Name: Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę monitorowania peksofagii zależnej od Stub1 w żywych komórkach SHSY5Y i NIH 3T3. Technika obrazowania konfokalnego pozwala śledzić degradację peroksysomów uszkodzonych przez ROS w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant badawczy MOST 111-2311-B-001-019-MY3 od Narodowej Rady Nauki i Technologii na Tajwanie.

1. Przygotowanie komórek wyrażających diKillerRed lub białka samoznakujące (SLP) w świetle peroksysomów
<ol>
	<li>Wysiewaj pożądane komórki na szalkach do hodowli komórkowych ze szklanym dnem. Do tego eksperymentu wysiewamy 2 x 105 ludzkich komórek SHSY5Y w 840 μl pożywki hodowlanej (DMEM/F-12 uzupełnione 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) lub 6 x 104 mysich komórek NIH3T3 w 840 μl pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnione 10% surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) na szalce hodowlanej o średnicy 35 mm ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 mm. 
UWAGA: Liczba wysianych komórek powinna być dostosowana proporcjonalnie do powierzchni szklanej mikrostudzienki w przypadku korzystania z naczyń ze szklanym dnem o innych specyfikacjach.</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze poniżej 5% CO2/37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Transfekować komórki pożądanymi plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji.
	<ol>
		<li>Użyj PMP34-TagBFP, aby oznaczyć peroksysomy w żywych komórkach. Użyj ukierunkowanego na peroksysomy diKillerRed-VKSKL lub SLP-VKSKL (+ ligandy SLP znakowane barwnikiem) do generowania ROS w świetle peroksysomów (poprzez aktywowaną światłem produkcję ROS). W tym protokole używamy samoznakującego się białka HaloTag-VKSKL21. Do monitorowania translokacji Stub1 / Hsp70, akumulacji ubikwitynowanych białek i tworzenia autofagosomów na peroksysomach zestresowanych ROS, odpowiednio transfekcja EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub lub EGFP-LC3B. Aby sprawdzić generowanie ROS w świetle peroksysomalnym, należy wykonać transfekcję diKillerRed-VKSKL za pomocą fluorescencyjnej sondy redoks zlokalizowanej w peroksysomach roGFP2-VKSKL22.</li>
		<li>W przypadku transfekcji komórek SHSY5Y należy rozcieńczyć plazmidy w 55 μl DMEM/F-12 bez surowicy i rozcieńczyć 1 μl odczynnika do transfekcji w 55 μl DMEM/F12 bez surowicy. Połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać kompleks do 20-milimetrowej mikrostudzienki uprzednio pokrytej 100 μl pożywki hodowlanej dla SHSY5Y bez antybiotyków (DMEM/F-12 z 10% płodową surowicą bydlęcą). Delikatnie potrząśnij naczyniem w przód iw tył.</li>
		<li>W przypadku transfekcji komórek NIH3T3 należy zastąpić zredukowaną pożywkę surowicy wolnym od surowicy DMEM/F-12 w celu rozcieńczenia plazmidów i odczynnika do transfekcji. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką hodowlaną SHSY5Y pożywką hodowlaną dla komórek NIH3T3 bez antybiotyków (DMEM z 10% surowicą bydlęcą).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 2 godzinach transfekcji usunąć pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodać 1 ml świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować komórki NIH3T3 lub SHSY5Y w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 24 godziny 
	UWAGA: Inne linie komórkowe mogą być również wykorzystywane do badania pekofagii, w której pośredniczy Stub1 (np. Komórki HeLa).</li>
</ol>
2. Barwienie peroksysomów znakowanymi barwnikiem ligandami SLP (do produkcji ROS aktywowanych światłem)
<ol>
	<li>Po 24 godzinach od transfekcji usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 100 μl liganda HaloTag TMR o długości 200 nM lub liganda HaloTag 200 nM Janelia Fluor 646 na szklaną mikrostudzienkę o średnicy 20 mm. 
	UWAGA: Znakowane barwnikiem ligandy SLP należy rozcieńczyć odpowiednią pożywką hodowlaną dla każdej linii komórkowej. Wybór ligandów znakowanych Janelia Fluor 646 zwolni niebieskie, zielone i czerwone kanały do dalszego obrazowania fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37°C, 5% CO2 . Bejca na 1 godzinę. Po 1 godzinie dokładnie usunąć pożywkę barwiącą i dodać 1 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
3. Stresowanie peroksysomów metodą ROS w laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym
<ol>
	<li>Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające żądane komórki na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w inkubator ze stopniem.</li>
