Name: Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj ilościową analizę autofagii w komórkach nowotworowych prostaty przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D. Ta metoda pozwala wizualizować dynamikę autofagosomów i lizosomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie grantowe: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (H.J. Kung), NIH CA150197S1 (C.A. Changou), NSF PHY-0120999 Center for Biophotonics Science & Technology (D.L. Wolfson, F.Y.S. Chuang), DOD PC073420 (R.J. Bold), The Research Council of Norway, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (B.S. Ahluwalia). H.J. Kung dziękuje również za wsparcie Auburn Community Cancer Endowment Fund. R.J. Bold również dziękuje za wsparcie J. McDonalda dar.
Dziękujemy dr Jenny Wei-Jen Kung i dr Bor-wen Wu z DesigneRx za hojne dostarczenie ADI.

1. Część 1: Hodowla komórkowa i znakowanie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Hoduj ludzkie komórki guza prostaty CWR22Rv1 na szklanych szkiełkach nakrywkowych (o grubości #1,5 lub 170 μm) umieszczonych na płytkach 6-dołkowych, z RPMI (Mediatech, VA) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny/glutaminy.</li>
	<li>Indukuj autofagię, traktując wybrane próbki deiminazą argininy (ADI, 0,3 μg / ml) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA, Fisher Scientific, NH) rozcieńczonego w PBS; 100 μl na szkiełko nakrywkowe, przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyj komórki 3x 1 ml HBS/BSA.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,05% saponiny (Sigma, MO) w HEPES (HBS)/BSA, 100 μl na szkiełko nakrywkowe, przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przed znakowaniem immunologicznym należy zablokować próbki z 2,5% kazeiną (Sigma, MO) w HBS/BSA, 100 μl na szkiełko nakrywkowe, przez 1 godzinę w temperaturze RT.</li>
	<li>Inkubować utrwalone komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 2,5% kazeinie/HBS/BSA, 100 μl na szkiełko nakrywkowe, O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyj komórki 3x 1 ml HBS/BSA.</li>
	<li>Inkubować utrwalone komórki z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 2,5% kazeinie/HBS/BSA, 100 μl na szkiełko nakrywkowe, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyj komórki 3x 1 ml HBS/BSA.</li>
	<li>Zamontuj przygotowane szkiełka nakrywkowe na zwykłych szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu SlowFade Gold lub Prolong Gold (Invitrogen, CA) zawierającego 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI).</li>
	<li>Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania, należy odczekać czas (najlepiej O/N), aby pożywka zapobiegająca blaknięciu dokładnie przeniknęła do komórek.</li>
	<li>Oczyścić powierzchnię szkiełka nakrywkowego metanolem i/lub chloroformem.</li>
	<li>Dodaj olejek immersyjny (współczynnik załamania światła 1,520 podczas obrazowania w temperaturze 37 °C lub 1,516 podczas obrazowania w temperaturze RT) do soczewki obiektywu 60X 1,42 N.A (Olympus, Japonia).</li>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość na interesujących komórkach.</li>
</ol>
2. Część 2: Przygotowanie komórek do obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Hoduj komórki CWR22Rv1 z ekspresją zielonego fluorescencyjnego łańcucha świetlnego sprzężonego z białkiem 3 (LC3-GFP) w pożywkach hodowlanych RPMI zawierających 10% FBS i 1% antybiotyków na 35-milimetrowych szalkach hodowlanych ze szklanym dnem pokrytych poli-d-lizyną (MatTek, MA). Komórki powinny być posiane z wystarczającą gęstością, aby ułatwić szybką proliferację, ale nie na tyle, aby komórki były przerośnięte i zlepione do czasu obrazowania.</li>
