Name: Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Poznaj metodę ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów przy użyciu chemostatu. Technika ta umożliwia ciągłą selekcję potomstwa E. coli pod kontrolowanymi warunkami stresu, wspierając badania nad odpowiedzią na stres i inżynierią metaboliczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane finansowo przez Koreańskie Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (program Centrum Inteligentnej Biologii Syntetycznej 2012M3A6A8054887). P. Kim był wspierany przez stypendium z Katolickiego Uniwersytetu Korei (2015).

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Zaopatrzyć się w słoik z chemostatem (150-250 ml) lub kolbę Erlenmeyera (250 ml) zawierającą króciec wlotowy i otwór wylotowy. Podłącz porty za pomocą silikonowych rurek, co pozwala na przepływ 10-100 ml / h. Opcjonalnie użyj odpowietrznika, portu wylotowego powietrza oraz portów wlotowych i wylotowych wody o kontrolowanej temperaturze.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w urządzenie odpowiednie do słoika z chemostatem, które zapewnia mieszanie i kontrolę temperatury (lub użyć inkubatora z obrotowym wytrząsaniem).</li>
	<li>Zaopatrz się w dwie pompy perystaltyczne w celu dostarczenia świeżej pożywki i zebrania kultury.</li>
	<li>Zaopatrz się w słoik zbiornika (10-20 l) zawierający średni port wylotowy i otwór wlotu powietrza.</li>
	<li>Uzyskać rurkę silikonową odpowiednią do szybkości rozcieńczania (tj. ID 0,8 mm, zakres przepływu 0,06-36 ml/min; Rurki L/S 13).</li>
</ol>
2. Przygotowanie i sterylizacja podłoża
<ol>
	<li>Podłoże początkowe
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,3 g glukozy, 0,08 g NH4Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na2HPO4·2H2O i 0,3 g KH2PO4 w 90 ml wody destylowanej (DW) w słoiku z chemostatem.</li>
		<li>Zamknij słoik chemostatu wraz z rurką za pomocą zacisków. Nie uszczelniaj odpowietrznika.</li>
		<li>Sterylizować słoik z chemostatem w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji słoik z chemostatem należy przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozpuścić 0,02 g MgSO4·7H2O, 0,01 g CaCl2 i 0,1 mg tiaminy w 10 ml DW (roztwór A).</li>
		<li>Roztwór filtracyjny A za pomocą strzykawki i wstępnie wysterylizowanego filtra strzykawkowego (filtr porowy 0,45 μm).</li>
		<li>Dodać roztwór A filtruje do słoika z chemostatem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Średni stres
	<ol>
		<li>Rozpuścić 30 g glukozy, 8 g NH4Cl, 5 g NaCl, 75 g Na2HPO4·2H2O, 30 g KH2PO4 i 300 g sześciowodnego bursztynianu disodowego (Na2·bursztynian·6H2O; stresor użyty w tym doświadczeniu) w 9,9 l s.w. w słoiku ze zbiornikiem.</li>
		<li>Uszczelnij słoik zbiornika wraz z rurką za pomocą clamps. Nie uszczelniaj odpowietrznika.</li>
		<li>Sterylizować słoik w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji przechowuj słoik w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozpuścić 2 g MgSO,4·7H2O, 1 g CaCl2 i 10 mg tiaminy w 100 ml s.m. (roztwór A).</li>
		<li>Roztwór filtracyjny A ze strzykawką i wstępnie wysterylizowanym filtrem strzykawkowym (filtr porowy 0,45 μm).</li>
		<li>Dodać roztwór A przesączający się do słoika zbiornika.</li>
		<li>Aseptycznie podłącz wysterylizowane rurki silikonowe do słoika zbiornika i podłącz pompy perystaltyczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysoki poziom stresu Średni
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę jak w sekcji 2.2, ale z większym stężeniem stresora (tj. o 3-5 g/l wyższym w adaptacji bursztynianu). 
		Uwaga: Ten protokół służy do adaptacji do stresu, który może być dostarczony przez medium. W przypadku fizycznych czynników stresogennych, takich jak temperatura, pobudzenie lub oświetlenie, uprawa powinna być odpowiednio zaprojektowana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Początkowa uprawa
<ol>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli typu dzikiego w 15 ml probówce zawierającej 4 ml pożywki początkowej.</li>
	<li>Inkubować probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.</li>
	<li>Przenieść w asepcie 1 ml kultury wstępnej do słoika z chemostatem.</li>
	<li>Inkubować słoik z chemostatem, zapewniając napowietrzanie (powietrze 50 ml/min) i mieszanie (200 obr./min), w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.</li>
</ol>
4. Adaptacja do stresu
<ol>
	<li>Podłączyć w asepcie koniec silikonowej rurki od pomp do słoika z chemostatem.</li>
	<li>Uruchomić pompę wylotową (10 ml/godz. lub wyższą) i zebrać kulturę. 
	Uwaga: Kultura powinna znajdować się w fazie wykładniczej, zwykle 4-8 godzin po początkowej uprawie.</li>
	<li>Sprawdź gęstość optyczną (600 nm) kultury z rurki wylotowej.</li>
	<li>Uruchomić pompę wlotową (10 ml/h, co odpowiada szybkości rozcieńczenia 0,1 h-1).</li>
	<li>Sprawdzaj gęstość optyczną kultury przy 600 nm z rurki wylotowej co 24 godziny.</li>
	<li>Używaj chemostatu przez 96 godzin (9,6-krotny obrót) lub dłużej. Jeśli gęstość optyczna jest stabilna, wymień zbiornik zawierający medium o wysokim naprężeniu. Jeśli gęstość optyczna jest mniejsza niż 0,2, zatrzymaj pompę zasilającą na 6 godzin. Uruchom ponownie pompę wlotową i sprawdź, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj stężenie stresora, zmieniając go na zbiornik zawierający wyższe stężenie stresora.</li>
	<li>Pobiera próbki przystosowanej kultury za każdym razem, gdy osiąga ona kamień milowy (np. szczep przystosowany do stresu bursztynianowego 100 g/l) i przechowuje je do dalszej analizy genomowej.</li>
	<li>W celu przechowywania próbki należy zmieszać próbkę kultury (0,5 ml) ze wysterylizowanym 80% roztworem glicerolu (0,5 ml) i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: Jeśli mikroorganizm uzyska zdolność do degradacji stresora podczas procesu ALE, stężenie stresora w słoiku fermentacyjnym nie jest takie samo jak w świeżym zbiorniku.</li>
</ol>
5. Izolacja pojedynczej kolonii szczepu przystosowanego do stresu
<ol>
	<li>Przygotować podłoże na płytce agarowej (1,6% agaru) zawierające ten sam stresor i o tym samym stężeniu pożywki.</li>
	<li>Umieścić na płytce kulturę wylotową (0,1 ml) z chemostatu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej wykałaczki należy pobrać pojedyncze kolonie z płytki i zaszczepić je w 15 ml probówkach zawierających ten sam stresor i w tym samym stężeniu podłoża co w chemostacie i inkubować przez 6 godzin.</li>
	<li>Przenieść 1 ml bulionu hodowlanego do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki. Zbierz 0,5 ml bulionu kulturowego co 1 godzinę i zmierz średnicę zewnętrzną przy 600 nm. Porównaj tempo wzrostu dostosowanego szczepu z tempem wzrostu szczepu dzikiego, biorąc pod uwagę stresor.</li>
</ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroorganizmy są w stanie przystosować się do prawie wszystkich środowisk ze względu na szybkie tempo wzrostu i różnorodność genetyczną. Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna umożliwia mikroorganizmom ewolucję w zaprojektowanych warunkach, co zapewnia sposób selekcji poszczególnych organizmów posiadających spontaniczne mutacje, które są korzystne w danych warunkach.
Technika chemostatu jest bardziej skuteczna w osiąganiu sztucznie sterowanej ewolucji niż techniki transferu z następujących powodó...