	<li>Kliknij Tool Window, wybierz Ocular, a następnie kliknij przycisk DIA (Rysunek 2A), aby włączyć światło przechodzące. View czasza przez okular mikroskopu i ustaw ostrość komórek, obracając pokrętło ostrości.</li>
	<li>Wybierz LSM i kliknij przycisk Dye & Detector Select (Wybór barwnika i detektora) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Kliknij dwukrotnie żądane barwniki w wyskakującym okienku, aby wybrać odpowiednie ustawienia lasera i filtra do obrazowania komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). Kliknij Livex4 w panelu Live, aby rozpocząć szybkie skanowanie laserowe w celu rozpoczęcia badania przesiewowego pod kątem sygnałów fluorescencyjnych komórek (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D).</li>
	<li>Przesuń stolik za pomocą kontrolera joysticka i zlokalizuj średnie komórki eksprymujące diKillerRed-VKSKL lub SLP-VKSKL, aby zastosować stres ROS (na peroksysomach). Uzyskaj obraz żądanej komórki.</li>
	<li>Kliknij na Tool Window (Okno narzędzi) i wybierz Stymulacja LSM (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). Kliknij przycisk elipsy i w oknie obrazu na żywo użyj myszy, aby narysować okrągły ROI o średnicy 15 μm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F) zawierający pożądane peroksysomy uzyskane w kroku 3.4, do których zostanie zastosowany stres ROS (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3 dla przykładu).</li>
	<li>Aby zastosować stres ROS, użyj 561 nm dla komórek z ligandem SLP znakowanym diKillerRed-PTS1 lub TMR i użyj 640 nm dla komórek wybarwionych ligandem SLP znakowanym Janelia Fluor 646.</li>
	<li>Wybierz długość fali lasera do zastosowania naprężenia ROS. Wprowadź żądaną wartość procentową lasera i czas trwania (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2G).</li>
	<li>Kliknij na Acquire, a następnie kliknij na przycisk Stimulation (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H), aby rozpocząć skanowanie światłem 561/640 nm przez ROI przez 30 sekund każdy. Odpowiada to ustawieniu ~5% mocy lasera zarówno dla 561 nm, jak i 640 nm w zastosowanym tutaj mikroskopie konfokalnym. Ta operacja doprowadzi do produkcji ROS w peroksysomach. 
	UWAGA: Można wybrać ROI o różnych rozmiarach. Należy proporcjonalnie dostosować czas oświetlenia dla każdego ROI w zależności od jego obszaru.</li>
	<li>Po 30 sekundach oświetlenia laserowego peroksysomy w ROI utracą swoje sygnały diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Ta utrata sygnału pozwala odróżnić oświetlone peroksysomy od nieoświetlonych (uszkodzonych i zdrowych) w komórce.</li>
</ol>
4. Monitorowanie pexofagii w żywych komórkach za pomocą obrazowania poklatkowego
<ol>
	<li>Śledź translokację znakowanych EGFP Stub1, Hsp70, Ub, p62 lub LC3B na oświetlone/zestresowane ROS peroksysomy poprzez obrazowanie poklatkowe z użyciem 10-minutowych odstępów między klatkami (dla przykładów, patrz rysunki 3-7). 
	UWAGA: Sygnały EGFP-Stub1 lub EGFP-Hsp70 zaczynają pojawiać się 10-20 minut po oświetleniu i pozostają na wszystkich uszkodzonych peroksysomach do ~ 40 minut po oświetleniu. Sygnały EGFP-Ub pojawiają się po 30 minutach od oświetlenia i trwają przez 2-3 godziny. Translokacja EGFP-p62 pojawia się po 60 minutach od oświetlenia, a sygnały EGFP-LC3B stają się widoczne ~3 godziny po rozświetleniu.</li>
	<li>Określ ilościowo sygnały EGFP na uszkodzonych peroksysomach (z Stub1, Ub, p62 lub LC3B) za pomocą ImageJ. Wykonaj następujące czynności, aby użyć ImageJ do ilościowego określenia obrazu trzykanałowego (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
	<ol>
		<li>Otwórz obraz i zastosuj zaznaczenia eliptyczne lub odręczne, aby zamknąć obszar zawierający wszystkie podświetlone peroksysomy (sygnał dodatni PMP34-TagBFP i sygnał liganda HaloTag wybielony; <silna klasa="xfig">Rysunek 8A).</li>
		<li>Kliknij na Duplikuj, aby wybrać kanał PMP34-TagBFP (Rysunek 8A). Ustaw próg za pomocą menu rozwijanego Obraz > Dostosuj próg>, aby oznaczyć peroksysomy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 8B).</li>
		<li>Wybierz Analizuj > Analizuj cząstki, aby określić dokładne obszary oświetlonych peroksysomów. ImageJ rejestruje te obszary zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI (<silna klasa="xfig">Rysunek 8C).</li>
		<li>Kliknij Duplikuj, aby wybrać kanał EGFP do analizy sygnału fluorescencji z Ub, p62 lub LC3B sprzężonego z EGFP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8D). Wybierz wszystkie ROI w Menedżerze ROI (<silna klasa="xfig">Rysunek 8E).</li>
