Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie inżynierowanych ludzkich tkanek serca o określonym składzie komórkowym. Metoda ta pozwala rozwiązać kluczowe problemy w dziedzinie inżynierii tkankowej serca, w tym kontrolę zmienności i wydajności różnicowania kardiologicznego oraz zrozumienie, w jaki sposób konkretne typy komórek wpływają na funkcję kurczliwą serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że wynikiem końcowym jest inżynierowana ludzka tkanka serca o kontrolowanym i zdefiniowanym składzie.

Powtórzenia tej techniki znajdują zastosowanie w terapii chorób serca, ponieważ zdefiniowane tkanki mogą stanowić nowatorską, biologicznie istotną platformę do badań biomedycznych, zdolną do oceny interwencji terapeutycznych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat nowych środków terapeutycznych w kardiologii, ludzki system inżynieryjnych tkanek serca może być również wykorzystany do zrozumienia mechanizmów terapii komórkowej serca. Rozpoczynając od kultur kardiomiocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, należy jednokrotnie przemyć komórki roztworem PBS i dodać 1 mL 0,04% trypsyny-EDTA.

Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37°C i 5% CO2. Podczas inkubacji komórek dodać 12 µL inhibitora ROCK do 6 mL roztworu neutralizującego trypsynę. Wyjąć płytki z inkubatora i dodać 1 mL roztworu neutralizującego do każdego dołka płytki sześciodołkowej.

Przenieść wszystkie komórki z każdej studzienki do jednej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przemyć wszystkie sześć studnieniek jedną dawką 3 ml PBS i połączyć ten płuczący roztwór z komórkami w probówce. Wirować probówkę z prędkością 300 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy.

Aby przygotować komórki do sortowania żywych komórek metodą FACS, należy przygotować bufor barwiący, dodając 5 ml FBS oraz 50 µL inhibitora ROCK do 45 ml PBS w lodzie. Usunąć nadsącz z osadu komórkowego i resuspender komórki w 1,2 ml buforu barwiącego. Przenieść 200 µL zawiesiny komórkowej do nowej, schłodzonej wcześniej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w lodzie.

Następnie przenieś pozostały 1 ml zawiesiny komórkowej do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do wirowania o pojemności 50 ml i umieść ją w lodzie, a następnie dodaj 2 µl przeciwciał SIRP alpha-PE/Cy7 oraz 4 µl przeciwciał CD90-FITC. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą pipety transferowej i pozostaw probówkę w lodzie. Inkubuj obie probówki o pojemności 50 ml zawierające kontrolę negatywną oraz próbkę na wytrząsarce kołyszącej w lodzie w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji komórek przenieś trzy mililitry medium do różnicowania dwa do każdej z dwóch probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Następnie dodaj trzy mikrolitry inhibitora ROCK i przechowuj te probówki do zbierania próbek FACS w lodzie do momentu użycia. Następnie odwiruj zbarwione komórki z prędkością 300 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przemyć je dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS. Ostrożnie resuspender osad próbki w 1–3 ml buforu barwiącego zawierającego DAPI. Do osadu kontroli negatywnej dodać 500 µl buforu barwiącego bez DAPI.

Przesącz obie zawiesiny komórkowe przez sito komórkowe o oczkach 40 µm, aby usunąć agregaty komórek, a następnie przenieś je do polistyrenowych probówek do FACS, utrzymując je w lodzie. Niezwłocznie dostarcz próbki do sortera komórkowego. Rozpocznij od próbki kontrolnej barwienia negatywnego, aby ustalić parametry bramkowania.

Następnie, podczas analizy komórek próbnych, należy wyselekcjonować populację żywych komórek negatywnych pod względem DAPI. Niezależnie od siebie należy zebrać populacje komórek pozytywnych pod względem FITC oraz PE/Cy7 przy ciśnieniu 20 PSI. Po hodowli i ponownej agregacji komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy wyjąć płytki do hodowli komórek z inkubatora i przenieść medium do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Przemyj płytki trzema mililitrami PBS i przenieś płuczkę do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj do płytek trzy mililitry 0,04% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po pięciu minutach sprawdź pod mikroskopem, czy komórki oddzieliły się od powierzchni płytek.

Po odklejeniu wszystkich komórek do płytek należy dodać trzy mililitry roztworu neutralizującego trypsynę. Delikatnie wymieszać i przenieść komórki do oryginalnej probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Płytki należy przemyć pięcioma mililitrami PBS, a otrzymany roztwór do płukania również dodać do probówki.

Odwirować komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz i resuspender osad w jednym mililitrze surowicy z noworodków bydła lub pożywki NBS. Następnie przenieść komórki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.

