Name: Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji LC3 do oceny autofagii w komórkach trzustki. Technika ta pozwala badać wpływ gemcitabiny na aktywność autofagiczną w modelach nowotworowych i acinarnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Uniwersytetu w Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Narodowej Rady Badań Naukowych i Technologii (CONICET) (2021-2023 GI− 11220200101549CO; oraz PUE 22920170100033) oraz Narodowej Agencji Promocji Nauki i Technologii (PICT 2019-01664).

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Namoczyć okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w etanolu absolutnym, a następnie umieścić je pionowo w dołkach płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Zdjąć pokrywę i poddać płytkę wielodołkową działaniu promieniowania ultrafioletowego przez 15 min.</li>
	<li>Ułożyć szkiełka nakrywkowe poziomo i przemyć je pożywką Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Wysiać komórki trzustki o niskim numerze pasażu. Ilość należy dostosować tak, aby w dniu fiksacji uzyskać 50%-75% konfluencji16. 
	UWAGA: W celu fiksacji komórek po 3 dniach zaleca się wysiać 2,5 × 104 komórek PANC-1 lub 4 × 104 komórek AR42J na dołek.</li>
	<li>Kulturować komórki w pożywce DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze uwilgotnionej z 5% dwutlenku węgla (CO2). 
	​UWAGA: W przypadku komórek PANC-1 zaleca się inkubację komórek przez 2 dni pomiędzy wysianiem a kolejnymi etapami. Po tym czasie komórki można poddać transfekcji, traktowaniu lub fiksacji. Niniejszy protokół przedstawia traktowanie gemcytabiną nietransfekowanych komórek PANC-1 oraz różnicowanie i traktowanie PP242 nietransfekowanych komórek AR42J.</li>
</ol>
2. Traktowanie komórek
<ol>
	<li>Leczenie komórek PANC-1 gemcytabiną
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór gemcytabiny o stężeniu 1 µg/µL w DMEM 2 dni po wysianiu komórek. Do każdej studzienki dodać 2,6 µL roztworu gemcytabiny (1 µg/µL), aby uzyskać stężenie końcowe 20 µM.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 24 h w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie komórek AR42J i leczenie PP242
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór deksametazonu o stężeniu 4 µg/mL w DMEM.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 4,9 µL roztworu deksametazonu (4 µg/mL), aby uzyskać stężenie końcowe 100 nM.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 48 h w inkubatorze.</li>
		<li>Usunąć medium i do każdej studzienki dodać 0,5 µL PP242 o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 µM.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 2 h w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fixacja i permeabilizacja komórek
<ol>
	<li>Przygotować płytkę 24-dołkową z zimnym metanolem oraz płytkę 6-dołkową z zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Przechowywać je w lodzie.</li>
	<li>Każde szkiełko nakrywkowe wyjąć pęsetą, dwukrotnie przemyć w PBS, a następnie inkubować przez 6 min w metanolu.</li>
</ol>
4. Blokowanie komórek
<ol>
	<li>Przemyć każde szkiełko nakrywkowe dwukrotnie w PBS, a następnie inkubować przez 1 h w 10% płodowej surowicy bydlęcej w PBS (roztwór blokujący). 
	UWAGA: Na tym etapie procedurę można przerwać. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez noc w lodówce w roztworze blokującym, a protokół kontynuować następnego dnia.</li>
</ol>
5. Inkubacja szkiełek nakrywkowych z przeciwciałem pierwszorzędowym
<ol>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała anty-LC3 w stężeniu 1:1 000 w roztworze blokującym i przechowywać go w lodzie.</li>
	<li>Na pokrywie płytki wielodobowej położyć kawałek laboratoryjnej folii uszczelniającej.</li>
	<li>Na folię uszczelniającą nanieść jedną kroplę (25 µL) roztworu anty-LC3 na każde szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Za pomocą pęsety pobrać każde szkiełko nakrywkowe i położyć je na kropli przeciwciała pierwszorzędowego, dbając o to, aby strona z komórkami stykała się z roztworem.</li>
	<li>Przygotować komorę wilgotnościową, umieszczając wilgotny kawałek papieru w plastikowym pudełku o płaskim dnie.</li>
	<li>Umieścić płytkę wielodobową w komorze wilgotnościowej, przykryć ją folią i inkubować przez noc w lodówce.</li>
</ol>
6. Inkubacja szkiełek podstawowych z przeciwciałem wtórnym
<ol>
	<li>Wyjmij płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej i umieść szkiełka nakrywki z powrotem w płytce.</li>
	<li>Przeprowadź trzy płukania buforem PBS.</li>
	<li>Przygotuj roztwór znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała antykróliczego w rozcieńczeniu 1:800 w roztworze blokującym i przechowuj go w lodzie, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Na pokrywce płytki wielodołkowej połóż fragment folii uszczelniającej.</li>
	<li>Na folię uszczelniającą nanieś jedną kroplę (25 µL) roztworu przeciwciała antykróliczego na każde szkiełko nakrywki.</li>
	<li>Za pomocą pęsety weź każde szkiełko nakrywki i połóż je na kropli przeciwciała pierwszorzędowego, dbając o to, aby strona z komórkami stykała się z roztworem.</li>
	<li>Inkubuj płytkę wielodołkową w komorze wilgotnościowej przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
7. Barwienie komórek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)
<ol>
	<li>Wyjmij płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej i umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w płytce.</li>