Mikroorganizmy potrafią przetrwać i przystosować się do różnorodnych środowisk. W warunkach silnego stresu adaptacja może zachodzić poprzez nabycie korzystnych fenotypów w wyniku losowych mutacji genomicznych i następującej po nich selekcji pozytywnej1-3. W związku z tym komórki mikrobowe mogą adaptować się poprzez zmianę sieci metabolicznych lub regulacyjnych w celu optymalizacji wzrostu, co określa się mianem „ewolucji adaptacyjnej”. Współczesne istotne tendencje mikrobiologiczne, takie jak epidemie superpatii czy pojawianie się odpornych szczepów drobnoustrojów, są ściśle powiązane z ewolucją adaptacyjną w warunkach stresowych. W zdefiniowanych warunkach laboratoryjnych jesteśmy w stanie badać mechanizmy ewolucji molekularnej, a nawet kontrolować kierunek ewolucji mikroorganizmów w różnych zastosowaniach. W przeciwieństwie do organizmów wielokomórkowych, organizmy jednokomórkowe są bardzo dobrze dostosowane do laboratoryjnej ewolucji adaptacyjnej (ALE) z następujących powodów: szybko się regenerują, utrzymują duże populacje oraz łatwo jest tworzyć i utrzymywać dla nich jednorodne środowiska. W połączeniu z ostatnimi postępami w technikach sekwencjonowania DNA i technologiami wysokoprzepustowymi, ALE pozwala na bezpośrednią obserwację zmian genomicznych, które prowadzą do systemowych zmian regulacyjnych. Możliwa jest również obserwacja dynamiki mutacyjnej oraz różnorodności populacji. Strategie inżynierii genetycznej mogą zostać opracowane na podstawie analizy szczepów poddanych ALE4,5.
Hodowla w chemostacie to metoda stosowana w celu uzyskania komórek w stanie stacjonarnym oraz zwiększenia wydajności w procesach fermentacji6. W trakcie procesu dodawana jest świeża pożywka i pobierany jest bulion hodowlany (ten drugi obejmuje pożywkę i biomasę). Długotrwała hodowla w chemostacie zmienia jednak wydajność kultury w stanie stacjonarnym i prowadzi do akumulacji spontanicznych mutacji oraz selekcji w trakcie hodowli (Rycina 1a). Pod wpływem różnych presji selekcyjnych (stresorów) akumulacja mutacji ulega nasileniu. Stopniowy wzrost stresu w długotrwałym chemostacie zapewnia ciągłą selekcję mutacji przeciwdziałających danym stresorom, takim jak temperatura, pH, ciśnienie osmotyczne, głodowanie nutrientowe, utlenianie, toksyczne produkty końcowe itp. Przenoszenie kolonii z pożywki stałej oraz przenoszenie seryjne z pożywki płynnej (powtarzalna hodowla okresowa) również pozwalają badaczom na uzyskanie ewoluowanych mikroorganizmów (Rycina 1b i 1c). Choć hodowla w chemostacie wymaga skomplikowanych metod, pula różnorodności (liczba replikacji i wielkość populacji) jest większa niż ta uzyskiwana za pomocą technik przenoszenia kolonii i przenoszenia seryjnego. Stabilna ekspozycja poszczególnych komórek na stres oraz zmniejszona zmienność stanu komórkowego podczas hodowli w chemostacie (stan stacjonarny) to inne zalety ALE w porównaniu do technik opartych na hodowli okresowej. W niniejszym artykule przedstawiono indukowaną stresem ALE Escherichia coli poddaną wysokim stężeniom bursztynianu.
<img alt="Schemat hodowli w chemostacie z wykresami wzrostu komórek; metody transferu seryjnego i kolonialnego." src="/files/ftp_upload/54446/54446fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metody adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej. (A) Chemostat; (B) transfer seryjny; (C) transfer kolonialny. Górne schematy ilustrują koncepcję metod ALE, a dolne wykresy przedstawiają liczbę komórek, które namnożyły się podczas ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini-fermentor chemostat</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>wyprodukowane na specjalne zamówienie</td></tr><tr><td>rurki silikonowe</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L / S 13</td><td>rozmiar rurki można zmieniać w zależności od stopnia rozcieńczenia i wielkości słoika fermentora.</td></tr><tr><td>słoik zbiornikowy</td><td>Butelka do przechowywania</td><td>Bellco</td> Media <td>20 L</td></tr><tr><td>chemikalia</td><td>Sigma-Aldrich-odczynnik</td><td></td> <td>klasy</td></tr><tr><td>glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Odczynnik ACS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>do biologii molekularnej, odpowiedni do hodowli komórkowych, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>odczynnik ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>odczynnik ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Odczynnik ACS do Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>, &ge; 98%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>odczynnik ACS, &ge; 96%</td></tr> <tr><td>tiamina i kropka środkowa; Klasa odczynnika HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2&middot; bursztynian i middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr></tbody></table>

procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Naturalna ewolucja obejmuje różnorodność genetyczną, taką jak zmiany środowiskowe i selekcja między małymi populacjami. Adaptacyjna ewolucja laboratoryjna (ALE) odnosi się do sytuacji eksperymentalnej, w której ewolucję obserwuje się przy użyciu organizmów żywych w kontrolowanych warunkach i stresorach; W ten sposób organizmy są sztucznie zmuszane do dokonywania zmian ewolucyjnych. Mikroorganizmy są narażone na różne czynniki stresogenne w środowisku i są zdolne do regulowania niektórych białek indukowanych stresem, aby zwiększyć swoje szanse na przeżycie. Naturalnie występujące spontaniczne mutacje powodują zmiany w genomie drobnoustroju, które wpływają na jego szanse na przeżycie. Długotrwała ekspozycja na kulturę chemostatu powoduje akumulację spontanicznych mutacji i sprawia, że najbardziej elastyczny szczep staje się dominujący. W porównaniu z metodami transferu kolonii i transferu szeregowego, hodowla chemostatu pociąga za sobą największą liczbę podziałów komórkowych, a tym samym największą liczbę zróżnicowanych populacji. Chociaż hodowla chemostatu w przypadku ALE wymaga bardziej skomplikowanych urządzeń do hodowli, jest mniej pracochłonna po rozpoczęciu operacji. Porównawcze analizy genomiczne i transkryptomiczne przystosowanego szczepu dostarczają ewolucyjnych wskazówek na temat tego, w jaki sposób stresory przyczyniają się do mutacji, które przezwyciężają stres. Celem niniejszej pracy jest doprowadzenie do przyspieszenia ewolucji mikroorganizmów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

