Name: Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Poznaj metodę śledzenia dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnej ewolucji bakterii. Technika łączy projektowanie trójnikowych primerów z równoległą elektroforezą kapilarną, umożliwiając precyzyjne monitorowanie zmian częstości alleli mutS przez 1000 pokoleń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) do S.B. Dane użyte w tej pracy zostały (częściowo) wygenerowane przez urządzenia techniczne GenSeq Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier przy wsparciu LabEx CeMEB, programu ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01).

Przygotowanie tego protokołu wymaga precyzyjnej wiedzy na temat punktu insercji, delecji, inwersji lub duplikacji w sekwencji przodka. Informacje te są zazwyczaj pozyskiwane poprzez sekwencjonowanie całego genomu (WGS) próbek z punktu końcowego lub pośredniego. W poniższym protokole dla każdego kroku przedstawiono ogólną zasadę dla przypadku mutacji insercyjnej, a obok niej reprezentatywny przypadek, w którym śledzono częstotliwość insercji IS10 w genie mutS w populacji eksperymentalnej ewolucji E. coli. W tej populacji WGS populacji końcowej zidentyfikowało insercję IS10 o długości 1 329 bp między pozycjami 2 463 a 2 471, co doprowadziło do duplikacji tego miejsca insercji. Metoda ta jest stosowalna do trzech pozostałych typów SV, a specyfika każdego przypadku została opisana w dyskusji.
1. Projektowanie starterów tripletowych
<ol>
	<li>Zastosuj klasyczne zasady projektowania starterów (18-24 bp, zawartość GC 40%-60%, rozpoczęcie i zakończenie parą G/C w miarę możliwości, różnica Tm &lt; 5 °C), aby opracować startery FW1 i RV1. Zaprojektuj startery tak, aby amplifikować krótki amplikon w allelu WT w obrębie miejsca insercji allelu zmutowanego (Rysunek 1). 
	UWAGA: Rozmiar amplikonu może wynosić od 100 bp do 3 000 bp, zgodnie z zakresem drabinki DNA stosowanej w elektroforezie kapilarnej. W tym przykładzie amplifikowano amplikon o wielkości 155 bp. Wybrany tutaj niewielki rozmiar fragmentu zapobiega niespecyficznej amplifikacji całej sekwencji insercyjnej IS10 (patrz sekcja 2).</li>
	<li>Zaprojektuj drugi starter forward FW2 w obrębie sekwencji insercyjnej, aby uzyskać drugi amplikon, który jest o około 5% większy lub mniejszy od amplikonu WT (Rysunek 1). Ta 5-procentowa różnica w rozmiarze jest minimalną różnicą, którą urządzenie do równoległej elektroforezy kapilarnej może wiarygodnie rozróżnić. W związku z tym zaprojektuj startery tak, aby dwa amplikony różniły się rozmiarem powyżej progu względnego, ale możliwie najbliżej niego. 
	UWAGA: Należy zadbać o zminimalizowanie różnicy Tm oraz tworzenia się dimerów starterów. W tym przykładzie drugi starter forward został zaprojektowany tak, aby uzyskać amplikon o wielkości 226 bp, czyli o 71 bp większy od amplikonu WT. W tym reprezentatywnym przykładzie sekwencje starterów są następujące: 
	FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC 
	RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC 
	FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG</li>
</ol>
<img alt="schemat genu mutS z insercją IS10, przedstawiający proces PCR i pozycje starterów do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64709/64709fig01.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat projektowania tripletu starterów dla genu mutS WT oraz mutanta z insercją IS10 w genie mutS. Czarny trójkąt reprezentuje miejsce insercji IS10 w genie mutS. Gen WT zaznaczono kolorem niebieskim, a IS10 kolorem pomarańczowym. Startery FW1 i RV1 wyznaczają miejsce insercji IS10 i generują amplikon WT o długości 155 bp. Starter RV1 oraz starter wewnątrz-IS10 FW2 generują drugi amplikon o długości 226 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64709/64709fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Optymalizacja warunków PCR
<ol>
	<li>Wyhodować nocną kulturę utrwalonych klonów typu dzikiego (WT) oraz klonów z allelem zmutowanym.</li>
	<li>Wyizolować DNA przy użyciu dowolnego zestawu.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie DNA.</li>
	<li>Przygotować próbki DNA poprzez rozcieńczenie wyizolowanego DNA typu dzikiego oraz zmutowanego do stężenia 5 ng/µL. Wymieszać obie próbki DNA w stosunku 50/50.</li>
