Metoda badania korelacji między lokalną strukturą kolagenu a właściwościami mechanicznymi tkanki włóknistej blaszki miażdżycowej

Protokół ten umożliwia lokalną ocenę zarówno architektury kolagenu, jak i charakterystyki uszkodzeń mechanicznych tkanki płytki włóknistej. Ponieważ zarówno ocena strukturalna, jak i mechaniczna została przeprowadzona na tej samej próbce tkanki, technika ta pozwala na rozwikłanie funkcjonalnego związku między oceną strukturalną i mechaniczną tkanki. Wiedza uzyskana dzięki temu protokołowi na temat struktury tkanki płytki włóknistej i charakterystyki uszkodzeń ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania i przewidywania klinicznych śmiertelnych zdarzeń wywołanych pęknięciem blaszki miażdżycowej.

Na początek rozetnij płytkę nazębną wzdłuż osi podłużnej tętnicy za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety. Z próbek płytki nazębnej należy wyciąć prostokątne próbki do badań, upewniając się, że próbki są jak największe, unikając jednocześnie obszarów tkanek zawierających rozdarcia lub zwapnienia. Następnie weź próbkę do badania płytki nazębnej i przymocuj oba jej końce do silikonu, wbijając igły w tkankę.

Włóż igły w obszar próbki, który będzie znajdował się w zaciskach urządzenia do prób rozciągania podczas próby mechanicznej. Załóż okulary ochronne. Użyj bocznego noża, aby skrócić igły, aby wystawały mniej niż kilka milimetrów ponad powierzchnię próbki, aby zapobiec uszkodzeniu obiektywu mikroskopu.

Wypełnić szalkę Petriego PBS, aż próbka zostanie zanurzona. Następnie włącz system mikroskopu, przekręć wielofotonowy i otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu. Umieścić szalkę Petriego zawierającą badaną próbkę pod obiektywem i opuścić obiektyw mikroskopu.

Włącz tryb skanowania na żywo. Przesuń obiektyw do rogu próbki za pomocą pokręteł na panelu inteligentnym i kliknij symbol pozycji znacznika w panelu Skanowanie kafelków. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, siatka ze wszystkimi wybranymi kafelkami do obrazowania pojawi się na pomarańczowo.

Następnie kliknij przycisk Start w prawym dolnym rogu ekranu, aby utworzyć skan kafelków całej powierzchni próbki w celu uzyskania przeglądu geometrii próbki. Po zeskanowaniu kafelków zwróć uwagę na współrzędne X i Y w lewym górnym rogu lewego górnego kafelka w panelu Skanowanie kafelków, który zostanie wyświetlony automatycznie. Zanotuj te współrzędne w arkuszu kalkulacyjnym.

W panelu Skanowanie kafelków obserwuj liczbę kafelków w kierunkach X i Y w polu o nazwie ScanField. Zwróć uwagę na rozmiar skanu kafelka w arkuszu kalkulacyjnym. Oblicz współrzędne innych kafelków, dodając lub odejmując rozmiar kafelka

Ze skanowania kafelków wybierz kafelki, które mają być obrazowane za pomocą drugiej generacji harmonicznych lub obrazowania SHG. Przy wyborze unikaj płytek w zaciskach i pozostaw jedną płytkę między każdą wybraną płytką zarówno w kierunku wzdłużnym, jak i obwodowym. Następnie określ lokalizację kafelków, które mają zostać zobrazowane, korzystając ze współrzędnych obliczonych w tym arkuszu kalkulacyjnym.

Wypełnij współrzędne w wyznaczonych polach i kliknij Enter, aby cel przeniósł się na prawy kafelek. Włącz tryb skanowania na żywo. Zwiększ moc lasera wielofotonowego lub MP za pomocą suwaka w górnym panelu i ustawień ścieżki wiązki, aby uzyskać najwyższą możliwą moc lasera bez znacznego wybielania.

