Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych
May 5th, 2023
Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.
Wbudowany druk 3D w kompozytach SHAPE przezwycięża tradycyjne ograniczenia biofabrykacji, umożliwiając dokładne wzorowanie mechanicznie wrażliwych tkanek wewnątrz hydrożeli przypominających rodzime środowisko zewnątrzkomórkowe. SHAPE toolbox opiera się na modułowym projektowaniu biomateriałów, co umożliwia łatwe zmiany w formułowaniu wsparcia druku. Wykorzystuje także tanie materiały i dostępny sprzęt do prostych adaptacji przez inne grupy badawcze.
To podejście można zastosować do tworzenia przestrzennie zdefiniowanych modeli ludzkiej tkanki nerwowej do badania rozwoju neuronów i komunikacji w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona. Zacznij od przygotowania roztworu węglanu wapnia w ultraczystej wodzie w stężeniu dwóch miligramów na mililitr. Wymieszaj go z roztworem alginatu w równym stopniu i mieszaj magnetycznie w 650 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj kwas octowy do tej mieszanki w proporcji 1 do 500 i mieszaj ponownie przez noc. Następnego dnia mechanicznie rozdrobnić roztwór galareatu alginianu na mikrocząstki przy 15 000 obr./min przez 10 minut za pomocą homogenizatora. Następnie wiruję w wirówce, aby uzyskać mikrocząstki.
Ostrożnie odrzuć supernatant i ponownie zawiesić cząstki w DMEM, zawierające dwa milimolowe wodorotlenek sodu i 1% penicyliny, streptomycynę. Kolor zawieszenia powinien wrócić do czerwonego. Inkubuj zawiesinę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji ujednolicz zawiesinę przez trzy minuty przy 15 000 obr./min i wiruj w 18 500 G przez 10 minut. Po wirowaniu usuń supernatant i obserwuj granulat pod kątem ściśle upakowanych mikrocząstek alginatu. Aby uzyskać kompozyt SHAPE, wymieszaj granulki mikrocząstek alginatu z rozcieńczonym i zneutralizowanym kolagenem w proporcji dwa do jednego i pipetuj go na lodzie.
Przenieś wygenerowany materiał kompozytowy do schłodzonej płyty o długości 24 dołków. Przed wydrukowaniem rozłóż wcześniej hodowane ludzkie komórki macierzyste nerwowe, czyli hNSC, przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą roztworu 0,025% trypsyny. Następnie zneutralizuj trypsynę podłożem wzrostu i wiruj zawiesinę komórkową w 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesij osad komórkowy w dwóch do trzech mililitrach podłoża wzrostowego. Używając tępej metalowej igły o grubości 21, załaduj do strzykawki 100 mikrolitrów ciasno upakowanych mikrocząstek alginatu. Następnie załaduję przygotowaną zawiesinę komórkową do strzykawki.
Do druku wymień igłę ładowającą na tępą metalową igłę 27. Korzystając z oprogramowania referencyjnego, po zaprojektowaniu struktury do druku kliknij generuj, aby uzyskać generowanie kodu G. Włóż strzykawkę załadowaną komórką do głowicy wytłaczania objętościowej na bioprinterze opartym na wytłaczaniu i zapisz długość igły, klikając na start proces pomiaru długości igły.
Następnie umieść płytę 24 dołków załadowaną kompozytem SHAPE na drukarce i kliknij na SHM, aby zmierzyć wysokość powierzchni pustego dołka. Wybierz pH 2, a następnie symbol klucza. Następnie pod ustawionym parametrem zmień przepływ objętościowy na 3,6 mikrolitra na sekundę i naciśnij Zastosowanie parametru, a następnie Zapisz i koniec.
Załaduj kod G do interfejsu drukarki, klikając ikonę, aby otworzyć kod G. Wybierz ikonę programu uruchamiania, aby rozpocząć procedurę drukowania. Zaraz po wydruku inkubuj żel SHAPE w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do wyżarzania.
Następnie delikatnie dodaj podłoże do żelowego podłoża SHAPE annealed. W przypadku immunobarwienia usuń nadmiar medium z żelu, a za pomocą szpatułki przenieś żel do pojemnika zawierającego DPBS. Gdy płytka zostanie umieszczona w okapie spalinowym, usuń DPBS.
Okryj żel roztworem 4% formaldehydu i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po umyciu DPBS dodaj roztwór blokujący do żelu. Delikatnie kołysz płytę i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze pokojowej, aby zapobiec nieokreślonym wiązaniu.
Po usunięciu roztworu blokującego dodaj do żelu główne przeciwciało i delikatnie go kołysaj. Inkubuj płytę przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po myciu DPBS podobnie traktuj żel roztworem przeciwciał wtórnych przez 24 godziny.
Umieść zabarwiony żel szpatułką w płytkę z cienkim dnem obrazującym przed wykonaniem obrazowania. W niniejszym badaniu tusz hNSC wydrukował włókno komórek o średnicy około 200 mikrometrów. Wydrukowane pasma były bogate w żywotne komórki o morfologii wokół nich.