	<li>Potraktuj wybrane próbki komórek ADI (0,3 μg/ml) w PBS.</li>
	<li>Około 1 godzinę przed obrazowaniem rozcieńczyć 1,5 μl LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) w 20 ml RPMI. Zawierającym 10% FBS i 1% antybiotyków. Roztwory zawierające dopuszczalne dzienne spożycie należy stosować do wybranych próbek. Podgrzej wszystkie podłoża do temperatury 37 °C przed dodaniem do naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Inkubować komórki z RPMI zawierającym LysoTracker Red DND-99 przez 15-45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Na około 30 minut przed obrazowaniem włącz obudowę środowiskową WeatherStation i pozwól na wyrównanie do 37 °C i 5% CO2 (przy nawilżonym powietrzu).</li>
	<li>Umyj komórki PBS i zastąp pożywkę standardowym RPMI zawierającą tylko 10% FBS i 1% antybiotyków. Dodaj ADI do próbek zgodnie ze wskazaniami.</li>
	<li>Zamontuj 35-milimetrowe naczynia hodowlane ze szkłem nakrywkowym w niestandardowym adapterze (Applied Precision, Inc., WA) i umieść na stoliku mikroskopu. Użyj olejku immersyjnego (współczynnik załamania światła 1.520) na soczewce obiektywu 60X 1.42 NA i umieść zamontowaną miskę hodowlaną na scenie.</li>
</ol>
3. Część 3: Mikroskopia dekonwolucyjna i analiza
Protokół w tej sekcji zakłada użycie osobistego mikroskopu dekonwolucji DV DeltaVision i powiązanego pakietu aplikacji SoftWorX (Applied Precision, Inc., WA).
<ol>
	<li>Włącz system mikroskopu, w tym stację roboczą akwizycji i kontroler instrumentu. Otwórz aplikację Resolve3D, aby zainicjować stolik mikroskopu i włączyć ksenonowe źródło światła. Odczekaj 10 minut, aż źródło światła rozgrzeje się i osiągnie stabilne warunki.</li>
	<li>Dodać kroplę olejku immersyjnego (współczynnik załamania światła 1,520 dla żywych próbek w temperaturze 37 °C lub 1,516 dla próbek stałych w temperaturze pokojowej) na soczewkę obiektywu 60X 1,42 N.A i środkową próbkę szkiełkową (szkiełko nakrywkowe skierowane w dół) na soczewkę obiektywu.</li>
	<li>Korzystając z jasnego pola lub oświetlenia zewnętrznego i pokrętła regulacji zgrubnej ostrości, powoli podnieś soczewkę obiektywu, aż kropla olejku immersyjnego zetknie się z odwróconym szkłem nakrywkowym. (Od tego momentu warstwa komórek powinna stać się ostra w ciągu kilku obrotów od pokrętła precyzyjnej regulacji ostrości). Podczas pracy z nieruchomymi próbkami na szkiełkach zaleca się unikanie komórek w obszarach z pęcherzykami lub w ich pobliżu. Podczas oglądania z żywymi próbkami na naczyniu ze szklanym dnem należy unikać przesuwania soczewki obiektywu poza granicę szklanego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Autofagosomy można zidentyfikować za pomocą sygnału eGFP (zielony). Lizosomy są identyfikowane za pomocą LysoTracker Red (żywa próbka) lub przeciwciała fluorescencyjnego anty-Lamp1 (próbka utrwalona). Jądra komórkowe są identyfikowane przez barwienie DAPI (utrwalona próbka).</li>
	<li>Wybierz żądane pole widzenia. Idealnie byłoby, gdyby komórki wykazywały dobry sygnał fluorescencyjny we wszystkich odpowiednich kanałach oraz były wystarczająco przyczepione i rozłożone na powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby zawartość wewnątrzkomórkowa była łatwa do wizualizacji. Niewielkie korekty bocznego ogniskowania x, y i z mogą być kontrolowane przez komputer za pomocą interfejsu Acquire3D. Ustaw kategoryzację na 1x1 lub 2x2, w zależności od żądanego pola widzenia (więcej komórek można zobaczyć w polu, gdy kategoryzacja jest ustawiona na 2x2).</li>
