz ją do stojaka na zbiornik mikroprzepływowy. Włożyć rurkę w taki sposób, aby jeden koniec był zanurzony w roztworze PVA, a drugi koniec był podłączony do wlotu zewnętrznego kanału wodnego urządzenia mikroprzepływowego. Zwiększ ciśnienie zewnętrznej fazy wodnej do 100 milibarów, aby przepłynąć roztwór PVA w zewnętrznych kanałach wodnych.Zwiększ ciśnienie wewnętrznych wodnych i przenoszących lipidy faz organicznych do 120 milibarów, aby zapobiec cofaniu się roztworu PVA do tych kanałów. Przepływaj roztwór PVA w ten sposób przez około pięć minut, zapewniając pełną funkcjonalizację kanału wyjściowego. Zwiększ ciśnienie w organicznych i wewnętrznych kanałach wodnych przenoszących lipidy do dwóch barów, aby usunąć roztwór PVA i natychmiast odłącz rurkę od zewnętrznego wlotu wodnego.Jednocześnie użyj rurki podłączonej do kanału podciśnieniowego, aby usunąć nadmiar PVA z kanału wyjściowego. Piecz urządzenie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 15 minut i pozwól mu ostygnąć przed użyciem. Urządzenie może być przechowywane w warunkach otoczenia przez co najmniej miesiąc.Dozuj roztwory do trzech 1,5-mililitrowych probówek i zmontuj je. Podłącz je do chipa mikroprzepływowego poddanego działaniu PVA i zastosuj nadciśnienie na trzy kanały, około 100 milibarów na wewnętrznych wodnych i przenoszących lipidy kanałach organicznych oraz około 200 milibarów na zewnętrznym kanale wodnym. Gdy wszystkie trzy fazy zaczną współpłynąć na skrzyżowaniu, upewnij się, że rozpoczyna się podwójna produkcja emulsji i dostosuj ciśnienie do jej jakości.W miarę przepływu podwójnych kropelek emulsji, wszystkie kieszenie oktanolu stają się coraz bardziej widoczne i w końcu zostają ściśnięte, tworząc liposomy. Pokazano tutaj obraz w jasnym polu szybkiego generowania się podwójnych kropel emulsji. Fluorescencyjny kanał lipidowy pokazuje tworzenie się całej kieszeni oktanolu w wyniku częściowego odwilżania.Wewnętrzny kanał wodny pokazuje enkapsulację żółtego białka fluorescencyjnego. Odwilżanie kieszeni oktanolu w kanale wyjściowym, która tworzy liposom, pokazano na tym rysunku. Obraz ten przedstawia schemat zależnego od pH przejścia jednorodnego roztworu polilizyny i ATP zamkniętego w liposomie do koacerwatów polilizyny ATP z separacją fazową.Początkowe kwaśne środowisko w liposomie sprawia, że ładunek molekularny ATP jest obojętny, hamując koacerwację. Kiedy pH wewnątrz liposomów równoważy się ze wzrostem pH zastosowanym zewnętrznie, ATP zyskuje ładunek ujemny, wywołując koacerwację. Na tym rysunku przedstawiono rozkład przestrzenny polilizyny i błony oraz obrazy poklatkowe powstawania koacerwatów polilizyny ATP w liposomach.Zewnętrzna edycja buforu podstawowego podnosi poziom pH wewnątrz liposomów w ciągu kilku minut i inicjuje koacerwację. T równa się zero minut odnosi się do czasu tuż przed wystąpieniem pierwszego zdarzenia koacerwacji. Podczas demonstrowania procedury ważne jest, aby cierpliwie regulować ciśnienie w kanale, aby wygenerować stałą produkcję podwójnej emulsji.OLA i jego odmiany zostały wykorzystane w różnych badaniach, na przykład nad wzrostem i podziałem liposomów, zrozumieniem dynamiki kondensatów biomolekularnych, ekspresją białka bez komórek, a także enkapsulacją bakterii. Tak więc, w kontuzjach, uważamy, że OLA jest wszechstronną platformą dla biologii syntetycznej.

on-chip-octanol-assisted-liposome-assembly-for-bioengineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Informujemy o inteligentnym zastosowaniu nanorurek węglowych do kinetycznej stabilizacji cząsteczek lipidowych, które zawierają samoorganizujące się nanostruktury w swoich rdzeniach. Przygotowanie cząsteczek lipidowych wymaga raczej niskich stężeń nanorurek węglowych, co pozwala na ich wykorzystanie w zastosowaniach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków.

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Poznaj metodę OLA do tworzenia monodyspersyjnych liposomów o wysokiej wydajności enkapsulacji w mikrofluidyce. Technika ta umożliwia natychmiastowe eksperymenty na chipie w biologii syntetycznej.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Przeglądaj więcej filmów