	<li>Amplifikować 10 ng z trzech próbek DNA (WT, zmutowana, mieszanina 50/50), stosując 2x gotowy do użycia master mix PCR, 0,5 µM startera FW1, 1 µM startera RV1 oraz 0,5 µM startera FW2 w objętości reakcyjnej 20 µL. Do rozdziału produktów PCR metodą klasycznej elektroforezy użyć żelu agarozowego 2% i wyznaczyć optymalne warunki PCR. 
	UWAGA: Czas elongacji należy zminimalizować, aby zapobiec powstawaniu amplikonu FW1 i RV1 w allelu zmutowanym. Temperaturę przyłączania (annealing) należy dobrać tak, aby zminimalizować stronniczą amplifikację alleli oraz amplifikację nieswoistą.
	<ol>
		<li>Aby zastosować program opisany w tym przykładzie, użyć następujących ustawień: 98 °C przez 10 s, następnie 25 cykli: 98 °C przez 1 s, 58 °C przez 15 s, 72 °C przez 8 s oraz końcowy etap elongacji w 72 °C przez 1 min. 
		​UWAGA: Czas elongacji został skrócony do 8 s, aby zapobiec amplifikacji produktu o długości &gt;1 000 bp powstającego z zastosowaniem startera forward i startera RV1 w allelu zmutowanym (mutS z insercją IS10).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Krzywa kalibracyjna
<ol>
	<li>Wymieszać dwie próbki DNA, WT oraz mutant, w proporcjach 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 i 90/10. 
	UWAGA: Powtórzenia biologiczne są przygotowywane z niezależnych nocnych kultur bakteryjnych.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację, stosując zoptymalizowane warunki PCR (patrz sekcja 2).</li>
	<li>Oznaczyć ilość produktu amplikonowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć produkty PCR do stężenia 0,1 ng/µL.</li>
	<li>Przygotować aparat do równoległej elektroforezy kapilarnej.
	<ol>
		<li>Wymieszać świeży żel i barwnik (zestaw do analizy ilościowej NGS (22, 33 lub 55); w tym przykładzie fragmenty HS NGS 1-6 000 bp). 
		UWAGA: Szczegółowe instrukcje znajdują się w przewodniku do analizy fragmentów HS NGS w równoległej elektroforezie kapilarnej (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymienić roztwór do przechowywania kapilar oraz bufor wlotowy, a następnie umieścić płytkę z buforem płuczącym w odpowiednich szufladach aparatu do równoległej elektroforezy kapilarnej.</li>
	<li>Do 22 µL każdej rozcieńczonej próbki na płytce 96-dołkowej dodać 2 µL markera rozcieńczającego HS.</li>
	<li>Do jednego dołka płytki 96-dołkowej dodać drabinę wielkości (drabina wielkości DNA; zakres 1-6 000 bp) z zestawu do analizy ilościowej HS NGS.</li>
	<li>Umieścić płytkę 96-dołkową w odpowiedniej szufladzie aparatu do równoległej elektroforezy kapilarnej i wybrać opcję Run w oprogramowaniu aparatu.</li>
	<li>Przeanalizować wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych, które wykrywa i identyfikuje każdy pik drabiny wielkości, przypisując piki próbek do ich znanej rzeczywistej wielkości.
	<ol>
		<li>W przypadku korzystania z zestawu ilościowego, użyć oprogramowania do określenia ilości DNA każdego fragmentu poprzez całkowanie pola pod pikiem, analogicznie do analizy danych chromatograficznych. Ponownie, porównać próbki z known amounts w standardach, aby określić ilość każdego piku z próbki i obliczyć stosunki między różnymi pikami wykrytymi w próbkach.</li>
		<li>Sporządzić krzywą kalibracyjną (Rysunek 2), wiążąc znaną proporcję allelu mutantowego (mieszanina DNA) z wartością zmierzoną za pomocą aparatu do równoległej elektroforezy kapilarnej. Krzywa kalibracyjna ta pozwala na ocenę wiarygodności metody i skorygowanie niewielkich błędów amplifikacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Próbki z poszczególnych punktów czasowych inkubować przez noc w standardowych warunkach.</li>
	<li>Wyizolować DNA.</li>
	<li>Oznaczyć ilość DNA.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację próbek przy użyciu zoptymalizowanych warunków PCR (patrz sekcja 2).</li>
	<li>Próbki poddać analizie w urządzeniu do równoległej elektroforezy kapilarnej (patrz kroki 3.5-3.10).</li>
</ol>
5. Ilościowe oznaczanie alleli
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania wyodrębnij ilości alleli mutantowych z danych urządzenia do kapilarnej elektroforezy równoległej, a następnie oblicz rzeczywiste proporcje, nanosząc te wartości na krzywą kalibracyjną.</li>
</ol>

