Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu
September 20th, 2016
Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.
Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie mikroorganizmowi ewolucji w warunkach laboratoryjnych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak relacje funkcji nadnerczy, reakcje na stres, inżynieria metaboliczna i oczywiście ewolucja. Główną zaletą tej techniki jest ciągła selekcja najbardziej eleganckiego potomka w określonych warunkach laboratoryjnych.
Rozpocznij tę procedurę od przygotowania sprzętu, a także podłoża początkowego, medium o średnim naprężeniu i podłoża o wysokim naprężeniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zaszczepij pojedynczą kolonię lub dziką E. coli w 15-mililitrowej probówce zawierającej cztery mililitry początkowej pożywki. Inkubować probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min.
Inkubować słoik z chemostatem, zapewniając napowietrzanie i mieszanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Po inkubacji należy w asepcie połączyć koniec silikonowej rurki z pompami do słoika z chemostatem. W asepcie przenieś jeden mililitr kultury wstępnej do słoika z chemostatem.
Uruchom pompę wylotową i zbierz kulturę w fazie wykładniczej. Sprawdź gęstość optyczną kultury w 600 nanometrach z rurki wylotowej. Następnie uruchom pompę wlotową.
Co 24 godziny sprawdzaj gęstość optyczną kultury w odległości 600 nanometrów od rurki wylotowej. Po uruchomieniu chemostatu przez 96 godzin, co daje 9,6 pełnego obrotu, należy wymienić zbiornik na najniższe stężenie podłoża o wysokim naprężeniu. Po wymianie zbiornika na podłoże o wyższym naprężeniu ogniwa mogą zostać zszokowane.
Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska, przestań na jakiś czas podawać pożywkę o wyższym poziomie stresu, aby przywrócić gęstość komórek. Jeśli gęstość optyczna jest mniejsza niż 0,2, zatrzymaj pompę wlotową zasilania na sześć godzin. Uruchom ponownie pompę wlotową i sprawdź, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.
Stopniowo zwiększaj stężenie stresora poprzez stopniowe przechodzenie do zbiornika zawierającego wyższe stężenie stresora. Pobieraj próbki zaadaptowanej kultury za każdym razem, gdy osiąga ona kamień milowy adaptacji do stresorów i przechowuj je do dalszej analizy genomowej. W celu przechowywania próbki wymieszaj 0,5 mililitra próbki kultury z 0,5 mililitra wysterylizowanego 80% roztworu glicerolu i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Przygotować 1,6% pożywkę płytkową zawierającą ten sam stresor w tym samym stężeniu, co w pożywce. Umieść 0,1 mililitra kultury wylotowej z chemostatu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Po inkubacji należy pobrać pojedyncze kolonie z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki i zaszczepić je w 15-mililitrowych probówkach zawierających ten sam stresor i o tym samym stężeniu podłoża co w chemostacie.
Inkubować przez sześć godzin. Przenieść jeden mililitr bulionu hodowlanego do 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 50 mililitrów pożywki. Zbierz 0,5 mililitra bulionu kulturowego co godzinę i zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach.
Porównaj tempo wzrostu dostosowanego szczepu z tempem wzrostu szczepu dzikiego, biorąc pod uwagę stresor. Dziki szczep E.coli ewoluował w warunkach wysokiego stresu bursztynianowego przez 270 dni, co odpowiada prawie 930 pokoleniom. Za każdym razem, gdy dodawano wyższy stres bursztynianowy, stężenie biomasy było natychmiast obniżane, a następnie przywracane.
Pokazano tutaj schematyczny schemat chemostatu z mutantem, który jest tolerancyjny na wysoki stres bursztynianowy. Większość komórek typu dzikiego jest wypłukiwana w warunkach stresowych, a mutant rośnie bardziej. W końcu populacja potomka mutanta zostaje zwiększona.
