Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Ogólnym celem tej eksperymentalnej strategii jest zbadanie funkcjonalności wariantów niekodujących związanych z chorobą. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w genomice, takie jak to, w jaki sposób warianty genetyczne, które w rzeczywistości nie zmieniają sekwencji aminokwasów, nadal przyczyniają się do fenotypu choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona usprawniony proces oceny wariancji genetycznej dla aktywności funkcjonalnej i daje wgląd w białka regulatorowe i szlaki, na które ma wpływ.

Technika ta może przynieść korzyści w badaniu każdej choroby z potencjalnym wariantem przyczynowym. Ponieważ procedura analizy tych wariantów jest uniwersalna niezależnie od badanego fenotypu. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat chorób ludzkich, może być również stosowana do mutacji w dowolnym organizmie.

W tym eksperymencie lizaty jądrowe zostaną przygotowane z komórek limfoblastoidalnych B, jednak procedura ta może być zastosowana do większości linii komórkowych. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru odkręć żądaną liczbę komórek do lizy. Odessać pożywkę, dodać 10 mililitrów lodowatego PBS i ponownie odwirować komórki.

Umyj komórki po raz drugi PBS i wyjmij PBS po odwirowaniu. Ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w lodowatym PBS, używając jednego mililitra PBS na 10 do siódmych komórek. Podamulować jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,5 mililitra probówek mikrowirówek, tak aby każda probówka zawierała od 10 do siódmych komórek w PBS.

Wirować przez dwie minuty i odessać z PBS. Dodać do zapasu roboczego buforu CE, jeden milimolowy ditiotreitol lub DTT, inhibitor fosfatazy 1X i 0,5 milimolowy fluorek fenylometanosulfonylu lub PMSF. Zawiesić każdą paletę komórkową z 400 mikrolitrami tego buforu i inkubować na lodzie przez 15 minut.

Dodaj 25 mikrolitrów 10% Nonidet P-40 do każdej probówki do mikrowirówki i wymieszaj przez pipetowanie. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza i maksymalnej prędkości przez trzy minuty. Zdekantować i odrzucić supernatant.

Następnie dodaj do zapasu roboczego buforu NE, jeden milimolowy DTT, 1X inhibitor fosfoazy i jeden milimolowy PMSF. Ponownie zawiesić każde podniebienie komórkowe za pomocą 30 mikrolitrów tego buforu i wymieszać przez wirowanie. Inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza w rotatorze rurowym przez 10 minut.

Wirować przez dwie minuty. Zebrać klarowny supernatant, którym jest lizat jądrowy. Podwielokrotnić lizat jądrowy przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą powodować degradację białka.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 50-nanomolowego zapasu roboczego oligonukleotydu, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Umieść oligonukleotydy w bloku grzewczym w temperaturze 90 stopni Celsjusza na pięć minut. Po pięciu minutach wyłącz blok grzewczy i pozwól oligonukleukleocie powoli ostygnąć do temperatury pokojowej przez co najmniej godzinę przed użyciem.

Następnie przygotuj test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej lub żel EMSA. Wyjmij szkiełko z prefabrykowanego, sześcioprocentowego żelu tris-boranowego EDTA lub żelu TBE i kilkakrotnie spłucz pod wodą dejonizowaną, aby usunąć bufor ze studzienek. Zmontuj aparat do elektroforezy żelowej i sprawdź, czy nie ma wycieków, wypełniając komorę wewnętrzną buforem 0,5X TBE.

Jeśli żaden bufor nie przecieka do komory zewnętrznej, napełnij komorę zewnętrzną mniej więcej do dwóch trzecich długości. Uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez 60 minut. Po zakończeniu uruchamiania wstępnego przepłucz każdą studzienkę 200 mikrolitrami buforu 0,5X TBE.

Przygotować główną mieszankę buforu wiążącego. W probówce do mikrowirówki wymieszaj te odczynniki, które są wspólne dla wszystkich reakcji. 10-krotny bufor wiążący, polisorbat DTT, poli(dI-dC) i DNA plemników łososia.

Aby ustawić reakcje EMSA, dodaj wodę wolną od nukleaz do każdej probówki mikrowirówki, tak aby końcowa objętość, po dodaniu wszystkich odczynników, wynosiła 20 mikrolitrów. Dodać odpowiednią ilość mieszanki wzorcowej do każdej probówki do mikrowirówki. Dodać osiem mikrogramów lizatu jądrowego do odpowiednich probówek do mikrowirówek.

Włączyć probówki zawierające oligonukleotydę, bez ekstraktu jądrowego, jako kontrole ujemne. Dodaj 50 femtomoli oligo do odpowiednich probówek do mikrowirówek i przesuń do mieszania. Krótko obróć zawartość na dno tuby.

Inkubować wszystkie probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dwa mikrolitry 10-krotnego pomarańczowego barwnika ładującego do każdej probówki mikrowirówki. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.