	<li>Przeprowadź trzy płukania roztworem PBS.</li>
	<li>Przygotuj 300 nM roztwór DAPI w PBS (chroniąc go przed światłem).</li>
	<li>Inkubuj każde szkiełko nakrywkowe w roztworze DAPI przez 10 min.</li>
	<li>Przeprowadź trzy płukania roztworem PBS. Przechowuj płytkę wielodołkową w warunkach chroniących przed światłem.</li>
</ol>
8. Montaż
<ol>
	<li>Przygotuj dwa zlewki z wodą oraz arkusz papieru.</li>
	<li>Nanieś na szkiełko jedną kroplę (10 µL) roztworu adduktu alkoholu poliwinylowego-bis(trimetyloglinianu glinu)-1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (PVA-DABCO) na każde szkiełko nakrywkę. 
	UWAGA: PVA-DABCO przygotowuje się poprzez połączenie 0,25 M DABCO, 10% w/v PVA, 20% glicerolu oraz 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) w wodzie ultraczystej.</li>
	<li>Chwyć każdą nakrywkę pęsetą, przemyj ją w obu zlewkach z wodą, osusz za pomocą papieru, a następnie nałóż na kroplę PVA-DABCO (tak, aby komórki miały kontakt z roztworem).</li>
	<li>Pozostaw do wyschnięcia na noc, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
9. Obserwacja i akwizycja obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Poddać szkiełka nakrywki obrazowaniu za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego, używając obiektywu o powiększeniu około 63x17.</li>
	<li>Wykonąć reprezentatywne zdjęcia znakowanych komórek.</li>
</ol>
10. Kwantyfikacja kropek LC3
<ol>
	<li>Przeciągnij i upuść każdy plik obrazu zawierający zarejestrowane kanały, np. w formacie ".czi", na ekran programu ImageJ (FIJI), aby go otworzyć. Kliknij Ok w oknie dialogowym i zamknij okno Console.</li>
	<li>Z karty Image wybierz Color &gt; Split Channels.</li>
	<li>Zamknij obrazy odpowiadające kanałom innym niż obraz LC3.</li>
	<li>Z karty Image wybierz Adjust &gt; Color Balance</li>
	<li>Przesuń suwak Maximum w lewo, aż obraz zostanie nasycony, aby zwizualizować kontury komórek.</li>
	<li>Obrysuj komórkę za pomocą narzędzia Freehand Selection.</li>
	<li>Kliknij przycisk Reset, aby zresetować ustawienia kolorów.</li>
	<li>Z karty Edit wybierz Cut, aby wyciąć zaznaczony element.</li>
	<li>Zamknij obraz bez zapisywania go.</li>
	<li>Z karty Edit wybierz Paste.</li>
	<li>W menu Analyze wybierz narzędzie 3D Objects Counter.</li>
	<li>Ustaw próg (threshold). W przykładzie przedstawionym w niniejszym badaniu próg został ustawiony na 2,000.</li>
	<li>Ustaw filtr wielkości (size filter). W niniejszym badaniu został on ustawiony w przedziale od 50 do 500.</li>
	<li>Upewnij się, że pola Objects oraz Summary są zaznaczone.</li>
	<li>Kliknij Ok. Liczba kropek zostanie opisana jako Objects Detected w sekcji Summary.</li>
</ol>
<img alt="Schemat przebiegu analizy immunofluorescencji z opisem kroków i odczynników do znakowania przeciwciałami oraz analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury immunofluorescencji LC3. Schemat przedstawiający ogólny protokół immunofluorescencji LC3. Rysunek utworzony za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li>
<li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li>
<li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li>
<li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+interpret+LC3+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li>
<li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094(2021).</li>
<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li>
<li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li>
<li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411(2020).</li>
<li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li>
<li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels%2C+secretory+organelles%2C+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%284th+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1(2021).</li>
<li>Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSegeritz%2C+C-P+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).</li>
<li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62%2C+prevents+pancreatic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li>
<li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li>
<li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events%3A+Omegasomes+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484(2013).</li>
<li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+an+autophagosome+marker%2C+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy%3A+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li>
<li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+measuring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).</li>
<li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504(2021).</li>
<li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li>
<li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305(2020).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Metoda opisana w tym protokole pozwala na wizualizację endogennego rozkładu LC3 w komórce i ilościowe określenie poziomów autofagicznych w różnych warunkach. Inna podobna metoda stosowana do analizy rozkładu LC3 i określania aktywacji autofagii obejmuje transfekcję LC3 znakowaną fluorescencją (taką jak RFP-LC3)19. Transfekcja RFP-LC3 ma tę zaletę, że nie wymaga fiksacji (co pozwala na zastosowanie tej metody w obrazowaniu żywych komórek20), jest tańsza i nie zależy od reakt...

