Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie ilościowych obrazów leczonych komórek nowotworu prostaty w celu zmierzenia stopnia i zakresu autofagii w różnych punktach czasowych. Osiąga się to poprzez najpierw potraktowanie komórek argininą, dazą lub innymi eksperymentalnymi odczynnikami w celu wywołania autofagii i/lub śmierci komórki. Drugim krokiem jest podjęcie decyzji, czy obrazować żywe komórki, czy komórki stałe, i odpowiednie przygotowanie próbek.

Następnie uzyskaj obrazy fluorescencyjne 3D żywych lub stałych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej, dekonwolucyjnej lub oświetlenia strukturalnego. Ostatnim krokiem jest zebranie danych statystycznych na temat rozkładu wielkości autofagosomów i kolokalizacji z innymi strukturami wewnątrzkomórkowymi. Korzystając z oprogramowania do cyfrowej analizy obrazów 3D, podejście to może uzyskać wyniki, które pokazują nie tylko indukcję fagów przez dazę argininy może powodować śmierć komórek nowotworu prostaty, ale także, że komórki te wykazują zmiany strukturalne, które są morfologicznie różne od zmian związanych z apoptozą i martwicą.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi obecnie istniejącymi metodami jest to, że ilościowe obrazowanie 3D może pokazać, kiedy i gdzie występuje określone zdarzenie molekularne zachodzące wewnątrz żywej komórki, a następnie przedstawić je w formacie trójwymiarowym Aby rozpocząć hodowlę ludzkich komórek raka prostaty wyrażających zielone białko fluorescencyjne, sprzężony łańcuch lekki trzy na 35 milimetrach powlekane poli de lycine szklane płytki hodowlane zgodnie z opisem w protokole tekstowym komórki powinny być posiane w wystarczającej gęstości, aby ułatwić szybką proliferację, ale nie na tyle, aby komórki były przerośnięte i zbite w czasie obrazowania. Potraktuj wybrane próbki komórek dazą argininową lub DI w PBS, aby zubożyć komórki w wolną argininę i wywołać stres metaboliczny w komórkach rakowych około godziny przed obrazowaniem, rozcieńczyć 1,5 mikrolitra czerwieni trackera Lyo z 20 mililitrami RPMI zawierającymi 10% FPS i 1% antybiotyków. Przygotuj roztwory z DI dla wybranych próbek, które zostały poddane obróbce po podgrzaniu wszystkich pożywek do 37 stopni Celsjusza.

Dodać odpowiednią pożywkę do każdej pożywki hodowlanej, inkubować komórki z RPMI zawierającym LYO Tracker czerwony przez 15 do 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, około 30 minut przed obrazowaniem. Włącz obudowę środowiskową stacji pogodowej i pozwól na równowagę do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, umyj komórki PBS i zastąp pożywkę standardowym RPMI zawierającym tylko 10% FBS i 1% antybiotyków. Dodaj DI do próbek, jak wskazano.

Zamontuj naczynia hodowlane ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów w niestandardowym adapterze. Użyj olejku immersyjnego na soczewce obiektywu o powiększeniu sześcioma DX, aperturze numerycznej 1,42 i umieść zamontowaną miskę hodowlaną na stoliku mikroskopu. W tym filmie pokazano mikroskopię 3D przy użyciu osobistej pozycji IDV, mikroskopu dekonwolucyjnego Delta vision i pakietu aplikacji Associated Soft Works.

Aby rozpocząć, włącz system mikroskopu, w tym stację roboczą akwizycji i kontroler instrumentu. Otwórz aplikację do sterowania komputerowego 3D w celu zainicjowania stolika mikroskopu i włącz ksenonowe źródło światła. Odczekaj 10 minut, aż źródło światła się rozgrzeje i osiągnie stabilne warunki.

Dodaj kroplę olejku immersyjnego na soczewkę obiektywową z sześcioma powiększeniami DX, aperturą numeryczną 1,42 i wyśrodkuj preparat szkiełkowy z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół nad soczewką obiektywu, używając jasnego pola lub oświetlenia zewnętrznego, a także zgrubnej ostrości. Pokrętło regulacji powoli podnieś soczewkę obiektywu, aż uderzenie olejku immersyjnego zetknie się z odwróconym szkłem nakrywkowym. Od tego momentu warstwa komórek powinna stać się ostra w ciągu kilku obrotów pokrętła precyzyjnej regulacji ostrości.

Podczas pracy z nieruchomymi próbkami na szkiełkach zaleca się unikanie komórek w obszarach z pęcherzykami lub w ich pobliżu. Podczas oglądania z żywymi próbkami na szklanym dnie naczynia należy unikać przesuwania soczewki obiektywu poza granicę szkiełka nakrywkowego. Wybierz żądane pole widzenia.

Idealnie byłoby, gdyby komórki wykazywały dobry sygnał fluorescencyjny we wszystkich odpowiednich kanałach oraz były wystarczająco przyczepione i rozłożone na powierzchni szkiełka nakrywkowego, tak aby zawartość wewnątrzkomórkowa była łatwa do wizualizacji. Niewielkie korekty bocznego ostrości X, Y i Z mogą być kontrolowane przez komputer za pomocą interfejsu akwizycji 3D. Ustaw wygięcie na jeden po jednym lub dwa po dwa w zależności od pożądanego pola widzenia dla danego obrazu przez środkową część komórki, ustaw parametry ekspozycji tak, aby maksymalna intensywność pikseli nie przekraczała 3000 zliczeń.

