Name: Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę oceny kurczliwości kardiomiocytów 2D pochodzących z ludzkich komórek iPSC przy użyciu mikroskopii wideo. To narzędzie wspiera rozwój bezpiecznych urządzeń kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez nominację do Programu Uczestnictwa w Badaniach w Centrum Urządzeń i Zdrowia Radiologicznego zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education poprzez międzyagencyjną umowę między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Amerykańską Agencją ds. Żywności i Leków. Autorzy dziękują Richardowi Grayowi, Trentowi Robertsonowi i Annie Avila za ich sugestie i pomoc techniczną. Badanie zostało sfinansowane przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków, Biuro Laboratoriów Naukowych i Inżynieryjnych.

1. Przygotowanie płyt i mediów
UWAGA: Typowa porcja hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) to ~200 μL w sterylnej probówce 1,5 ml przechowywanej w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkanek przygotuj sterylną 6-dołkową płytkę, przenosząc 2 ml 0,1% żelatyny (tabela materiałów) do każdego dołka. Umieścić pokrywkę na płytce 6-dołkowej i pozostawić pokrytą płytkę do inkubacji w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Na jeden dzień przed wysiewem hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym, należy rozmrozić podwielokrotność hydrożelu (tabela materiałów) w lodówce na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę kardiomiocytową (tabela materiałów), mieszając 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x suplementu B-27 i 5 ml penicyliny-streptomycyny9.</li>
</ol>
2. Wysiewanie kriokonserwowanych hiPSC-CM
<ol>
	<li>Dwa dni przed wysiewem hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym, należy wstępnie pokryć hiPSC-CM na sterylnych 6-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o zawartości 0,1%. Rozmrażanie hiPSC-CM przy użyciu standardowego protokołu rozmrażania9,25.</li>
	<li>Następnie należy umieścić łącznie 1 500 000 hiPSC-CM (Tabela materiałów) na studzience zgodnie z instrukcjami producenta (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A) 26.</li>
	<li>Hodować hiPSC-CM w standardowej pożywce kardiomiocytowej przez 2-4 dni, aby umożliwić hiPSC-CM regenerację po kriokonserwacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zużytą pożywkę należy odświeżać pożywką 100% kardiomiocytów co 48 godzin.</li>
</ol>
3. Dysocjacja i zliczanie wstępnie platerowanych hiPSC-CM
<ol>
	<li>Sprawdź stan hiPSC-CM przed dysocjacją. Oceń stan hiPSC-CM, zapewniając żywotność i stabilne bicie. 
	UWAGA: Czystość populacji hiPSC-CM jest ważna (np. >90% sercowej troponiny T)7. Metoda selekcji kardiomiocytów (np. selekcja metaboliczna lub sortowanie) jest zalecana w celu zmniejszenia rozerwania substratu hydrożelowego przez komórki niekardiomiocytów25,26.</li>
	<li>Przemyć hiPSC-CMs 2x 4 ml na studzienkę D-PBS bez CaCl2 lub MgCl2 (tabela materiałów). Odessać D-PBS, dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego w temperaturze pokojowej do każdego dołka, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki kardiomiocytowej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odłącz hiPSC-CM od płytki 6-dołkowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B). Dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml26.</li>
	<li>Przepłukać studzienkę 1 ml świeżej pożywki kardiomiocytowej, aby zebrać wszelkie pozostałości hiPSC-CM i dodać je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić końcową objętość stożkowej rurki do 15 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut (200 × g). Usunąć supernatant do oznaczenia 1 ml. Zawiesić komórki w pożywce kardiomiocytowej do końcowej objętości 5 ml.</li>
	<li>Policz hiPSC-CM za pomocą ręcznego lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Zawiesinę hiPSC-CM należy inkubować w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania elastycznych substratów hydrożelowych (maksymalnie 30 minut).</li>
</ol>
4. Przygotowanie elastycznych substratów hydrożelowych
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw pipet o pojemności 20 μl i objętości 1 μl, końcówki do pipet o pojemności 20 μl (np. 20 μl) i sterylną 48-dołkową szklaną płytkę dolną. Upewnij się, że stoper/minutnik jest gotowy przed przygotowaniem substratów hydrożelowych.</li>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkankowych wymieszaj podłoże hydrożelowe na bazie ECM, delikatnie stukając w probówkę, a następnie natychmiast umieść go z powrotem na lodzie.</li>
	<li>Następnie uruchom stoper/minutnik bezpośrednio przed nałożeniem pierwszego podłoża hydrożelowego - jest to czas zerowy.</li>
	<li>Odpipetować 1 μl podłoża hydrożelowego w górę iw dół ~3x, aby schłodzić końcówkę pipety. Nałóż ~ 1 μl nierozcieńczonego substratu hydrożelowego poziomo na dno każdej studzienki płytki 48-dołkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A), trzymając pipetę pod kątem 45°. Ułóż wszystkie podłoża hydrożelowe w tej samej orientacji w każdym dołku (Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3), aby pomóc zidentyfikować podłoże podczas wykonywania eksperymentów przy 40-krotnym powiększeniu7,9,17,27. 
	UWAGA: Każda linia ~1 μL to jeden substrat hydrożelowy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3). Zazwyczaj przygotowanie 48 dołków zajmuje ~5 minut. Zastosowanie nachylonego w poziomie stojaka na mikropłytki (np. 30°) może umożliwić lepszy widok dna studni i podłoża hydrożelowego. Pamiętaj, aby przejść przez całą długość studni (tj. od lewej do prawej). Krótkie podłoża hydrożelowe mogą być zbyt grube, co zmniejsza stabilność podłoża. Nie dopuścić do wyschnięcia podłoża hydrożelowego w końcówce pipety. W takim przypadku szybko przełącz się na nową końcówkę i natychmiast kontynuuj. Alternatywnie można użyć schłodzonych końcówek do pipet. Podłoże hydrożelowe na bazie ECM może szybko polimeryzować, gdy nie znajduje się na lodzie. Sugeruje się przygotowanie kilku studzienek jednocześnie (np. 10). Dodatkowo zaleca się ćwiczenie na próbie 48-dołkowej płytki.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na 48-dołkowej płytce i pozwól substratom hydrożelowym inkubować przez 8-10 minut w temperaturze pokojowej w sterylnym kapturze do hodowli tkanek przed dodaniem komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). 