		<li>Zastosuj pomiar w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby zmierzyć sygnały EGFP na peroksysomach (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 8E). Znajdź wartość obszaru i gęstości zintegrowanej (suma wszystkich intensywności pikseli) dla każdego ROI w tabeli wyników (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8E).</li>
		<li>Aby uzyskać średnią intensywność fluorescencji EGFP w różnych punktach czasowych po naświetleniu, należy podzielić zintegrowaną intensywność EGFP przez całkowitą powierzchnię oświetlonych peroksysomów (obszary dodatnie sygnału PMP34-TagBFP i ujemne obszary sygnału ligandu HaloTag). Aby uzyskać skumulowany sygnał na peroksysomach, odejmij uśrednioną intensywność w punkcie czasowym przez uśrednioną intensywność w czasie = 0, a następnie znormalizuj przez uśrednioną intensywność w czasie = 0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Globalne uszkodzenie wszystkich peroksysomów (w każdej komórce) na szalce hodowlanej
<ol>
	<li>Wykonaj etap 1 (przygotowanie komórek wykazujących ekspresję diKillerRed ukierunkowanego na peroksysomy [diKillerRed-VKSKL] lub SLP [SLP-VKSKL]) i etap 2 (barwienie peroksysomów ligandem SLP [do produkcji ROS aktywowanych światłem]).</li>
	<li>Po 1 godzinie barwienia ligandem znakowanym TMR usunąć pożywkę barwiącą i dodać 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; inhibitor katalazy). 
	UWAGA: Katalaza jest zmiataczem ROS ulegającym ekspresji w świetle peroksysomów, więc leczenie 3-AT pomaga zwiększyć wywołane światłem uszkodzenia oksydacyjne peroksysomów.</li>
	<li>Umieść naczynie hodowlane nad diodą LED (555-570 nm). Oświetl wszystkie komórki o gęstości mocy 1,8 W/cm2 przez 9 godzin w inkubatorze. 
	UWAGA: Aby wykonać ten krok na zewnątrz inkubatora, umieść naczynie hodowlane na płycie grzewczej o temperaturze 37°C. Dodaj 20 mM HEPES do pożywki zawierającej 3-AT i przykryj naczynie hodowlane przezroczystą folią, aby zminimalizować wymianę gazową. HEPES jest środkiem buforującym, który utrzymuje fizjologiczne pH w hodowli komórkowej poza inkubatorem CO2 podczas oświetlenia LED.</li>
	<li>Zweryfikuj powodzenie uszkodzeń wywołanych przez diody LED, obrazując sygnały EGFP-Ub, EGFP-p62 lub EGFP-LC3B na peroksysomach. Korzystając z warunków oświetlenia opisanych powyżej, 82% komórek SHSY5Y stabilnie eksprymujących HaloTag-VKSKL wykazywało pexofagię za pośrednictwem Stub1.</li>
	<li>Zbierz komórki do dalszej analizy biochemicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).</li>
<li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+%CE%B2-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li>
<li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li>
<li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransen%2C+M+%22Peroxisomes+and+their+Key+Role+in+Cellular+Signaling+and+Metabolism%22">Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism</a>. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).</li>
<li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li>
<li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li>
<li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+is+responsible+for+65%25+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li>
<li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+in+yeast+and+mammals%3A+An+update+on+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li>
<li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li>
<li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+The+selective+degradation+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).</li>
<li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+A+model+for+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).</li>
<li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li>
<li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li>
<li>Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsc70%2FStub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428(2013).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób wywołać pekofagię za pośrednictwem Stub1 w hodowlach komórkowych poprzez podniesienie poziomu peroksysomalnych ROS za pomocą światła. Ponieważ protokół opiera się na wytwarzaniu ROS wspomaganym barwnikiem, należy zapewnić wystarczającą ekspresję barwienia ligandem diKillerRed-VKSKL lub znakowanym barwnikiem ligandem SLP w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę, że różne typy komórek lub komórki o różnym pochodzeniu genetycznym mogą zawierać peroksy...