	<li>Dla danego obrazu przez środkową część komórki należy ustawić parametry ekspozycji (np. % mocy transmisji i czas ekspozycji) tak, aby maksymalna intensywność pikseli nie przekraczała 3 000 zliczeń. Ogólnie rzecz biorąc, % transmisji powinno być ustawione na jak najniższym poziomie, bez zwiększania odpowiedniego czasu ekspozycji o ponad 1 sekundę. Powtórz tę procedurę dla każdego koloru fluorescencji, który ma być zobrazowany, oraz dla każdego oddzielnego pola widzenia, aby uzyskać obrazy najwyższej jakości.</li>
	<li>Ustaw górne i dolne granice stosu Z, nieznacznie regulując ostrość odpowiednio nad górną i dolną częścią próbki komórki. Całkowita liczba obrazów w danym stosie Z będzie więc określana przez te limity oraz przez odstępy między warstwami (wartość domyślna: 0,2 μm).</li>
	<li>Aby zminimalizować artefakty ruchu podczas akwizycji obrazu, zalecamy ustawienie trybu akwizycji obrazu na "długość fali, a następnie stos z" dla stałych próbek i "z-stos, a następnie długość fali" dla próbek na żywo.</li>
	<li>Obrazy fluorescencyjne są dekonwolucjonizowane za pomocą SoftWorX (Applied Precision, WA), a następnie analizowane za pomocą VoloCITY (Improvision, obecnie Perkin Elmer, MA).</li>
</ol>
4. Część 4: Mikroskopia z oświetleniem strukturalnym (OMX) o wysokiej rozdzielczości
Protokół w tej sekcji dotyczy korzystania z mikroskopu oświetlenia strukturalnego OMX (Applied Precision, WA).
<ol>
	<li>Włącz główne zasilanie i żądane lasery (410 nm, 488 nm i/lub 532 nm). Odczekaj 20 minut, aż lasery zostaną ustabilizowane termicznie.</li>
	<li>Dodaj olejek immersyjny (współczynnik załamania światła 1,516 dla próbek stałych przy RT) na soczewkę obiektywu 60X 1,42 NA. Jeśli w kropli oleju widoczne są bąbelki, wyczyść obiektyw i ponownie dodaj olej.</li>
	<li>Umieścić szkiełko z próbką na stoliku i w razie potrzeby odczekać 10 minut, aż komórki osiądą na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Zainicjuj program akwizycyjny. Użyj oświetlenia fluorescencyjnego, aby wyregulować ostrość, aż będzie widoczny ostry kontur komórki. (Należy zachować ostrożność przez cały czas, aby zminimalizować narażenie komórek na wzbudzenie fluorescencyjne, aż do faktycznego uzyskania obrazu).</li>
	<li>Skan mozaiki spiralnej można uzyskać, aby wyświetlić podgląd większych obszarów próbki w celu wybrania komórek lub obszarów zainteresowania. Zaleca się stosowanie krótkich czasów naświetlania (1-10 ms) i niskiej mocy wzbudzenia (0,1-1% transmisji) podczas skanowania próbki lub wyszukiwania celów.</li>
	<li>Zidentyfikuj autofagosomy za pomocą fluorescencji GFP-LC3. Zidentyfikuj lizosomy za pomocą anty-LAMP Alexa Fluor 555 (białko błonowe związane z lizosomami) i jąder komórkowych za pomocą DAPI (utrwalone próbki).</li>
	<li>Wybierz warunki eksperymentalne, w tym długość fali wzbudzenia, obszar obrazu (np. 512x512), grubość stosu, czas ekspozycji i procent transmisji laserowej. W przypadku obrazów o wysokiej rozdzielczości upewnij się, że opcja oświetlenia strukturalnego jest włączona. W przypadku mikroskopii dekonwolucyjnej na OMX wybierz opcję konwencjonalnego oświetlenia.</li>