Makroautofagia (powszechnie nazywana autofagią) to wyspecjalizowany proces kataboliczny, który selektywnie degraduje składniki cytoplazmatyczne, w tym białka i uszkodzone organelle1,2. Autofagia pozwala komórkom fizjologicznie reagować na bodźce stresowe, a tym samym utrzymywać homeostazę komórkową3. Podczas autofagii tworzy się pęcherzyk z podwójną błoną: autofagosom. Autofagosom zawiera cząsteczki ładunku i kieruje je do lizosomu w celu degradacji1,4. 
Autofagosomy są ozdobione przez białko autofagiczne, białko związane z mikrotubulami, łańcuch lekki 3 (LC3)5. Gdy autofagia nie jest indukowana, LC3 jest dyfundowany w cytoplazmie i jądrze w konformacji LC3-I. Z drugiej strony, gdy indukowana jest autofagia, LC3 jest sprzężona z fosfatydyloetanoloaminą w błonie struktur autofagicznych6. Ta nowa konformacja LC3 jest znana jako LC3-II1. Przesunięcie konformacji LC3 powoduje zmiany w jego lokalizacji komórkowej i migracji elektroforezy w żelu dodecylowo-siarczanowo-poliakrylamidowym (SDS-PAGE), które można wykryć za pomocą technik takich jak immunofluorescencja i western blot5,7. W ten sposób koniugacja LC3 jest kluczowym wydarzeniem w procesie autofagicznym, które można wykorzystać do pomiaru aktywności autofagicznej.
Komórka groniasta trzustki jest wysoce zróżnicowaną komórką, która w zdrowych warunkach ma niski wskaźnik autofagii. Jednak w różnych warunkach fizjologicznych lub pod wpływem stymulacji farmakologicznej mogą aktywować autofagię. Dlatego określenie poziomów autofagicznych w tej linii komórkowej jest przydatne do badania potencjalnego bezpośredniego lub pośredniego wpływu różnych czynników farmakologicznych lub biologicznych na autofagię8,9.
Gruczolakorak przewodowy trzustki jest jednym z najbardziej śmiertelnych rodzajów raka, biorąc pod uwagę jego późną diagnozę i wysoką oporność na chemioterapię10. Komórki raka trzustki mają wysoką aktywność autofagii ze względu na regulację w górę transkrypcji i potranslacyjną aktywację białek związanych z autofagią11. Komórki raka trzustki mogą dostosowywać poziom autofagii w odpowiedzi na niekorzystne warunki, takie jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych lub uszkodzenia wywołane chemioterapią11. W związku z tym analiza poziomów autofagii w komórkach raka trzustki może pomóc zrozumieć, w jaki sposób przystosowują się one do różnych środowisk i ocenić skuteczność leczenia modulującego autofagię.
To badanie pokazuje metodę przeprowadzania immunofluorescencji LC3 w dwóch różnych modelach komórkowych trzustki. Pierwszy model, komórki PANC-1, posłużył jako model gruczolakoraka przewodowego trzustki. Komórki te leczono gemcytabiną, środkiem chemioterapeutycznym, który, jak wykazano wcześniej, indukuje autofagię, szczególnie w komórkach raka trzustki zawierających onkogenny gen wirusa mięsaka szczura Kirsten (KRAS)12,13. Drugi model, komórki AR42J, służył jako bardziej fizjologiczny model zewnątrzwydzielniczych komórek trzustki. Komórki te różnicowano deksametazonem, aby upodobnić się do groniastych komórek trzustki14. W tych komórkach autofagia została farmakologicznie wywołana za pomocą PP242, który jest silnym inhibitorem mTOR 15. W tym badaniu wykazujemy możliwość zastosowania protokołu opisanego za pomocą dwóch różnych modeli trzustki i jego zdolność do rozróżniania stanów niskiej i wysokiej autofagii.