W celu adaptacji do stresu wywołanego wysokim stężeniem bursztynianu, szczep dziki E. coli W3110 hodowano w chemostacie przy D = 0,1 hr-1 przez 270 dni (Rysunek 2).
<img alt="Krzywa wzrostu bakterii, pomiar OD600, dane z serii czasowej, wykres z pikiem i strzałkami, 0-250 dni." src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Adaptacja do stresu wywołane...

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie mikroorganizmowi ewolucji w warunkach laboratoryjnych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny mikrobiologii, takie jak zależności dotyczące funkcji nadnerczy, odpowiedzi na stres, inżynieria metaboliczna, a oczywiście także ewolucja. Główną zaletą tej techniki jest ciągła selekcja najlepiej przystosowanego potomstwa w określonych warunkach laboratoryjnych.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania sprzętu, a także pożywki początkowej, pożywki stresowej i pożywki o wysokim stopniu stresu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zaszczep pojedynczą kolonię lub szczep dziki E.coli w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki początkowej. Inkubuj probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 37 °C i przy 220 rpm.Inkubuj naczynie chemostatu, zapewniając napowietrzanie i mieszanie w temperaturze 37 °C przez sześć godzin. Po inkubacji aseptycznie podłącz koniec silikonowego wężyka z pomp do naczynia chemostatu. Aseptycznie przenieś jeden mililitr prekultury do naczynia chemostatu.Uruchom pompę wylotową i zbierz kulturę w fazie wykładniczej. Sprawdź gęstość optyczną kultury z przewodu wylotowego przy 600 nanometrach. Następnie uruchom pompę wlotową.Co 24 godziny sprawdzaj gęstość optyczną hodowli przy 600 nanometrach, pobierając próbkę z przewodu wylotowego. Po 96 godzinach pracy chemostatu, co odpowiada 9,6 pełnej wymianie, wymień zbiornik na medium o najniższym stężeniu czynnika stresowego. Podczas wymiany zbiornika na medium o wyższym poziomie stresu komórki mogą doznać szoku.Jeśli gęstość komórek jest zbyt niska, należy na jakiś czas przerwać podawanie pożywki o wysokim poziomie stresu, aby przywrócić gęstość komórek. Jeśli gęstość optyczna jest niższa niż 0,2, należy zatrzymać pompę wlotową na sześć godzin. Następnie należy ponownie uruchomić pompę wlotową i sprawdzić, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.Stopniowo zwiększaj stężenie stresora, sukcesywnie przenosząc kulturę do zbiornika zawierającego wyższe stężenie stresora. Pobieraj próbki zaadaptowanej kultury za każdym razem, gdy osiągnie ona kamień milowy adaptacji do stresora, i przechowuj je do dalszej analizy genomicznej. W celu przechowywania próbek zmieszaj 0,5 ml próbki kultury z 0,5 ml sterylnego 80% roztworu glicerolu i przechowuj w temperaturze -80 °C.Przygotować pożywkę agarową 1,6% zawierającą ten sam stresor w takim samym stężeniu, jak w pożywce płynnej. Wysiać 0,1 ml kultury z odpływu chemostatu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Po inkubacji wyizolować pojedyncze kolonie z płytki za pomocą sterylnego wymazika i zaszczepić je do probówek o pojemności 15 ml zawierających ten sam stresor i taką samą koncentrację pożywki, jak w chemostacie.Inkubować przez sześć godzin. Przenieść 1 ml pożywki hodowlanej do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki. Pobierać 0,5 ml pożywki hodowlanej co godzinę i mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm.Porównaj tempo wzrostu szczepu zaadaptowanego z tempem wzrostu szczepu typu dzikiego w obecności stresora. Szczep E.coli typu dzikiego był ewoluowany w warunkach stresu wywołanego wysokim stężeniem bursztynianu przez 270 dni, co odpowiada niemal 930 generacjom. W każdym przypadku dodania wyższego stresu bursztynianowego stężenie biomasy natychmiast spadało, a następnie ulegało przywróceniu.Przedstawiony tutaj schemat blokowy obrazuje chemostat z mutantem wykazującym tolerancję na wysoki stres bursztynowy. Większość komórek typu dzikiego zostaje wypłukana w warunkach stresowych, podczas gdy mutant rośnie intensywniej. W konsekwencji zwiększa się populacja potomstwa mutanta.Druga i trzecia mutacja są stale selekcjonowane i ostatecznie dominują w chemostacie. Rysunek ten pokazuje, że szczep zaadaptowany rósł bez opóźnienia w warunkach wysokiego stresu wywołanego przez bursztynian, podczas gdy szczep typu dzikiego tego nie robił. Podobną strategię można zastosować w adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej z wykorzystaniem chemostatu z różnymi wariantami stresorów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak pozyskiwać i ewoluować mikroorganizmy w określonych warunkach. Po opanowaniu tej techniki proces ten może zostać zrealizowany w ciągu kilku miesięcy. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby nie wypłukać komórek z chemostatu poprzez zbyt gwałtowne zastosowanie stresora oraz aby pamiętać o codziennym sprawdzaniu gęstości optycznej.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić analizy, takie jak analiza genomu i analiza transkryptomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: jaka mutacja przyczynia się do ewolucji tolerancji na stres?