Peroksysomy to organelle związane z pojedynczą błoną, obecne w większości komórek eukariotycznych. Peroksysomy są przedziałem metabolicznym niezbędnym do przeprowadzania beta-oksydacji bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, katabolizmu puryn oraz syntezy fosfolipidów eterowych i kwasów żółciowych1. Acetylo-CoA pochodzący z peroksysomów kontroluje homeostazę lipidów poprzez regulację centralnej sygnalizacji w metabolizmie2. Dlatego nie jest niespodzianką, że upośledzone funkcje peroksysomalne są implikowane w różnych chorobach, w tym zaburzeniach neurodegeneracyjnych, starzeniu się, nowotworach, otyłości i cukrzycy3,4,5. Niezbędnym procesem w utrzymaniu działania peroksysomalnego jest peksofagia. Peksofagia to kataboliczny proces selektywnej wymiany peroksysomów przez autofagię. Komórki wykorzystują pekofagię, aby pomóc kontrolować ilość i jakość peroksysomów, zapewniając w ten sposób prawidłową funkcję peroksysomów. Niedawne badanie wykazało, że utrata peroksysomów spowodowana mutacjami w czynnikach biogenezy peroksysomalnej PEX1 1 i 6 wynika z niekontrolowanej peksofagii 6. Warto zauważyć, że 65% wszystkich pacjentów z zaburzeniami biogenezy peroksysomów (PBD) ma niedobory peroksysomalnego kompleksu ATPaa AAA, składającego się z PEX1, PEX6 i PEX26 w komórkach ssaków7.
Do inicjowania i badania pexofagii można użyć wielu metod. U drożdży peksofagia jest wyzwalana, gdy dostarczane składniki odżywcze są przełączane ze źródeł węgla zależnych od peroksysomów na niezależne od peroksysomów źródła węgla (w celu obniżenia liczby peroksysomów komórkowych)8. Na przykład przeniesienie komórek Pichia pastoris wyhodowanych w metanolu z pożywki metanolowej na pożywkę glukozową i pożywkę etanolową indukuje odpowiednio mikropeksofagię i makropeksofagię8,9,10. Sekwestratory mikropeksofagiczne grupowały peroksysomy w celu degradacji poprzez przebudowę wakuoli w celu utworzenia przypominających miseczki błon sekwestracyjnych wakuolarnych i struktury przypominającej pokrywę, zwanej aparatem błonowym specyficznym dla mikropekofagii (MIPA). W makropeksofagii poszczególne peroksysomy są pochłaniane przez struktury o podwójnej błonie znane jako pekofagosomy, po których następuje fuzja z wakuolą w celu degradacji8,9,10. Fosforylacja receptorów pexofagii, takich jak Atg36p u Saccharomyces cerevisiae i Atg30p u Pichia pastoris, ma kluczowe znaczenie dla receptorów w celu rekrutacji rdzeniowej maszynerii autofagii i ułatwienia peroksysomalnego kierowania do autofagosomów8,11.
W komórkach ssaków pexofagia może być indukowana przez ubikwitynację. Znakowanie białek błony peroksysomalnej PMP34 lub PEX3 ubikwityną po stronie cytozolu indukuje pexofagię12. Nadekspresja PEX3 indukuje ubikwitynację peroksysomów i eliminację peroksysomów przez lizosomy13. Ponadto, fuzja PEX5 z C-końcowym EGFP upośledza eksport monoubikwitynowanego PEX5 i powoduje powstanie pexophagy14. Z drugiej strony, peksofagia może być również wywołana przez leczenieH2O2. Peroksysomy wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS); w szczególności enzym peroksysomalny Acox1, który katalizuje początkowy etap beta-oksydacji bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (> 22 atom węgla), wytwarza nie tylko acetylo-CoA, ale także peroksysomalny ROS. W odpowiedzi na podwyższone poziomy ROS w ramach leczeniaH2O2, komórki ssaków aktywują pekofagię, aby obniżyć produkcję ROS i złagodzić stres. Doniesiono, że leczenieH2O2napędza rekrutację zmutowanych ataksji-teleangiektazji (ATM) do peroksysomów. ATM następnie fosforyluje PEX5, aby promować obrót peroksysomalny przez pexofagię15.
Ponieważ peroksysomy są centrami generującymi ROS, są one również podatne na uszkodzenia ROS. Uszkodzenia peroksysomalne wywołane przez ROS zmuszają komórki do aktywacji peksofagii w celu zainicjowania szlaków kontroli jakości peroksysomów (usunięcie uszkodzonego peroksysomu przez autofagię). W tym miejscu przedstawiamy podejście do wyzwalania na żądanie uszkodzenia peroksysomalnego wywołanego przez ROS. Protokół wykorzystuje aktywowaną światłem produkcję ROS w organellach16,17,18,19,20 (Rysunek 1). Peroksysomy znakowane barwnikiem są oświetlane, co prowadzi do produkcji ROS w świetle peroksysomalnym, co w szczególności wywołuje uszkodzenie peroksysomalne. Za pomocą tego protokołu wykazano, że peroksysomy obciążone ROS są usuwane przez szlak degradacji zależny od ubikwityny. Peroksysomy zestresowane ROS rekrutują ligazę ubikwityny E3 Stub1, aby umożliwić ich wchłonięcie do autofagosomów w celu indywidualnego usunięcia przez pexofagię16. Można użyć tego protokołu do porównania losu uszkodzonych i zdrowych peroksysomów w tej samej komórce za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta może być również stosowana do globalnego uszkodzenia wszystkich peroksysomów (we wszystkich komórkach) na szalce hodowlanej, co pozwala na analizę biochemiczną szlaku pekofagii.

