Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych
5 maja 2023
Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.
Wbudowany druk 3D w kompozytach SHAPE przezwycięża tradycyjne ograniczenia biofabrykacji, umożliwiając dokładne wzorowanie mechanicznie wrażliwych tkanek wewnątrz hydrożeli przypominających rodzime środowisko zewnątrzkomórkowe. SHAPE toolbox opiera się na modułowym projektowaniu biomateriałów, co umożliwia łatwe zmiany w formułowaniu wsparcia druku. Wykorzystuje także tanie materiały i dostępny sprzęt do prostych adaptacji przez inne grupy badawcze.
To podejście można zastosować do tworzenia przestrzennie zdefiniowanych modeli ludzkiej tkanki nerwowej do badania rozwoju neuronów i komunikacji w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona. Zacznij od przygotowania roztworu węglanu wapnia w ultraczystej wodzie w stężeniu dwóch miligramów na mililitr. Wymieszaj go z roztworem alginatu w równym stopniu i mieszaj magnetycznie w 650 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj kwas octowy do tej mieszanki w proporcji 1 do 500 i mieszaj ponownie przez noc. Następnego dnia mechanicznie rozdrobnić roztwór galareatu alginianu na mikrocząstki przy 15 000 obr./min przez 10 minut za pomocą homogenizatora. Następnie wiruję w wirówce, aby uzyskać mikrocząstki.
Ostrożnie odrzuć supernatant i ponownie zawiesić cząstki w DMEM, zawierające dwa milimolowe wodorotlenek sodu i 1% penicyliny, streptomycynę. Kolor zawieszenia powinien wrócić do czerwonego. Inkubuj zawiesinę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji ujednolicz zawiesinę przez trzy minuty przy 15 000 obr./min i wiruj w 18 500 G przez 10 minut. Po wirowaniu usuń supernatant i obserwuj granulat pod kątem ściśle upakowanych mikrocząstek alginatu. Aby uzyskać kompozyt SHAPE, wymieszaj granulki mikrocząstek alginatu z rozcieńczonym i zneutralizowanym kolagenem w proporcji dwa do jednego i pipetuj go na lodzie.
Przenieś wygenerowany materiał kompozytowy do schłodzonej płyty o długości 24 dołków. Przed wydrukowaniem rozłóż wcześniej hodowane ludzkie komórki macierzyste nerwowe, czyli hNSC, przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą roztworu 0,025% trypsyny. Następnie zneutralizuj trypsynę podłożem wzrostu i wiruj zawiesinę komórkową w 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij osad komórkowy w dwóch do trzech mililitrach podłoża wzrostowego. Używając tępej metalowej igły o grubości 21, załaduj do strzykawki 100 mikrolitrów ciasno upakowanych mikrocząstek alginatu. Następnie załaduję przygotowaną zawiesinę komórkową do strzykawki.
Do druku wymień igłę ładowającą na tępą metalową igłę 27. Korzystając z oprogramowania referencyjnego, po zaprojektowaniu struktury do druku kliknij generuj, aby uzyskać generowanie kodu G. Włóż strzykawkę załadowaną komórką do głowicy wytłaczania objętościowej na bioprinterze opartym na wytłaczaniu i zapisz długość igły, klikając na start proces pomiaru długości igły.
Następnie umieść płytę 24 dołków załadowaną kompozytem SHAPE na drukarce i kliknij na SHM, aby zmierzyć wysokość powierzchni pustego dołka. Wybierz pH 2, a następnie symbol klucza. Następnie pod ustawionym parametrem zmień przepływ objętościowy na 3,6 mikrolitra na sekundę i naciśnij Zastosowanie parametru, a następnie Zapisz i koniec.
Załaduj kod G do interfejsu drukarki, klikając ikonę, aby otworzyć kod G. Wybierz ikonę programu uruchamiania, aby rozpocząć procedurę drukowania. Zaraz po wydruku inkubuj żel SHAPE w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do wyżarzania.
Następnie delikatnie dodaj podłoże do żelowego podłoża SHAPE annealed. W przypadku immunobarwienia usuń nadmiar medium z żelu, a za pomocą szpatułki przenieś żel do pojemnika zawierającego DPBS. Gdy płytka zostanie umieszczona w okapie spalinowym, usuń DPBS.
