Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Biuro Laboratoriów Naukowych i Inżynieryjnych przy FDA opracowuje regulacyjne narzędzia naukowe, aby pomóc twórcom urządzeń medycznych i recenzentom FDA. Naszym nadrzędnym celem jest przyspieszenie dostępu pacjentów do innowacyjnych, bezpiecznych i skutecznych urządzeń medycznych dzięki najlepszej dostępnej nauce. W tym protokole stosujemy najnowocześniejszą technologię indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do oceny wyrobów medycznych, które są stosowane w leczeniu zagrażających życiu schorzeń serca.

To proste narzędzie umożliwia powtarzalną ocenę urządzeń do elektrofizjologii serca w naczyniu przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Może być również stosowany z komórkami specyficznymi dla pacjenta pochodzącymi od dawców z różnymi chorobami serca. Na początek rozmrożone ludzkie kardiomiocyty pochodzące z iPSC należy umieścić na sterylnych sześciodołkowych płytkach pokrytych żelatyną o stężeniu 0,1% żelatyny co najmniej dwa dni przed wysiewem kardiomiocytów na elastycznym podłożu hydrożelowym.

Hodowla ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC w standardowym pożywce kardiomiocytów przez dwa do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić im powrót do zdrowia po kriokonserwacji. Odświeżaj zużytą pożywkę za pomocą pożywki 100% kardiomiocytów co 48 godzin. Sprawdź stan ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC przed dysocjacją, oceniając stan komórek, zapewniając żywotność i stabilne bicie.

Umyj kardiomiocyty czterema mililitrami na studzienkę DPBS bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu. Dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego w temperaturze pokojowej do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki kardiomiocytowej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Oddzielić kardiomiocyty od sześciodołkowych płytek za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki. Przepłucz studzienki jednym mililitrem świeżej pożywki kardiomiocytowej, aby zebrać wszelkie resztki kardiomiocytów i dodać je do stożkowej probówki. Następnie doprowadź końcową objętość stożkowej rurki do 15 mililitrów za pomocą pożywki.

Odwirować probówkę o sile 200 G przez pięć minut i usunąć supernatant do oznaczenia jednego mililitra. Ponownie zawiesić komórki w pożywce kardiomiocytowej do końcowej objętości pięciu mililitrów i policzyć kardiomiocyty za pomocą ręcznego lub automatycznego licznika komórek. Następnie inkubować zawiesinę komórek kardiomiocytów przez około 30 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy elastyczne podłoża hydrożelowe są przygotowywane.

Przygotuj zestaw pipet o pojemności 20 mikrolitrów na jeden mikrolitr, końcówki do pipet, sterylną 48-dołkową szklaną płytkę dolną i stoper w kapturze do hodowli tkankowych. Wymieszaj macierz zewnątrzkomórkową lub podłoże hydrożelowe na bazie ECM, delikatnie stukając w probówkę i natychmiast umieszczając ją z powrotem na lodzie. Uruchom stoper bezpośrednio przed posianiem pierwszego podłoża hydrożelowego i oznacz to jako czas zerowy.

Odpipetować jeden mikrolitr podłoża hydrożelowego w górę iw dół około trzy razy, aby schłodzić końcówkę pipety. Następnie nanieść około jednego mikrolitra nierozcieńczonego podłoża hydrożelowego poziomo na dno każdego dołka w 48-dołkowej płytce, trzymając pipetę pod kątem 45 stopni. Umieść wszystkie podłoża hydrożelowe w tej samej orientacji w każdym dołku, aby pomóc zidentyfikować podłoże podczas wykonywania eksperymentów przy 40-krotnym powiększeniu.

Umieścić pokrywkę na 48-dołkowej płytce i pozostawić substraty hydrożelowe do inkubacji przez osiem do 10 minut w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowej przed dodaniem komórek. Po inkubacji natychmiast wysiewać kardiomiocyty kroplami bezpośrednio na podłoża hydrożelowe z około 30 000 żywotnych kardiomiocytów na studzienkę w małej objętości pożywki około 200 mikrolitrów pożywki kardiomiocytowej. Po zamknięciu pokrywy pozwól kardiomiocytom inkubować bez przeszkód przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej w kapturze, aby umożliwić komórkom przyleganie do podłoża hydrożelowego.

Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki kardiomiocytowej do każdej studzienki. Umieść płytkę z zamkniętą pokrywką w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na dwa do czterech dni. Włącz mikroskop i komorę kontroli środowiska, aby zrównoważyć temperaturę do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Wyjmij pożywkę kardiomiocytów z płytki 48-dołkowej i delikatnie przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 600 mikrolitrami pożywki do modulacji kurczliwości serca lub pożywki do oznaczania CCM. Następnie dodać 300 mikrolitrów pożywki testowej CCM na studzienkę i umieścić 48-dołkową płytkę na mikroskopie w komorze kontroli środowiska. Włóż elektrody i równoważ ogniwa przez pięć minut.

Aby nagrać filmy skurczu za pomocą mikroskopii wideo, otwórz oprogramowanie do nagrywania wideo i ustaw liczbę klatek na sekundę 100 klatek na sekundę. Następnie wybierz obszar zainteresowania lub ROI w pobliżu środka monowarstwy hiPSC-CM. Następnie pole stymuluje komórki za pomocą komercyjnego generatora impulsów, aby elektrycznie stymulować monowarstwy kardiomiocytów 2D.

Umieść kardiomiocyt na 1,5-krotnym progu przy jednym hercu z wyjściowymi parametrami tętna. Na przykład monofazowe impulsy o stymulacji fali prostokątnej o czasie trwania impulsu bodźca wynoszącym dwie milisekundy wynoszącym pięć woltów. Nagraj film ze skurczem tylko przy stymulacji wyjściowej przed CCM przez co najmniej pięć uderzeń.

Następnie stymuluj monowarstwę kardiomiocytów eksperymentalnym sygnałem elektrycznym o 30 milisekundach opóźnienia, dwoma symetrycznymi dwufazowymi impulsami o czasie trwania fazy 5,14 milisekundy, o całkowitym czasie trwania 20,56 milisekundy, amplitudzie fazy 10 woltów i zerowym interwale między fazami. Nagraj wideo skurczu wywołanego CCM przez co najmniej pięć uderzeń. Wyłącz sygnał CCM, stymuluj impulsem stymulacji wyjściowej i nagraj film skurczowy z okresu rekonwalescencji po CCM przez co najmniej pięć uderzeń.

Użyj standardowego oprogramowania do skurczu, aby automatycznie przeanalizować filmy skurczowe i określić ilościowo kluczowe właściwości skurczu, takie jak amplituda skurczu, nachylenie skurczu, nachylenie relaksacji, czas do szczytu, czas do linii podstawowej 90% i czas trwania skurczu 50%Scharakteryzowano jednowarstwowe właściwości kontraktowe kardiomiocytów pochodzących z ludzkich iPSC 2D i określono ilościowo kluczowe parametry kurczliwości kardiomiocytów. Zastosowanie standardowych parametrów stymulacji CCM skutkowało poprawą właściwości kurczliwych in vitro. Oceniono wpływ zewnątrzkomórkowej modulacji stężenia wapnia na właściwości skurczowe człowieka ze stymulacją CCM i bez niej.

Zaobserwowano oczekiwaną wyjściową zależność skurczu od wapnia, a także wywołany przez CCM wzrost wrażliwości wapniowej na poziomie monowarstwy kardiomiocytów. Ponadto farmakologiczne badanie szlaku sygnalizacji beta-androgennej ujawniło, że efekty inotropowe wywołane przez CCM były częściowo pośredniczone przez sygnalizację beta-adrenergiczną. Co więcej, narzędzie to można rozszerzyć na kardiomiocyty specyficzne dla pacjenta, w tym kardiomiopatię rozstrzeniową, aby zrozumieć wpływ CCM w kontekście stanów chorobowych.

Tutaj skupiamy się przede wszystkim na ocenie właściwości skurczowych człowieka. Jednak za pomocą tego narzędzia można również ocenić inne odczyty sprzężenia skurczu pobudzenia serca, w tym potencjały czynnościowe i obchodzenie się z wapniem. Jest to pierwsze narzędzie nauk regulacyjnych, które łączy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą technologii z oceną urządzeń kardiologicznych.

Ta alternatywna metoda toruje drogę do oceny wyrobów medycznych w naczyniu i może potencjalnie zmniejszyć potrzebę przeprowadzania testów na zwierzętach i ludziach.