Załaduj próbki do sześcioprocentowego żelu TBE przed uruchomieniem, pipetując w górę i w dół w celu wymieszania, a następnie wyrzucając każdą próbkę do oddzielnego dołka. Uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez około 60 do 75 minut, aż pomarańczowy barwnik przeniesie się przez dwie trzecie do trzech czwartych drogi w dół żelu. Po zakończeniu biegu użyj noża do żelu, aby podważyć plastikową kasetę.

Wyjmij żel z kasety i umieść go w pojemniku z 0,5-procentowym buforem TBE, aby nie wyschł. Umieść żel na powierzchni systemu obrazowania w podczerwieni i chemiluminescencji. Wyeliminuj wszelkie bąbelki lub zanieczyszczenia, które mogą zakłócić obraz.

Zeskanuj żel za pomocą oprogramowania systemu skanowania, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pięciomikromolowy oligotyp roboczy zgodnie z opisem w tekście protokołu. Umieść oligonukleotydy w bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza na pięć minut.

Po pięciu minutach wyłącz blok grzewczy i pozwól oligonukleotydom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej przed użyciem. Podgrzej następujące do temperatury pokojowej: bufor wiążący, bufor płuczący o niskiej rygorystyczności, bufor płuczący o wysokiej rygorystyczności i bufor elucyjny. Przygotuj mieszanki wiążące dla każdego wariantu.

Zmieszać jedną objętość lizatu jądrowego z dwiema objętościami buforu wiążącego. Dodaj 1X inhibitor fosfatazy, 0,5 milimolowy PMSF i 1X wzmacniacz wiązania. Dodaj 10 mikrolitrów pięciu mikromolowych biotynylowanych wychwytów DNA do każdej mieszaniny wiążącej.

Wymieszaj, kilkakrotnie przesuwając tubkę. Inkubować mieszaniny wiążące przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów mikrokulek streptawidyny do każdej mieszaniny wiążącej.

Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dla każdej badanej sondy oligonukleocytowej umieścić kolumnę wiążącą w separatorze magnetycznym. Upewnij się, że kolumny są oznaczone wariantem oligo, który został użyty w mieszaninie wiążącej.

Umieść probówkę do mikrowirówki bezpośrednio pod każdą kolumną wiążącą i nałóż 100 mikrolitrów buforu wiążącego do przepłukania kolumny. Odpipetować zawartość każdej mieszaniny wiążącej do oddzielnych kolumn. Pozwól, aby ciecz całkowicie przepłynęła przez kolumnę do probówki mikrowirówkowej.

Nałóż 100 mikrolitrów buforu płuczącego o niskiej rygorystyczności na kolumnę i poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie pusty. Ponownie nałożyć 100 mikrolitrów buforu płuczącego o niskiej rygorystyczności na kolumnę. Nałóż 100 mikrolitrów buforu płuczącego o wysokiej rygorystyczności na kolumnę i poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie pusty.

Ponownie nałóż 100 mikrolitrów buforu płuczącego o wysokiej rygorystyczności do kolumny. Dodać 30 mikrolitrów natywnego buforu elucyjnego do kolumny i odstawić na pięć minut. Na koniec dodaj dodatkowe 50 mikrolitrów natywnego buforu elucyjnego, aby wymyć związane czynniki transkrypcyjne.

W celu zbadania odtwarzalności wyników EMSA oraz konsekwencji cykli zamrażania i rozmrażania, oligonukleotyde zawierające allel referencyjny lub niereferencyjny wariantu genetycznego wykorzystano do zbadania tego samego preparatu ekstraktu jądrowego limfocytów B po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania. Niebieska strzałka wskazuje wolną sondę. Wiązanie czynników transkrypcyjnych z oligonugolaką, jest widoczne jako prążek w górnej połowie żelu, oznaczony czerwoną strzałką.

Wyniki te wskazują, że zamrażanie i rozmrażanie tego konkretnego ekstraktu jądrowego do pięciu razy nie ma, jak się wydaje, żadnego wpływu na integralność białek. Ważne jest również zoptymalizowanie stosunku sygnału do szumu dla EMSA. Różne stężenia oligonukleotydów wykorzystano do zbadania pojedynczego preparatu lizatu jądrowego.

Zaobserwowano wzrost intensywności pasma, do 100 femtomoli oligo. Reprezentatywne wyniki badania allelu ryzyka związanego z toczniem przedstawiono tutaj. Czynnik transkrypcyjny, STAT 1, został najpierw zidentyfikowany za pomocą DAPA, a następnie analizy proteomicznej.

Western blot DAPA potwierdził następnie tożsamość STAT 1 i wyższe wiązanie fosforylowanej formy STAT 1 z oligonugoligugojadykiem ryzyka tocznia. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak spektrometria mas i western blot. Pomoże nam to zidentyfikować białko regulatorowe wykazujące wiązanie zależne od alleli.

Testy reporterowe, takie jak lucyferazy, mogą być również wykorzystywane do badania zmian w ekspresji genów w funkcji allelu.