Druga i trzecia mutacja są stale selekcjonowane i ostatecznie dominują w chemostacie. Rysunek ten pokazuje, że przystosowany szczep rósł bez opóźnień w warunkach wysokiego stresu bursztynianowego, podczas gdy szczep typu dzikiego nie. Podobną strategię można zastosować do adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej przy użyciu chemostatu z różnymi czynnikami stresogennymi.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać i ewoluować mikroorganizm w określonych warunkach. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku miesięcy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie wypłukiwać komórek chemostatu poprzez dodanie zbyt dużego stresu na raz i pamiętać o codziennym sprawdzaniu gęstości optycznej.
Czy zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić takie metody, jak analiza genomu i analiza transkryptomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jaka mutacja przyczynia się do ewolucji tolerującej stres?
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów za pomocą kultury chemostatowej. Omawia analizę genomową ewoluowanego szczepu i jego implikacje w mikrobiologii.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Laboratoryjna ewolucja
- Analiza genomowa
Tło
- Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna pozwala mikroorganizmom ewolować w kontrolowanych warunkach.
- Ta metoda może dostarczyć informacji na temat reakcji na stres i inżynierii metabolicznej.
- Ciągła selekcja potomków poprawia badania procesów ewolucyjnych.
- Wstępna przygotowanie mediów jest kluczowa dla pomyślnej implementacji.
Cel badania
- Aby umożliwić mikroorganizmom ewolucję w warunkach laboratoryjnych.
- Aby zbadać relacje między reakcjami na stres a adaptacjami ewolucyjnymi.
- Aby ułatwić badania nad inżynierią metaboliczną.
Stosowane metody
- Przygotowanie początkowego, stresującego i bardzo stresującego mediów.
- Inokulacja E. coli w probówce z początkowym medium.
- Inkubacja w inkubatorze drgającym w określonych warunkach.
- Ciągłe monitorowanie ewolucji mikroorganizmów.
Główne wyniki
- Sukces w ewolucji mikroorganizmów w kontrolowanych warunkach.
- Wgląd w mechanizmy reakcji na stres.
- Potencjalne zastosowania w inżynierii metabolicznej.
- Analiza genomowa ujawnia adaptacje w ewoluowanych szczepach.
Wnioski
- Protokół umożliwia efektywną laboratoryjną ewolucję mikroorganizmów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia adaptacji mikrobiowych.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych pytań badawczych w mikrobiologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Adaptive laboratory evolution using chemostat culture enables continuous selection of microbial strains under controlled stress conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach generates diverse populations through high cell division rates, improving predictive confidence for strain engineering and pathway optimization. The method facilitates translational continuity by linking laboratory evolution to genomic and transcriptomic analysis for identifying adaptive mutations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stressor-induced evolution and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dominant adaptive strains under selective pressure.
- Predictive Value: Generates diverse mutant populations for functional target validation and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized stress-tolerant phenotypes for downstream screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through continuous culture and defined stressor gradients.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple stressors and microbial hosts for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects evolved strain phenotypes to genomic changes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides evolutionary continuity from discovery through preclinical validation via traceable adaptation milestones.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking stress tolerance to specific mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by continuous selection and genomic analysis outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled stressor exposure and mutant enrichment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cultures with quantitative optical density monitoring for strain comparison.
- Analytics: Enables comparative genomic and transcriptome analysis to identify mutations contributing to stress tolerance.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical continuity through documented adaptation milestones and cryopreserved samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evolving microorganisms under varying stressors across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in strain engineering by revealing mechanisms of stress adaptation.
- Operational Value: Reduces labor intensity post-setup through automated continuous culture and defined sampling intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking evolutionary outcomes to genomic drivers of fitness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated adaptive mutations and growth performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, chemostat operation, and aseptic technique.
- Depends on instrumentation for precise pump control, aeration, agitation, and optical density monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for media preparation, stressor gradients, and sampling protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains to shake-flask or plate-based validation assays.
- Includes practical limitations such as cell washout risk under excessive stress and the need for daily optical density checks to maintain culture stability.
