Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Immunofluorescencja LC3 umożliwia określenie poziomu autofagii w komórkach trzustki. Pozwala to na badanie potencjalnego wpływu różnych czynników na autofagię komórek trzustki. Immunofluorescencja to technika stosowana do wykrywania endogennego białka LC3, która pozwala uniknąć problemów spowodowanych nadmierną ekspresją LC3, takich jak tworzenie agregatów białkowych niezwiązanych z autofagią.

Procedurę zademonstrują Felipe Renna, doktorant oraz Malena Herrera Lopez, doktorantka z laboratorium Marii Ines Vaccaro. Aby rozpocząć przygotowanie komórek, namocz 12-milimetrowe okrągłe szkiełka nakrywkowe w absolutnym etanolu. Po zdjęciu pokrywy umieść nasączone szkiełko nakrywkowe pionowo w płytce 24-dołkowej.

Wystaw płytkę wielodołkową na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 15 minut. Następnie ustaw szkiełko nakrywkowe poziomo i umyj je DMEM. Teraz zobacz niską liczbę pasaży komórek trzustki, ponownie zawieszonych w DMEM, zawierających 10% FBS, penicyliny i streptomycyny, i inkubuj komórki przez dwa dni.

Dwa dni po wysiewie komórek przygotować roztwór gemcytabiny w DMEM w stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr. Następnie odessać połowę objętości z każdej studzienki do osobnej probówki i dodać odpowiednią ilość roztworu gemcytabiny. Z powrotem do studzienek poddanych działaniu środka należy zwrócić połowę objętości odpowiadającą każdej studzience i inkubować komórki przez 24 godziny.

W celu utrwalenia i przepuszczalności komórek, dodaj zimny metanol do 24-dołkowej płytki zawierającej komórki. Przygotuj również sześciodołkową płytkę z zimnym PBS. Za pomocą igły strzykawkowej i pęsety weź każde szkiełko nakrywkowe i umyj je dwukrotnie w PBS.

Następnie inkubować w metanolu przez sześć minut. Po dwukrotnym przemyciu PBS inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze blokującym przez jedną godzinę. Dodać anty LC3 do roztworu blokującego w stosunku jeden do 1000 i utrzymywać na lodzie.

Umieść kawałek laboratoryjnej folii uszczelniającej na pokrywie z wieloma dołkami i dodaj 25 mikrolitrów roztworu anty-LC3 na szkiełko nakrywkowe na folię uszczelniającą. Za pomocą igły strzykawkowej i pęsety umieść każdy szkiełko nakrywkowe na kropli przeciwciała pierwotnego, upewniając się, że strona komórki styka się z roztworem. Umieść płytkę wielodołkową w komorze wilgotnościowej.

Przykryj folią i inkubuj przez noc w lodówce. Następnego dnia wyjmij płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej. Umieść szkiełka pokrywy z powrotem na płytce wielodołkowej i umyj je trzykrotnie PBS.

Rozcieńczyć znakowany fluorescencyjnie anty-królik w roztworze blokującym w stosunku jeden do 800 i trzymać na lodzie w ciemności. Po uszczelnieniu pokrywy wielodołkowej dodać 25 mikrolitrów roztworu anty-króliczego na szkiełko nakrywkowe na folię uszczelniającą. I potraktuj szkiełko nakrywkowe przeciwciałem drugorzędowym, jak wykazano wcześniej.

Następnie inkubować płytkę w komorze wilgotnościowej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji z przeciwciałem przemyć szkiełka nakrywkowe na płytce wielodołkowej trzykrotnie PBS. Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z przygotowanym roztworem DAPI przez 10 minut.

Po umyciu PBS utrzymuj płytkę wielodołkową w ciemności. Do montażu komórek przygotuj dwie zlewki z wodą i kawałkiem papieru. Dodać 10 mikrolitrów roztworu PVA-DABCO na szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.

Umyj szkiełko nakrywkowe w wodzie, a następnie wysusz je na papierze. Na koniec umieść go nad kroplą PVA-DABCO. I wysuszyć przez noc w ciemności.

Następnego dnia, za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego, zwizualizuj oznaczone komórki i uchwyć obrazy. Po przechwyceniu obrazów przeciągnij i upuść każdy plik obrazu zawierający przechwycone kanały na ekranie Fidżi. W oknie dialogowym kliknij przycisk OK, aby otworzyć obraz.

Następnie zamknij otwarte okno konsoli. Na karcie Obraz wybierz opcję Kolor, a następnie pozycję Podziel kanały. Zamknij obraz odpowiadający kanałom innym niż obraz PO3.

Następnie na karcie Obraz wybierz Dostosuj, a następnie Balans kolorów. Przesuń suwak maksimum w lewo, aż obraz zostanie nasycony, aby uwidocznić kontury komórek. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby narysować kontur komórki, a następnie kliknij przycisk resetuj, aby dostosować kolory.

Aby wyciąć zaznaczony element z karty Edycja, wybierz opcję Wytnij i zamknij obraz bez zapisywania go. Z karty Edytuj wybierz wklej. Z menu Analizuj wybierz narzędzie Licznik obiektów 3D.

Ustaw próg na 2000, a filtr rozmiaru na 50 do 500. Upewnij się, że obiekty i pola podsumowania są oznaczone, a następnie kliknij OK.In oknie dziennika, liczba kropek zostanie opisana jako wykryte obiekty. Immunofluorescencja wskazywała na komórkową dystrybucję białka LC3, podczas gdy DAPI wykazywała lokalizację jądrową w komórkach trzustki.

Kropki LC3 znacznie wzrosły pod wpływem leczenia gemcytabiną, co wskazuje na aktywność autofagiczną. Pod nadmiernym zbiegiem zewnątrzwydzielnicze komórki trzustki mają tendencję do gromadzenia się i wzrostu jedna na drugiej. Metoda wiązania komórek paraformaldehydu była nieskuteczna w zachowaniu białek LC3, ponieważ nie odzwierciedlała dokładnej dystrybucji.

Gdy utrwalenie lub leczenie zostało wykonane bez czekania dwóch dni po wysiewie, komórki PANC1 miały okrągły kształt. Ta morfologia zmniejszyła związek między cytoplazmą a jądrem, co utrudniało zrozumienie wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia LC3. Niepełne utrwalenie metanolu może zakłócać prawidłowe znakowanie immunologiczne LC3, prowadząc do niejasnych obrazów i nieoptymalnej kwantyfikacji.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że komórki muszą być utrwalone w zimnym metanolu przez sześć minut, zamiast w paraformaldehydzie. Po tej procedurze można przeanalizować kolokalizację między LC3 a innymi białkami, co pozwala na badanie różnych szlaków molekularnych związanych z funkcjami LC3.