	<li>Aby uzyskać najlepsze wyniki rekonstrukcji, należy wybrać warunki eksperymentalne tak, aby maksymalna intensywność wynosiła od 10 000 do 15 000 podczas akwizycji. Jeśli problemem jest fotowybielanie, można zastosować obrazowanie przy niższej ekspozycji (liczba od 5 000 do 10 000). Idealnie byłoby, gdyby liczba nie zmniejszyła się o więcej niż dwukrotny czynnik podczas całego przejęcia i należy unikać spadków o więcej niż czterokrotny czynnik. W razie potrzeby zmniejsz grubość stosu, aby zapewnić stałą liczbę intensywności. Kamera nasyca się na poziomie 64 000 zliczeń, więc maksymalna intensywność nigdy nie powinna tego przekraczać. W przypadku dobrych próbek stwierdziliśmy, że warunki eksperymentalne to czas ekspozycji 10 ~ 50 ms z 1% transmisją laserową. Preferowane są jasne i fotostabilne próbki, które można wielokrotnie obrazować. W przypadku zdjęć poklatkowych w super rozdzielczości wymagana jest stabilna plama.</li>
	<li>Aby zredukować szumy, zalecana jest prędkość odczytu 95 MHz (opcja średniej prędkości) i czas akwizycji wynoszący 2 ms lub więcej. Zwiększone artefakty uzyskuje się w zrekonstruowanym obrazie, gdy próbka porusza się podczas akwizycji. Ze względu na ten wpływ krótkie ekspozycje są zalecane w przypadku nieprzylegających lub szybko poruszających się komórek.</li>
	<li>Obrazowanie wielokanałowe może być wykonywane jednocześnie lub sekwencyjnie. Tryb sekwencyjny zapewnia mniej przesłuchów i dlatego jest zalecany.</li>
	<li>Aby zmniejszyć fotowybielanie, ogólnie zaleca się obrazowanie najpierw za pomocą dłuższych fal wzbudzenia (532 nm, 488 nm, a następnie 410 nm). Jednak w przypadku wyników eksperymentalnych pokazanych na rysunku 3 kolejność ta została odwrócona (tj. 48 nm, 532 nm i 410 nm) ze względu na fotostabilność tej konkretnej próbki.</li>
	<li>Ustaw górną/dolną granicę stosu Z, przesuwając stolik mikroskopu, aż górna/dolna część komórek będzie nieco nieostra. Żądana odległość między każdym obrazem powinna być utrzymywana na stałym poziomie 0,125 μm dla obrazowania w super rozdzielczości, ponieważ oprogramowanie do rekonstrukcji przyjmuje tę wartość jako domyślną.</li>
	<li>Rekonstruuj stosy obrazów za pomocą SoftWorX (Applied Precision, WA) i analizuj za pomocą VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).</li>
</ol>

<ol><li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li>
<li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li>
<li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li>
<li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li>
<li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2%2FBcl-X%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li>
<li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRAM%2C+a+p53-induced+modulator+of+autophagy%2C+is+critical+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li>
<li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers%3A+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li>
<li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li>
<li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podczas gdy bezpośrednia obserwacja komórek znakowanych sondami fluorescencyjnymi przeciwko LC3 jest powszechnie akceptowana jako standardowa metoda potwierdzania odpowiedzi autofagicznej6, ilościowe obrazowanie 3D tego samego systemu (tak jak to zrobiliśmy) dostarcza bezprecedensowych informacji i szczegółów na temat złożonego procesu autofagii komórkowej. W szczególności obserwujemy, że setki (jeśli nie tysiące) autofagosomów w żywych komórkach powstają w ciągu 80 minut od indukcji autofagii. Podobnie obserw...