	UWAGA: Ważne jest, aby przestrzegać sugerowanych czasów inkubacji. Czas inkubacji dłuższy niż 10 minut doprowadzi do powstania sztywnych substratów hydrożelowych i braku widocznych skurczów. Czas inkubacji krótszy niż 8 minut może prowadzić do zapadania się substratów.</li>
	<li>Natychmiast wysiew hiPSC-CM kroplami bezpośrednio na podłoża hydrożelowe, z ~ 30 000 żywotnych hiPSC-CM na studzienkę w małej objętości pożywki ~ 200 μl pożywki kardiomiocytowej, używając pipety 1 000 μl (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3B). 
	UWAGA: Proces ten zatrzymuje polimeryzację substratu hydrożelowego i zapewnia, że hiPSC-CM znajdują się na podłożu7,9,17,27.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na płytce i pozwól hiPSC-CM inkubować bez zakłóceń przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C) w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, aby umożliwić hiPSC-CM przyleganie do podłoża hydrożelowego.</li>
	<li>Delikatnie dodaj ~100 μL świeżej pożywki kardiomiocytowej do każdej studzienki (końcowa objętość: ~300 μL na dołek). Umieść pokrywkę na szalce i przenieś do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2-4 dni. Odświeżaj 100% podłoże co 24 godziny przed wykonaniem eksperymentów skurczowych. 
	UWAGA: Sprawdź wzrokowo hiPSC-CM pod kątem prawidłowej morfologii; Natychmiast po poszyciu hiPSC-CM powinny pojawić się okrągłe (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Do 2 dnia po wysiewie zaobserwuje się zlewający się monowarstwowy syncytium 2D hiPSC-CM (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C) (Dodatkowe wideo S1) z silnym widocznym skurczem (Uzupełniający film S2).</li>
</ol>
5. Rejestracja i analiza skurczów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do oznaczania CCM, która jest roztworem Tyrode'a zawierającym następujące substancje (w mmol/l): CaCl2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glukoza 10 i HEPES 10, o pH dostosowanym do 7,4 z NaOH i zrównoważyć do 37 °C w łaźni wodnej><.
	UWAGA: Submaksymalny wapń zewnątrzkomórkowy (0,5 mM) służy do poprawy okna testu CCM.</li>
	<li>Włącz mikroskop i komorę kontroli środowiska, aby zrównoważyć temperaturę do 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć pożywkę kardiomiocytów z płytki 48-dołkowej i delikatnie przepłukać każdą pożywkę dwukrotnie 600 μl pożywki do oznaczania CCM.</li>
	<li>Dodać 300 μl pożywki testowej CCM do dołka i umieścić 48-dołkową płytkę na mikroskopie w komorze kontroli środowiska. Włóż elektrody i równoważ ogniwa przez 5 minut.</li>
	<li>Użyj mikroskopii wideo, aby nagrać filmy skurczowe. Otwórz oprogramowanie do nagrywania wideo i ustaw liczbę klatek na sekundę 100 klatek/s. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) w pobliżu środka monowarstwy hiPSC-CM. 
	UWAGA: Nie wybieraj ROI w pobliżu krawędzi monowarstw hiPSC-CM, ponieważ może to być niestabilne w przypadku nagrań kurczliwych.</li>
	<li>Następnie pole stymuluje komórki za pomocą komercyjnego generatora impulsów (Tabela materiałów), aby elektrycznie nadawać tempo monowarstwom 2D hiPSC-CM. Tempo hiPSC-CM przy 1,5-krotnym progu przy 1 Hz z podstawowymi parametrami impulsu (np. monofazowe impulsy stymulacyjne fali prostokątnej z czasem trwania impulsu bodźca 2 ms wynoszącym ~14 V/cm)17.</li>
	<li>Nagraj linię bazową, tylko tempo (tj. przed CCM) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) wideo skurczu przez co najmniej pięć uderzeń17,28.</li>
	<li>Następnie stymuluj monowarstwę hiPSC-CM eksperymentalnym sygnałem elektrycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć standardowych parametrów stymulacji CCM: dwa symetryczne impulsy dwufazowe o czasie trwania fazy 5,14 ms (całkowity czas trwania 20,56 ms), ~28 V/cm (amplituda fazy), zerowy interwał międzyfazowy i opóźnienie 30 ms (tj. czas od końca impulsu stymulującego do początku impulsu CCM) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D)29,30, i nagraj wideo z wywołanym CCM skurczem przez minimum pięć uderzeń.</li>
	<li>Wyłącz sygnał CCM, stymuluj impulsem stymulującym linię bazową i nagraj film skurczowy z okresu rekonwalescencji (tj. po CCM) przez co najmniej pięć uderzeń.</li>
	<li>Użyj standardowego oprogramowania do skurczu, aby automatycznie przeanalizować filmy skurczu i określić ilościowo kluczowe właściwości skurczu (np. amplituda skurczu, nachylenie skurczu, nachylenie relaksacji, czas do szczytu, czas do linii bazowej 90% i czas trwania skurczu 50%)7,17,31,32.</li>
	<li>Użyj 2D hiPSC-CMs na elastycznym podłożu hydrożelowym do eksperymentów kurczliwości od 2 do 14 dni po posiewie na podłożu.</li>
</ol>

Niniejszy artykuł odzwierciedla poglądy autorów i nie powinien być interpretowany jako reprezentujący poglądy lub politykę Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków. Wzmianka o produktach komercyjnych, ich źródłach lub wykorzystaniu w związku z materiałami zgłoszonymi w niniejszym dokumencie nie może być interpretowana jako faktyczne lub dorozumiane poparcie takich produktów przez Departament Zdrowia i Opieki Społecznej. Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów w odniesieniu do tej pracy.

