Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach
February 3rd, 2023
Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.
Warianty strukturalne, takie jak insercje, delecje, duplikacje i inwersje, były w przeszłości trudniejsze do śledzenia eksperymentalnie, a ich częstości nie można dokładnie zmierzyć za pomocą sekwencjonowania amplikonów. Tutaj zapewniamy prostą, opłacalną technikę, która łączy potrójny projekt startera i równoległą elektroferezę kapilarną, aby śledzić częstotliwości alleli wariantów strukturalnych w czasie. Metoda ta została opracowana w celu uzupełnienia sekwencjonowania punktów końcowych w ewolucji eksperymentalnej oraz prześledzenia częstości występowania pojawiających się alleli de novo.
Mamy nadzieję, że ta metoda przyniesie korzyści również osobom pracującym z danymi o patogenach wewnątrz gospodarzy. Procedurę zademonstruje Jeanne Hamet, asystentka naukowa z naszego laboratorium. Poszczególne etapy metod zostaną pokazane w przypadku, gdy uzyskany allel wynika z insercji IS10 w genie bakteryjnym zwanym mutS.
Najpierw zaprojektuj parę starterów, aby amplifikować krótki amplikon na allelu typu dzikiego wokół miejsca insercji mutanta. Zaprojektuj trzeci starter forward starter drugi w sekwencji wstawiania, aby uzyskać niewielką zmienną wielkości z amplikonu typu dzikiego. Zacznij od ekstrakcji DNA z 24-godzinnych kultur ustalonych klonów alleli typu dzikiego i zmutowanego.
Po ilościowym określeniu DNA rozcieńczyć każdy ekstrakt DNA do pięciu nanogramów na mikrolitr wodą. Utrwal dwie próbki w stosunku 50/50. Przygotuj 20-mikrolitrową reakcję zawierającą 10 nanogramów próbki DNA, startery i główną mieszankę PCR.
Następnie oddziel produkt PCR przez elektroforezę, używając 2% żelu agarozowego. Różnica w wielkości między amplikonami typu dzikiego a mutantem musi być zweryfikowana na żelu. Aby uzyskać krzywą kalibracyjną, zacznij od zmieszania DNA typu dzikiego i zmutowanego DNA w różnych proporcjach.
Rozcieńczyć produkty PCR do 0,1 nanograma na mikrolitr stężenia. Aby przygotować żel separacyjny, wymieszaj świeży żel i barwnik. Wymień bufor wlotowy.
Umieść bufor płuczący we właściwym miejscu szuflady przyrządu do elektroforezy kapilarnej równoległej. Dodać 22 mikrolitry markera rozcieńczalnika do dołków płytki 96-dołkowej. Teraz dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonych produktów PCR do każdej studzienki próbki.
Do jednej studni dodaj drabinkę wielkości DNA z zestawu o wysokiej czułości, o wielkości od jednej do 6 000 par zasad. Umieść mikropłytkę w równoległym przyrządzie do elektroforezy kapilarnej w wybranym uruchomieniu w oprogramowaniu urządzenia. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy danych.
Najpierw zidentyfikuj szczyty na podstawie ich znanego rozmiaru. Określ ilościowo każdy amplikon, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Na koniec sprawdź, czy względne ilości dwóch alleli są prawidłowo zmierzone.
Ta krzywa kalibracyjna jest następnie wykorzystywana do obliczenia ilości wariantów strukturalnych po amplifikacji PCR i równoległej elektroforezie kapilarnej. Te reprezentatywne wyniki są następstwem destrukcyjnej insercji w genie mutS. Nokautacje i mutS prowadzą do fenotypu hipermutatora, co pozwala bakteriom na pobranie większej liczby mutacji niż wynosi ich podstawowa szybkość mutacji.
Za pomocą przedstawionej metody śledzono częstość występowania wariantów strukturalnych mutS w 1000 pokoleń. Ujawniono niemonotoniczną trajektorię wyłaniającego się zmutowanego allelu. Zmutowany allel został po raz pierwszy wykryty w pokoleniu 680.
