Name: Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj metodę tworzenia zdefiniowanych tkankowych struktur serca z wykorzystaniem sortowania komórek i bioreaktora wielotkankowego. Ta technika pozwala badać mechanizmy terapii komórkowej serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (1F30HL118923-01A1) do T.J.C., NIH/NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C do K.D.C., research grant council of Hong Kong TRS T13-706/11(K.D.C), NIH (R01 HL113499) do B.D.G., American Heart Association (12PRE12060254) do R.J. oraz Research Grant Council of HKSAR (TBRS, T13-706/11) do R.L. Dodatkowe fundusze zostały zapewnione T.J.C. przez NIH DRB 5T32GM008553-18 oraz jako staż na NIDCR-Interdisciplinary Szkolenie z zakresu biologii systemowej i rozwojowej oraz wad wrodzonych T32HD075735. Autorzy pragną również podziękować Arthurowi Autzowi z The Zahn Center of The City College of New York za pomoc w obróbce bioreaktora oraz Mamdouhowi Eldaly'emu za pomoc techniczną. Dziękujemy również dr Kennethowi Bohelerowi za porady dotyczące różnicowania serca oraz dr Joshua Hare za hojne dostarczenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych.

<ol><li>Serrao, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte-depleted+engineered+cardiac+tissues+support+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).</li>
<li>Yildirim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+biological+ventricular+assist+device%3A+preliminary+data+from+a+small+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model.</a> Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Cell+Sheet+Transplantation+Improves+Damaged+Heart+Function+via+Superior+Cell+Survival+in+Comparison+with+Dissociated+Cell+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection.</a> Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li>
<li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+tissue-engineered+human+vascularized+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).</li>
<li>Turnbull, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+functional+engineered+cardiac+tissues+toward+a+preclinical+model+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium.</a> FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).</li>
<li>Thavandiran, N., Dubois, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+formulation+of+functional+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PloS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+filamentous+human+diseased+cardiac+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model.</a> Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology%2C+adhesion+junctions%2C+presence+of+myofibrils+and+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS One. 7 (5), e38147(2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
<li>Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).</li>
<li>Dubois, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Gago-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THY-1+receptor+expression+differentiates+cardiosphere-derived+cells+with+divergent+cardiogenic+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential.</a> Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).</li>
<li>Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+dose-escalation+study+of+intravenous+adult+human+mesenchymal+stem+cells+%28prochymal%29+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).</li>
<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Wollert, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+autologous+bone-marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+the+BOOST+randomised+controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial.</a> Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+autologous+mononuclear+bone+marrow+cells+or+peripheral+mononuclear+blood+cells+after+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+rationale+and+design+of+the+HEBE+trial--a+prospective%2C+multicenter%2C+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart.+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial.</a> Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).</li>
<li>Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+bone+marrow+cell+therapy+improves+survival+and+induces+long-term+improvement+in+cardiac+parameters%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis.</a> Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).</li>
<li>Meyer, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+bone+marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+5-year+follow-up+from+the+randomized-controlled+BOOST+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial.</a> Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).</li>
<li>Meyer, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+bone+marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+eighteen+months%27+follow-up+data+from+the+randomized%2C+controlled+BOOST+%28BOne+marrOw+transfer+to+enhance+ST-elevation+infarct+regeneration%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial.</a> Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+mononuclear+cells+from+bone+marrow+or+peripheral+blood+compared+with+standard+therapy+in+patients+after+acute+myocardial+infarction+treated+by+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+results+of+the+randomized+controlled+HEBE+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial.</a> Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).</li>
<li>Simari, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mononuclear+cell+therapy+for+acute+myocardial+infarction%3A+a+perspective+from+the+cardiovascular+cell+therapy+research+network%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network.</a> Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSCs%3A+Delivery+Routes+and+Engraftment%2C+Cell-Targeting+Strategies%2C+and+Immune+Modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation.</a> Stem Cells Int. , 732742(2013).</li>
<li>Trachtenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+design+of+the+Transendocardial+Injection+of+Autologous+Human+Cells+%28bone+marrow+or+mesenchymal%29+in+Chronic+Ischemic+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Heart+Failure+Secondary+to+Myocardial+Infarction+%28TAC-HFT%29+trial%3A+A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study+of+safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy.</a> Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).</li>
<li>Williams, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+stem+cell+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy%3A+functional+recovery+and+reverse+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling.</a> Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).</li>
<li>Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+gene+expression+in+fetal+and+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Metabolic gene expression in fetal and failing human heart.</a> Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail.+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program%3A+a+suggested+metabolic+link+to+gene+expression+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Budowa zdefiniowanych ludzkich zmodyfikowanych tkanek serca (hECT) może zapewnić bardziej spójny i wiarygodny model funkcji ludzkich miocytów sercowych. Co najważniejsze, wszystkie komponenty komórkowe i zewnątrzkomórkowe w systemie są znane i można nimi manipulować zgodnie z potrzebami, usuwając w ten sposób zakłócający wpływ innych nieznanych typów komórek wynikający z procesu różnicowania. Aby zrównoważyć szybki wzrost komórek i wysoką wydajność, zaleca się, aby różnicowanie rozpoczynało się przy 75% konfluencji hESC,...