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół opisuje metodę generowania solidnie kurczących się monowarstw 2D hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z dostępnymi w handlu odczynnikami 7,17. HiPSC-CM wysiane na elastycznym podłożu hydrożelowym zachowują żywotność i mają ulepszone właściwości kurczliwe7. Technika ta opiera się na standardowym sprzęcie i możliwościach laboratoryjnych7. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, w tym związanych z pracą z substratem hydrożelowym na bazie ECM, które wymagają szczególnej dbałości o szczegóły. Jednym z potencjalnych problemów jest obecność surowicy w pożywce. Może to spowodować, że hiPSC-CM utworzą sieci (np. sieci śródbłonka/naczyniowe) zamiast zlewającego się arkusza monowarstwowego; w związku z tym zaleca się stosowanie pożywki bez surowicy podczas tworzenia elastycznych monowarstw hydrożelowych hiPSC-CM (tj. od dnia 0 do dnia 4). Podobnie, przygotowanie zbyt wielu substratów hydrożelowych za jednym razem może skutkować słabymi lub nierównymi podłożami z powodu zmęczenia operatora. Chociaż ważne jest, aby pracować szybko, integralność każdego podłoża hydrożelowego ma kluczowe znaczenie. Podobnie, należy ostrożnie wysiewać hiPSC-CM i zmieniać pożywkę; Nie należy tego robić na siłę. Podczas zmiany podłoża należy je dodawać delikatnie od górnej krawędzi studzienki, aby nie naruszyć podłoża hydrożelowego ani komórek. Podobnie jak w przypadku standardowych kultur 2D hiPSC-CM (tj. konwencjonalnych kultur tkankowych z tworzywa sztucznego lub szkła), powlekanie o niskiej gęstości spowoduje niepełne tworzenie monowarstwy. Ważne jest, aby dokonać oględzin hiPSC-CM, aby upewnić się, że znajdują się na podłożu hydrożelowym i użyć timera, aby zapewnić dokładny czas. Co więcej, hodowla monowarstw 2D hiPSC-CM przez ponad 14 dni na podłożu hydrożelowym może spowodować rozerwanie monowarstwy, w oparciu o właściwości ECM i instrukcje producenta substratu.
Istnieje kilka ograniczeń obecnej metody, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, komórki użyte w tym protokole pochodziły od komercyjnego dostawcy hiPSC-CMs, a komórki te tworzą syncytium elektrycznie sprzężonych komórek. Syncytium zawiera mieszaninę hiPSC-CM ze wszystkich trzech podtypów serca (tj. komorowych, przedsionkowych i węzłowych)17. Korzyści z badań mogą dotyczyć populacji hiPSC-CM z wyjątkiem dla podtypu (tj. 100% komorowego lub 100% przedsionkowego). Po drugie, w tej metodzie wykorzystano tylko hiPSC-CM, podczas gdy nie-miocyty, w tym fibroblasty serca, komórki śródbłonka i neurony, mogą zwiększać funkcjonalność hiPSC-CM22,36. Po trzecie, 2D hiPSC-CM wykazują kilka cech stosunkowo niedojrzałych kardiomiocytów, w tym spontaniczne bicie, amorficzną morfologię i brak odpowiedzi inotropowej 8,37. Po czwarte, podczas gdy protokół ten wytwarza solidnie kurczące się monowarstwy 2D hiPSC-CM, jest prawdopodobne, że funkcjonalnie ulepszone modele 3D hiPSC-CM, takie jak zmodyfikowane tkanki serca (ECT), spowodują zwiększoną reakcję skurczową indukowaną przez CCM przy fizjologicznych stężeniach wapnia 8,38. Wreszcie, opisany tutaj protokół jest przeznaczony dla formatu 48-dołkowego. Jednak dzięki optymalizacji i włączeniu automatyzacji można to przeskalować do formatu o wysokiej przepustowości (np. płytki 96-dołkowe lub 384-dołkowe).
Obecnie złotym standardem w badaniach hiPSC-CM są konwencjonalne, sztywne warunki hodowli 2D (tj. kultura tkankowa z tworzywa sztucznego lub szkła). Chociaż konwencjonalna metodologia jest przydatna w badaniach elektrofizjologii3 i obchodzenia się z wapniem39, skutkuje ona minimalnymi właściwościami skurczowymi 5,6,7. W rezultacie, konwencjonalne sztywne warunki hodowli 2D nie są podatne na ocenę efektów kurczliwości CCM8. Funkcjonalnie ulepszone metody 3D hiPSC-CM ECT38 są technicznie trudne, czasochłonne i wymagają zaawansowanego sprzętu, który nie jest łatwo dostępny w każdym laboratorium. W tym protokole opisujemy prostą metodologię generowania solidnie kurczących się monowarstw 2D hiPSC-CM w krótszym czasie niż metody 3D ECT lub długoterminowe, konwencjonalne metody 2D 7,40,41. Co więcej, stosowane tutaj odczynniki są dostępne na rynku, w tym substrat hydrożelowy i hiPSC-CM, i oba mają znaczną konsystencję między partiami. Chociaż użyliśmy wymiennych elektrod z drutu platynowego (odległość między elektrodami: 2,0 mm, szerokość: 1,0 mm), różne materiały i konfiguracje elektrod są podatne na ocenę kurczliwości CCM in vitro 8,15,17,18,22. Podobnie, dostępnych jest wiele zautomatyzowanych programów, które umożliwiają analizę filmów skurczowych 7,31,32.