<table><tbody><tr><td>Arginina Deiminaza (ADI)</td><td>DesigneRx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anty-myszy 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anty-królik 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Czerwony DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>anty-Lamp1</td><td>DSHB</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>anty-kadherynowa</td><td>sygnalizacja komórkowa</td> <td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>35 mm płyta dolna ze szkła powlekanego poli-d-lizyną</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-1.4-C</td><td></td></tr><tr><td>No.1, szkiełko nakrywkowe 22 mm</td><td>Corning</td><td>#2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Globe Scientific</td><td>1324G</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3d

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Rak prostaty jest główną formą nowotworów złośliwych wśród mężczyzn w USA. Podczas gdy operacja wiąże się ze znacznym ryzykiem impotencji i nietrzymania moczu, tradycyjne podejścia chemioterapeutyczne są w dużej mierze nieskuteczne. Terapia hormonalna jest skuteczna we wczesnym stadium, ale często zawodzi wraz z ostatecznym rozwojem nowotworów opornych na hormony. Byliśmy zainteresowani opracowaniem terapii ukierunkowanych na specyficzny niedobór metaboliczny komórek nowotworowych. Niedawno wykazaliśmy, że komórkom nowotworowym prostaty brakuje enzymu (syntazy argininobursztynianu lub ASS) zaangażowanego w syntezę aminokwasu argininy1. Ten stan powoduje, że komórki nowotworowe stają się zależne od egzogennej argininy i przechodzą stres metaboliczny, gdy wolna arginina jest zubożona przez deiminazę argininy (ADI)1,10. Rzeczywiście, wykazaliśmy, że ludzkie komórki raka prostaty CWR22Rv1 są skutecznie zabijane przez ADI z apoptozą niezależną od kaspazy i agresywną autofagią (lub makroautofagią)1,2,3. Autofagia to ewolucyjnie konserwatywny proces, który pozwala komórkom metabolizować niechciane białka przez rozkład lizosomalny podczas głodu żywieniowego4,5. Chociaż zasadnicze składniki tego szlaku są dobrze scharakteryzowane6,7,8,9, wiele aspektów mechanizmu molekularnego jest nadal niejasnych - w szczególności, jaka jest rola autofagii w odpowiedzi na śmierć komórek raka prostaty po leczeniu ADI? Aby odpowiedzieć na to pytanie, potrzebowaliśmy eksperymentalnej metody pomiaru poziomu i zakresu odpowiedzi autofagicznej w komórkach - a ponieważ nie ma znanych markerów molekularnych, które mogłyby dokładnie śledzić ten proces, zdecydowaliśmy się opracować podejście oparte na obrazowaniu, wykorzystując ilościową mikroskopię fluorescencyjną 3D11,12.
Używając komórek CWR22Rv1 specjalnie znakowanych sondami fluorescencyjnymi dla autofagosomów i lizosomów, pokazujemy, że stosy obrazów 3D uzyskane za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej o szerokim polu widzenia (a później za pomocą mikroskopii z oświetleniem strukturalnym o superrozdzielczości) mogą wyraźnie uchwycić wczesne etapy indukcji autofagii. Dzięki dostępnym na rynku aplikacjom do cyfrowej analizy obrazu możemy łatwo uzyskać informacje statystyczne o liczbie, rozmiarze, rozmieszczeniu i stopniu kolokalizacji autofagosomów i lizosomów z dowolnej obrazowanej komórki. Informacje te pozwalają nam precyzyjnie śledzić postęp autofagii w żywych komórkach i umożliwiają dalsze badania nad rolą autofagii w chemioterapii nowotworów.

Sekwencja obrazów przedstawiona na Rysunku 1 pokazuje zmiany fizyczne zachodzące w komórkach CWR22 podczas pierwszych 80 min indukcji autofagii. W tym oraz w innych badaniach (niewykazanych) konsekwentnie obserwowaliśmy: (1) przemieszczenie jądra komórkowego z centrum komórki; (2) redukcję punktów adhezji ogniskowej; oraz (3) ogólną translokację autofagosomów i lizosomów w kierunku centrum komórki. Ponadto w późniejszych punktach czasowych zaobserwowaliśmy niewielki wzrost kolokalizacji (oznaczonej na żó...