Inżynieria tkankowa serca znacznie się rozwinęła w ostatnim dziesięcioleciu, a wiele grup publikuje wyniki w pełni funkcjonalnych, pokonanych tkanek wykonanych zarówno z mysich kardiomiocytów1-6, jak i, ostatnio, ludzkich miocytów serca pochodzących z komórek macierzystych7-12. Dziedzina inżynierii tkankowej serca opiera się na dwóch podstawowych i zasadniczo niezależnych celach: 1) opracowanie egzogennych przeszczepów, które można przeszczepić do niewydolnych serc w celu poprawy funkcji4-6; oraz 2) opracowanie modeli in vitro do badania fizjologii i chorób lub jako narzędzi przesiewowych do rozwoju terapeutycznego2,7.
Trójwymiarowa (3-D) hodowla komórek jest uważana za niezbędną do rozwoju narzędzi przesiewowych nowej generacji, ponieważ matryca 3D odzwierciedla bardziej naturalne mikrośrodowisko serca niż tradycyjna jednowarstwowa hodowla komórkowa 2D; w rzeczywistości niektóre aspekty biologii komórki są zasadniczo różne w kulturach 2-D vs. 3-D13,14. Dodatkowo, zmodyfikowane tkanki serca są zbudowane z całkowicie zdefiniowanych komponentów: macierzy zewnątrzkomórkowej i populacji komórek. W przypadku tradycyjnie modyfikowanych tkanek ludzkiego serca, podczas gdy skład macierzy zewnątrzkomórkowej (zwykle fibryna9 lub kolagen7,8,10) jest ściśle kontrolowany, skład komórek wejściowych jest mniej dobrze zdefiniowany, z całą mieszaniną komórek pochodzących z ukierunkowanego różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych (ESC7,9) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC10,12) dodawane do tkanek. W zależności od konkretnej linii komórkowej i skuteczności zastosowanego protokołu różnicowania, uzyskany odsetek kardiomiocytów może wynosić od mniej niż 25% do ponad 90%, określony fenotyp kardiomiocytów (tj. podobny do komorowego, przedsionkowego lub rozrusznika serca) może się również różnić, nawet frakcja niekardiomiocytów może być wysoce niejednorodna15,16 i zmieniać dojrzałość zróżnicowanych miocytów serca17.