Większość nieklinicznych metod oceny kurczliwości kardiologicznych wyrobów medycznych opiera się w dużej mierze na kosztownych modelach zwierzęcych in vivo (np. psy lub świnie) i trudnych technicznie paskach mięśni brodawkowatych (np. króliki)18. W artykule opisano ludzki model in vitro do oceny wpływu sygnałów urządzeń medycznych do elektrofizjologii serca na kurczliwość. Narzędzie to może zmniejszyć zależność od badań na zwierzętach i być przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Wraz ze starzeniem się populacji Stanów Zjednoczonych, liczba pacjentów z niewydolnością serca stale rośnie, wraz z bezpośrednimi kosztami leczenia1,2. Istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich terapii leczenia niewydolności serca oraz innowacyjnych metodologii nieklinicznych w celu przetestowania takich terapii. Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs) zostały zaproponowane jako narzędzie in vitro wspomagające proces rozwoju terapii i były wykorzystywane w zgłoszeniach regulacyjnych3,4. Jednak ich powszechne zastosowanie w badaniach kurczliwości było ograniczone ze względu na brak solidnych właściwości kurczliwych podczas powlekania w standardowych sztywnych warunkach hodowli 2D (tj. konwencjonalnych kultur tkankowych z tworzywa sztucznego lub szkła)5,6,7,8. Wcześniej zademonstrowaliśmy użyteczność powlekania izolowanych pojedynczych hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym w celu uzyskania solidnych widocznych właściwości kurczliwości9. Wykazaliśmy, że izolowane hiPSC-CM mają porównywalne właściwości kurczliwe do świeżo izolowanych dorosłych kardiomiocytów komorowych królika. Ponadto wykazaliśmy przydatność tej metody do oceny reakcji skurczowych na czynniki farmakologiczne7. Co więcej, w innych badaniach zastosowano tę technologię do ocen mechanistycznych w naukach podstawowych i modelowaniu chorób10,11,12. W tym przypadku metodologia ta została rozszerzona na monowarstwy 2D hiPSC-CM i wykazano jej przydatność w ocenie fizjologicznie istotnych sygnałów elektrycznych urządzeń medycznych z modulacją kurczliwości serca (CCM) in vitro.
CCM to wewnątrzsercowa terapia niewydolności serca, w której niepobudzające sygnały elektrofizjologiczne są dostarczane do mięśnia sercowego podczas bezwzględnego okresu refrakcji cyklu sercowego13,14. Brakuje powtarzalnych metod oceny CCM w modelach ludzkich komórek serca. W poprzednich pracach wykorzystano różne modele komórek serca do oceny odpowiedzi skurczowej CCM. Wykazaliśmy in vitro, że świeżo wyizolowane kardiomiocyty komorowe królika reagują na stymulację CCM przejściowym wzrostem wapnia i amplitudy skurczu15. Inne badanie na izolowanych kardiomiocytach komorowych psów wykazało indukowane przez CCM zwiększenie wewnątrzkomórkowej amplitudy przejściowej wapnia wapnia16. Jednak w większości badań CCM stosowano preparaty pochodzenia zwierzęcego ex vivo i in vivo. Badania te są trudne do skorelowania ze sobą, ponieważ stosują różne parametry impulsu CCM i species17. Jedno badanie na izolowanym modelu brodawkowatym królika wykazało zwiększoną kurczliwość wywołaną przez CCM8,18, a szereg badań całego serca wykazał indukowane przez CCM poprawę funkcji skurczu19,20,21. Badania te dostarczyły ważnych informacji mechanistycznych. Brakuje jednak odtwarzalnych modeli ludzkich do badań in vitro skurczliwości EP serca, w tym CCM. W tym celu opracowaliśmy kilka modeli 2D i 3D hiPSC i wykazaliśmy indukowaną przez CCM poprawę właściwości skurczowych w sposób zależny od parametrów. Co więcej, stwierdzono, że efekty inotropowe wywołane przez CCM są częściowo pośredniczone przez wejście neuronalne i sygnalizację β-adrenergiczną8,17,22. Mimo to trzeba wiedzieć więcej o mechanizmach terapii CCM, a wykorzystanie kurczących się ludzkich kardiomiocytów może pomóc w osiągnięciu tego wyniku. W związku z tym istnieje znacząca potrzeba opracowania nieklinicznych narzędzi stosowanych u ludzi w celu oceny nowych urządzeń i sygnałów CCM, przyspieszenia procesu regulacyjnego, zmniejszenia obciążenia modeli zwierzęcych i pomocy w podejmowaniu decyzji dotyczących twórców urządzeń8,17,23,24. Ważne jest, aby opracować łatwe protokoły typu "zrób to sam", które można przenieść do dowolnego laboratorium i które wykorzystują standardowy sprzęt i niskie wymagania dotyczące ogniw w celu obniżenia kosztów. Metoda ta wyjaśnia wpływ stymulacji CCM na funkcję ludzkich kardiomiocytów i dostarcza ważnych informacji na temat bezpieczeństwa i skuteczności CCM17. W tym miejscu opisujemy metodę generowania monowarstw 2D hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym w celu wytworzenia znormalizowanego nieklinicznego narzędzia do ilościowego określania odpowiedzi skurczowych urządzenia medycznego do elektrofizjologii serca (tj. CCM) w zdrowiu i chorobie.

<table><tbody><tr><td>0,1% żelatyna</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Wstępne posiewanie podłoża hodowlanego</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka</td><td>MatTek&nbsp;</td><td>P48G-1.5-6-F</td><td>Podłoże hydrożelowe hiPSC-CM Culture, szklana</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Thermofisher</td><td>140675</td><td>hiPSC-CM Culture,</td></tr><tr><td>plastikowy suplement B-27, z insuliną</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Kardiomiocyty Podłoże</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>c70-500</td><td>Tyrode' s rozwiązanie</td></tr><tr><td>Platforma i oprogramowanie CellOPTIQ&nbsp;</td><td>Clyde Biosciences</td><td></td><td>Rejestracja i analiza skurczu Rurka</td></tr><tr><td>stożkowa 15 ml</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352099</td><td>hiPSC-CM Dysocjacja</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U30</td><td>Nagrywanie wideo skurczu</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Komora kontroli środowiska do mycia komórek</td></tr><tr><td></td><td>OKOLAB INC</td><td>H201-K-FRAME</td><td>Regulacja środowiskowa</td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1kg</td><td>Tyrode' s rozwiązanie</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-107</td><td>hiPSC-CM Liczenie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' s solution</td></tr><tr><td>iCell Kardiomiocyty Pożywka galwaniczna</td><td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&nbsp;</td><td>M1001</td><td>hiPSC-CM Pożywka galwaniczna</td></tr><tr><td>iCell Kardiomiocyty2, 01434</td><td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&nbsp;</td><td>Inkubator