<ol><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variant+calling%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246(2019).</li>
<li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846(2014).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li>
<li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li>
<li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li>
<li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li>
<li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980(2021).</li>
<li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li>
<li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50%2C000-generation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li>
<li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li>
<li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635(2015).</li>
<li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li>
<li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8(2019).</li>
<li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutators%2C+population+size%2C+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu zaproponowaliśmy opłacalną metodę, która pozwala śledzić dynamikę pojawiających się adaptacyjnych alleli SV w eksperymentalnych populacjach ewolucyjnych. Metoda ta łączy klasyczne techniki PCR i zautomatyzowaną równoległą elektroforezę kapilarną, co pozwala na określenie względnych ilości dwóch alleli. Po skonfigurowaniu pozwala na ilościowe określenie proporcji alleli w wielu próbkach równolegle i jest znacznie tańsze niż WGS. Metoda ta może być postrzegana jako odpowiednik sekwencjonowania amplikonów dla ...

Warianty strukturalne (SVs) to zmiany sekwencji genomowej, zazwyczaj wpływające na 50 pz lub więcej. Cztery kategorie opisanych SV to duże insercje, duże delecje, inwersje i duplikacje. Do niedawna więcej uwagi poświęcano wariantom pojedynczych nukleotydów (SNV) niż wariantom strukturalnym, pod względem ich skutków fenotypowych i roli jako genetycznych uwarunkowań choroby lub ich wkładu w adaptację. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że łatwiej jest zarówno wykryć SNV, jak i przewidzieć ich skutki fenotypowe. Jednak technologie głębokiego sekwencjonowania z krótkim i długim odczytem znacznie poprawiły wykrywanie SV, przynajmniej w pojedynczych genomach osobniczych lub klonalnych1. Równolegle ich efekty fenotypowe zostały lepiej scharakteryzowane, a wiele przykładów ich implikacji jako genetycznych determinantów chorób u ludzi 2,3 lub adaptacji do nowego środowiska4 zostało udokumentowanych.
Delecje i insercje, często spowodowane insercjami ruchomych elementów genetycznych (MGE), są znacznie bardziej uciążliwe niż polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) i prowadzą do mutacji przesunięcia ramki i modyfikacji struktury białka. Delecje i inserkcje MGE w obrębie genów prawie zawsze powodują inaktywację genów, a inserkcje do regionów niekodujących mogą prowadzić do represji lub konstytutywnej ekspresji sąsiednich genów, gdy sekwencje insercji (IS) zawierają sekwencje promotora lub terminacji5. Podczas gdy nokaut niezbędnych genów prowadzi do wyraźnego szkodliwego wpływu na sprawność bakterii, utrata nieistotnych genów jest w niektórych przypadkach korzystna. Pomimo nieodłącznych kosztów, duplikacje mogą być również korzystne i uczestniczyć w adaptacji, ponieważ prowadzą do zmiany dawki genów; Wzrost aktywności określonego białka może być korzystny w zależności od warunków6.