Następnie dostosuj wzmocnienie detektora, aby uzyskać jasne obrazy bez nasyconych pikseli, za pomocą pokrętła na inteligentnym panelu lub klikając w nazwę detektora oraz ustawienia ścieżki wiązki i dodatkowych kanałów. Typowe wartości wzmocnienia detektora wynoszą od 500 do 800 woltów. Użyj pokrętła pozycji Z na inteligentnym panelu, aby wyregulować płaszczyznę ostrości.

Następnie przejdź do górnej części próbki i ustaw pozycje górnej części stosu Z, klikając grot strzałki w panelu stosu Z na karcie Akwizycja z trzeciego panelu. Następnie skoncentruj się na próbce, aż sygnał SHG przestanie być wykrywany. Ponownie kliknij grot strzałki w panelu Z-stack, aby ustawić tę pozycję.

Po zakończeniu wyłącz tryb skanowania na żywo. Na karcie Akwizycja w drugim panelu utrzymuj prędkość skanowania na poziomie 400 herców, ustaw średnią linii na dwa, a rozdzielczość na 512 na 512 pikseli na obraz, korzystając z list rozwijanych. Włącz przycisk Dwukierunkowe skanowanie X.

Kliknij rozmiar kroku z w panelu stosu Z i wypełnij rozmiar kroku z wynoszący trzy mikrony w polu. Kliknij Start w prawym dolnym rogu ekranu, aby utworzyć stos Z. Po zakończeniu zapisz współrzędne kafelka w nazwie pliku lub nadaj każdemu kafelkowi jego numer.

Po zobrazowaniu próbka poddawana jest badaniom mechanicznym. Aby wygenerować wzór szpachlówki, przytrzymaj aerograf wypełniony barwnikiem tkankowym w odległości około 30 centymetrów od badanej próbki i spryskaj nim powierzchnię światła. Następnie, w przypadku jednoosiowej próby rozciągania, umieść próbkę w zaciskach testera rozciągania tak, aby kierunek obwodowy próbki był wyrównany z kierunkiem rozciągania przy rozciąganiu, a stroną świetlną próbki była skierowana do góry.

Upewnij się, że początkowa długość miernika jest ustawiona tak, aby stosunek szerokości do długości paska był mniejszy niż jeden. Dokręć uchwytów, dokręcając śrubometrem o wartości 20 centyniunometrów za pomocą śrubokręta dynamometrycznego. Dodać PBS do łaźni grzewczej, aż próbka zostanie zanurzona.

Rozerwij ogniwo obciążnikowe i rozpocznij rejestrowanie globalnych pomiarów siły i przemieszczenia z ogniwa obciążnikowego i siłownika testera rozciągania. Wyprostuj próbkę, stosując wstępne rozciąganie o wartości 0,05 niutona, aby pozbyć się luzu w próbce. Wykonaj 10 cykli kondycjonowania wstępnego, z naprężeniem do 10%, w oparciu o pomiar długości miernika przez siłownik po zastosowaniu wstępnego rozciągania.

Rozpocznij jednoosiową próbę rozciągania aż do całkowitego uszkodzenia próbki, jednocześnie nagrywając film z deformacji próbki za pomocą szybkiej kamery. Po awarii przestań rejestrować globalne pomiary siły i przemieszczenia. Otwórz stosy Z uzyskane podczas mikroskopii wielofotonowej (MPM) z SHG na obrazie J i utwórz projekcje maksymalnej intensywności lub MIP dla każdego stosu Z.

Przeanalizuj każdy MIP za pomocą narzędzia do analizy orientacji włókien opartego na oprogramowaniu open source MATLAB, aby zmierzyć kąt orientacji poszczególnych włókien kolagenowych obecnych w płytkach. Użyj innego narzędzia opartego na MATLAB, FibLab, aby dopasować rozkład Gaussa do histogramu rozkładu kątów. Z wykresu rozkładu Gaussa wyodrębnij parametry strukturalne, takie jak dominujący kąt włókna, który jest trybem rozkładu, odchylenie standardowe rozkładu kąta włókna i frakcja anizotropowa.

Przeprowadź oględziny obrazów z kamery, aby zidentyfikować klatkę, w której następuje inicjacja pęknięcia. Wizualnie zidentyfikuj miejsce pęknięcia. Wykonaj analizę cyfrowej korelacji obrazu (DIC) za pomocą oprogramowania ncorr opartego na MATLAB, korzystając z obrazów z kamery zarejestrowanych podczas próby rozciągania.