Ostatnie prace inżynierii tkankowej serca próbowały kontrolować wejściową populację komórek, przy użyciu albo reportera sercowego ludzkiej embrionalnej komórki macierzystejlinii 8, albo markerów powierzchni komórki18 do izolacji składnika różnicowania miocytów sercowych. Chociaż początkowo tkanka złożona tylko z miocytów serca wydawałaby się idealna, w rzeczywistości tak nie jest; hECT złożone wyłącznie z miocytów serca nie ulegają zagęszczeniu w funkcjonalne tkanki, przy czym niektóre grupy stwierdzają stosunek miocytów serca do fibroblastów wynoszący 3:1 wytwarzających największą siłę skurczu8. Dzięki zastosowaniu różnych metod selekcji komórek, w tym markerów powierzchniowych do sortowania żywych komórek, możliwe jest tworzenie hECT ze zdefiniowanymi populacjami komórek. Chociaż markery komórek zrębu niesercowego są dostępne od pewnego czasu, takie jak domniemany marker fibroblastów CD9019,20, markery powierzchniowe miocytów serca są trudniejsze do zidentyfikowania. SIRPα był jednym z pierwszych markerów powierzchni serca zidentyfikowanych dla ludzkich miocytów serca18 i wykazano, że jest wysoce selektywny dla linii serca. Niedawno odkryliśmy, że podwójne sortowanie komórek SIRPα + i CD90 daje prawie czyste kardiomiocyty, przy czym populacja CD90 + wykazuje fenotyp podobny do fibroblastów (Josowitz, niepublikowane obserwacje). Opierając się na tych zebranych wynikach, w niniejszym artykule opisano tworzenie hECT przy użyciu kombinacji 3:1 kardiomiocytów SIRPα+/CD90- i fibroblastów CD90+.
Zdolność do stworzenia całkowicie zdefiniowanej tkanki serca ludzkiego jest niezbędna nie tylko do tworzenia solidnych narzędzi przesiewowych, ale także do rozwijania systemów modelowych do badania pojawiających się terapii kardiologicznych opartych na komórkach i genach. W szczególności w badaniach klinicznych przetestowano liczne terapie komórkowe stosowane w leczeniu niewydolności serca, wykorzystujące typy komórek, w tym mezenchymalne komórki macierzyste (MSC)21, komórki macierzyste serca22 i komórki jednojądrzaste szpiku kostnego23-25. Podczas gdy wiele początkowych wyników było obiecujących21,23,25, początkowe korzyści często maleją z czasem26-29. Podobny trend zaobserwowano w mysich tkankach serca, które wykazują znaczące korzyści funkcjonalne dzięki suplementacji MSC, ale korzyść ta nie utrzymuje się podczas długotrwałej hodowli1. U podstaw nieoptymalnej wydajności leży nasza ograniczona wiedza na temat mechanizmów rządzących terapiami komórkowymi. Głębsze zrozumienie, w jaki sposób komórki terapeutyczne wywierają korzystny wpływ, a także potencjalne negatywne konsekwencje interakcji miocyty-niemiocyty, umożliwiłoby opracowanie ulepszonych terapii przynoszących klinicznie istotne i trwałe korzyści, przy minimalnych skutkach ubocznych, dla pacjentów z niewydolnością serca.
Tutaj opisujemy użycie zdefiniowanych hECT do badania mechanizmów terapii opartej na komórkach. Kontrolowany skład tkanek jest niezbędny do identyfikacji określonych czynników wpływających na wydajność kardiomiocytów. Bezpośrednie uzupełnienie hECT o terapeutyczny typ komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. MSCs) może ujawnić wpływ na wydajność miocytów serca, jak wykazaliśmy w przypadku ECTu szczurów 1.