<table><tbody><tr><td>Naczynie hodowlane 35 mm ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 mm&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)</td> ze szklanym dnem <td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>wykonany przez dołączenie dimeru tandemowego KillerRed do PTS1 (VKSKL)</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td> Zmodyfikowana mieszanka pożywki Eagle firmy Dulbecco <td></td></tr><tr><td>F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>Szkielet EGFP-C1 został użyty do klonowania EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-HSP70</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>Gen Hsp70 (HSPA1A) PCR amplifikowany z cDNA HeLa i klonowany do EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>generowany przez wprowadzenie ludzkiego genu SQSTM1 (poprzez amplifikację PCR cDNA komórki HeLa) do EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>generowany przez wprowadzenie mysiego genu Stub1 (poprzez amplifikację PCR całkowitego cDNA nerki myszy) do EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ligand HaloTag TMR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1 dołączony i sklonowany do szkieletu EGFP-C1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Mikroskop Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&nbsp; z inkubatorem komorowym TOKAI HIT i nasadką do czaszy UNIV2-D35</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 nm</td></tr><tr><td>lipofektamina 2000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>NIH3T3 komórka</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>przylegający</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>zredukowana pożywka w surowicy</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR amplifikowany z cDNA HeLa i klonowany wtoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>generowane przez dołączenie eroGFP (pobranego z plazmidu Addgene 20131) z sekwencją aminokwasową VKSKL i sklonowane do komórki EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>przylegającej</td></tr></tbody></table>