Ogólnie rzecz biorąc, procent transmisji powinien być ustawiony na jak najniższym poziomie, bez zwiększania odpowiedniej ekspozycji. Czas ponad jedną sekundę. Powtórz tę procedurę dla każdego koloru fluorescencji, który ma być zobrazowany, i dla każdego oddzielnego pola view.

Aby uzyskać obrazy najwyższej jakości, ustaw górną i dolną granicę Pocka, dostosowując ostrość odpowiednio nad górną i dolną częścią próbki komórki. Całkowita liczba obrazów w danym stosie Z będzie zatem określana przez te limity i odstępy między warstwami. Aby zminimalizować artefakty ruchu podczas akwizycji obrazu, tryb akwizycji obrazu można ustawić na długość fali.

Następnie stos ZS dla stałych próbek i stos ZS, a następnie długość fali dla żywych próbek. Po ustawieniu wszystkich parametrów można uzyskać obrazy fluorescencyjne. Obrazy fluorescencyjne są następnie degenerowane za pomocą miękkich prac, a następnie analizowane za pomocą prędkości.

Pokazana tutaj sekwencja obrazu pokazuje zmiany fizyczne, które zachodzą w komórkach cwr 22 w ciągu pierwszych 80 minut indukcji autofagii. Na tych obrazach biała przerywana linia reprezentuje kontur komórki, a jasny zacieniony obszar reprezentuje położenie jądra. W ciągu 80 minut obrazy ujawniają przemieszczenie jądra od środka komórki, zmniejszenie ogniskowych punktów adhezji i ogólną translokację autosomów i lizosomów w kierunku środka komórki, wyświetlane tutaj odpowiednio na zielono i czerwono w późniejszych punktach czasowych.

Zaobserwowano również niewielki wzrost kolokalizacji między autosomami a lizosomami, na co wskazuje kolor żółty. Pakiet aplikacji do obrazowania cyfrowego prędkości został następnie wykorzystany do identyfikacji, zliczania i gromadzenia danych statystycznych na temat znakowanych autosomów i lizosomów na obrazach komórek CWR 22. Pokazana tutaj liczba i rozmiar autosomów po ich początkowym utworzeniu w momencie pojawienia się zmieniają się w czasie.

Po 80 minutach indukcji autofagii nastąpił stopniowy spadek liczby autosomów przy jednoczesnym wzroście średniej wielkości autosomów. Ponadto nastąpił mierzalny wzrost kolokalizacji autosomów i lizosomów w oparciu o analizę współczynnika korelacji Pearsona. Łącznie odkrycia te sugerowały, że po stymulacji autofagii wiele małych autosomów z czasem przekształciło się w większe autosomy.

Poniżej przedstawiono porównanie obrazów uzyskanych i zrekonstruowanych w trybie DV, symulowanej dekonwolucji szerokokątnej i w trybie oświetlenia strukturalnego. Dzięki zastosowaniu mikroskopu OMX rozdzielczość boczna została poprawiona do 120 nanometrów, dwukrotnie większa niż w przypadku konwencjonalnej mikroskopii z ograniczoną dyfrakcją. Kolokalizacja autosomów i lizosomów na małą skalę była wyraźnie widoczna w mikroskopii superrozdzielczej, podczas gdy była prawie niewidoczna w przypadku konwencjonalnego obrazowania fluorescencyjnego.

Jedną z zalet korzystania z mikroskopii dekonwolucyjnej jest rekonstrukcja wszystkich obrazów w model 3D, który ujawni dokładniejsze informacje przestrzenne między różnymi cząsteczkami. Pokazano tutaj ogólny obraz jednej komórki Cwr 22 RV przechodzącej autofagię w późniejszym momencie, w którym zaczyna zachodzić znaczna kolokalizacja między autosomami a lizosomami. Spójne barwienie, jak wskazano na białym kolorze, ujawnia kontur komórki docelowej w tym filmie.

Zrekonstruowany model 3D dostarcza więcej szczegółów przestrzennych fuzji między autosomami i lizosomami. Jak wskazano w kolorze żółtym, interakcja między sygnałami z zielonego łańcucha świetlnego i czerwonymi sygnałami lizosomów jest widoczna w obecności połączonych sygnałów w celu wytworzenia koloru żółtego. Tak więc to podejście sprosta dwóm głównym wyzwaniom stojącym przed naukowcami zajmującymi się badaniami nad autofagią.

Przede wszystkim zależy nam na utrzymaniu bezstresowego środowiska poprzez zastosowanie mikropłynu, komory obfitościowej, aby utrzymać jej pierwotny stan fizjologiczny na stolikach mikroskopowych. Drugim wyzwaniem jest zebranie statystycznie istotnych ilościowych danych obrazowych, a w przypadku komórek stałych zwykle pobieramy wiele obrazów z różnych komórek i kompilujemy je w użyteczne informacje. Jednak w przypadku komórki życiowej po prostu śledzimy jedną komórkę w czasie, aby uzyskać równoważne informacje.

Wierzymy więc, że ta technika umożliwi innym badaczom zbadanie funkcji i roli autofagii w różnych narządach i różnych chorobach.