Następujący wieloetapowy protokół rozpoczyna się od ukierunkowanego różnicowania komórek macierzystych serca, następnie produkcji wielotkankowego bioreaktora, a kończy na opisie budowy tkanki i analizie funkcjonalnej. Nasze eksperymenty są przeprowadzane przy użyciu zatwierdzonej przez NIH linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H7 (hESC). Jednak poniższe protokoły zostały również przetestowane przy użyciu dodatkowej linii hESC i trzech linii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) z podobnymi wynikami. Odkryliśmy, że skuteczność różnicowania kardiomiocytów i sukces w wytwarzaniu hECT może być zależny od linii komórkowej, szczególnie w przypadku linii hiPSC pochodzących od indywidualnych pacjentów. Postępując zgodnie z tym protokołem, dwie 6-dołkowe szalki są platerowane łącznie 1,68 miliona hESC (140 000 komórek na dołek), co daje około 2,5 miliona miocytów po różnicowaniu przez 20 dni i sortowaniu, co wystarcza do wytworzenia sześciu zdefiniowanych tkanek.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>Przygotuj zapas 2,5 mg/ml w DMSO i sterylizuj filtrem</td></tr><tr><td>B27 za pomocą Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>17505055</td><td></td></tr><tr><td>B27 bez insuliny</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Create 6 &mu; M zapasów, a następnie podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>H7 Ludzkie embrionalne komórki macierzyste</td><td>WiCell</td><td>WA07</td><td></td></tr><tr><td>Matryca kwalifikowana do hESC, Corning Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Rozmrażanie na lodzie w temperaturze 4 & stopni; C przez noc, a następnie podwielokrotność 150 &mu; l do oddzielnych tub i przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td>Utwórz 10 mM kolby i podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>surowicy cielęcej noworodków</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik dysocjacji nieenzymatycznej: Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Przechowywać w lodówce</td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibitor ROCK)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Zawiesić do stężenia zapasów 10 mM, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&nbsp; &deg;C. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>Cell Sorting<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr>4<tr><td>',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>CD90-FITC</td><td>BioLegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji enzymatycznej: Cell Detach Kit I (0,04% trypsyny / 0,03% EDTA, roztwór neutralizujący trypsynę i buforowany roztwór soli Hanksa)&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-41200</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11250</td><td></td></tr><tr><td>SIRP&alpha;-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>323807</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Construction</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna/0,1% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-053-CI</td><td>Opcjonalnie: Do pobierania dodatkowych komórek zainteresowania</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Pakiety PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen, bydło typu I</td><td>Life Technologies</td><td>A10644-01</td><td>Trzymaj na lodzie</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagles (DMEM), wysoka glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Sodowy HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiały</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific NC0536757</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowa probówka</td> wirówkowa <td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyrenowa rurka okrągłodenna</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Ze zintegrowanym 35 &mu; M Sitko komórkowe</td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płaska płytka do hodowli tkankowych z płaskim dnem</td><td>Skrobak do komórek Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>, jednorazowy</td><td>Biologix</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Polisulfon</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Politetrafluoroetylen (teflon)</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment<</td><td>strong>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>Lub podobny, musi mieć uchwyt do szybkiej kamery do mocowania</td></tr><tr><td>Elektryczny system stymulacji</td><td>Astro-Med, Inc</td><td>Stymulator</td><td></td>trawy S88X</tr><tr><td>o dużej prędkości Kamera</td><td>Pixelink</td><td>PL-B741U</td><td>Lub podobna, ale musi być zdolna do 100 klatek na sekundę w celu dokładnego pozyskiwania danych</td></tr><tr><td>Kontrola</td><td></td><td></td> temperatury płyty <td>Służy do utrzymywania temperatury nośnika podczas pozyskiwania danych.</td></tr><tr><td>Custom Materials<</td><td>strong>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>LabView Program</td><td></td><td></td> Post-tracking <td>dostępny na życzenie od autorów</td></tr></tbody></table>

budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Inżynieria tkankowa ludzkiego serca może fundamentalnie wpłynąć na odkrycia terapeutyczne poprzez rozwój nowych systemów badań przesiewowych specyficznych dla gatunku, które replikują biowierność trójwymiarowego rodzimego ludzkiego mięśnia sercowego, jednocześnie umożliwiając kontrolowany poziom złożoności biologicznej i umożliwiając nieniszczące monitorowanie podłużne funkcji skurczu tkanek. Początkowo ludzkie zmodyfikowane tkanki serca (hECT) zostały stworzone przy użyciu całej populacji komórek uzyskanych z ukierunkowanego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które zwykle dawały mniej niż 50% kardiomiocytów. Jednak, aby stworzyć wiarygodne modele predykcyjne ludzkiego mięśnia sercowego i wyjaśnić mechanizmy interakcji heterokomórkowych, niezbędna jest dokładna kontrola składu biologicznego w zmodyfikowanych tkankach. 