Eksperymentalne populacje ewolucji mikrobiologicznej są zwykle rozpoczynane od klonów. Ten początkowy brak różnorodności genetycznej, w połączeniu z "zamkniętym środowiskiem" charakterystycznym dla probówek, prowadzi do bardzo ograniczonego potencjału ewolucji przez pozyskiwanie genów poprzez horyzontalny transfer genów i rekombinację. W tych specyficznych warunkach szczególnie ważny jest wkład w adaptację delecji, duplikacji i intragenomowej insercji MGE; Bakterie często adaptują się poprzez mutacje powodujące utratę funkcji (głównie z powodu delecji lub insercji MGE), wpływając na geny, które nie są przydatne w stabilnych, często bogatych w składniki odżywcze, monokulturowych sztucznych środowiskach7. W najdłużej trwającym eksperymencie ewolucji E. coli, inserpcje IS150 są szczególnie częste wśród populacji, które wyewoluowały po 50 000 pokoleń, przy czym elementy IS stanowią 35% mutacji, które osiągają wysoką częstotliwość w populacjach, które zachowują swój wskaźnik mutacji punktowych przodków8.
Ewolucja i badania nad resekwencją łączą eksperymentalne technologie ewolucji i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), aby zbadać, jak bakterie adaptują się, na poziomie fenotypowym i genomowym, do różnych warunków środowiskowych i stresów, takich jak różne źródła węgla i energii, antybiotyki i stres osmotyczny9,10,11. Badania te zazwyczaj uzyskują informacje genomowe na temat wyewoluowanych populacji lub klonów wyłącznie w eksperymentalnym punkcie końcowym, a w niektórych przypadkach w kilku pośrednich punktach czasowych12,13,14. Dane te dostarczają informacji na temat genów i szlaków zaangażowanych w adaptację do danego środowiska, ale rzadko pozwalają naukowcom śledzić dynamikę pojawiających się i zanikających alleli de novo w czasie.
Jednym z podejść do śledzenia tej dynamiki jest wybranie ograniczonej liczby interesujących nas alleli segregacji (ze względu na funkcję genów, na które wpływają, ponieważ poruszają się równolegle w niezależnych populacjach, itp.) i użycie sekwencjonowania amplikonów do ilościowego określenia proporcji alleli, łącząc wiele punktów czasowych w tym samym przebiegu sekwencjonowania15. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do śledzenia dynamiki wariantów o małych rozmiarach (SNP lub indele 1 bp) w eksperymentalnych16 i natural17 populacjach drobnoustrojów. Jednak w przypadku większych indeli lub insercji MGE różnica wielkości amplikonów indukuje różnice w wydajności PCR, które zniekształcają zależność między proporcjami odczytu i alleli. W niektórych przypadkach różnica wielkości między dwoma allelami jest większa niż klasyczna długość amplikonu. W tym przypadku połączyliśmy technikę tripletowej PCR z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną, aby określić ilościowo względną częstość allelu insercji w oparciu o dyskryminację wielkości. Podejście to pozwala na wykorzystanie niedostatecznie wykorzystanych eksperymentalnych punktów czasowych w celu określenia dynamiki pojawiającego się zmutowanego allelu i śledzenia jego częstości do utrwalenia lub utraty, w opłacalny sposób. Zastosowaliśmy tę metodę do śledzenia pojawiających się alleli mutS-, zmutowanych poprzez insercję IS10, zapewniając zmutowanemu genotypowi fenotyp hipermutatora.
Ta metoda wymaga dwóch docelowych alleli o ≥5% różnicy wielkości. Po pierwsze, trojaczki starterów są zaprojektowane tak, aby wytwarzać fragmenty o podobnej wielkości, które mają wspólny starter. Po drugie, optymalizuje się warunki PCR, a krzywą kalibracyjną wytwarza się przy użyciu mieszanin dzikiego typu (WT) i zmutowanego gDNA. Na koniec próbki są amplifikowane przez PCR, a względna częstość każdego allelu jest określana ilościowo za pomocą równoległej ilościowej elektroforezy kapilarnej.

