Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach
3 lutego 2023
Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.
Warianty strukturalne, takie jak insercje, delecje, duplikacje i inwersje, były w przeszłości trudniejsze do śledzenia eksperymentalnie, a ich częstości nie można dokładnie zmierzyć za pomocą sekwencjonowania amplikonów. Tutaj zapewniamy prostą, opłacalną technikę, która łączy potrójny projekt startera i równoległą elektroferezę kapilarną, aby śledzić częstotliwości alleli wariantów strukturalnych w czasie. Metoda ta została opracowana w celu uzupełnienia sekwencjonowania punktów końcowych w ewolucji eksperymentalnej oraz prześledzenia częstości występowania pojawiających się alleli de novo.
Mamy nadzieję, że ta metoda przyniesie korzyści również osobom pracującym z danymi o patogenach wewnątrz gospodarzy. Procedurę zademonstruje Jeanne Hamet, asystentka naukowa z naszego laboratorium. Poszczególne etapy metod zostaną pokazane w przypadku, gdy uzyskany allel wynika z insercji IS10 w genie bakteryjnym zwanym mutS.
Najpierw zaprojektuj parę starterów, aby amplifikować krótki amplikon na allelu typu dzikiego wokół miejsca insercji mutanta. Zaprojektuj trzeci starter forward starter drugi w sekwencji wstawiania, aby uzyskać niewielką zmienną wielkości z amplikonu typu dzikiego. Zacznij od ekstrakcji DNA z 24-godzinnych kultur ustalonych klonów alleli typu dzikiego i zmutowanego.
Po ilościowym określeniu DNA rozcieńczyć każdy ekstrakt DNA do pięciu nanogramów na mikrolitr wodą. Utrwal dwie próbki w stosunku 50/50. Przygotuj 20-mikrolitrową reakcję zawierającą 10 nanogramów próbki DNA, startery i główną mieszankę PCR.
Następnie oddziel produkt PCR przez elektroforezę, używając 2% żelu agarozowego. Różnica w wielkości między amplikonami typu dzikiego a mutantem musi być zweryfikowana na żelu. Aby uzyskać krzywą kalibracyjną, zacznij od zmieszania DNA typu dzikiego i zmutowanego DNA w różnych proporcjach.
Rozcieńczyć produkty PCR do 0,1 nanograma na mikrolitr stężenia. Aby przygotować żel separacyjny, wymieszaj świeży żel i barwnik. Wymień bufor wlotowy.
Umieść bufor płuczący we właściwym miejscu szuflady przyrządu do elektroforezy kapilarnej równoległej. Dodać 22 mikrolitry markera rozcieńczalnika do dołków płytki 96-dołkowej. Teraz dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonych produktów PCR do każdej studzienki próbki.
Do jednej studni dodaj drabinkę wielkości DNA z zestawu o wysokiej czułości, o wielkości od jednej do 6 000 par zasad. Umieść mikropłytkę w równoległym przyrządzie do elektroforezy kapilarnej w wybranym uruchomieniu w oprogramowaniu urządzenia. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych.
Najpierw zidentyfikuj szczyty na podstawie ich znanego rozmiaru. Określ ilościowo każdy amplikon, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Na koniec sprawdź, czy względne ilości dwóch alleli są prawidłowo zmierzone.
Ta krzywa kalibracyjna jest następnie wykorzystywana do obliczenia ilości wariantów strukturalnych po amplifikacji PCR i równoległej elektroforezie kapilarnej. Te reprezentatywne wyniki są następstwem destrukcyjnej insercji w genie mutS. Nokautacje i mutS prowadzą do fenotypu hipermutatora, co pozwala bakteriom na pobranie większej liczby mutacji niż wynosi ich podstawowa szybkość mutacji.
Za pomocą przedstawionej metody śledzono częstość występowania wariantów strukturalnych mutS w 1000 pokoleń. Ujawniono niemonotoniczną trajektorię wyłaniającego się zmutowanego allelu. Zmutowany allel został po raz pierwszy wykryty w pokoleniu 680.
Częstość występowania allelu gwałtownie wzrosła, osiągając 67% w pokoleniu 713. Wzrost ten następnie uległ stagnacji, zwiększając się tylko o 10% w ciągu następnych 53 pokoleń, do 76%Nieoczekiwanie częstość występowania zmutowanych alleli spadła z 76% do 49% w ciągu 13 pokoleń, po czym wzrosła do utrwalenia. Metoda ta przyniesie korzyści osobom pracującym nad ewolucją eksperymentalną.