Aby rozwiązać ten problem, wykorzystujemy sortowanie żywych komórek dla markera powierzchni serca SIRPα i markera fibroblastów CD90, aby stworzyć tkanki zawierające odpowiednio stosunek 3:1 tych typów komórek, które są następnie mieszane ze sobą i dodawane do roztworu macierzy na bazie kolagenu. Powstałe w ten sposób hECT są w pełni zdefiniowane zarówno pod względem składu macierzy komórkowej, jak i zewnątrzkomórkowej.
Tutaj opisujemy konstrukcję zdefiniowanych hECT jako modelowego systemu do zrozumienia mechanizmów interakcji komórka-komórka w terapiach komórkowych, na przykładzie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego (hMSC), które są obecnie używane w badaniach klinicznych na ludziach. Zdefiniowany skład tkankowy jest niezbędny, aby zrozumieć, w jaki sposób hMSC mogą wchodzić w interakcje z endogennymi typami komórek serca w celu poprawy funkcji tkanek. Opisano również system bioreaktorów, który jednocześnie hoduje sześć hECT równolegle, co pozwala na bardziej efektywne wykorzystanie komórek po sortowaniu.

W celu uzyskania kardiomiocytów stosuje się nieco zmodyfikowaną wersję metod różnicowania Bohelera i Liana30,31. Konieczne jest, aby różnicowanie rozpoczęło się w fazie logarytmicznej wzrostu komórek, a jednocześnie, aby populacja wyjściowa była wystarczająco konfluentna, by po sortowaniu uzyskać użyteczną liczbę komórek (optymalnie około 75%). Zazwyczaj w przypadku hESC H7, wysiew w gęstości 140 000 hESC na dołek płytki 6-dołkowej w pożywce Essential 8 w inkubatorze z 5% CO2 utrzymywanym w 37 °C po...

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie inżynierowanych ludzkich tkanek serca o określonym składzie komórkowym. Metoda ta pozwala rozwiązać kluczowe problemy w dziedzinie inżynierii tkankowej serca, w tym kontrolę zmienności i wydajności różnicowania kardiologicznego oraz zrozumienie, w jaki sposób konkretne typy komórek wpływają na funkcję kurczliwą serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że wynikiem końcowym jest inżynierowana ludzka tkanka serca o kontrolowanym i zdefiniowanym składzie.Powtórzenia tej techniki znajdują zastosowanie w terapii chorób serca, ponieważ zdefiniowane tkanki mogą stanowić nowatorską, biologicznie istotną platformę do badań biomedycznych, zdolną do oceny interwencji terapeutycznych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat nowych środków terapeutycznych w kardiologii, ludzki system inżynieryjnych tkanek serca może być również wykorzystany do zrozumienia mechanizmów terapii komórkowej serca. Rozpoczynając od kultur kardiomiocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, należy jednokrotnie przemyć komórki roztworem PBS i dodać 1 mL 0,04% trypsyny-EDTA.Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37°C i 5% CO2. Podczas inkubacji komórek dodać 12 µL inhibitora ROCK do 6 mL roztworu neutralizującego trypsynę. Wyjąć płytki z inkubatora i dodać 1 mL roztworu neutralizującego do każdego dołka płytki sześciodołkowej.Przenieść wszystkie komórki z każdej studzienki do jednej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przemyć wszystkie sześć studnieniek jedną dawką 3 ml PBS i połączyć ten płuczący roztwór z komórkami w probówce. Wirować probówkę z prędkością 300 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy.Aby przygotować komórki do sortowania żywych komórek metodą FACS, należy przygotować bufor barwiący, dodając 5 ml FBS oraz 50 µL inhibitora ROCK do 45 ml PBS w lodzie. Usunąć nadsącz z osadu komórkowego i resuspender komórki w 1,2 ml buforu barwiącego. Przenieść 200 µL zawiesiny komórkowej do nowej, schłodzonej wcześniej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w lodzie.Następnie przenieś pozostały 1 ml zawiesiny komórkowej do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do wirowania o pojemności 50 ml i umieść ją w lodzie, a następnie dodaj 2 µl przeciwciał SIRP alpha-PE/Cy7 oraz 4 µl przeciwciał CD90-FITC. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą pipety transferowej i pozostaw probówkę w lodzie. Inkubuj obie probówki o pojemności 50 ml zawierające kontrolę negatywną oraz próbkę na wytrząsarce kołyszącej w lodzie w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.Podczas inkubacji komórek przenieś trzy mililitry medium do różnicowania dwa do każdej z dwóch probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Następnie dodaj trzy mikrolitry inhibitora ROCK i przechowuj te probówki do zbierania próbek FACS w lodzie do momentu użycia. Następnie odwiruj zbarwione komórki z prędkością 300 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przemyć je dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS. Ostrożnie resuspender osad próbki w 1–3 ml buforu barwiącego zawierającego DAPI. Do osadu kontroli negatywnej dodać 500 µl buforu barwiącego bez DAPI.Przesącz obie zawiesiny komórkowe przez sito komórkowe o oczkach 40 µm, aby usunąć agregaty komórek, a następnie przenieś je do polistyrenowych probówek do FACS, utrzymując je w lodzie. Niezwłocznie dostarcz próbki do sortera komórkowego. Rozpocznij od próbki kontrolnej barwienia negatywnego, aby ustalić parametry bramkowania.Następnie, podczas analizy komórek próbnych, należy wyselekcjonować populację żywych komórek negatywnych pod względem DAPI. Niezależnie od siebie należy zebrać populacje komórek pozytywnych pod względem FITC oraz PE/Cy7 przy ciśnieniu 20 PSI. Po hodowli i ponownej agregacji komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy wyjąć płytki do hodowli komórek z inkubatora i przenieść medium do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Przemyj płytki trzema mililitrami PBS i przenieś płuczkę do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj do płytek trzy mililitry 0,04% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po pięciu minutach sprawdź pod mikroskopem, czy komórki oddzieliły się od powierzchni płytek.Po odklejeniu wszystkich komórek do płytek należy dodać trzy mililitry roztworu neutralizującego trypsynę. Delikatnie wymieszać i przenieść komórki do oryginalnej probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Płytki należy przemyć pięcioma mililitrami PBS, a otrzymany roztwór do płukania również dodać do probówki.Odwirować komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz i resuspender osad w jednym mililitrze surowicy z noworodków bydła lub pożywki NBS. Następnie przenieść komórki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Odwiruj komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usuń nadsącz. Aby rozpocząć tworzenie sześciu inżynierowanych tkanek serca, rozcieńcz 60,0 µL zapasu kolagenu o stężeniu 5 mg/mL do stężenia 3,125 mg/mL, dodając 1,5 µL 1 M wodorotlenku sodu, 9,6 µL 10X PBS oraz 24,9 µL sterylnej ultraczystej wody. Na tym etapie kluczowe jest unikanie wprowadzania pęcherzyków powietrza do mieszaniny kolagenu, ponieważ pęcherzyki te powoli uwalniają się z lepki roztworu i mogą zakłócać formowanie tkanek podczas procesu ich zagęszczania.Pipetując po ściance probówki o pojemności 15 ml, dodaj po 12,0 µL 10X MEM oraz 0,2 normalnego HEPES o pH 9 w celu rozcieńczenia mieszaniny kolagenu. Następnie dodaj macierz błony podstawnej do mieszaniny kolagenu do końcowego stężenia 0,9 mg/ml i delikatnie wymieszaj. Przechowuj tak przygotowaną końcową mieszaninę tkankową w lodzie.Następnie przenieś całą mieszaninę tkanek do osadu komórkowego i dodaj dodatkowe komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dopełnij probówkę do objętości końcowej 150 µL pożywką NBS bez komórek i delikatnie wymieszaj. Ostrożnie pipetuj 25 µL zawiesiny komórkowej do każdego z sześciu dołków w płytce bazowej bioreaktora.Powtarzaj procedurę mieszania pomiędzy poszczególnymi dołkami, aby ponownie zawiesić komórki, które mogły opaść na dno. Pipetuj tylko jedną próbkę tkanki do każdego dołka naraz, aby zapewnić spójną objętość i liczbę komórek na