monitorowanie peksofagii zależnej od stub1

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Komórki ssaków mogą przewracać peroksysomy za pośrednictwem Stub1 pexofagii. Szlak potencjalnie umożliwia komórkową kontrolę ilości i jakości peroksysomów. Podczas tego procesu białko szoku cieplnego 70 i ligaza ubikwityny E3, Stub1, przemieszczają się do peroksysomów, które są odwracane w celu zainicjowania pekofagii. Aktywność ligazy Stub1 umożliwia akumulację ubikwityny i innych modułów związanych z autofagią na docelowych peroksysomach. Podniesienie poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) w świetle peroksysomalnym może aktywować peksofagię, w której pośredniczy Stub1. Można zatem użyć wspomaganego barwnikiem generowania ROS do wyzwalania i monitorowania tej ścieżki. W artykule przedstawiono procedury stosowania dwóch klas barwników, białek fluorescencyjnych i syntetycznych fluoroforów, do inicjacji pekofagii w hodowlach komórek ssaków. Te wspomagane barwnikiem protokoły generowania ROS mogą być nie tylko wykorzystywane do celowania we wszystkie peroksysomy w populacji komórek na całym świecie, ale mogą również umożliwiać manipulowanie pojedynczymi peroksysomami w pojedynczych komórkach. Opisujemy również, w jaki sposób można śledzić pexofagię, w której pośredniczy Stub1, za pomocą mikroskopii żywych komórek.

Przedstawiony tutaj schemat indukcji peksofagii pośredniczonej przez Stub1 wykorzystuje generowanie ROS wspomagane barwnikiem wewnątrz lumenu peroksysomu. Operacja ta wymaga minimalnego natężenia światła. Peroksysomy zawierające białka fluorescencyjne lub barwniki mogą być zatem naświetlane przy użyciu standardowych konfokalnych mikroskopów skaningowych. Naświetlanie ogniskowe prowadzi do natychmiastowej i zlokalizowanej produkcji ROS w poszczególnych peroksysomach, co wskazują pomiary reportera fluorescencyjnego roGFP2-...

Ten protokół dostarcza instrukcje dotyczące wyzwalania i monitorowania pexofagii za pośrednictwem Stub1 w żywych komórkach.

Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroksysomy przeprowadzają utlenianie beta i są podatne na uszkodzenia ROS. Metoda ta pozwala zbadać, jak komórki radzą sobie z peroksysomami zestresowanymi ROS. Protokół ten jest używany nie tylko do globalnego celowania we wszystkie peroksysomy w populacji komórek, ale może również umożliwić manipulowanie poszczególnymi peroksysomami w pojedynczych komórkach.Wspomagane barwnikiem wytwarzanie ROS może być również wykorzystywane do celowania w organelle poza peroksysomami w celu zbadania, jak komórki radzą sobie z uszkodzeniami organelli. Na początek wysiewaj dwa razy 10 do piątych ludzkich komórek SHSY5Y lub sześć razy 10 do czwartych mysich komórek NIH H3T3 w 840 mikrolitrach pożywki hodowlanej na 35-milimetrowych szalkach hodowlanych ze szklanym dnem ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 milimetrów. Hoduj komórki w temperaturze poniżej 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnie przetransfekuj komórki pożądanymi plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji lub transfekcji komórek SHSY5Y. Rozcieńczyć plazmidy w 55 mikrolitrach DMEM/F-12 bez surowicy i rozcieńczyć jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji w 55 mikrolitrach DMEM/F-12 bez surowicy. Połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem.Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj kompleks do 20-milimetrowej mikrostudzienki uprzednio pokrytej 100 mikrolitrami pożywki hodowlanej zawierającej komórki SHSY5Y bez antybiotyków. Delikatnie potrząśnij naczyniem w przód iw tył.Wykonaj transfekcję komórek NIH 3T3, jak pokazano wcześniej, ale zastąp zredukowaną pożywkę surowicy zamiast wolnego od surowicy DMEM / F-12 do rozcieńczania plazmidu i odczynnika do transfekcji. Po dwóch godzinach transfekcji usuń pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodaj jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej. Inkubuj komórki NIH 3T3 lub SHSY5Y w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.W przypadku produkcji ROS aktywowanej światłem, po 24 godzinach od transfekcji usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 10 mikrolitrów 200-nanomolowego liganda HaloTag TMR lub 200-nanomolowego liganda Janelia Fluor 646 HaloTag do 20-milimetrowej szklanej mikrostudzienki. Przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i pozostaw na godzinę, aby zabarwić komórki. Po godzinie dokładnie usuń pożywkę barwiącą i dodaj jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej.Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające żądane komórki na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w inkubator typu stage top. W oprogramowaniu kliknij Okno narzędzi, wybierz Ocular, a następnie kliknij przycisk DIA, aby włączyć światło przechodzące. View czasza przez okular mikroskopu i ustaw ostrość komórek, obracając pokrętło ostrości.Wybierz LSM i kliknij przycisk Wybór detektora barwników. Kliknij dwukrotnie żądane barwniki w wyskakującym okienku, aby wybrać odpowiednie ustawienia lasera i filtra do obrazowania komórek. Kliknij Live4x w panelu Na żywo, aby rozpocząć szybkie skanowanie laserowe w celu rozpoczęcia badań przesiewowych pod kątem sygnałów fluorescencyjnych komórek.Przesuń stolik za pomocą kontrolera joysticka i zlokalizuj średnie komórki eksprymujące diKillerRed VKSKL lub SLP-VKSKL, aby zastosować stres ROS na peroksysomy. Uzyskaj obraz żądanej komórki. Kliknij Okno narzędzi i wybierz Stymulacja LSM.Następnie kliknij przycisk elipsy i w oknie Live Image użyj myszki, aby narysować ROI o średnicy 15 mikrometrów zawierające żądane peroksysomy, do których zostanie zastosowany stres ROS. Aby zastosować stres ROS, użyj 561 nanometrów dla komórek z ligandem SLP znakowanym diKillerRed VKSKL lub TMR i użyj 640 nanometrów dla komórek wybarwionych ligandem SLP znakowanym Janelia Fluor 646. Wybierz długość fali lasera do zastosowania naprężenia ROS.Wprowadź żądaną wartość procentową lasera i czas trwania. Aby uzyskać produkcję ROS w peroksysomach, kliknij przycisk Pobierz, a następnie Stymulacja, aby rozpocząć skanowanie światłem o długości 561 lub 640 nanometrów przez ROI przez 30 sekund każdy. Stymulacja ta odpowiada około 5% ustawieniom mocy lasera dla 561 i 640 nanometrów.Po 30 sekundach świecenia laserowego peroksysomy w ROI tracą sygnały diKillerRed VKSKL, TMR lub Janelia Fluor 646. Ta utrata sygnału pozwala na rozróżnienie oświetlonych i nieoświetlonych peroksysomów w komórce. Aby monitorować żywe komórki pexofagean, śledź translokację znakowanego EGFP Stub1, Hsp70, ubikwityny, p62 lub LC3B na oświetlone lub zestresowane ROS peroksysomy za pomocą obrazowania poklatkowego w 10-minutowych odstępach między klatkami.Oświetlenie ogniskowe prowadzi do natychmiastowej i miejscowej produkcji ROS w poszczególnych peroksysomach, jak wskazuje fluorescencyjny reporter roGFP2-VKSKL. Zdjęcie diKillerRed VKSKL zostało wykonane po wykonaniu wszystkich pomiarów roGFP2-VKSKL w celu wskazania lokalizacji uszkodzonych peroksysomów. Dane pokazują również, że nieoświetlone peroksysomy nie są dotknięte, co wskazuje na precyzję metodologii.Metodologia ta została wykorzystana do monitorowania pexofagii, w której pośredniczy Stub1. Podczas tego procesu Hsp70, Stub1, ubikwitynowane białka, adaptery autofagii p62 i LC3B pojawiają się następnie w peroksysomach zestresowanych ROS, aby napędzać pekofagię. Stosując tę samą strategię, możliwe było jednoczesne uszkodzenie wszystkich peroksysomów na szalce hodowlanej w celu biochemicznej charakterystyki pexofagii, w której pośredniczy Stub1.Przed oświetleniem LED fluorescencja EGFP-ubikwityny była jednorodna w cytoplazmie i nie kolokalizowała się z peroksysomami. Po dziewięciu godzinach świecenia diodami LED, sygnały EGFP-ubikwityny skumulowały się na wszystkich peroksysomach w komórkach hodowanych w naczyniu konfokalnym. Korzystając z tego protokołu, odkryliśmy, że peroksysomy zestresowane ROS są usuwane przez szlak degradacji zależny od ubikwityny.Peroksysomy zestresowane ROS rekrutują ligazę ubikwityny E3 Stub1, aby umożliwić ich usunięcie przez peksofagię.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