Okryj żel roztworem 4% formaldehydu i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po umyciu DPBS dodaj roztwór blokujący do żelu. Delikatnie kołysz płytę i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze pokojowej, aby zapobiec nieokreślonym wiązaniu.
Po usunięciu roztworu blokującego dodaj do żelu główne przeciwciało i delikatnie go kołysaj. Inkubuj płytę przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po myciu DPBS podobnie traktuj żel roztworem przeciwciał wtórnych przez 24 godziny.
Umieść zabarwiony żel szpatułką w płytkę z cienkim dnem obrazującym przed wykonaniem obrazowania. W niniejszym badaniu tusz hNSC wydrukował włókno komórek o średnicy około 200 mikrometrów. Wydrukowane pasma były bogate w żywotne komórki o morfologii wokół nich.
Po 30 dniach od druku komórki wykazały morfologię neuronalną z małymi ciałami komórkowymi i długimi, cienkimi wyrostkami, co wskazywało na udaną różnicację hNSC. Barwienie tubuliną beta 3 umożliwiło wizualizację generowanych sieci neuronowych z zachowaniem geometrii. Podczas procesu różnicowania komórki nie migrowały poza wydrukowane nici.
Kompozyt SHAPE może być używany do tworzenia kanałów przepuszczalnych poprzez drukowanie atramentu ofiarnego zamiast komórek. Ponadto wsparcie może obejmować kulki wrażliwe na tlen do monitorowania napięcia tlenu w konstrukcjach drukowanych 3D w czasie i przestrzeni.
Przegląd
Niniejsza praca opisuje protokół wbudowanego druku 3D neuronalnych komórek macierzystych wewnątrz samogojących się, wyżarzalnych kompozytów cząsteczkowych i macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta umożliwia programowalne wzorowanie wzajemnie połączonych struktur ludzkiej tkanki nerwowej z wysoką precyzją.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofabrykacja
- Inżynieria tkankowa
Wprowadzenie
- Tradycyjne metody biofabrykacji wykazują ograniczenia w tworzeniu tkanek wrażliwych mechanicznie.
- Kompozyty SHAPE zapewniają natywne środowisko zewnątrzkomórkowe dla rozwoju tkanki.
- Modułowa konstrukcja biomateriału pozwala na łatą adaptację i wprowadzanie zmian w formulacji.
- Niskokosztowe materiały i dostępny sprzęt ułatwiają szersze zastosowania badawcze.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do precyzyjnego wzorowania modeli tkanki nerwowej.
- Badanie rozwoju i komunikacji neuronów w zaburzeniach neurodegeneracyjnych.
- Zapewnienie ram umożliwiających innym grupom badawczym replikację i adaptację tej metody.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu węglanu wapnia w wodzie ultrapurej.
- Mieszanie z roztworem alginianu w określonym stosunku.
- Mieszanie magnetyczne przy kontrolowanej prędkości i temperaturze.
- Wykorzystanie kompozytów SHAPE do druku 3D wewnątrz innego materiału.
Główne wyniki
- Skuteczne stworzenie przestrzenie określonych modeli ludzkiej tkanki neuronalnej.
- Wykazana zdolność do wzorkowania tkanek z wysoką precyzją.
- Potencjalne zastosowania w badaniu schorzeń neurodegeneracyjnych.
- Adaptacyjność protokołu do różnych warunków badawczych.
Wnioski
- Protokół ten rozszerza możliwości biofabrykacji w neuronauce.
