Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie ludzkich zmodyfikowanych tkanek serca o określonym składzie komórkowym. Metoda ta może rozwiązać kluczowe wyzwania w dziedzinie inżynierii tkanek serca, w tym kontrolować zmienność i skuteczność różnicowania serca oraz zrozumieć, w jaki sposób określone typy komórek wpływają na funkcję skurczową serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że efektem końcowym jest ludzka zmodyfikowana tkanka serca o kontrolowanym i określonym składzie.

Replikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób serca, ponieważ zdefiniowane tkanki mogą stanowić nową, biologicznie istotną i biomedyczną platformę przesiewową, zdolną do oceny interwencji terapeutycznych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat nowych terapii kardiologicznych, system tkanki serca zaprojektowany przez człowieka może być również wykorzystany do zrozumienia mechanizmów terapii komórkami serca. Zaczynając od hodowli kardiomiocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, umyj komórki jeden raz PBS i dodaj jeden mililitr 0,04% trypsyny-EDTA.

Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Kiedy komórki inkubują, dodaj 12 mikrolitrów inhibitora ROCK do sześciu mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę. Wyjąć płytki z inkubatora i dodać jeden mililitr roztworu neutralizującego do każdego dołka płytki sześciodołkowej.

Przenieś wszystkie komórki z każdej studzienki do jednej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj wszystkie sześć studzienek jedną trzymililitrową objętością PBS i połącz to płukanie z komórkami w probówce. Odwirować probówkę o temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać komórki.

Aby przygotować komórki do sortowania żywych komórek za pomocą FACS, należy przygotować bufor barwiący, dodając pięć mililitrów FBS i 50 mikrolitrów inhibitora ROCK do 45 mililitrów PBS na lodzie. Usunąć supernatant z granulowanych komórek i ponownie zawiesić je w 1,2 mililitra buforu barwiącego. Przenieś 200 mikrolitrów zawieszonych komórek do nowej, wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie.

Następnie przenieś pozostały jeden mililitr zawiesiny komórkowej do nowej, wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie i dodaj dwa mikrolitry SIRP alfa-PE/Cy7 i cztery mikrolitry przeciwciał CD90-FITC. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety transferowej i umieścić probówkę na lodzie. Inkubować dwie 50-mililitrowe probówki zawierające kontrolę ujemną i próbkę na wytrząsarce kołyskowej na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji komórek przenieś trzy mililitry pożywki różnicującej po dwa do każdej z dwóch 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie dodaj trzy mikrolitry inhibitora ROCK i przechowuj te probówki do pobierania FACS na lodzie przed użyciem. Następnie opluwaj wybarwione komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

I umyj je dwukrotnie 10 mililitrami lodowatego PBS. Delikatnie zawiesić osad próbki z jednym do trzech mililitrów buforu barwiącego zawierającego DAPI. Dodać 500 mikrolitrów buforu barwiącego bez DAPI do osadu kontroli ujemnej.

Przefiltruj obie zawiesiny komórek przez sitko o średnicy 40 mikronów, aby usunąć grudki komórek, a następnie przenieś je do probówek polistyrenowych FACS na lodzie. Natychmiast przynieś próbki do sortownika komórek. Zaczynając od ujemnej próbki kontrolnej barwienia, ustalić parametry bramkowania.

Następnie, podczas uruchamiania komórek próbki, wybierz dla populacji żywych komórek ujemnych DAPI. Zebrać niezależnie zarówno populacje komórek FITC dodatnich, jak i PE / Cy7 przy 20 PSI. Po wyhodowaniu i ponownej agregacji komórek, jak wskazano w protokole tekstowym, należy wyjąć płytki z kultur komórkowych z inkubatora i przenieść pożywkę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Umyj płytki trzema mililitrami PBS i przenieś popłuczynę do tej samej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj trzy mililitry 0,04% trypsyny-EDTA do płytek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po pięciu minutach zbadaj płytki pod kątem oderwania komórek za pomocą mikroskopu.

Gdy wszystkie komórki się odłączą, dodaj trzy mililitry roztworu neutralizującego trypsynę do płytek. Delikatnie wymieszaj i przenieś komórki do oryginalnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj płytki pięcioma mililitrami PBS i dodaj ten płyn również do probówki.

Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze surowicy bydlęcej noworodków lub pożywce NBS. Następnie przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Osadzać komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Aby rozpocząć generowanie sześciu zmodyfikowanych tkanek serca, rozcieńczyć 60,0 mikrolitrów z pięciu miligramów na mililitr kolagenu do 3,125 miligramów na mililitr z 1,5 mikrolitra jednego molowego wodorotlenku sodu, 9,6 mikrolitra 10X PBS i 24,9 mikrolitrów sterylnej ultra czystej wody. W tym przypadku bardzo ważne jest, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do mieszanki kolagenowej, ponieważ pęcherzyki powietrza powoli uwalniają się z lepkiego roztworu i mogą zakłócać tworzenie się tkanek podczas zagęszczania tkanek.

Odpipetuj bok 15-mililitrowej probówki, aby dodać po 12,0 mikrolitrów 10X MEM i 0,2 normalnych stert o pH 9, aby rozcieńczyć mieszaninę kolagenu. Następnie dodaj macierz błony podstawnej do mieszaniny kolagenu do końcowego stężenia 0,9 miligrama na mililitr i delikatnie wymieszaj. Przechowuj tę końcową mieszankę tkanek na lodzie.

Następnie przenieś całą mieszaninę tkanek do osadu komórkowego i dodaj dodatkowe komórki, jak wskazano w protokole tekstowym. Napełnij probówkę do końcowej objętości 150 mikrolitrów bezkomórkowymi pożywkami NBS i delikatnie wymieszaj. Ostrożnie odpipetować 25 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z sześciu studzienek w płycie podstawy bioreaktora.

Powtórz procedurę mieszania między każdym studzienką, aby ponownie zawiesić wszelkie komórki, które mogły się osadzić. Pipetuj tylko jedną tkankę na dołek na raz, aby zapewnić stałą objętość i liczbę komórek w tkance. Oddzielnie wepchnij dwa rzędy czujników siły polidimetylosiloksanu lub PDMS po obu stronach ramy polisulfonowej, aby utworzyć sześć par przeciwległych słupków.

Odwróć ramę na górze płyty podstawy tak, aby jedna para słupków weszła do każdej studzienki zawierającej zawiesinę komórek. Następnie umieść bioreaktor w 60-milimetrowej czaszy i umieść tę naczynie bez pokrywy w 10-centymetrowej czaszyce. Umieść pokrywkę na 10-centymetrowej czaszy i przenieś cały zespół bioreaktora do inkubatora do hodowli tkankowych.

Po dwóch godzinach inkubacji wyjmij zespół bioreaktora i dodaj 14 mililitrów pożywki NBS, aby przykryć płytę podstawy. Umieść bioreaktor z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych i codziennie zmieniaj połowę pożywki. Po 48 godzinach delikatnie zdejmij płytkę podstawy po kilka milimetrów na raz.

Następnie zwróć bioreaktor z tkanką skierowaną w dół do podłoża. Jeśli chusteczka spadnie ze słupka podczas zdejmowania płyty podstawy, delikatnie przymocuj ją ponownie do słupka. Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do powstania mieszanej kultury składającej się głównie z kardiomiocytów i fibroblastów, które samoorganizują się w klastry i tworzą silnie bijące się sieci na całej naczyniu.

Sortowanie tych kultur metodą FACS wykazało, że ta metoda różnicowania daje w wyniku populację zawierającą co najmniej 65% komórek alfa-dodatnich SIRP i 10% komórek dodatnich CD90. Po zdjęciu płytki podstawy, zmodyfikowane przez człowieka tkanki serca (HECT) mogą się samoorganizować w bioreaktorze. Dojrzałe i zwarte HECT widocznie odchylają zintegrowane słupki czujnika siły ze średnią siłą od pięciu do 15 mikroniutonów.

Pomiary siły drgającej ujawniają, w jaki sposób izolowane zmienne zmieniają siłę skurczu w tych zdefiniowanych zmodyfikowanych tkankach. W tym przypadku, gdy tkanki są uzupełnione 10% ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, obserwuje się znaczne zwiększenie siły skurczu zarówno przy częstotliwościach stymulacji jednohercowej, jak i dwuhercowej. Po opanowaniu różnicowanie zajmie około 20 dni, sortowanie komórek około pięciu godzin, a budowa tkanki około trzech godzin.

Kolejne siedem dni będzie potrzebne do prawidłowego powstania tkanki po budowie. Po tej procedurze można wykonać inne metody, w tym znakowanie komórek i suplementację mieszanki tkankowej, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące efektów określonych interakcji komórka-komórka lub określenia mechanizmów terapii komórkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć ludzkie zmodyfikowane tkanki serca o znanym i kontrolowanym składzie komórkowym.