R1017</td><td>hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>(37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>Thermofisher</td><td>50116047</td> Utrzymuj mikroskop odwrócony <td>hiPSC-CMs</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Obrazowanie hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>m33-500</td><td>Tyrode' s rozwiązanie</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning&nbsp;</td><td>356230</td> Elastyczne probówki do mikrowirówek <td>z podłożem hydrożelowym</td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Podłoże hydrożelowe Wielokrotność</td></tr> podwielokrotności <tr><td>Model 4100 Izolowany stymulator dużej mocy</td><td>AM-Systems</td><td>Model 4100&nbsp;</td><td>Generator impulsów</td></tr><tr><td>Kardiomiocyty MyCell DCM LMNA L35P, 01016</td><td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&nbsp;</td><td>R1153</td><td>DCM hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Pipeta do kardiomiocytów</td></tr><tr><td>L-20</td><td>Pipeta</td><td>hydrożelowa do podłoża</td>Rainin <td>17014392</td></tr><tr><td>P1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1000 ul</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-509</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 20 ul</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10S</td><td>Wytwarzanie podłoża hydrożelowego</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td>Tyrode' s roztwór</td></tr><tr><td>RPMI 1640, z glukozą&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>Kardiomiocyty Media</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>s641-212</td><td>Tyrode' s roztwór</td></tr><tr><td>wodorotlenku sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Tyrode" s rozwiązanie</td></tr><tr><td>Elektrody</td><td></td><td></td> stymulacyjne <td>Stymulacja i stymulacja CCM</td></tr><tr><td>Stoper/Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-261-840</td><td>Podłoże hydrożelowe do powlekania</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>hiPSC-CM Liczenie</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>hiPSC-CM Dysocjacja</td></tr></tbody></table>

ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2d pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są obecnie badane pod kątem wielu zastosowań in vitro i były wykorzystywane w zgłoszeniach regulacyjnych. W tym miejscu rozszerzamy ich zastosowanie na bezpieczeństwo kardiologicznych wyrobów medycznych lub oceny działania. Opracowaliśmy nowatorską metodę oceny właściwości kurczliwości kardiologicznych wyrobów medycznych w solidnie kurczących się monowarstwach 2D hiPSC-CM platerowanych na elastycznym podłożu hydrożelowym na bazie elastycznej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Narzędzie to umożliwia ilościowe określenie wpływu sygnałów urządzenia do elektrofizjologii serca na czynność serca człowieka (np. właściwości skurczowe) za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego. Monowarstwy 2D hiPSC-CM hodowano przez 2-4 dni na elastycznym podłożu hydrożelowym w formacie 48-dołkowym.
 hiPSC-CMs byli wystawieni na standardowe sygnały elektryczne urządzeń medycznych z modulacją kurczliwości serca (CCM) i porównani z kontrolnymi (tj. tylko stymulacją) hiPSC-CM. Podstawowe właściwości kurczliwe hiPSC-CM 2D określono ilościowo za pomocą analizy detekcji wideo opartej na przemieszczeniu pikseli. Stymulowane CCM 2D hiPSC-CM osadzone na elastycznym podłożu hydrożelowym wykazywały znacznie ulepszone właściwości kurczliwe w stosunku do linii podstawowej (tj. przed stymulacją CCM), w tym zwiększoną szczytową amplitudę skurczu oraz przyspieszoną kinetykę skurczu i relaksacji. Co więcej, wykorzystanie elastycznego substratu hydrożelowego umożliwia zwielokrotnienie odczytów sprzężenia skurczu serca i pobudzenia serca na podstawie wideo (tj. elektrofizjologii, obchodzenia się z wapniem i skurczu) u zdrowych i chorych hiPSC-CM. Dokładne wykrywanie i ilościowe określanie wpływu sygnałów elektrofizjologicznych serca na skurcz serca u ludzi ma kluczowe znaczenie dla opracowywania, optymalizacji i zmniejszania ryzyka wyrobów medycznych do pracy serca. Metoda ta umożliwia solidną wizualizację i ilościowe określenie właściwości skurczowych syncytium serca, co powinno być cenne dla nieklinicznych testów bezpieczeństwa lub skuteczności kardiologicznych wyrobów medycznych. W artykule szczegółowo opisano metodykę generowania monowarstw substratów hydrożelowych 2D hiPSC-CM.

W niniejszym protokole opisano proste i niezawodne narzędzie do generowania widocznie kurczących się dwuwymiarowych (2D) monowarstw kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CM) na elastycznym podłożu hydrożelowym. Pomiar właściwości kurczliwych przeprowadzany jest za pomocą zapisu wideo z wykorzystaniem oprogramowania do analizy kurczliwości. Umożliwia to ilościowe określenie kluczowych parametrów kurczliwości kardiomiocytów, w tym amplitudy skurczu, nachylenia krzywej skurczu, nachylenia krzywej rozkurczu, czasu do szczytu, czasu do 90% poziomu bazowego oraz 50% czasu trwania skurczu. Model ten jest wykorzystywany do charakterystyki bazowych właściwości kurczliwych hiPSC-CM (Rysunek 4) od różnych „zdrowych” dawców i może zostać rozszerzone na ocenę sygnałów z urządzeń medycznych do elektrofizjologii serca (np. CCM). Zastosowanie standardowych parametrów stymulacji CCM (Rycina 1D)29,30 zaowocowało poprawą właściwości kurczliwych in vitro (Rysunek 5 i Tabela 1)17.
Wykazaliśmy ponadto, że metoda ta może być wykorzystana do oceny wpływu modulacji stężeń wapnia pozakomórkowego na właściwości skurczowe ludzkich komórek z i bez stymulacji CCM (Rycina 6)17. Zaobserwowano spodziewaną zależność skurczu od poziomu wapnia w stanie spoczynku7,17, a także indukowany przez CCM wzrost wrażliwości na wapń na poziomie monowarstwy kardiomiocytów. Dodatkowo, farmakologiczna analiza szlaku sygnalizacyjnego β-adrenergicznego (Rycina 7) wykazała, że inotropowe efekty wywołane przez CCM były częściowo zapśredniczone przez sygnalizację β-adrenergiczną17. Co więcej, narzędzie to można rozszerzyć na kardiomiocyty pacjentów z konkretnymi jednostkami chorobowymi, w tym z kardiomiopatią rozszerzaczną (DCM)33,34,35 (Rycina 8), aby zrozumieć wpływ CCM w kontekście stanów chorobowych; rzeczywiście, przy przetestowanej tutaj „dawce” CCM zaobserwowano zwiększoną amplitudę skurczu oraz przyspieszoną kinetykę skurczu i rozkurczu (Rycina 8). Choć w naszym laboratorium dysponujemy urządzeniem imitującym CCM, zastosowana tutaj metodologia nie jest specyficzna dla tego systemu i mogłaby zostać zastosowana w innych urządzeniach do elektrofizjologii serca.