tkankę. Osobno wsuń dwa rzędy czujników siły z polidimetylosiloksanu (PDMS) po obu stronach ramki z polisulfonu, tworząc sześć par przeciwległych słupków.Odwróć ramkę na płytce podstawowej w taki sposób, aby jedna para wsporników trafiła do każdego dołka zawierającego zawiesinę komórek. Następnie umieść bioreaktor w szalce o średnicy 60 mm, a szalkę tę (bez przykrycia) włóż do szalki o średnicy 10 cm. Nałóż pokrywkę na szalkę 10-centymetrową i przenieś cały zestaw bioreaktora do inkubatora do hodowli tkanek.Po dwóch godzinach inkubacji należy wyjąć zespół bioreaktora i dodać 14 mililitrów pożywki NBS, aby zakryć płytkę podstawową. Bioreaktor należy zwrócić do inkubatora do hodowli komórkowych i codziennie wymieniać połowę pożywki. Po 48 godzinach płytkę podstawową należy delikatnie usunąć, przesuwając ją o kilka milimetrów naraz.Następnie należy ponownie umieścić bioreaktor w medium, tak aby tkanka była skierowana w dół. Jeśli podczas zdejmowania płytki podstawowej tkanka odpadnie z podpory, należy ją delikatnie przymocować z powrotem. Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do powstania mieszanej hodowli, składającej się głównie z kardiomiocytów i fibroblastów, które samoorganizują się w klastry i tworzą silnie bijące sieci w całej płytce.Sortowanie FACS tych kultur wykazało, że ta metoda różnicowania prowadzi do uzyskania populacji zawierającej co najmniej 65% komórek pozytywnych pod kątem SIRP alpha oraz 10% komórek pozytywnych pod kątem CD90. Po usunięciu płytki podstawowej inżynieryjne tkanki serca człowieka, lub HECTs, ulegają samoorganizacji wewnątrz bioreaktora. Dojrzałe i skompaktowane HECTs widocznie odchylają zintegrowane słupki czujników siły, wywierając średnią siłę od 5 do 15 mikroniutonów.Pomiary siły skurczu pojedynczego wykazują, w jaki sposób izolowane zmienne zmieniają siłę skurczową w tych zdefiniowanych tkankach inżynieryjnych. W tym przypadku, gdy tkanki są uzupełnione o 10% ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, obserwuje się znaczny wzrost siły skurczowej zarówno przy częstotliwości stymulacji 1 Hz, jak i 2 Hz. Po opanowaniu metody, różnicowanie zajmie około 20 dni, sortowanie komórek około pięciu godzin, a konstrukcja tkanki około trzech godzin.Kolejne siedem dni będzie wymaganych do prawidłowego uformowania się tkanki po konstrukcji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, w tym znakowanie komórek oraz suplementację mieszanki tkankowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu specyficznych interakcji międzykomórkowych lub ustalić mechanizmy terapii komórkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak tworzyć inżynierowane tkanki serca człowieka o znanym i kontrolowanym składzie komórkowym.

construction-defined-human-engineered-cardiac-tissues-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Tutaj pokazujemy generowanie ludzkiej tkanki serca z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów. Przedstawiono metodę analizy siły skurczu oraz przykładową zmianę wzorca skurczu przez inhibitor kanału hERG E-4031. Metoda ta wykazuje wysoki poziom odporności i przydatności do badań przesiewowych leków sercowych.

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ten protokół ma na celu wytworzenie sferoid 3D serca (CS) poprzez kokulturację komórek w wiszących kroplach. CS z kolagenem są leczone doksorubicyną (DOX, środek kardiotoksyczny) w stężeniach fizjologicznych w celu modelowania niewydolności serca. Badania in vitro z wykorzystaniem CS poddanych działaniu DOX mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych terapii dla pacjentów z niewydolnością serca.

Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę tworzenia zdefiniowanych tkankowych struktur serca z wykorzystaniem sortowania komórek i bioreaktora wielotkankowego. Ta technika pozwala badać mechanizmy terapii komórkowej serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Przeglądaj więcej filmów