Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów
30 czerwca 2023
Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.
Zaprojektowaliśmy modele 3D tkanki płucnej, aby pomóc światu łatwiej oddychać. Naszą misją jest wykorzystanie biomateriałów 3D i technik, takich jak druk 3D, do budowania platform, które pomogą nam zrozumieć, co powoduje przewlekłe choroby płuc i jak lepiej leczyć te schorzenia. Jednym z eksperymentalnych wyzwań w naszych badaniach jest trudność drukowania 3D miękkich materiałów w skomplikowane kształty.
Precyzyjnie osadzamy komórki, drukując nasz biotusz w kąpieli podporowej rozrzedzonej ścinaniem, która pomaga zachować ich kształt podczas procesu drukowania. Nasze biomateriały zapewniają kontrolę nad właściwościami mechanicznymi próbki przez cały czas trwania eksperymentu. Ta formuła pozwala naukowcom hodować komórki w hydrożelu, który odpowiada sztywności zarówno zdrowej, jak i chorej tkanki płucnej.
Użytkownicy mogą decydować, kiedy usztywnić próbki i zmierzyć odpowiedzi komórkowe. Fotodostrajalne biomateriały użyte w tym protokole pozwalają na stworzenie zmiękczonego modelu, który później można usztywnić w celu zbadania odpowiedzi komórkowych na usztywnienie mikrośrodowiska. Podobne techniki, które wykorzystują statyczny biomateriał zamiast biomateriału fotostrojowalnego, skutkują modelem, którego nie można usztywnić po wydrukowaniu.
Wyniki innych badań przeprowadzonych w naszym laboratorium sugerują, że płeć i wiek odgrywają kluczową rolę w postępie choroby płuc. Przyszłe modele będą badać te zmienne i uwzględniać większą złożoność, taką jak dodatkowe warstwy specyficzne dla komórki. Połączenie tych wysiłków zaowocuje bardziej realistycznymi odciskami biologicznymi i doprowadzi do nowych sposobów leczenia chorób zwłóknieniowych.
Przygotowanie biotuszu hydrożelowego należy rozpocząć w sposób aseptyczny w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przygotowując najpierw roztwór podstawowy metakrylanu PEG o stężeniu 0,25 miligrama na mililitr w sterylnej pożywce do hodowli komórkowych bez FBS. Ponadto, używając 20-milimolowego sterylnego TCEP, przygotuj 250-milimolowe roztwory podstawowe degradowalnego środka sieciującego DTT MMP2 i peptydu RGD. Na koniec przygotuj 15-procentowy roztwór podstawowy PEO, używając wody destylowanej.
Połączyć wymagane ilości przygotowanych roztworów podstawowych odczynników i pożywki do hodowli komórek o niskiej surowicy z fibroblastami w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Dokładnie wymieszaj powstały biotusz za pomocą pipety wyporowej, aby upewnić się, że komórki są pojedyncze. Sprawdzić, czy końcowy roztwór prekursora ma pH 6,2.
Wyjmij głowicę drukującą z biodrukarki, aby uzyskać dostęp do szklanej strzykawki. Aby załadować biotusz do szklanej strzykawki, wyjmij tłok strzykawki, a następnie zbierz biotusz z probówki wirówkowej za pomocą oddzielnej strzykawki zamontowanej na igle o długości 1,5 cala i średnicy 15 z końcówką. Zastąp igłę o rozmiarze 15 igłą o długości 30 cm i długości 0,5 cala i przenieś ją do szklanej strzykawki, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
Na koniec umieść szklaną strzykawkę w głowicy drukującej i przymocuj elementy głowicy drukującej, zapewniając jednocześnie stabilny montaż do drukowania. Aby rozpocząć drukowanie 3D fotostrojalnych konstrukcji hydrożelowych, umieść szklaną strzykawkę z hydrożelowym biotuszem zawierającym fibroblasty w głowicy drukującej i przymocuj elementy głowicy drukującej, zapewniając jednocześnie mocny montaż do drukowania. Następnie za pomocą strzałek kierunkowych w oprogramowaniu Pronterface ręcznie i ostrożnie wyreguluj położenie igieł do wytłaczania w zawiesinie kąpieli podporowej w środku studzienki płyty studziennej.
Pozostaw co najmniej jeden milimetr gnojowicy poniżej końcówki igły. Po prawidłowym umieszczeniu końcówki igły naciśnij przycisk drukowania w oprogramowaniu Pronterface i poczekaj na zakończenie drukowania. Powtarzaj wcześniej zademonstrowane kroki, aż do uzyskania żądanej liczby biodrukowanych konstruktów.
Po wydrukowaniu pozostaw płytkę studzienki z konstruktami przykrytymi w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego na jedną godzinę. Pozwala to na polimeryzację katalizowaną przez zasadę za pomocą fotostrojonego biotuszu hydrożelowego. Następnie umieść płytkę studzienkową z biodrukowanymi konstruktami 3D w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 18 godzin, aby stopić zawiesinę kąpieli podporowej.
Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zmień nośniki otaczające biodrukowane konstrukty. W tym celu należy ręcznie usunąć pożywkę i stopioną kąpiel podporową żelatyny ze studzienek, nie naruszając konstrukcji. Następnie dodaj odpowiednią objętość pożywki o niskiej surowicy do każdego dołka.