Po 30 dniach od druku komórki wykazały morfologię neuronalną z małymi ciałami komórkowymi i długimi, cienkimi wyrostkami, co wskazywało na udaną różnicację hNSC. Barwienie tubuliną beta 3 umożliwiło wizualizację generowanych sieci neuronowych z zachowaniem geometrii. Podczas procesu różnicowania komórki nie migrowały poza wydrukowane nici.
Kompozyt SHAPE może być używany do tworzenia kanałów przepuszczalnych poprzez drukowanie atramentu ofiarnego zamiast komórek. Ponadto wsparcie może obejmować kulki wrażliwe na tlen do monitorowania napięcia tlenu w konstrukcjach drukowanych 3D w czasie i przestrzeni.
Przegląd
To dzieło opisuje protokół osadzonego druku 3D komórek macierzystych układu nerwowego w kompozytach cząstek i macierzy zewnątrzkomórkowej, które same się naprawiają i mogą być odpuszczane. Ta metoda umożliwia programowalne kształtowanie połączonych ludzkich konstrukcji tkanki nerwowej z wysoką wiernością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofabrykacja
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Tradycyjne metody biofabrykacji napotykają na ograniczenia w tworzeniu mechanicznie wrażliwych tkanek.
- Kompozyty SHAPE zapewniają natywne środowisko zewnątrzkomórkowe dla rozwoju tkanek.
- Modulowa konstrukcja biomateriału umożliwia łatwą adaptację i zmiany w formule.
- Niskie koszty materiałów i dostępne sprzęty ułatwiają szersze zastosowania badań.
Cel badania
- Opracowanie protokołu dla dokładnego kształtowania modeli tkanki nerwowej.
- Zbadanie rozwoju neuronów i komunikacji w zaburzeniach neurodegeneracyjnych.
- Dostarczenie ram dla innych grup badawczych do replikacji i adaptacji metody.
Stosowane metody
- Przygotowanie roztworu węglanu wapnia w ultraczystej wodzie.
- Mieszanie z roztworem alginianu w określonym stosunku.
- Mieszanie magnetyczne z kontrolowaną prędkością i temperaturą.
- Wykorzystanie kompozytów SHAPE do osadzonego druku 3D.
Główne wyniki
- Udane stworzenie przestrzennie określonych modeli ludzkiej tkanki nerwowej.
- Wykazana zdolność do kształtowania tkanek z wysoką wiernością.
- Potencjalne zastosowania w badaniach zaburzeń neurodegeneracyjnych.
- Adaptacyjność protokołu dla różnych ustawień badawczych.
Wnioski
- Protokół zwiększa możliwości biofabrykacji w neuronauce.
- Dostawia cenne narzędzie do badania interakcji neuronowych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie do eksploracji różnych stanów neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Embedded 3D printing of human neural constructs within SHAPE composites addresses a critical gap in modeling neurodegenerative diseases by providing a tunable, ECM-mimetic environment that supports long-term culture and functional maturation. This approach enables biopharma R&D to generate reproducible, human-relevant neural tissue models for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The modular, low-cost design supports scalable adoption across discovery workflows for Parkinson’s and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in human-derived neural tissue with preserved architecture and viability.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining printed cell localization and differentiation over extended culture periods.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement in spatially defined neural networks relevant to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized, reproducible support medium for long-term culture and quantitative imaging of neural constructs.
- Scalability: Uses accessible equipment and low-cost materials to enable platform reuse across multiple compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Allows live-cell fluorescence and immunocytochemistry readouts to measure differentiation, axonal outgrowth, and network formation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Generates human neural tissue models applicable to studying neuronal development and communication in neurodegenerative disorders like Parkinson’s.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining construct geometry and enabling functional readouts over weeks.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through observable differentiation and network formation without cell migration from printed strands.
Pipeline & Workflow Integration
The SHAPE composite method integrates into the discovery continuum by enabling early-stage hypothesis testing in human neural models, supporting assay development for compound evaluation, and providing translational readouts that bridge to preclinical assessment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise patterning and long-term culture of human neural stem cells to study differentiation and network formation.
- Screening: Enables standardized, reproducible construct generation for compound exposure and functional readout via imaging and staining.
- Analytics: Delivers quantitative, spatially resolved data through live-cell imaging and immunocytochemistry to compare conditions and assess target modulation.
- Translational Research: Maintains construct integrity and supports axonal outgrowth, providing a disease-relevant system for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Leverages modular design and low-cost materials to allow adaptation across research groups and iterative use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing a tunable, ECM-like microenvironment that supports neural differentiation and network formation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through self-healing, annealable support media and accessible fabrication protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on complex systems and enabling broad adoption across discovery teams.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through observable, long-term neural maturation and network stability in printed constructs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial preparation, particle generation, and sterile tissue culture techniques.
- Depends on access to homogenizers, centrifuges, bioprinters, and standard imaging and immunostaining equipment.
- Necessitates cross-team standardization of SHAPE composite formulation and printing parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or ECM components beyond alginate and collagen.
- Includes practical limitations such as the need for precise particle sizing and annealing timing to maintain support fidelity during printing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Self Healing Annealable Particle: Extracellular Matrix (SHAPE) Composite Preparation
2:40
Human Neural Stem Cell (hNSC) Bioink Preparation and Embedded 3D Printing
6:19
Results: Characterization of 3D Printed Human Neural Construct
7:11
Conclusion