<img alt="układ hiPSC-CM do badania funkcji serca za pomocą mikroskopii; obejmuje wysiewanie, matrycę hydrożelową i stymulację CCM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny podsumowanie 2D modelu in vitro CCM dla hiPSC-CM. (A) hiPSC-CM są wstępnie wysiewane w formacie monowarstwy na płytkach 6-dołkowych pokrytych żelatyną (0.1%). (B) Po 2 dniach hodowli hiPSC-CM są dysocjowane i przygotowywane do wysiewania na elastycznym podłożu hydrożelowym. (C) Izolowane hiPSC-CM są wysiewane z wysoką gęstością na podłożach hydrożelowych ułożonych w formacie 48-dołkowym (po lewej) i analizowane w (0.5 mM) zewnętrznym roztworze wapnia Tyrode'a (po prawej). (D) Do stymulacji hiPSC-CM wykorzystuje się komercyjny generator impulsów oraz standardowe kliniczne parametry impulsów CCM29,30 (po prawej); funkcję serca ocenia się za pomocą analizy wideo (po lewej). (E) Reprezentatywne zapisy skurczów przed CCM (baseline: 5 V), podczas CCM (CCM: 10 V) oraz po CCM (recovery: 5 V). Rysunek ten został przedrukowany z Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przygotowania płytki 48-dołkowej; hydrożel ECM, wysiew hiPSC-CM do hodowli komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat nakładania i wysiewu na elastyczny podłoże hydrożelowe. (A) Całkowicie rozmrożony, nierozcieńczony hydrożel na bazie ECM jest nakładany na sterylną płytkę 48-dołkową (lewy panel), przy zastosowaniu 1 µL podłoża hydrożelowego na dołek (prawy panel). (B) Podłoże hydrożelowe inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 8-10 min (prawy panel), po czym następuje wysiew hiPSC-CM o wysokiej gęstości w małej objętości medium (~200 µL) (lewy panel). (C) Po 10-15 min inkubacji do każdego dołka dodaje się medium (lewy panel), a płytki przenosi się do standardowego inkubatora do hodowli tkanek (prawy panel). Skróty: ECM = macierz zewnątrzkomórkowa, hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych; RT = temperatura pokojowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces tworzenia kolonii bakteryjnych, obrazy mikroskopowe pokazujące wzorce wzrostu, widoczne paski skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Podłoże hydrożelowe oparte na macierzy zewnątrzkomórkowej. (A) Reprezentatywne podłoże hydrożelowe (bez komórek) w jednym dołku szklanej płytki 48-dołkowej bezpośrednio po naniesieniu podłoża do dołka. (B) Czas 0 po wysianiu hiPSC-CMs. (C) Czas 24 h po wysianiu hiPSC-CMs. Ten panel został przedrukowany z Feaster et al.17. Białe strzałki wskazują krawędź podłoża hydrożelowego, powiększenie 4x. Pasek skali = 1 mm. Skrót: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres i histogram analizy skurczów serca; wyniki pomiaru amplitudy skurczu i czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Charakterystyka właściwości kurczliwych 2D monowarstwy hiPSC-CM. (A) Reprezentatywny zapis skurczów 2D hiPSC-CM stymulowanych z częstotliwością 1 Hz (5 V). (B) Reprezentatywne ślady skurczów przedstawiające jeden cykl skurczowy. (C) Podsumowujące wykresy słupkowe. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. n = 18. Skrót: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza amplitudy skurczów serca; wykresy pokazujące efekty przed i po terapii CCM; porównanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ostry efekt CCM na właściwości kurczliwe 2D hiPSC-CM. (A) Reprezentatywny zapis skurczów przed CCM (5 V), w trakcie CCM (10 V) oraz po CCM (5 V). (B) Reprezentatywne przebiegi skurczów dla efektów natychmiastowych (tj. ostatniego skurczu przed CCM, pierwszego skurczu podczas CCM oraz pierwszego skurczu po CCM, zaznaczone symbolem +). (C) Podsumowujące wykresy słupkowe efektów natychmiastowych. Procentowa zmiana, dane przedstawiono jako średnia ± SEM. n = 23. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. Rycina ta została przedrukowana z pracy Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ wapnia zewnątrzkomórkowego na skurcz; wykresy amplitudy i nachylenia w funkcji stężenia Ca2+ (mM)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wpływ modulacji wapnia zewnątrzkomórkowego na odpowiedź CCM. (A) Reprezentatywne zapisy skurczów wykazujące natychmiastowe efekty dla każdej grupy przed CCM (5 V), podczas CCM (10 V) oraz po CCM (5 V); hiPSC-CM poddano działaniu rosnących stężeń wapnia zewnątrzkomórkowego (Cao) w zakresie 0,25-2 mM. (B-D) Przetworzone dane (sigmoidalne) ułatwiające interpretację, demonstrujące wpływ CCM na wrażliwość wapniową właściwości skurczowych (tj. amplitudę i kinetykę) (nachylenie krzywej Hilla = 1,0). n = 6-8 na grupę. Rysunek został przedrukowany z pracy Feaster i wsp.17. Skróty: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy i słupki kurczliwości serca; efekty nośnika w porównaniu z metoprololem; analiza skurczu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Próba farmakologiczna. Reprezentatywne zapisy skurczów dla każdej grupy przed CCM (5 V), podczas CCM (10 V) oraz po CCM (5 V); hiPSC-CMs zostały poddane wstępnej obróbce (A) nośnikiem lub (B) metoprololem (2 µM). (C,D) Podsumowujące wykresy słupkowe dla każdego stanu. Procentowa zmiana, dane przedstawione jako średnia ± SEM. n = 10 na grupę. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. Rysunek został przedrukowany z pracy Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza skurczu serca; wykres pokazujący amplitudę (DCM vs DCM+CCM) oraz wykres słupkowy parametrów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Ostry efekt CCM na właściwości skurczowe chorych 2D hiPSC-CMs. (A) Reprezentatywny zapis skurczu dla DCM L35P, bazowej kontroli (przed, 6 V) oraz DCM L35P z dodatkiem CCM (10 V). (B) Podsumowujące wykresy słupkowe. Procentowa zmiana, dane przedstawiono jako średnia ± SEM. n = 3. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01. Skróty: hiPSC-CM = kardiomiocyt pochodzący z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca; DCM = rozstrzeniowa kardiomiopatia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Wideo dodatkowe S1: Time-lapse kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs) na hydrożelu opartym na macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwuwymiarowe hiPSC-CMs wysiane na elastycznym podłożu hydrożelowym; Czas: 0-90 h; jedna studnia szklanej płytki 48-dołkowej; powiększenie 4x. hiPSC-CMs tworzą poziomy syncytium monowarstwy (tj. od lewej do prawej). Pasek skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające S2: hiPSC-CMs na hydrożelu opartym na macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwuwymiarowe hiPSC-CMs wysiane na elastycznym podłożu hydrożelowym; czas: ~24 h; jedna studzienka szklanej płytki 48-dołkowej; powiększenie 4x. hiPSC-CMs tworzą morfologię monowarstwy i wykazują silne skurcze w ~24 h po wysianiu. Pasek skali = 1 mm. Materiał wideo pochodzi z pracy Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Parametr</td>
			<td >CCM</td>
			<td >Po</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Amplituda </td>
			<td >16 ± 4%**</td>
			<td >4 ± 5%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas do szczytu 50% </td>
			<td >-20 ± 9%*</td>
			<td >7 ± 5%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas do szczytu 90% </td>
			<td >-22 ± 8%*</td>
			<td >6 ± 5%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas powrotu do linii bazowej 50% </td>
			<td >-8 ± 5%</td>
			<td >4 ± 4%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas powrotu do linii bazowej 90% </td>
			<td >-12 ± 6%*</td>
			<td >5 ± 5%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas trwania skurczu 10% </td>
			<td >-13 ± 6%</td>
			<td >3 ± 5%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas trwania skurczu 50%</td>
			<td >-6 ± 5 %</td>
			<td >3 ± 5%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas trwania skurczu 90% </td>
			<td >0 ± 5%</td>
			<td >3 ± 4%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >N</td>
			<td >23</td>
			<td >23</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Właściwości kurczliwe. Procentowa zmiana w stosunku do stanu przed CCM (5 V); dane przedstawiają średnią ± SEM dla wszystkich skurczów w każdej grupie podczas CCM (10 V) oraz po CCM (5 V). n = 23. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. Tabela została przedrukowana z opracowania Feaster et al.17.

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Biuro Laboratoriów Naukowych i Inżynieryjnych przy FDA opracowuje regulacyjne narzędzia naukowe, aby pomóc twórcom urządzeń medycznych i recenzentom FDA. Naszym nadrzędnym celem jest przyspieszenie dostępu pacjentów do innowacyjnych, bezpiecznych i skutecznych urządzeń medycznych dzięki najlepszej dostępnej nauce. W tym protokole stosujemy najnowocześniejszą technologię indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do oceny wyrobów medycznych, które są stosowane w leczeniu zagrażających życiu schorzeń serca.To proste narzędzie umożliwia powtarzalną ocenę urządzeń do elektrofizjologii serca w naczyniu przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Może być również stosowany z komórkami specyficznymi dla pacjenta pochodzącymi od dawców z różnymi chorobami serca. Na początek rozmrożone ludzkie kardiomiocyty pochodzące z iPSC należy umieścić na sterylnych sześciodołkowych płytkach pokrytych żelatyną o stężeniu 0,1% żelatyny co najmniej dwa dni przed wysiewem kardiomiocytów na elastycznym podłożu hydrożelowym.Hodowla ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC w standardowym pożywce kardiomiocytów przez dwa do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić im powrót do zdrowia po kriokonserwacji. Odświeżaj zużytą pożywkę za pomocą pożywki 100% kardiomiocytów co 48 godzin. Sprawdź stan ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC przed dysocjacją, oceniając stan komórek, zapewniając żywotność i stabilne bicie.Umyj kardiomiocyty czterema mililitrami na studzienkę DPBS bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu. Dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego w temperaturze pokojowej do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki kardiomiocytowej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Oddzielić kardiomiocyty od sześciodołkowych płytek za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki. Przepłucz studzienki jednym mililitrem świeżej pożywki kardiomiocytowej, aby zebrać wszelkie resztki kardiomiocytów i dodać je do stożkowej probówki. Następnie doprowadź końcową objętość stożkowej rurki do 15 mililitrów za pomocą pożywki.Odwirować probówkę o sile 200 G przez pięć minut i usunąć supernatant do oznaczenia jednego mililitra. Ponownie zawiesić komórki w pożywce kardiomiocytowej do końcowej objętości pięciu mililitrów i policzyć kardiomiocyty za pomocą ręcznego lub automatycznego licznika komórek. Następnie inkubować zawiesinę komórek kardiomiocytów przez około 30 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy elastyczne podłoża hydrożelowe są przygotowywane.Przygotuj zestaw pipet o pojemności 20 mikrolitrów na jeden mikrolitr, końcówki do pipet, sterylną 48-dołkową szklaną płytkę dolną i stoper w kapturze do hodowli tkankowych. Wymieszaj macierz zewnątrzkomórkową lub podłoże hydrożelowe na bazie ECM, delikatnie stukając w probówkę i natychmiast umieszczając ją z powrotem na lodzie. Uruchom stoper bezpośrednio przed posianiem pierwszego podłoża hydrożelowego i oznacz to jako czas zerowy.Odpipetować jeden mikrolitr podłoża hydrożelowego w górę iw dół około trzy razy, aby schłodzić końcówkę pipety. Następnie nanieść około jednego mikrolitra nierozcieńczonego podłoża hydrożelowego poziomo na dno każdego dołka w 48-dołkowej płytce, trzymając pipetę pod kątem 45 stopni. Umieść wszystkie podłoża hydrożelowe w tej samej orientacji w każdym dołku, aby pomóc zidentyfikować podłoże podczas wykonywania eksperymentów przy 40-krotnym powiększeniu.Umieścić pokrywkę na 48-dołkowej płytce i pozostawić substraty hydrożelowe do inkubacji przez osiem do 10 minut w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowej przed dodaniem komórek. Po inkubacji natychmiast wysiewać kardiomiocyty kroplami bezpośrednio na podłoża hydrożelowe z około 30 000 żywotnych kardiomiocytów na studzienkę w małej objętości pożywki około 200 mikrolitrów pożywki kardiomiocytowej. Po zamknięciu pokrywy pozwól kardiomiocytom inkubować bez przeszkód przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej w kapturze, aby umożliwić komórkom przyleganie do podłoża hydrożelowego.Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki kardiomiocytowej do każdej studzienki. Umieść płytkę z zamkniętą pokrywką w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na dwa do czterech dni. Włącz mikroskop i komorę kontroli środowiska, aby zrównoważyć temperaturę do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Wyjmij pożywkę kardiomiocytów z płytki 48-dołkowej i delikatnie przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 600 mikrolitrami pożywki do modulacji kurczliwości serca lub pożywki do oznaczania CCM. Następnie dodać 300 mikrolitrów pożywki testowej CCM na studzienkę i umieścić 48-dołkową płytkę na mikroskopie w komorze kontroli środowiska. Włóż elektrody i równoważ ogniwa przez pięć minut.Aby nagrać filmy skurczu za pomocą mikroskopii wideo, otwórz oprogramowanie do nagrywania wideo i ustaw liczbę klatek na sekundę 100 klatek na sekundę. Następnie wybierz obszar zainteresowania lub ROI w pobliżu środka monowarstwy hiPSC-CM. Następnie pole stymuluje komórki za pomocą komercyjnego generatora impulsów, aby elektrycznie stymulować monowarstwy kardiomiocytów 2D.Umieść kardiomiocyt na 1,5-krotnym progu przy jednym hercu z wyjściowymi parametrami tętna. Na przykład monofazowe impulsy o stymulacji fali prostokątnej o czasie trwania impulsu bodźca wynoszącym dwie milisekundy wynoszącym pięć woltów. Nagraj film ze skurczem tylko przy stymulacji wyjściowej przed CCM przez co najmniej pięć uderzeń.Następnie stymuluj monowarstwę kardiomiocytów eksperymentalnym sygnałem elektrycznym o 30 milisekundach opóźnienia, dwoma symetrycznymi dwufazowymi impulsami o czasie trwania fazy 5,14 milisekundy, o całkowitym czasie trwania 20,56 milisekundy, amplitudzie fazy 10 woltów i zerowym interwale między fazami. Nagraj wideo skurczu wywołanego CCM przez co najmniej pięć uderzeń. Wyłącz sygnał CCM, stymuluj impulsem stymulacji wyjściowej i nagraj film skurczowy z okresu rekonwalescencji po CCM przez co najmniej pięć uderzeń.Użyj standardowego oprogramowania do skurczu, aby automatycznie przeanalizować filmy skurczowe i określić ilościowo kluczowe właściwości skurczu, takie jak amplituda skurczu, nachylenie skurczu, nachylenie relaksacji, czas do szczytu, czas do linii podstawowej 90% i czas trwania skurczu 50%Scharakteryzowano jednowarstwowe właściwości kontraktowe kardiomiocytów pochodzących z ludzkich iPSC 2D i określono ilościowo kluczowe parametry kurczliwości kardiomiocytów. Zastosowanie standardowych parametrów stymulacji CCM skutkowało poprawą właściwości kurczliwych in vitro. Oceniono wpływ zewnątrzkomórkowej modulacji stężenia wapnia na właściwości skurczowe człowieka ze stymulacją CCM i bez niej.Zaobserwowano oczekiwaną wyjściową zależność skurczu od wapnia, a także wywołany przez CCM wzrost wrażliwości wapniowej na poziomie monowarstwy kardiomiocytów. Ponadto farmakologiczne badanie szlaku sygnalizacji beta-androgennej ujawniło, że efekty inotropowe wywołane przez CCM były częściowo pośredniczone przez sygnalizację beta-adrenergiczną. Co więcej, narzędzie to można rozszerzyć na kardiomiocyty specyficzne dla pacjenta, w tym kardiomiopatię rozstrzeniową, aby zrozumieć wpływ CCM w kontekście stanów chorobowych.Tutaj skupiamy się przede wszystkim na ocenie właściwości skurczowych człowieka. Jednak za pomocą tego narzędzia można również ocenić inne odczyty sprzężenia skurczu pobudzenia serca, w tym potencjały czynnościowe i obchodzenie się z wapniem. Jest to pierwsze narzędzie nauk regulacyjnych, które łączy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą technologii z oceną urządzeń kardiologicznych.Ta alternatywna metoda toruje drogę do oceny wyrobów medycznych w naczyniu i może potencjalnie zmniejszyć potrzebę przeprowadzania testów na zwierzętach i ludziach.

evaluation-cardiac-contractility-modulation-therapy-2d-human-stem

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Tutaj pokazujemy generowanie ludzkiej tkanki serca z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów. Przedstawiono metodę analizy siły skurczu oraz przykładową zmianę wzorca skurczu przez inhibitor kanału hERG E-4031. Metoda ta wykazuje wysoki poziom odporności i przydatności do badań przesiewowych leków sercowych.

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Spontanicznie kurczące się syncytia kardiomiocytów pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych są użytecznymi modelami ludzkiej fizjologii serca i farmakologii. Poniżej przedstawiamy wysokoprzepustowy system przesiewowy do ilościowego określania wpływu związków egzogennych na częstotliwość dudnienia, przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca i wielodołkowego czytnika płytek do obrazowania z kontrolowaną temperaturą.

Skurcze syncytii kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC mierzone za pomocą barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca na płytkach 384-dołkowych o kontrolowanej temperaturze

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę oceny kurczliwości kardiomiocytów 2D pochodzących z ludzkich komórek iPSC przy użyciu mikroskopii wideo. To narzędzie wspiera rozwój bezpiecznych urządzeń kardiologicznych.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów