Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazów ilościowych leczonych komórek nowotworowych prostaty, aby zmierzyć stopień i zakres autofagii w różnych punktach czasowych. Jest to realizowane poprzez wstępne potraktowanie komórek argininą, dase lub innymi odczynnikami eksperymentalnymi w celu indukcji autofagii i/lub śmierci komórkowej. Drugim krokiem jest podjęcie decyzji, czy obrazować żywe, czy utrwalone komórki, a następnie odpowiednie przygotowanie próbek.

Następnie należy uzyskać trójwymiarowe obrazy fluorescencyjne komórek żywych lub utrwalonych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną w polu szerokim, dekonwolucyjną lub z oświetleniem strukturalnym. Ostatnim krokiem jest zebranie danych statystycznych dotyczących rozkładu wielkości autofagosomów oraz ich kolokalizacji z innymi strukturami wewnątrzkomórkowymi. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do cyfrowej analizy obrazów 3D metoda ta pozwala uzyskać wyniki wykazujące nie tylko, że indukcja autofagii przez argininazę może prowadzić do śmierci komórek nowotworu prostaty, ale także, że komórki te wykazują zmiany strukturalne, które są morfologicznie odróżnialne od zmian związanych z apoptozą i nekrozą.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi obecnie istniejącymi metodami jest to, że ilościowe obrazowanie 3D pozwala określić czas i miejsce wystąpienia konkretnego zdarzenia molekularnego wewnątrz żywej komórki, a następnie przedstawić je w formacie trójwymiarowym. Aby rozpocząć, należy hodować ludzkie komórki raka prostaty wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego połączonego z lekkim łańcuchem 3 na 35 milimetrowych szalkach hodowlanych z dna szklanego pokrytego poli-D-lizyną, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Komórki powinny zostać wysiane z gęstością wystarczającą do umożliwienia szybkiej proliferacji, lecz nie tak dużą, aby do czasu obrazowania komórki nadmiernie narosły i utworzyły skupiska. Wybrane próbki komórek należy potraktować argininazą lub DI w PBS, aby usunąć z komórek wolną argininę i wywołać stres metaboliczny w komórkach nowotworowych. Około godzinę przed obrazowaniem należy rozcieńczyć 1,5 µL LysoTracker Red w 20 mL pożywki RPMI zawierającej 10% FBS i 1% antybiotyków. Dla wybranych próbek, które zostały potraktowane DI, należy przygotować odpowiednie roztwory po uprzednim ogrzaniu wszystkich mediów do 37 °C.

Do każdej szalki z hodowlą dodać odpowiednie medium i inkubować komórki w medium RPMI zawierającym LYO Tracker red przez 15 do 45 minut w temperaturze 37 °C, około 30 minut przed obrazowaniem. Włączyć komorę środowiskową stacji pogodowej i odczekać do osiągnięcia stanu równowagi przy 37 °C i 5% carbon dioxide; przemyć komórki PBS i zastąpić medium standardowym RPMI zawierającym tylko 10%FBS i 1%antibiotics. Do próbek dodać DI zgodnie z instrukcją.

Zamocuj naczynia hodowlane z dnem z pokrywki szkiełkowej o średnicy 35 milimetrów w specjalnym adapterze. Na obiektywie o powiększeniu 6DX i aperturze numerycznej 1,42 zastosuj olej immersyjny, a następnie umieść zamocowane naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu. W tym filmie zaprezentowano mikroskopię 3D z wykorzystaniem mikroskopu dekonwolucyjnego Delta Vision personal IDV applied position oraz powiązanego zestawu aplikacji SoftWorks.

W celu rozpoczęcia należy włączyć system mikroskopowy, w tym stację roboczą do akwizycji danych oraz kontroler urządzenia. Otwórz aplikację sterującą komputerem resolve 3D, aby zainicjować stół mikroskopu i włączyć ksenonowe źródło światła. Odczekaj 10 minut, aż źródło światła się rozgrzeje i osiągnie stabilne warunki.

Nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw o powiększeniu 60× i aperturze numerycznej 1,42, a następnie wycentruj preparat na szkiełku, ustawiając go szkiełkiem nakrywkowym do dołu nad obiektywem, korzystając z oświetlenia w polu jasnym lub zewnętrznego oraz pokrętła grubego ustawiania ostrości. Powoli obracaj pokrętło, podnosząc obiektyw, aż kropla olejku immersyjnego zetknie się z odwróconym szkiełkiem nakrywkowym. Od tego momentu warstwa komórek powinna stać się widoczna po kilku obrotach pokrętła mikrometrycznego.

Podczas pracy z utrwalonymi próbkami na szkiełkach zaleca się unikania komórek znajdujących się wewnątrz lub w pobliżu obszarów z pęcherzykami powietrza. Podczas obserwacji żywych próbek w naczyniu z szklanym dnem należy unikać przesuwania obiektywu poza obrys szklanej lamellki. Wybierz pożądane pole widzenia.

W idealnym przypadku komórki powinny wykazywać silny sygnał fluorescencyjny we wszystkich odpowiednich kanałach oraz być wystarczająco przytwierdzone i rozpostarte na powierzchni szkiełka nakrywkowe, aby zawartość wewnątrzkomórkowa była łatwa do wizualizacji. Niewielkie korekty w osiach X, Y i Z mogą być kontrolowane komputerowo za pomocą interfejsu acquire 3D. Ustaw binning na 1x1 lub 2x2, w zależności od pożądanego pola widzenia dla danego obrazu przekroju środkowego komórki, a parametry ekspozycji tak, aby maksymalna intensywność pikseli nie przekraczała 3000 counts.

Zazwyczaj procent transmisji powinien być ustawiony na jak najniższą wartość, tak aby nie zwiększyć odpowiadającego mu czasu ekspozycji. Czas powinien wynosić ponad jedną sekundę. Powtórz tę procedurę dla każdego koloru fluorescencji, który ma zostać zobrazowany, oraz dla każdego oddzielnego pola widzenia.

Aby uzyskać obrazy najwyższej jakości, należy ustawić górną i dolną granicę stosu Z, dostosowując ostrość odpowiednio nieco powyżej i poniżej próbki komórkowej. Całkowita liczba obrazów w danym stosie Z będzie zatem określona przez te granice oraz odstępy między warstwami. Aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas akwizycji obrazu, tryb akwizycji można ustawić na długość fali.

Następnie wykonuje się stos ZS dla próbek utrwalonych oraz stos ZS, a następnie zmianę długości fali dla próbek żywych. Po ustawieniu wszystkich parametrów można przystąpić do akwizycji obrazów fluorescencyjnych. Obrazy fluorescencyjne są następnie poddawane dekonwolucji przy użyciu oprogramowania soft works, a później analizowane za pomocą programu velocity.

Przedstawiona sekwencja obrazów ukazuje zmiany fizyczne zachodzące w komórkach cwr 22 podczas pierwszych 80 minut indukcji autofagii. Na obrazach biała przerywana linia wyznacza obrys komórki, a jasno zaznaczony obszar reprezentuje położenie jądra. W ciągu 80 minut obrazy ujawniają przemieszczenie jądra z centrum komórki, redukcję punktów adhezji ogniskowej oraz ogólną translokację autosomów i lizosomów w stronę centrum komórki, co w późniejszych punktach czasowych przedstawiono odpowiednio w kolorze zielonym i czerwonym.

Zaobserwowano również niewielki wzrost kolokalizacji między autosomami a lizosomami, co zostało wskazane kolorem żółtym. Następnie wykorzystano pakiet aplikacji do obrazowania cyfrowego Velocity w celu identyfikacji, przeliczenia i zebrania danych statystycznych dotyczących znakowanych autosomów i lizosomów na obrazach komórek CWR 22. Przedstawiono tutaj, że liczba i wielkość autosomów po ich początkowym utworzeniu i pojawieniu się zmieniają się w czasie.

Po 80 minutach indukcji autofagii nastąpił stopniowy spadek liczby autofagosomów, któremu towarzyszył wzrost ich średniego rozmiaru. Dodatkowo, na podstawie analizy współczynnika korelacji Pearsona, odnotowano mierzalny wzrost kolokalizacji autofagosomów i lizosomów. Wspólnie wyniki te sugerują, że po stymulacji autofagii liczne małe autofagosomy z czasem łączyły się, tworząc większe autofagosomy.

Przedstawiono tutaj porównanie obok siebie obrazów nabytych i zrekonstruowanych w trybie DV, symulowanej dekonwolucji szerokopolowej oraz trybie iluminacji strukturyzowanej. Dzięki zastosowaniu mikroskopu OMX rozdzielczość boczna została poprawiona do 120 nanometrów, co stanowi dwukrotność rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii ograniczonej dyfrakcją. Małoskalowa kolokalizacja autosomów i lizosomów była wyraźnie widoczna w mikroskopii superrozdzielczej, podczas gdy w konwencjonalnym obrazowaniu fluorescencyjnym była ona ledwo dostrzegalna.

Jedną z zalet stosowania mikroskopii dekonwolucyjnej jest możliwość rekonstrukcji wszystkich obrazów w model 3D, który ujawni dokładniejsze informacje przestrzenne dotyczące rozmieszczenia różnych cząsteczek. Przedstawiony tutaj ogólny obraz pojedynczej komórki Cwr 22 RV przechodzącej autofagię w późniejszym punkcie czasowym, w którym zaczyna występować znaczna kolokalizacja autosomów i lizosomów. Barwienie spójne, zaznaczone kolorem białym, ujawnia zarys komórki docelowej w tym filmie.

Model zrekonstruowany w 3D dostarcza więcej szczegółów przestrzennych dotyczących fuzji autosomów z lizosomami. Jak wskazano kolorem żółtym, interakcja między zielonymi sygnałami lekkiego łańcucha trzy a czerwonymi sygnałami lizosomów jest widoczna w postaci sygnałów scalonych, które tworzą kolor żółty. Zatem podejście to rozwiąże dwa główne problemy badaczy zajmujących się autofagią.

Przede wszystkim dążymy do utrzymania środowiska wolnego od stresu poprzez zastosowanie mikroprzepływów oraz komory perfuzyjnej, aby zachować pierwotny stan fizjologiczny na stołach mikroskopowych. Drugim wyzwaniem jest zgromadzenie statystycznie istotnych ilościowych danych obrazowych; w przypadku utrwalonych komórek zazwyczaj wykonujemy wiele zdjęć różnych komórek, a następnie kompilujemy je w użyteczne informacje. Jednak w przypadku żywych komórek śledzimy jedną komórkę w czasie, aby uzyskać równoważne informacje.

Wierzymy zatem, że technika ta umożliwi innym badaczom analizę funkcji i roli autofagii w różnych narządach oraz w przebiegu różnych chorób.