Ponownie, 24 godziny przed pożądanym punktem czasowym usztywnienia, zastąp pożywkę w studzienkach pożywką o niskiej surowicy uzupełnioną 2,2 milimolowym sterylnym LAP. W pożądanym punkcie czasowym usztywnienia usuń połowę podłoża z dołków, które mają być usztywnione i umieść płytkę bez pokrywki pod światłem ultrafioletowym lub UV OmniCure. Włącz światło UV za pomocą filtra pasmowego 365 nanometrów, aby usztywnić konstrukcje na pięć minut.
Po usztywnieniu usuń pozostałe pożywki z tych studzienek przed dodaniem świeżej pożywki o niskiej surowicy do każdej studzienki. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do czasu przeprowadzenia badania aktywacji fibroblastów w żądanym punkcie czasowym. Połączenie kwaśnego biotuszu i zawiesiny do kąpieli w kąpieli z podstawowym podłożem ułatwiło polimeryzację biodrukowanych konstruktów 3D i utrzymało struktury cylindryczne.
Mikroskopia znakowanego fluorescencyjnie hydrożelu wykazała pory w hydrożelu indukowane przez mikrocząsteczki żelatyny w kąpieli podporowej. Mikroskopia konfokalna wykazała przestrzenną kontrolę nad usztywnieniem w 3D. Testy żywotności fibroblastów wykazały, że konstrukcje o grubości ścianki 300 mikronów i mające 4 miliony komórek na mililitr przewyższały wszystkie inne warunki w każdym punkcie czasowym.
Żywotność osiągnęła szczyt w siódmym dniu, gdy około 91% komórek było żywych, a w 14. dniu 85% było nadal zdolnych do życia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje inżynierię 3D modeli tkanki płucnej przy użyciu fototunelnych hydrożeli. Te modele są zaprojektowane do badania stężenia macierzy pozakomórkowej i aktywacji fibroblastów, co przyczynia się do zrozumienia przewlekłych chorób płuc.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- 3D biodrukowanie
- Badania macierzy pozakomórkowej
- Modelowanie tkanki płucnej
Tło
- Przewlekłe choroby płuc stanowią znaczące wyzwania zdrowotne.
- Zrozumienie mechanicznych właściwości tkanki płucnej jest kluczowe dla opracowywania terapii.
- Techniki druku 3D mogą tworzyć skomplikowane struktury tkankowe.
- Hydrożele mogą naśladować sztywność zarówno zdrowych, jak i chorych tkanek.
Cel badania
- Opracowanie metody 3D biodrukowania hydrożeli.
- Zbadanie wpływu sztywności macierzy pozakomórkowej na zachowanie fibroblastów.
- Stworzenie platformy do badań nad mechanizmami przewlekłych chorób płuc.
Stosowane metody
- 3D biodrukowanie fototunelnych hydrożeli.
- Wykorzystanie kątowych łaźni wspierających do depozycji komórek.
- Kontrola właściwości mechanicznych podczas eksperymentów.
- Porównanie wzrostu komórek w hydrożelach naśladujących zdrową i chorobę tkanki płucnej.
Główne wyniki
- Udane 3D drukowanie hydrożeli o regulacji sztywności.
- Wykazane aktywowanie fibroblastów w odpowiedzi na sztywność macierzy.
- Dostarczenie informacji na temat właściwości mechanicznych tkanki płucnej.
- Ustanowienie nowej platformy do badań nad przewlekłymi chorobami płuc.
Konkluzje
- Badanie poszerza zrozumienie mechaniki tkanki płucnej.
- 3D biodrukowanie może skutecznie modelować warunki chorobowe.
- Wyniki mogą wpłynąć na przyszłe strategie terapeutyczne w leczeniu chorób płuc.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dynamic 3D bioprinting of phototunable hydrogels enables precise modeling of extracellular matrix (ECM) stiffening, a key driver in fibrotic disease progression. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for fibroblast activation pathways, directly informing early-stage portfolio decisions in chronic lung disease research. The approach enhances predictive confidence by allowing temporal control over microenvironmental cues within disease-relevant 3D systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of fibroblast activation mechanisms in response to controlled ECM stiffening.
- Supports functional target validation by replicating disease-relevant microenvironmental changes.
- Facilitates mechanistic de-risking for pathways implicated in fibrosis and tissue remodeling.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for standardized 3D cell culture with tunable mechanical properties.
- Enables reproducible assessment of cellular responses to microenvironmental changes.
- Supports quantitative readouts of fibroblast viability and activation within physiologically relevant constructs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant tissue mechanics for translational biomarker studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling dynamic ECM modulation.
- Reduces translational risk by modeling progressive tissue stiffening observed in fibrotic diseases.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven studies of ECM-driven cell activation and supporting downstream assay development for fibrosis research.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing of fibroblast activation in response to ECM stiffening.
- Screening: Delivers assay-ready 3D constructs with tunable stiffness for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative viability and activation measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating disease-relevant mechanical cues.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various tissue and disease models requiring dynamic ECM control.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies of fibrosis.
- Operational Value: Standardizes 3D bioprinting workflows for reproducible and scalable model generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling dynamic modeling of disease progression.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of fibrosis-related targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting and hydrogel chemistry for protocol execution.
- Demands access to bioprinting instrumentation and controlled light sources for photostiffening.
- Necessitates cross-team standardization of bioink formulation and printing parameters.
- Adaptable to different cell types and tissue models with protocol optimization.
- Limited by the need for precise control of pH and photoinitiator concentrations to ensure reproducibility.