<table><tbody><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe 12 mm</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 Well- Płytka do hodowli komórkowych</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Oślica anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu NATOCOR&nbsp;</td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>Gemcitabina</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Anedra</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" (laboratoryjna folia uszczelniająca)</td> <td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji lc3

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Autofagia to wyspecjalizowany proces kataboliczny, który selektywnie degraduje składniki cytoplazmatyczne, w tym białka i uszkodzone organelle. Autofagia pozwala komórkom fizjologicznie reagować na bodźce stresowe, a tym samym utrzymywać homeostazę komórkową. Komórki rakowe mogą modulować poziom autofagii, aby przystosować się do niekorzystnych warunków, takich jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych lub uszkodzenia spowodowane chemioterapią. Gruczolakorak przewodowy trzustki jest jednym z najbardziej śmiertelnych rodzajów raka. Komórki raka trzustki mają wysoką aktywność autofagii ze względu na regulację w górę transkrypcji i potranslacyjną aktywację białek autofagii.
Tutaj linia komórkowa PANC-1 została użyta jako model ludzkich komórek raka trzustki, a linia komórek groniastych trzustki AR42J została użyta jako model fizjologiczny wysoce zróżnicowanych komórek ssaków. W badaniu tym wykorzystano immunofluorescencję białka łańcucha lekkiego 3 związanego z mikrotubulami (LC3) jako wskaźnik stanu aktywacji autofagii. LC3 jest białkiem autofagii, które w warunkach podstawowych wykazuje rozproszony wzór dystrybucji w cytoplazmie (znany w tym stanie jako LC3-I). Indukcja autofagii wyzwala koniugację LC3 z fosfatydyloetanoloaminą na powierzchni nowo powstałych autofagosomów, tworząc LC3-II, białko związane z błoną, które pomaga w tworzeniu i rozszerzaniu autofagosomów. Aby określić ilościowo liczbę oznakowanych struktur autofagicznych, wykorzystano oprogramowanie open source FIJI za pomocą narzędzia "3D Objects Counter".
Pomiar poziomu autofagii zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w komórkach nowotworowych, pozwala nam badać modulację autofagii w różnych warunkach, takich jak niedotlenienie, chemioterapia lub knockdown niektórych białek.

Niniejszy protokół opisuje przeprowadzenie immunofluoroscencji LC3 w liniach komórkowych trzustki w celu określenia poziomu autofagii w różnych warunkach. Wynikiem tego eksperymentu było uzyskanie obrazów komórkowych z kanałów czerwonego i niebieskiego, odpowiadających odpowiednio LC3 i DAPI. Obrazy LC3 wskazują rozkład komórkowy tego białka, natomiast DAPI pokazuje lokalizację jąder komórkowych. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywny obraz immunofluoroscencji LC3 oraz obraz złożony z barwie...

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

Immunofluorescencja LC3 umożliwia określenie poziomu autofagii w komórkach trzustki. Pozwala to na badanie potencjalnego wpływu różnych czynników na autofagię komórek trzustki. Immunofluorescencja to technika stosowana do wykrywania endogennego białka LC3, która pozwala uniknąć problemów spowodowanych nadmierną ekspresją LC3, takich jak tworzenie agregatów białkowych niezwiązanych z autofagią.Procedurę zademonstrują Felipe Renna, doktorant oraz Malena Herrera Lopez, doktorantka z laboratorium Marii Ines Vaccaro. Aby rozpocząć przygotowanie komórek, namocz 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe w absolutnym etanolu. Po zdjęciu pokrywy umieść nasączone szkiełko nakrywkowe pionowo w płytce 24-dołkowej.Wystaw płytkę wielodołkową na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 15 minut. Następnie ustaw szkiełko nakrywkowe poziomo i umyj je DMEM. Teraz zobacz niską liczbę pasaży komórek trzustki, ponownie zawieszonych w DMEM, zawierających 10% FBS, penicyliny i streptomycyny, i inkubuj komórki przez dwa dni.Dwa dni po wysiewie komórek przygotować roztwór gemcytabiny w DMEM w stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr. Następnie odessać połowę objętości z każdej studzienki do osobnej

evaluating-autophagy-levels-two-different-pancreatic-cell-models

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

Poznaj metodę immunofluorescencji LC3 do oceny autofagii w komórkach trzustki. Technika ta pozwala badać wpływ gemcitabiny na aktywność autofagiczną w modelach nowotworowych i acinarnych.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Przeglądaj więcej filmów