<table><tbody><tr><td>96 Płytka do PCR z grubą spódnicą</td><td>4titude</td><td>4Ti - 0740</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Klasa biologii molekularnej agarozy</td><td>Eurogentec</td><td>EP-0010-05</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Skrócona instrukcja obsługi dla systemów analizatora fragmentów</td><td>Agilent</td><td></td><td>Instrukcja obsługi PDF</td></tr><tr><td>Bufor TBE</td><td>Panreac appliChem</td><td>A4228,5000Pc</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym&nbsp;</td></tr><tr><td>Kalibrowane jednorazowe pętle i igły do zaszczepiania</td><td>LABELIANS</td><td>8175CSR40H</td><td>Hodowla bakterii</td></tr><tr><td>Dneasy Zestaw do krwi i tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Zasilacz do elektroforezy</td><td>Amilabo</td><td>ST606T</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym&nbsp;</td></tr><tr><td>Analizator fragmentów Zautomatyzowany system CE</td><td>Agilent</td><td></td><td>Równoległa elektroforeza kapilarna</td></tr><tr><td>Drabinka fragmentu DNA</td><td>Agilent</td><td>DNF-396, zakres 1-6000bp</td><td>Równoległa elektroforeza kapilarna</td></tr><tr><td>BIOODCZYNNIK DO SOLI SIARCZANU GENTAMYCYNY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264-1G</td><td>Kultura bakteryjna</td></tr><tr><td>Marker rozcieńczalnika o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>DNF-373</td><td>Kapilara równoległa elektroforeza</td></tr><tr><td>Zestaw do analizy ilościowej NGS o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>DNF-474</td><td>Równoległa elektroforeza kapilarna</td></tr><tr><td>Drabinka szybkiego obciążenia 1 kb plus drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N0469S</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym&nbsp;</td></tr><tr><td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td><td>Millipore</td><td>28713</td><td>Kultura bakteryjna</td></tr><tr><td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F548L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Primers Oprogramowanie</td> do analizy danych <td>Eurogentec</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Prosize v.4</td><td>Agilent</td><td>V.4</td><td>Równoległa elektroforeza kapilarna</td></tr><tr><td>Testy kubitowe</td><td>Invitrogen</td><td>MAN0010876</td><td>Kwantyfikacja DNA Zestaw do oznaczania jakości HS</td></tr><tr><td>QBIT SDS</td> LIFE <td>TECHNOLOGIES SAS</td><td>Q32854</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>Gradienty Ep</td><td>PCR</td></tr><tr><td>UVbox, eBOX VX5</td><td>Vilber Lourmat</td><td></td><td>Wizualizacja elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Woda do preparatu do wstrzykiwań</td><td>Aguettant</td><td>PROAMP</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Warianty strukturalne (SV) (tj. delecje, insercje, duplikacje i inwersje) są teraz znane z tego, że odgrywają ważną rolę w zmienności fenotypowej, a w konsekwencji w procesach takich jak determinacja choroby lub adaptacja do nowego środowiska. Jednak wariantom pojedynczych nukleotydów poświęca się znacznie więcej uwagi niż SV, prawdopodobnie dlatego, że są łatwiejsze do wykrycia, a ich efekty fenotypowe są łatwiejsze do przewidzenia. Rozwój technologii głębokiego sekwencjonowania z krótkim i długim odczytem znacznie poprawił wykrywanie SV, ale kwantyfikacja ich częstotliwości na podstawie danych sekwencjonowania zbiorczego (poolseq) jest nadal technicznie złożona i kosztowna.
Tutaj prezentujemy raczej prostą i tanią metodę, która pozwala badaczom śledzić dynamikę częstości allelu SV. Jako przykład zastosowania śledzimy częstotliwość insercji sekwencji insercyjnej (IS) w eksperymentalnych populacjach ewolucyjnych bakterii. Metoda ta opiera się na zaprojektowaniu trójek starterów wokół granic wariantów strukturalnych, tak aby amplikony wytworzone przez amplifikację alleli typu dzikiego (WT) i pochodne różniły się wielkością o co najmniej 5%, a ich skuteczność amplifikacji była podobna. Ilość każdego amplikonu jest następnie określana za pomocą równoległej elektroforezy kapilarnej i normalizowana do krzywej kalibracyjnej. Metodę tę można łatwo rozszerzyć na kwantyfikację częstości występowania innych wariantów strukturalnych (delecje, duplikacje i inwersje) oraz na podejścia typu pool-seq w populacjach naturalnych, w tym w populacjach patogenów wewnątrzszpitalnych.

