Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu
20 września 2016
Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.
Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie mikroorganizmowi ewolucji w warunkach laboratoryjnych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak relacje funkcji nadnerczy, reakcje na stres, inżynieria metaboliczna i oczywiście ewolucja. Główną zaletą tej techniki jest ciągła selekcja najbardziej eleganckiego potomka w określonych warunkach laboratoryjnych.
Rozpocznij tę procedurę od przygotowania sprzętu, a także podłoża początkowego, medium o średnim naprężeniu i podłoża o wysokim naprężeniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zaszczepij pojedynczą kolonię lub dziką E. coli w 15-mililitrowej probówce zawierającej cztery mililitry początkowej pożywki. Inkubować probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min.
Inkubować słoik z chemostatem, zapewniając napowietrzanie i mieszanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Po inkubacji należy w asepcie połączyć koniec silikonowej rurki z pompami do słoika z chemostatem. W asepcie przenieś jeden mililitr kultury wstępnej do słoika z chemostatem.
Uruchom pompę wylotową i zbierz kulturę w fazie wykładniczej. Sprawdź gęstość optyczną kultury w 600 nanometrach z rurki wylotowej. Następnie uruchom pompę wlotową.
Co 24 godziny sprawdzaj gęstość optyczną kultury w odległości 600 nanometrów od rurki wylotowej. Po uruchomieniu chemostatu przez 96 godzin, co daje 9,6 pełnego obrotu, należy wymienić zbiornik na najniższe stężenie podłoża o wysokim naprężeniu. Po wymianie zbiornika na podłoże o wyższym naprężeniu ogniwa mogą zostać zszokowane.
Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska, przestań na jakiś czas podawać pożywkę o wyższym poziomie stresu, aby przywrócić gęstość komórek. Jeśli gęstość optyczna jest mniejsza niż 0,2, zatrzymaj pompę wlotową zasilania na sześć godzin. Uruchom ponownie pompę wlotową i sprawdź, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.
Stopniowo zwiększaj stężenie stresora poprzez stopniowe przechodzenie do zbiornika zawierającego wyższe stężenie stresora. Pobieraj próbki zaadaptowanej kultury za każdym razem, gdy osiąga ona kamień milowy adaptacji do stresorów i przechowuj je do dalszej analizy genomowej. W celu przechowywania próbki wymieszaj 0,5 mililitra próbki kultury z 0,5 mililitra wysterylizowanego 80% roztworu glicerolu i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Przygotować 1,6% pożywkę płytkową zawierającą ten sam stresor w tym samym stężeniu, co w pożywce. Umieść 0,1 mililitra kultury wylotowej z chemostatu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Po inkubacji należy pobrać pojedyncze kolonie z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki i zaszczepić je w 15-mililitrowych probówkach zawierających ten sam stresor i o tym samym stężeniu podłoża co w chemostacie.
Inkubować przez sześć godzin. Przenieść jeden mililitr bulionu hodowlanego do 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 50 mililitrów pożywki. Zbierz 0,5 mililitra bulionu kulturowego co godzinę i zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach.
Porównaj tempo wzrostu dostosowanego szczepu z tempem wzrostu szczepu dzikiego, biorąc pod uwagę stresor. Dziki szczep E.coli ewoluował w warunkach wysokiego stresu bursztynianowego przez 270 dni, co odpowiada prawie 930 pokoleniom. Za każdym razem, gdy dodawano wyższy stres bursztynianowy, stężenie biomasy było natychmiast obniżane, a następnie przywracane.
Pokazano tutaj schematyczny schemat chemostatu z mutantem, który jest tolerancyjny na wysoki stres bursztynianowy. Większość komórek typu dzikiego jest wypłukiwana w warunkach stresowych, a mutant rośnie bardziej. W końcu populacja potomka mutanta zostaje zwiększona.
Druga i trzecia mutacja są stale selekcjonowane i ostatecznie dominują w chemostacie. Rysunek ten pokazuje, że przystosowany szczep rósł bez opóźnień w warunkach wysokiego stresu bursztynianowego, podczas gdy szczep typu dzikiego nie. Podobną strategię można zastosować do adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej przy użyciu chemostatu z różnymi czynnikami stresogennymi.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać i ewoluować mikroorganizm w określonych warunkach. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku miesięcy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie wypłukiwać komórek chemostatu poprzez dodanie zbyt dużego stresu na raz i pamiętać o codziennym sprawdzaniu gęstości optycznej.
Czy zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić takie metody, jak analiza genomu i analiza transkryptomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jaka mutacja przyczynia się do ewolucji tolerującej stres?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów z wykorzystaniem hodowli w chemostacie. Omówiono w nim analizę genomiczną ewoluowanego szczepu oraz jej znaczenie dla mikrobiologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Ewolucja laboratoryjna
- Analiza genomiczna
Wprowadzenie
- Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna pozwala mikroorganizmom ewoluować w kontrolowanych warunkach.
- Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat odpowiedzi na stres oraz inżynierii metabolicznej.
- Ciągła selekcja potomstwa usprawnia badanie procesów ewolucyjnych.
- Wstępne przygotowanie pożywek jest kluczowe dla pomyślnej implementacji.
Cel badania
- Umożliwienie mikroorganizmom ewolucji w warunkach laboratoryjnych.
- Badanie zależności między odpowiedziami na stres a adaptacjami ewolucyjnymi.
- Ułatwienie prowadzenia badań z zakresu inżynierii metabolicznej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywek początkowej, stresowej i wysokostresowej.
- Inokulacja E. coli w probówce z pożywką początkową.
- Inkubacja w inkubatorze z wytrząsaniem w określonych warunkach.
- Ciągłe monitorowanie ewolucji mikrobiologicznej.
Główne wyniki
- Skuteczna ewolucja mikroorganizmów w kontrolowanych warunkach.
- Wgląd w mechanizmy odpowiedzi na stres.
- Potencjalne zastosowania w inżynierii metabolicznej.
- Analiza genomiczna ujawnia adaptacje w ewolwowanych szczepach.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia efektywną ewolucję laboratoryjną mikroorganizmów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia adaptacji mikrobiologicznych.
- Metoda ta może być zastosowana w różnych pytaniach badawczych z zakresu mikrobiologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna z wykorzystaniem hodowli w chemostacie umożliwia ciągłą selekcję szczepów mikrobiologicznych w kontrolowanych warunkach stresowych, co wspiera walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w początkowej fazie odkryć. Podejście to generuje zróżnicowane populacje dzięki wysokim tempom podziałów komórkowych, co zwiększa pewność predykcyjną w zakresie inżynierii szczepów i optymalizacji szlaków metabolicznych. Metoda ta ułatwia ciągłość translacyjną poprzez powiązanie ewolucji laboratoryjnej z analizami genomicznymi i transkryptomicznymi w celu identyfikacji mutacji adaptacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ewolucję indukowaną stresorem oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez identyfikację dominujących szczepów adaptacyjnych pod wpływem presji selekcyjnej.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na generowanie zróżnicowanych populacji mutantów w celu funkcjonalnej walidacji celów i identyfikacji związków wiodących.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych o ustabilizowanych fenotypach tolerancyjnych na stres do dalszych badań przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki ciągłej hodowli i zdefiniowanym gradientom stresora.
- Skalowalność: Możliwość ponownego wykorzystania platformy dla wielu stresorów i gospodarzy mikrobiologicznych w celu przygotowania do badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy fenotypy ewoluujących szczepów ze zmianami genomowymi, wspierając dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość ewolucyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez możliwe do prześledzenia kamienie milowe adaptacji.
- Minimalizacja ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie tolerancji na stres ze specyficznymi mutacjami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez we wczesnej fazie odkrywania, po identyfikację związków wiodących i walidację przedkliniczną, przy wsparciu wyników ciągłej selekcji i analizy genomicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kontrolowaną ekspozycję na stresory oraz wzbogacanie mutantów.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne kultury z ilościowym monitorowaniem gęstości optycznej w celu porównania szczepów.
- Analityka: Umożliwia porównawczą analizę genomową i transkryptomiczną w celu zidentyfikowania mutacji przyczyniających się do tolerancji na stres.
- Badania translacyjne: Łączy ewolucję laboratoryjną z ciągłością przedkliniczną poprzez udokumentowane kamienie milowe adaptacji i kriokonserwowane próbki.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do ewolucji mikroorganizmów pod wpływem różnych stresorów w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w inżynierii szczepów poprzez ujawnienie mechanizmów adaptacji do stresu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza nakład pracy po konfiguracji dzięki zautomatyzowanej hodowli ciągłej i określonym odstępom czasu pobierania próbek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) poprzez powiązanie wyników ewolucyjnych z genomicznymi czynnikami sprawności biologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację szczepów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane mutacje adaptacyjne i wydajność wzrostu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikrobiologii, obsługi chemostatu oraz technik aseptycznych.
- Zależność od aparatury zapewniającej precyzyjną kontrolę pomp, napowietrzanie, mieszanie oraz monitorowanie gęstości optycznej.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania pożywek, gradientów stresorów oraz protokołów pobierania próbek.
- Konieczność uwzględnienia kwestii adaptacji podczas przenoszenia ewoluowanych szczepów do testów walidacyjnych w kolbach z wytrząsaniem lub na płytkach.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko wypłukiwania komórek przy nadmiernym stresie oraz konieczność codziennej kontroli gęstości optycznej w celu utrzymania stabilności hodowli.