Częstość występowania allelu gwałtownie wzrosła, osiągając 67% w pokoleniu 713. Wzrost ten następnie uległ stagnacji, zwiększając się tylko o 10% w ciągu następnych 53 pokoleń, do 76%Nieoczekiwanie częstość występowania zmutowanych alleli spadła z 76% do 49% w ciągu 13 pokoleń, po czym wzrosła do utrwalenia. Metoda ta przyniesie korzyści osobom pracującym nad ewolucją eksperymentalną.
Protokół ten pozwala użytkownikowi na korzystanie z zamrożonych archiwów i badanie trajektorii ewolucyjnych, które w przeciwnym razie nie byłyby obserwowalne za pomocą danych sekwencjonowania punktów końcowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie prezentuje nową, opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli wariantów strukturalnych, szczególnie insercji, podczas ewolucji eksperymentalnej. Łącząc projektowanie tripletów z równoległą elektroforezą kapilarną, technika ta może ujawniać zmiany częstości alleli w czasie, demonstrując jej użyteczność w badaniu trajektorii ewolucyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Genetyka
- Ewolucja eksperymentalna
- Warianty strukturalne
Tło
- Warianty strukturalne były trudne do sprecyzowania za pomocą konwencjonalnych metod.
- Amplifikowanie i mierzenie częstości alleli insercji jest kluczowe dla zrozumienia ich ról w ewolucji.
- Metoda ma na celu uzupełnienie istniejących technik sekwencjonowania.
Zastosowane metody
- Technika PCR tripletów połączona z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną
- Bakteryalny system modelowy (gen mutS)
- Ilościowa ocena częstości alleli
Główne wyniki
- Skuteczna obserwacja niemonotonicznej trajektorii alleli genu mutS przez 1000 generacji.
- Ujawnienie złożonej dynamiki, gdzie częstość mutacji początkowo wzrosła, a następnie spadła przed fiksacją.
- Demonstracja zastosowania w analizie zamrożonych próbek do badań ewolucyjnych.
Wnioski
- Badanie wprowadza solidną metodę obserwacji dynamiki wariantów strukturalnych, które inaczej są pomijane przez sekwencjonowanie końcowe.
- To podejście oferuje istotne implikacje dla badaczy studiujących ewolucję eksperymentalną i dynamikę patogenów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying structural variant (SV) allele dynamics is critical for understanding genetic adaptation and phenotypic diversity in microbial and pathogen populations. This method enables precise, cost-effective tracking of SV frequencies, addressing a key gap in discovery-stage genomics and supporting predictive confidence in variant-driven functional studies. Its scalability and compatibility with pooled samples position it as a valuable tool for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative tracking of SV allele frequencies to clarify variant-driven phenotypes.
- Supports functional target validation by monitoring de novo allele emergence in evolving populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-monotonic variant trajectories over time.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening by quantifying SVs in pooled samples.
- Standardizes SV detection with reproducible primer design and capillary electrophoresis readouts.
- Enables scalable, parallelized analysis suitable for high-throughput variant screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling SV quantification in intra-host pathogen populations.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by tracking variant dynamics in archived samples.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement decisions in microbial and pathogen research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic SV tracking from early hypothesis testing through translational research, especially in microbial and pathogen systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying emerging SVs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative SV measurements for assay readiness.
- Analytics: Provides calibration-based quantification and comparative analysis of allele frequencies.
- Translational Research: Enables SV tracking in natural and intra-host populations, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, cost-effective workflow for SV quantification across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in SV-driven studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible SV quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying variant impact early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of SV-related targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primer design and capillary electrophoresis instrumentation.
- Needs access to parallel capillary electrophoresis and quantitative analysis software.
- Demands cross-team standardization of calibration and normalization protocols.
- Adaptable to various SV types and pooled sample contexts with appropriate primer sets.
- Limited by requirement for detectable amplicon size differences and calibration accuracy.