Wykorzystując DNA wyekstrahowane z klonu przodka oraz klonu hipermutatora wyizolowanego z populacji S2.11 w pokoleniu 1 000, ustaliliśmy krzywą kalibracyjną przedstawioną na Rysunku 2. Rzeczywiste proporcje mutantów w przygotowanych laboratoryjnie mieszaninach DNA, zmierzone za pomocą urządzenia do kapilarnej elektroforezy równoległej, były powiązane liniowo z nachyleniem 1,0706 i współczynnikiem R2 wynoszącym 0,9705. Ponadto odnotowano dobrą zgodność między powtórzeniami biologic...

Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Warianty strukturalne, takie jak insercje, delecje, duplikacje i inwersje, były w przeszłości trudniejsze do śledzenia eksperymentalnie, a ich częstości nie można dokładnie zmierzyć za pomocą sekwencjonowania amplikonów. Tutaj zapewniamy prostą, opłacalną technikę, która łączy potrójny projekt startera i równoległą elektroferezę kapilarną, aby śledzić częstotliwości alleli wariantów strukturalnych w czasie. Metoda ta została opracowana w celu uzupełnienia sekwencjonowania punktów końcowych w ewolucji eksperymentalnej oraz prześledzenia częstości występowania pojawiających się alleli de novo.Mamy nadzieję, że ta metoda przyniesie korzyści również osobom pracującym z danymi o patogenach wewnątrz gospodarzy. Procedurę zademonstruje Jeanne Hamet, asystentka naukowa z naszego laboratorium. Poszczególne etapy metod zostaną pokazane w przypadku, gdy uzyskany allel wynika z insercji IS10 w genie bakteryjnym zwanym mutS.Najpierw zaprojektuj parę starterów, aby amplifikować krótki amplikon na allelu typu dzikiego wokół miejsca insercji mutanta. Zaprojektuj trzeci starter forward starter drugi w sekwencji wstawiania, aby uzyskać niewielką zmienną wielkości z amplikonu typu dzikiego. Zacznij od ekstrakcji DNA z 24-godzinnych kultur ustalonych klonów alleli typu dzikiego i zmutowanego.Po ilościowym określeniu DNA rozcieńczyć każdy ekstrakt DNA do pięciu nanogramów na mikrolitr wodą. Utrwal dwie próbki w stosunku 50/50. Przygotuj 20-mikrolitrową reakcję zawierającą 10 nanogramów próbki DNA, startery i główną mieszankę PCR.Następnie oddziel produkt PCR przez elektroforezę, używając 2% żelu agarozowego. Różnica w wielkości między amplikonami typu dzikiego a mutantem musi być zweryfikowana na żelu. Aby uzyskać krzywą kalibracyjną, zacznij od zmieszania DNA typu dzikiego i zmutowanego DNA w różnych proporcjach.Rozcieńczyć produkty PCR do 0,1 nanograma na mikrolitr stężenia. Aby przygotować żel separacyjny, wymieszaj świeży żel i barwnik. Wymień bufor wlotowy.Umieść bufor płuczący we właściwym miejscu szuflady przyrządu do elektroforezy kapilarnej równoległej. Dodać 22 mikrolitry markera rozcieńczalnika do dołków płytki 96-dołkowej. Teraz dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonych produktów PCR do każdej studzienki próbki.Do jednej studni dodaj drabinkę wielkości DNA z zestawu o wysokiej czułości, o wielkości od jednej do 6 000 par zasad. Umieść mikropłytkę w równoległym przyrządzie do elektroforezy kapilarnej w wybranym uruchomieniu w oprogramowaniu urządzenia. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych.Najpierw zidentyfikuj szczyty na podstawie ich znanego rozmiaru. Określ ilościowo każdy amplikon, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Na koniec sprawdź, czy względne ilości dwóch alleli są prawidłowo zmierzone.Ta krzywa kalibracyjna jest następnie wykorzystywana do obliczenia ilości wariantów strukturalnych po amplifikacji PCR i równoległej elektroforezie kapilarnej. Te reprezentatywne wyniki są następstwem destrukcyjnej insercji w genie mutS. Nokautacje i mutS prowadzą do fenotypu hipermutatora, co pozwala bakteriom na pobranie większej liczby mutacji niż wynosi ich podstawowa szybkość mutacji.Za pomocą przedstawionej metody śledzono częstość występowania wariantów strukturalnych mutS w 1000 pokoleń. Ujawniono niemonotoniczną trajektorię wyłaniającego się zmutowanego allelu. Zmutowany allel został po raz pierwszy wykryty w pokoleniu 680.Częstość występowania allelu gwałtownie wzrosła, osiągając 67% w pokoleniu 713. Wzrost ten następnie uległ stagnacji, zwiększając się tylko o 10% w ciągu następnych 53 pokoleń, do 76%Nieoczekiwanie częstość występowania zmutowanych alleli spadła z 76% do 49% w ciągu 13 pokoleń, po czym wzrosła do utrwalenia. Metoda ta przyniesie korzyści osobom pracującym nad ewolucją eksperymentalną.Protokół ten pozwala użytkownikowi na korzystanie z zamrożonych archiwów i badanie trajektorii ewolucyjnych, które w przeciwnym razie nie byłyby obserwowalne za pomocą danych sekwencjonowania punktów końcowych.