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazów ilościowych leczonych komórek nowotworowych prostaty, aby zmierzyć stopień i zakres autofagii w różnych punktach czasowych. Jest to realizowane poprzez wstępne potraktowanie komórek argininą, dase lub innymi odczynnikami eksperymentalnymi w celu indukcji autofagii i/lub śmierci komórkowej. Drugim krokiem jest podjęcie decyzji, czy obrazować żywe, czy utrwalone komórki, a następnie odpowiednie przygotowanie próbek.Następnie należy uzyskać trójwymiarowe obrazy fluorescencyjne komórek żywych lub utrwalonych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną w polu szerokim, dekonwolucyjną lub z oświetleniem strukturalnym. Ostatnim krokiem jest zebranie danych statystycznych dotyczących rozkładu wielkości autofagosomów oraz ich kolokalizacji z innymi strukturami wewnątrzkomórkowymi. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do cyfrowej analizy obrazów 3D metoda ta pozwala uzyskać wyniki wykazujące nie tylko, że indukcja autofagii przez argininazę może prowadzić do śmierci komórek nowotworu prostaty, ale także, że komórki te wykazują zmiany strukturalne, które są morfologicznie odróżnialne od zmian związanych z apoptozą i nekrozą.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi obecnie istniejącymi metodami jest to, że ilościowe obrazowanie 3D pozwala określić czas i miejsce wystąpienia konkretnego zdarzenia molekularnego wewnątrz żywej komórki, a następnie przedstawić je w formacie trójwymiarowym. Aby rozpocząć, należy hodować ludzkie komórki raka prostaty wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego połączonego z lekkim łańcuchem 3 na 35 milimetrowych szalkach hodowlanych z dna szklanego pokrytego poli-D-lizyną, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Komórki powinny zostać wysiane z gęstością wystarczającą do umożliwienia szybkiej proliferacji, lecz nie tak dużą, aby do czasu obrazowania komórki nadmiernie narosły i utworzyły skupiska. Wybrane próbki komórek należy potraktować argininazą lub DI w PBS, aby usunąć z komórek wolną argininę i wywołać stres metaboliczny w komórkach nowotworowych. Około godzinę przed obrazowaniem należy rozcieńczyć 1,5 µL LysoTracker Red w 20 mL pożywki RPMI zawierającej 10% FBS i 1% antybiotyków. Dla wybranych próbek, które zostały potraktowane DI, należy przygotować odpowiednie roztwory po uprzednim ogrzaniu wszystkich mediów do 37 °C.Do każdej szalki z hodowlą dodać odpowiednie medium i inkubować komórki w medium RPMI zawierającym LYO Tracker red przez 15 do 45 minut w temperaturze 37 °C, około 30 minut przed obrazowaniem. Włączyć komorę środowiskową stacji pogodowej i odczekać do osiągnięcia stanu równowagi przy 37 °C i 5% carbon dioxide; przemyć komórki PBS i zastąpić medium standardowym RPMI zawierającym tylko 10%FBS i 1%antibiotics. Do próbek dodać DI zgodnie z instrukcją.Zamocuj naczynia hodowlane z dnem z pokrywki szkiełkowej o średnicy 35 milimetrów w specjalnym adapterze. Na obiektywie o powiększeniu 6DX i aperturze numerycznej 1,42 zastosuj olej immersyjny, a następnie umieść zamocowane naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu. W tym filmie zaprezentowano mikroskopię 3D z wykorzystaniem mikroskopu dekonwolucyjnego Delta Vision personal IDV applied position oraz powiązanego zestawu aplikacji SoftWorks.W celu rozpoczęcia należy włączyć system mikroskopowy, w tym stację roboczą do akwizycji danych oraz kontroler urządzenia. Otwórz aplikację sterującą komputerem resolve 3D, aby zainicjować stół mikroskopu i włączyć ksenonowe źródło światła. Odczekaj 10 minut, aż źródło światła się rozgrzeje i osiągnie stabilne warunki.Nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw o powiększeniu 60× i aperturze numerycznej 1,42, a następnie wycentruj preparat na szkiełku, ustawiając go szkiełkiem nakrywkowym do dołu nad obiektywem, korzystając z oświetlenia w polu jasnym lub zewnętrznego oraz pokrętła grubego ustawiania ostrości. Powoli obracaj pokrętło, podnosząc obiektyw, aż kropla olejku immersyjnego zetknie się z odwróconym szkiełkiem nakrywkowym. Od tego momentu warstwa komórek powinna stać się widoczna po kilku obrotach pokrętła mikrometrycznego.Podczas pracy z utrwalonymi próbkami na szkiełkach zaleca się unikania komórek znajdujących się wewnątrz lub w pobliżu obszarów z pęcherzykami powietrza. Podczas obserwacji żywych próbek w naczyniu z szklanym dnem należy unikać przesuwania obiektywu poza obrys szklanej lamellki. Wybierz pożądane pole widzenia.W idealnym przypadku komórki powinny wykazywać silny sygnał fluorescencyjny we wszystkich odpowiednich kanałach oraz być wystarczająco przytwierdzone i rozpostarte na powierzchni szkiełka nakrywkowe, aby zawartość wewnątrzkomórkowa była łatwa do wizualizacji. Niewielkie korekty w osiach X, Y i Z mogą być kontrolowane komputerowo za pomocą interfejsu acquire 3D. Ustaw binning na 1x1 lub 2x2, w zależności od pożądanego pola widzenia dla danego obrazu przekroju środkowego komórki, a parametry ekspozycji tak, aby maksymalna intensywność pikseli nie przekraczała 3000 counts.Zazwyczaj procent transmisji powinien być ustawiony na jak najniższą wartość, tak aby nie zwiększyć odpowiadającego mu czasu ekspozycji. Czas powinien wynosić ponad jedną sekundę. Powtórz tę procedurę dla każdego koloru fluorescencji, który ma zostać zobrazowany, oraz dla każdego oddzielnego pola widzenia.Aby uzyskać obrazy najwyższej jakości, należy ustawić górną i dolną granicę stosu Z, dostosowując ostrość odpowiednio nieco powyżej i poniżej próbki komórkowej. Całkowita liczba obrazów w danym stosie Z będzie zatem określona przez te granice oraz odstępy między warstwami. Aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas akwizycji obrazu, tryb akwizycji można ustawić na długość fali.Następnie wykonuje się stos ZS dla próbek utrwalonych oraz stos ZS, a następnie zmianę długości fali dla próbek żywych. Po ustawieniu wszystkich parametrów można przystąpić do akwizycji obrazów fluorescencyjnych. Obrazy fluorescencyjne są następnie poddawane dekonwolucji przy użyciu oprogramowania soft works, a później analizowane za pomocą programu velocity.Przedstawiona sekwencja obrazów ukazuje zmiany fizyczne zachodzące w komórkach cwr 22 podczas pierwszych 80 minut indukcji autofagii. Na obrazach biała przerywana linia wyznacza obrys komórki, a jasno zaznaczony obszar reprezentuje położenie jądra. W ciągu 80 minut obrazy ujawniają przemieszczenie jądra z centrum komórki, redukcję punktów adhezji ogniskowej oraz ogólną translokację autosomów i lizosomów w stronę centrum komórki, co w późniejszych punktach czasowych przedstawiono odpowiednio w kolorze zielonym i czerwonym.Zaobserwowano również niewielki wzrost kolokalizacji między autosomami a lizosomami, co zostało wskazane kolorem żółtym. Następnie wykorzystano pakiet aplikacji do obrazowania cyfrowego Velocity w celu identyfikacji, przeliczenia i zebrania danych statystycznych dotyczących znakowanych autosomów i lizosomów na obrazach komórek CWR 22. Przedstawiono tutaj, że liczba i wielkość autosomów po ich początkowym utworzeniu i pojawieniu się zmieniają się w czasie.Po 80 minutach indukcji autofagii nastąpił stopniowy spadek liczby autofagosomów, któremu towarzyszył wzrost ich średniego rozmiaru. Dodatkowo, na podstawie analizy współczynnika korelacji Pearsona, odnotowano mierzalny wzrost kolokalizacji autofagosomów