- Stanowi on wartościowe narzędzie do badania interakcji neuronalnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zgłębienia różnych schorzeń neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zintegrowany druk 3D ludzkich konstruktów neuronalnych w kompozytach SHAPE wypełnia istotną lukę w modelowaniu chorób neurodegeneracyjnych, zapewniając regulowane środowisko naśladujące macierz zewnątrzkomórkową (ECM), które wspiera długoterminową hodowlę i dojrzewanie funkcjonalne. Podejście to umożliwia działom badawczo-rozwojowym w branży biofarmaceutycznej generowanie powtarzalnych, istotnych dla człowieka modeli tkanki neuronalnej do walidacji celów terapeutycznych i minimalizacji ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków. Modułowa, niskokosztowa konstrukcja wspiera skalowalną adaptację w procesach badawczych nad chorobą Parkinsona i zaburzeniami pokrewnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w tkance neuronalnej pochodzenia ludzkiego z zachowaną architekturą i żywotnością.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez utrzymanie lokalizacji i różnicowania wydrukowanych komórek podczas przedłużonych okresów hodowli.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę oddziaływania na cel w przestrzennie zdefiniowanych sieciach neuronalnych istotnych dla mechanizmów chorobowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne podłoże wspierające dla długoterminowej hodowli i ilościowego obrazowania konstruktów neuronalnych.
- Skalowalność: Wykorzystuje dostępny sprzęt i niedrogie materiały, co umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w wielu kampaniach przesiewowych związków.
- Wyniki ilościowe: Pozwala na odczyty fluorescencyjne żywych komórek oraz immunocytochemiczne w celu pomiaru różnicowania, wypustek aksonalnych i tworzenia sieci.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Pozwala na tworzenie ludzkich modeli tkanki nerwowej, które można wykorzystać do badania rozwoju neuronów oraz komunikacji neuronalnej w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście z etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie geometrii konstruktu i umożliwienie funkcjonalnych odczytów w ciągu wielu tygodni.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki możliwości obserwacji różnicowania i tworzenia sieci bez migracji komórek z wydrukowanych nici.
Integracja potoków i przepływów pracy
Kompozytowa metoda SHAPE integruje się z kontinuum odkryć, umożliwiając wczesne testowanie hipotez w ludzkich modelach neuronalnych, wspierając rozwój testów do oceny związków oraz dostarczając translacyjnych odczytów, które stanowią pomost do oceny przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnego tworzenia wzorców i długoterminowej hodowli ludzkich komórek macierzystych sieci neuronowych w celu badania różnicowania i tworzenia sieci.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowane i powtarzalne generowanie konstruktów do ekspozycji na związki oraz odczytu funkcjonalnego za pomocą obrazowania i barwienia.
- Analityka: Dostarcza ilościowe, rozdzielcze przestrzennie dane dzięki obrazowaniu żywych komórek i immunocytochemii w celu porównania warunków i oceny modulacji celu.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność konstruktu i wspiera wzrost aksonów, zapewniając system istotny dla danej choroby w kontekście ciągłości przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wykorzystuje modułową konstrukcję i niskokosztowe materiały, co pozwala na adaptację w różnych grupach badawczych i iteracyjne zastosowanie w procesach odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez zapewnienie regulowalnego mikrośrodowiska przypominającego macierz zewnątrzkomórkową (ECM), które wspiera różnicowanie neuronów i tworzenie sieci.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki samoregenerującym się, wygrzewalnym mediom wspierającym oraz przystępnym protokołom wytwarzania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zależności od złożonych systemów i umożliwienie szerokiej adaptacji w zespołach badawczych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka dzięki obserwowalnemu, długoterminowemu dojrzewaniu neuronów i stabilności sieci w wydrukowanych konstrukcjach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu biomateriałów, generowaniu cząsteczek oraz w sterylnych technikach hodowli tkankowej.
- Zależy od dostępu do homogenizatorów, wirówek, biodrukarek oraz standardowego sprzętu do obrazowania i immunobarwienia.
- Wymaga standaryzacji formulacji kompozytu SHAPE i parametrów drukowania w ramach zespołów w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzeniu jej na inne typy komórek lub komponenty ECM poza alginian i kolagen.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba precyzyjnego określenia wielkości cząsteczek i czasu wygrzewania w celu zachowania wierności struktury wsporczej podczas drukowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Self Healing Annealable Particle: Extracellular Matrix (SHAPE) Composite Preparation
2:40
Human Neural Stem Cell (hNSC) Bioink Preparation and Embedded 3D Printing
6:19
Results: Characterization of 3D Printed Human Neural Construct
7:11
Conclusion