following-dynamics-structural-variants-experimentally-evolved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Strategia genetyki molekularnej w celu znalezienia mutacji de novo powodujących powszechne zaburzenia, takie jak autyzm i schizofrenia.

Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Ta analityczna platforma obliczeniowa dostarcza praktycznych wskazówek dla mikrobiologów, ekologów i epidemiologów zainteresowanych genomiką populacji bakteryjnej. W szczególności zaprezentowane tutaj prace pokazały, w jaki sposób można przeprowadzić: i) mapowanie hierarchicznych genotypów pod kierunkiem filogenezy; ii) analiza genotypów oparta na częstotliwości; iii) analizy pokrewieństwa i klonalności; iv) Identyfikacja loci akcesoryjnych różnicujących rodowód.

Eksploracja heurystyczna hierarchicznych genotypów i dodatkowych loci genomu w populacjach bakteryjnych

Ten protokół opisuje, jak utrzymać Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) poprzez wykonywanie codziennych transferów i okresowych zamrażania oraz jak przeprowadzać testy konkurencji w celu zmierzenia poprawy kondycji u wyewoluowanych bakterii. Procedury te mogą służyć jako szablon dla naukowców rozpoczynających własne eksperymenty z ewolucją drobnoustrojów.

Codzienne transfery, archiwizacja populacji i pomiar sprawności w długoterminowym eksperymencie ewolucji z Escherichia coli

Obecne strategie walki z HIV-1 dążą do zahamowania cyklu życiowego wirusa, lecz nie eliminują skutecznie infekcji. W niniejszej pracy wykazujemy, że zmodyfikowana rekombinaza może efektywnie wycinać zintegrowane prowiralne DNA HIV-1 z genomu zainfekowanych komórek.

Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Poznaj metodę śledzenia dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnej ewolucji bakterii. Technika łączy projektowanie trójnikowych primerów z równoległą elektroforezą kapilarną, umożliwiając precyzyjne monitorowanie zmian częstości alleli mutS przez 1000 pokoleń.

Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach

Przeglądaj więcej filmów