i lizosomów. Wspólnie wyniki te sugerują, że po stymulacji autofagii liczne małe autofagosomy z czasem łączyły się, tworząc większe autofagosomy.Przedstawiono tutaj porównanie obok siebie obrazów nabytych i zrekonstruowanych w trybie DV, symulowanej dekonwolucji szerokopolowej oraz trybie iluminacji strukturyzowanej. Dzięki zastosowaniu mikroskopu OMX rozdzielczość boczna została poprawiona do 120 nanometrów, co stanowi dwukrotność rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii ograniczonej dyfrakcją. Małoskalowa kolokalizacja autosomów i lizosomów była wyraźnie widoczna w mikroskopii superrozdzielczej, podczas gdy w konwencjonalnym obrazowaniu fluorescencyjnym była ona ledwo dostrzegalna.Jedną z zalet stosowania mikroskopii dekonwolucyjnej jest możliwość rekonstrukcji wszystkich obrazów w model 3D, który ujawni dokładniejsze informacje przestrzenne dotyczące rozmieszczenia różnych cząsteczek. Przedstawiony tutaj ogólny obraz pojedynczej komórki Cwr 22 RV przechodzącej autofagię w późniejszym punkcie czasowym, w którym zaczyna występować znaczna kolokalizacja autosomów i lizosomów. Barwienie spójne, zaznaczone kolorem białym, ujawnia zarys komórki docelowej w tym filmie.Model zrekonstruowany w 3D dostarcza więcej szczegółów przestrzennych dotyczących fuzji autosomów z lizosomami. Jak wskazano kolorem żółtym, interakcja między zielonymi sygnałami lekkiego łańcucha trzy a czerwonymi sygnałami lizosomów jest widoczna w postaci sygnałów scalonych, które tworzą kolor żółty. Zatem podejście to rozwiąże dwa główne problemy badaczy zajmujących się autofagią.Przede wszystkim dążymy do utrzymania środowiska wolnego od stresu poprzez zastosowanie mikroprzepływów oraz komory perfuzyjnej, aby zachować pierwotny stan fizjologiczny na stołach mikroskopowych. Drugim wyzwaniem jest zgromadzenie statystycznie istotnych ilościowych danych obrazowych; w przypadku utrwalonych komórek zazwyczaj wykonujemy wiele zdjęć różnych komórek, a następnie kompilujemy je w użyteczne informacje. Jednak w przypadku żywych komórek śledzimy jedną komórkę w czasie, aby uzyskać równoważne informacje.Wierzymy zatem, że technika ta umożliwi innym badaczom analizę funkcji i roli autofagii w różnych narządach oraz w przebiegu różnych chorób.

quantitative-analysis-autophagy-using-advanced-3d-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ilościowa autofagii za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

W tym filmie deiminazy deiminazy demonstrujemy indukcję autofagii opartej na deiminazie w komórkach raka prostaty. Co więcej, zaawansowana mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do wizualizacji zmian związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Indukcja autofagii oparta na ADI w komórkach raka prostaty: oparta na enzymach technika pomiaru odpowiedzi autofagicznej w komórkach

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Wygodna i skuteczna metoda badania autofagii u Penicillium chrysogenum za pomocą podkładek głodowych (mieszaniny agarozy i wody z kranu w szkiełku mikroskopowym zawierającym centralną jamę) jest przedstawiona tutaj.

Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Opisujemy nasz protokół pomiaru rytmów biologicznych w katabolizmie białek poprzez autofagię i proteasom w wątrobie myszy.

Pomiar rytmów dobowych w strumieniu autofagicznym i proteasomalnym

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

Poznaj ilościową analizę autofagii w komórkach nowotworowych prostaty przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D. Ta metoda pozwala wizualizować dynamikę autofagosomów i lizosomów.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Przeglądaj więcej filmów