procedure-for-adaptive-laboratory-evolution-microorganisms-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Jian, X. i in., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Ten film demonstruje zastosowanie systemu hodowli mikrobiologicznych mikrokropel do kierowania adaptacyjną ewolucją bakterii w kierunku tolerancji metanolu. Mieszając zmodyfikowane kultury bakteryjne z podłożem stresowym o wysokiej zawartości metanolu i dzieląc je na mikrokropelki, system wybiera mutanty, które wykazują lepszy wzrost pod...

Adaptacyjna ewolucja bakterii przy użyciu mikrobiologicznego systemu hodowli mikrokropelek

Źródło: Jeong, H., i inni. Procedura adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów z użyciem chemostatu. J. Vis. Exp. (2016).Ten film pokazuje selektywną izolację i rozwój bakterii przystosowanych do stresu z hodowli narażonej na długotrwały stres. Kultura jest nakładana na agarze zawierającym stresor, a pojedyncza kolonia jest wybierana do inokulacji ciekłego medium stresorem. Absorpcja jest mierzona w regularnych odstępach czasu, aby monitorować wzrost i potwierdzić skuteczną izolację...

Izolacja bakterii adaptowanych do stresu poprzez selekcję pojedynczej kolonii

Tempo wzrostu komórek jest procesem regulowanym i głównym wyznacznikiem fizjologii komórki. Ciągła hodowla przy użyciu chemostatów umożliwia zewnętrzną kontrolę tempa wzrostu komórek poprzez ograniczenie składników odżywczych, co ułatwia badanie sieci molekularnych, które kontrolują wzrost komórek i jak te sieci ewoluują w celu optymalizacji wzrostu komórek.

Zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych

Opracowaliśmy i sprawdziliśmy zestaw miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części za niskie koszty. Wyniki ewolucji fizjologicznej i eksperymentalnej były podobne do chemostatów o większej objętości. Macierz ministat zapewnia kompaktową, niedrogą i dostępną platformę do tradycyjnych eksperymentów z chemostatem, genomiki funkcjonalnej i badań przesiewowych substancji chemicznych.

Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.

Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)

Ten protokół opisuje, jak utrzymać Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) poprzez wykonywanie codziennych transferów i okresowych zamrażania oraz jak przeprowadzać testy konkurencji w celu zmierzenia poprawy kondycji u wyewoluowanych bakterii. Procedury te mogą służyć jako szablon dla naukowców rozpoczynających własne eksperymenty z ewolucją drobnoustrojów.

Codzienne transfery, archiwizacja populacji i pomiar sprawności w długoterminowym eksperymencie ewolucji z Escherichia coli

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Poznaj metodę ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów przy użyciu chemostatu. Technika ta umożliwia ciągłą selekcję potomstwa E. coli pod kontrolowanymi warunkami stresu, wspierając badania nad odpowiedzią na stres i inżynierią metaboliczną.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Przeglądaj więcej filmów