Zaznacz ostatnią klatkę przed ostatecznym rozciąganiem aż do niepowodzenia jako obraz referencyjny. Dla bieżących obrazów wybierz wszystkie obrazy od początku końcowego rozciągania do ostatniej klatki przed klatką, w której nastąpiło zainicjowanie zerwania. Wybierz przykładową powierzchnię jako obszar zainteresowania lub ROI.

Wyklucz obszary, które znajdują się w pobliżu zacisków. Wykonaj DIC, ustawiając promień podzbioru parametru na 30 pikseli, odstępy między podzbiorami na trzy piksele, odcięcie iteracji na 50, normę odcięcia wektora różnicy na 10 do potęgi pięciu, promień odkształcenia na pięć i krok autopropagacji na pięć. Z analizy DIC za pomocą ncorr uzyskaj rozkłady odkształceń Greena-LaGrange'a lub Eulera ROI.

Użyj tych rozkładów odkształceń, aby obliczyć średnie odkształcenie Greena-LaGrange'a na całej powierzchni próbki płytki nazębnej w ostatniej klatce przed pęknięciem. Oblicz odkształcenie Greena-LaGrange'a w miejscu pęknięcia. Korzystając z naturalnych punktów orientacyjnych w próbce testowej, nałóż obraz referencyjny i skan płytki, aby zidentyfikować miejsce pęknięcia na skanie płytki.

Zidentyfikuj płytkę MPM-SHG, w której nastąpiło pęknięcie. Jeśli pęknięcie nie znajduje się na kafelku zeskanowanym za pomocą MPM-SHG, zidentyfikuj płytkę znajdującą się najbliżej miejsca pęknięcia. Uzyskaj parametry konstrukcyjne znalezione na płytce, na której nastąpiło pęknięcie.

Pokazano tutaj świeżą i nienaruszoną próbkę płytki nazębnej z niewielkimi lub żadnymi rozdarciami i makrozwapnieniami. Próbki płytki nazębnej mogą być pobierane z obszarów, które nie obejmują tych rozdarć i zwapnień. Obrazowanie SHG i przetwarzanie końcowe obrazu zapewniają MIP-y z każdego obrazowanego kafelka.

Dalsza obróbka końcowa poprzez detekcję włókien daje histogramy orientacji włókien, z których można wyodrębnić parametry strukturalne kolagenu. Ponadto do analizy wizualnej uzyskuje się mapy barwne przedstawiające lokalne parametry strukturalne kolagenu w całej próbce płytki nazębnej. Z tych próbek testowych zaobserwowano dużą zmienność parametrów strukturalnych kolagenu w obrębie próby.

Wykazano tutaj inicjację pęknięcia i propagację w próbce tkanki blaszki miażdżycowej podczas próby rozciągania. Cyfrowa analiza korelacji obrazu zapewnia lokalne mapy deformacji tkanek, takie jak mapy odkształceń Greena-LaGrange'a. Na podstawie tych map szczepów zaobserwowano dużą zmienność w obrębie próbki w lokalnych szczepach.

Po zidentyfikowaniu miejsca pęknięcia na nagraniach z kamery, można je odwzorować z powrotem na obraz referencyjny z kamery i skan kafelka mikroskopowego. W ten sposób otrzymujemy płytkę MPM-SHG, w której nastąpiło pęknięcie i parametry konstrukcyjne znajdujące się na tej płytce. Uzyskanie próbek tkanek włóknistych, które są wolne od zwapnień i mają wystarczająco duży rozmiar, aby można je było poddać testom mechanicznym, może być trudnym zadaniem w przypadku silnie zwapnionych blaszek.

Po zidentyfikowaniu cechy mechanicznej lub strukturalnej jako predyktora niewydolności tkanki płytki nazębnej, system obrazowania in vivo mierzący tę cechę pozwoli przewidzieć ryzyko pęknięcia blaszki miażdżycowej u pacjentów.