Protokół ten pozwala użytkownikowi na korzystanie z zamrożonych archiwów i badanie trajektorii ewolucyjnych, które w przeciwnym razie nie byłyby obserwowalne za pomocą danych sekwencjonowania punktów końcowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową, kosztowo efektywną metodę śledzenia dynamiki alleli wariantów strukturalnych, a w szczególności insercji, podczas ewolucji eksperymentalnej. Dzięki połączeniu projektowania zestawów trzech starterów z równoległą elektroforezą kapilarną, technika ta pozwala na ujawnienie zmian częstości występowania alleli w czasie, co demonstruje jej przydatność w badaniu trajektorii ewolucyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Genetyka
- Ewolucja eksperymentalna
- Warianty strukturalne
Wprowadzenie
- Kwantyfikacja wariantów strukturalnych przy użyciu konwencjonalnych metod stanowiła dotychczas wyzwanie.
- Amplifikacja i pomiar częstotliwości alleli insercyjnych są kluczowe dla zrozumienia ich roli w ewolucji.
- Celem opracowanej metody jest uzupełnienie istniejących technik sekwencjonowania.
Zastosowane metody
- Technika Triplet PCR w połączeniu z zautomatyzowaną równoległą elektroforezą kapilarną
- Bakteryjny system modelowy (gen mutS)
- Ilościowa ocena częstości występowania alleli
Główne wyniki
- Pomyślnie prześledzono niemonotoniczną trajektorię allelu mutS na przestrzeni 1000 generacji.
- Ujawniono złożoną dynamikę, w której częstość mutacji początkowo gwałtownie wzrosła, a następnie spadła przed utrwaleniem.
- Zademonstrowano zastosowanie w analizie utrwalonych zamrożonych próbek w badaniach ewolucyjnych.
Wnioski
- Badanie przedstawia solidną metodę obserwacji dynamiki wariantów strukturalnych, które w innym przypadku zostałyby pominięte podczas sekwencjonowania końcowego.
- Podejście to ma istotne znaczenie dla badaczy zajmujących się ewolucją eksperymentalną oraz dynamiką patogenów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie dynamiki alleli wariantów strukturalnych (SV) jest kluczowe dla zrozumienia adaptacji genetycznej i różnorodności fenotypowej w populacjach drobnoustrojów i patogenów. Metoda ta umożliwia precyzyjne i kosztowo efektywne śledzenie częstości występowania SV, wypełniając istotną lukę w genomice na etapie odkrywczym i zwiększając pewność prognostyczną w badaniach funkcjonalnych opartych na wariantach. Jej skalowalność oraz kompatybilność z próbkami pulowanymi sprawiają, że jest ona cennym narzędziem we wczesnych etapach odkryć i w procesach badawczych o charakterze translacyjnym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna analiza i walidacja celu
- Umożliwia ilościowe śledzenie częstotliwości alleli SV w celu wyjaśnienia fenotypów napędzanych przez warianty.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez monitorowanie pojawiania się alleli de novo w ewoluujących populacjach.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez ujawnianie niemonotonicznych trajektorii wariantów w czasie.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz przesiewowych poprzez ilościowe określanie SV w próbkach pulowanych.
- Standaryzuje wykrywanie SV dzięki powtarzalnemu projektowaniu starterów i odczytom z elektroforezy kapilarnej.
- Umożliwia skalowalną, zrównolegloną analizę odpowiednią dla wysokoprzepustowych procesów przesiewowych wariantów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z systemami istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając kwantyfikację SV w populacjach patogenów wewnątrz gospodarza.
- Wspiera ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez śledzenie dynamiki wariantów w próbkach archiwalnych.
- Zapewnia wartość prognostyczną dla decyzji o rozwoju projektu korygowanych o ryzyko w badaniach nad drobnoustrojami i patogenami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając dynamiczne śledzenie SV od wczesnego etapu weryfikacji hipotez po badania translacyjne, w szczególności w systemach mikrobialnych i patogennych.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kwantyfikację pojawiających się SV.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary SV w celu przygotowania testów.
- Analityka: Umożliwia kwantyfikację opartą na kalibracji oraz analizę porównawczą częstości występowania alleli.
- Badania translacyjne: Umożliwia śledzenie SV w populacjach naturalnych i wewnątrz gospodarza, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowany, kosztowo efektywny schemat pracy dla kwantyfikacji SV w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad wariantami strukturalnymi (SV).
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, skalowalną i powtarzalną kwantyfikację SV.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie wpływu wariantów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli związanych z SV z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu starterów oraz obsługą aparatury do elektroforezy kapilarnej.
- Wymaga dostępu do urządzenia do równoległej elektroforezy kapilarnej oraz oprogramowania do analizy ilościowej.
- Wymaga standaryzacji protokołów kalibracji i normalizacji pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów SV i kontekstów próbek pulowanych przy zastosowaniu odpowiednich zestawów starterów.
- Ograniczona przez wymóg wykrywalnych różnic w rozmiarze amplikonów oraz dokładność kalibracji.
