Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Zaprojektowaliśmy modele 3D tkanki płucnej, aby pomóc światu łatwiej oddychać. Naszą misją jest wykorzystanie biomateriałów 3D i technik, takich jak druk 3D, do budowania platform, które pomogą nam zrozumieć, co powoduje przewlekłe choroby płuc i jak lepiej leczyć te schorzenia. Jednym z eksperymentalnych wyzwań w naszych badaniach jest trudność drukowania 3D miękkich materiałów w skomplikowane kształty.

Precyzyjnie osadzamy komórki, drukując nasz biotusz w kąpieli podporowej rozrzedzonej ścinaniem, która pomaga zachować ich kształt podczas procesu drukowania. Nasze biomateriały zapewniają kontrolę nad właściwościami mechanicznymi próbki przez cały czas trwania eksperymentu. Ta formuła pozwala naukowcom hodować komórki w hydrożelu, który odpowiada sztywności zarówno zdrowej, jak i chorej tkanki płucnej.

Użytkownicy mogą decydować, kiedy usztywnić próbki i zmierzyć odpowiedzi komórkowe. Fotodostrajalne biomateriały użyte w tym protokole pozwalają na stworzenie zmiękczonego modelu, który później można usztywnić w celu zbadania odpowiedzi komórkowych na usztywnienie mikrośrodowiska. Podobne techniki, które wykorzystują statyczny biomateriał zamiast biomateriału fotostrojowalnego, skutkują modelem, którego nie można usztywnić po wydrukowaniu.

Wyniki innych badań przeprowadzonych w naszym laboratorium sugerują, że płeć i wiek odgrywają kluczową rolę w postępie choroby płuc. Przyszłe modele będą badać te zmienne i uwzględniać większą złożoność, taką jak dodatkowe warstwy specyficzne dla komórki. Połączenie tych wysiłków zaowocuje bardziej realistycznymi odciskami biologicznymi i doprowadzi do nowych sposobów leczenia chorób zwłóknieniowych.

Przygotowanie biotuszu hydrożelowego należy rozpocząć w sposób aseptyczny w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przygotowując najpierw roztwór podstawowy metakrylanu PEG o stężeniu 0,25 miligrama na mililitr w sterylnej pożywce do hodowli komórkowych bez FBS. Ponadto, używając 20-milimolowego sterylnego TCEP, przygotuj 250-milimolowe roztwory podstawowe degradowalnego środka sieciującego DTT MMP2 i peptydu RGD. Na koniec przygotuj 15-procentowy roztwór podstawowy PEO, używając wody destylowanej.

Połączyć wymagane ilości przygotowanych roztworów podstawowych odczynników i pożywki do hodowli komórek o niskiej surowicy z fibroblastami w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Dokładnie wymieszaj powstały biotusz za pomocą pipety wyporowej, aby upewnić się, że komórki są pojedyncze. Sprawdzić, czy końcowy roztwór prekursora ma pH 6,2.

Wyjmij głowicę drukującą z biodrukarki, aby uzyskać dostęp do szklanej strzykawki. Aby załadować biotusz do szklanej strzykawki, wyjmij tłok strzykawki, a następnie zbierz biotusz z probówki wirówkowej za pomocą oddzielnej strzykawki zamontowanej na igle o długości 1,5 cala i średnicy 15 z końcówką. Zastąp igłę o rozmiarze 15 igłą o długości 30 cm i długości 0,5 cala i przenieś ją do szklanej strzykawki, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Na koniec umieść szklaną strzykawkę w głowicy drukującej i przymocuj elementy głowicy drukującej, zapewniając jednocześnie stabilny montaż do drukowania. Aby rozpocząć drukowanie 3D fotostrojalnych konstrukcji hydrożelowych, umieść szklaną strzykawkę z hydrożelowym biotuszem zawierającym fibroblasty w głowicy drukującej i przymocuj elementy głowicy drukującej, zapewniając jednocześnie mocny montaż do drukowania. Następnie za pomocą strzałek kierunkowych w oprogramowaniu Pronterface ręcznie i ostrożnie wyreguluj położenie igieł do wytłaczania w zawiesinie kąpieli podporowej w środku studzienki płyty studziennej.

Pozostaw co najmniej jeden milimetr gnojowicy poniżej końcówki igły. Po prawidłowym umieszczeniu końcówki igły naciśnij przycisk drukowania w oprogramowaniu Pronterface i poczekaj na zakończenie drukowania. Powtarzaj wcześniej zademonstrowane kroki, aż do uzyskania żądanej liczby biodrukowanych konstruktów.

Po wydrukowaniu pozostaw płytkę studzienki z konstruktami przykrytymi w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego na jedną godzinę. Pozwala to na polimeryzację katalizowaną przez zasadę za pomocą fotostrojonego biotuszu hydrożelowego. Następnie umieść płytkę studzienkową z biodrukowanymi konstruktami 3D w sterylnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 18 godzin, aby stopić zawiesinę kąpieli podporowej.

Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zmień nośniki otaczające biodrukowane konstrukty. W tym celu należy ręcznie usunąć pożywkę i stopioną kąpiel podporową żelatyny ze studzienek, nie naruszając konstrukcji. Następnie dodaj odpowiednią objętość pożywki o niskiej surowicy do każdego dołka.

Ponownie, 24 godziny przed pożądanym punktem czasowym usztywnienia, zastąp pożywkę w studzienkach pożywką o niskiej surowicy uzupełnioną 2,2 milimolowym sterylnym LAP. W pożądanym punkcie czasowym usztywnienia usuń połowę podłoża z dołków, które mają być usztywnione i umieść płytkę bez pokrywki pod światłem ultrafioletowym lub UV OmniCure. Włącz światło UV za pomocą filtra pasmowego 365 nanometrów, aby usztywnić konstrukcje na pięć minut.

Po usztywnieniu usuń pozostałe pożywki z tych studzienek przed dodaniem świeżej pożywki o niskiej surowicy do każdej studzienki. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do czasu przeprowadzenia badania aktywacji fibroblastów w żądanym punkcie czasowym. Połączenie kwaśnego biotuszu i zawiesiny do kąpieli w kąpieli z podstawowym podłożem ułatwiło polimeryzację biodrukowanych konstruktów 3D i utrzymało struktury cylindryczne.

Mikroskopia znakowanego fluorescencyjnie hydrożelu wykazała pory w hydrożelu indukowane przez mikrocząsteczki żelatyny w kąpieli podporowej. Mikroskopia konfokalna wykazała przestrzenną kontrolę nad usztywnieniem w 3D. Testy żywotności fibroblastów wykazały, że konstrukcje o grubości ścianki 300 mikronów i mające 4 miliony komórek na mililitr przewyższały wszystkie inne warunki w każdym punkcie czasowym.

Żywotność osiągnęła szczyt w siódmym dniu, gdy około 91% komórek było żywych, a w 14. dniu 85% było nadal zdolnych do życia.