Odwiruj komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usuń nadsącz. Aby rozpocząć tworzenie sześciu inżynierowanych tkanek serca, rozcieńcz 60,0 µL zapasu kolagenu o stężeniu 5 mg/mL do stężenia 3,125 mg/mL, dodając 1,5 µL 1 M wodorotlenku sodu, 9,6 µL 10X PBS oraz 24,9 µL sterylnej ultraczystej wody. Na tym etapie kluczowe jest unikanie wprowadzania pęcherzyków powietrza do mieszaniny kolagenu, ponieważ pęcherzyki te powoli uwalniają się z lepki roztworu i mogą zakłócać formowanie tkanek podczas procesu ich zagęszczania.

Pipetując po ściance probówki o pojemności 15 ml, dodaj po 12,0 µL 10X MEM oraz 0,2 normalnego HEPES o pH 9 w celu rozcieńczenia mieszaniny kolagenu. Następnie dodaj macierz błony podstawnej do mieszaniny kolagenu do końcowego stężenia 0,9 mg/ml i delikatnie wymieszaj. Przechowuj tak przygotowaną końcową mieszaninę tkankową w lodzie.

Następnie przenieś całą mieszaninę tkanek do osadu komórkowego i dodaj dodatkowe komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dopełnij probówkę do objętości końcowej 150 µL pożywką NBS bez komórek i delikatnie wymieszaj. Ostrożnie pipetuj 25 µL zawiesiny komórkowej do każdego z sześciu dołków w płytce bazowej bioreaktora.

Powtarzaj procedurę mieszania pomiędzy poszczególnymi dołkami, aby ponownie zawiesić komórki, które mogły opaść na dno. Pipetuj tylko jedną próbkę tkanki do każdego dołka naraz, aby zapewnić spójną objętość i liczbę komórek na tkankę. Osobno wsuń dwa rzędy czujników siły z polidimetylosiloksanu (PDMS) po obu stronach ramki z polisulfonu, tworząc sześć par przeciwległych słupków.

Odwróć ramkę na płytce podstawowej w taki sposób, aby jedna para wsporników trafiła do każdego dołka zawierającego zawiesinę komórek. Następnie umieść bioreaktor w szalce o średnicy 60 mm, a szalkę tę (bez przykrycia) włóż do szalki o średnicy 10 cm. Nałóż pokrywkę na szalkę 10-centymetrową i przenieś cały zestaw bioreaktora do inkubatora do hodowli tkanek.

Po dwóch godzinach inkubacji należy wyjąć zespół bioreaktora i dodać 14 mililitrów pożywki NBS, aby zakryć płytkę podstawową. Bioreaktor należy zwrócić do inkubatora do hodowli komórkowych i codziennie wymieniać połowę pożywki. Po 48 godzinach płytkę podstawową należy delikatnie usunąć, przesuwając ją o kilka milimetrów naraz.

Następnie należy ponownie umieścić bioreaktor w medium, tak aby tkanka była skierowana w dół. Jeśli podczas zdejmowania płytki podstawowej tkanka odpadnie z podpory, należy ją delikatnie przymocować z powrotem. Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do powstania mieszanej hodowli, składającej się głównie z kardiomiocytów i fibroblastów, które samoorganizują się w klastry i tworzą silnie bijące sieci w całej płytce.

Sortowanie FACS tych kultur wykazało, że ta metoda różnicowania prowadzi do uzyskania populacji zawierającej co najmniej 65% komórek pozytywnych pod kątem SIRP alpha oraz 10% komórek pozytywnych pod kątem CD90. Po usunięciu płytki podstawowej inżynieryjne tkanki serca człowieka, lub HECTs, ulegają samoorganizacji wewnątrz bioreaktora. Dojrzałe i skompaktowane HECTs widocznie odchylają zintegrowane słupki czujników siły, wywierając średnią siłę od 5 do 15 mikroniutonów.

Pomiary siły skurczu pojedynczego wykazują, w jaki sposób izolowane zmienne zmieniają siłę skurczową w tych zdefiniowanych tkankach inżynieryjnych. W tym przypadku, gdy tkanki są uzupełnione o 10% ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, obserwuje się znaczny wzrost siły skurczowej zarówno przy częstotliwości stymulacji 1 Hz, jak i 2 Hz. Po opanowaniu metody, różnicowanie zajmie około 20 dni, sortowanie komórek około pięciu godzin, a konstrukcja tkanki około trzech godzin.

Kolejne siedem dni będzie wymaganych do prawidłowego uformowania się tkanki po konstrukcji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, w tym znakowanie komórek oraz suplementację mieszanki tkankowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu specyficznych interakcji międzykomórkowych lub ustalić mechanizmy terapii komórkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak tworzyć inżynierowane tkanki serca człowieka o znanym i kontrolowanym składzie komórkowym.