Wygodna i skuteczna metoda badania autofagii u Penicillium chrysogenum za pomocą podkładek głodowych (mieszaniny agarozy i wody z kranu w szkiełku mikroskopowym zawierającym centralną jamę) jest przedstawiona tutaj.

Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Endosomy recyklingowe są częścią endosomalnej sieci kanalikowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania dynamiki recyklingu endosomów przy użyciu GFP-STX13 jako markera organelli.

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Lipofagia to selektywna forma autofagii, która polega na degradacji kropelek lipidów. Dysfunkcje w tym procesie są związane z rozwojem nowotworów. Jednak dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Protokół ten opisuje ilościowe podejścia do obrazowania, aby lepiej zrozumieć wzajemne zależności między autofagią, metabolizmem lipidów i progresją raka.

Badanie regulacji katabolizmu kropelek lipidów poprzez lipofagię

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

Sondy PeroxiSPY są używane do wykrywania peroksysomów w komórkach ssaków. Tutaj pokazujemy, jak używać sond do barwienia peroksysomów w żywych i stałych komórkach.

Barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów

Poznaj metodę monitorowania peksofagii zależnej od Stub1 w żywych komórkach SHSY5Y i NIH 3T3. Technika obrazowania konfokalnego pozwala śledzić degradację peroksysomów uszkodzonych przez ROS w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1

Przeglądaj więcej filmów