Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1
12 maja 2023
Ten protokół dostarcza instrukcje dotyczące wyzwalania i monitorowania pexofagii za pośrednictwem Stub1 w żywych komórkach.
Peroksysomy przeprowadzają utlenianie beta i są podatne na uszkodzenia ROS. Metoda ta pozwala zbadać, jak komórki radzą sobie z peroksysomami zestresowanymi ROS. Protokół ten jest używany nie tylko do globalnego celowania we wszystkie peroksysomy w populacji komórek, ale może również umożliwić manipulowanie poszczególnymi peroksysomami w pojedynczych komórkach.
Wspomagane barwnikiem wytwarzanie ROS może być również wykorzystywane do celowania w organelle poza peroksysomami w celu zbadania, jak komórki radzą sobie z uszkodzeniami organelli. Na początek wysiewaj dwa razy 10 do piątych ludzkich komórek SHSY5Y lub sześć razy 10 do czwartych mysich komórek NIH H3T3 w 840 mikrolitrach pożywki hodowlanej na 35-milimetrowych szalkach hodowlanych ze szklanym dnem ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 milimetrów. Hoduj komórki w temperaturze poniżej 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Następnie przetransfekuj komórki pożądanymi plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji lub transfekcji komórek SHSY5Y. Rozcieńczyć plazmidy w 55 mikrolitrach DMEM/F-12 bez surowicy i rozcieńczyć jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji w 55 mikrolitrach DMEM/F-12 bez surowicy. Połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem.
Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj kompleks do 20-milimetrowej mikrostudzienki uprzednio pokrytej 100 mikrolitrami pożywki hodowlanej zawierającej komórki SHSY5Y bez antybiotyków. Delikatnie potrząśnij naczyniem w przód iw tył.
Wykonaj transfekcję komórek NIH 3T3, jak pokazano wcześniej, ale zastąp zredukowaną pożywkę surowicy zamiast wolnego od surowicy DMEM / F-12 do rozcieńczania plazmidu i odczynnika do transfekcji. Po dwóch godzinach transfekcji usuń pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodaj jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej. Inkubuj komórki NIH 3T3 lub SHSY5Y w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.
W przypadku produkcji ROS aktywowanej światłem, po 24 godzinach od transfekcji usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 10 mikrolitrów 200-nanomolowego liganda HaloTag TMR lub 200-nanomolowego liganda Janelia Fluor 646 HaloTag do 20-milimetrowej szklanej mikrostudzienki. Przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i pozostaw na godzinę, aby zabarwić komórki. Po godzinie dokładnie usuń pożywkę barwiącą i dodaj jeden mililitr świeżej pożywki hodowlanej.
Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające żądane komórki na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w inkubator typu stage top. W oprogramowaniu kliknij Okno narzędzi, wybierz Ocular, a następnie kliknij przycisk DIA, aby włączyć światło przechodzące. View czasza przez okular mikroskopu i ustaw ostrość komórek, obracając pokrętło ostrości.
Wybierz LSM i kliknij przycisk Wybór detektora barwników. Kliknij dwukrotnie żądane barwniki w wyskakującym okienku, aby wybrać odpowiednie ustawienia lasera i filtra do obrazowania komórek. Kliknij Live4x w panelu Na żywo, aby rozpocząć szybkie skanowanie laserowe w celu rozpoczęcia badań przesiewowych pod kątem sygnałów fluorescencyjnych komórek.
Przesuń stolik za pomocą kontrolera joysticka i zlokalizuj średnie komórki eksprymujące diKillerRed VKSKL lub SLP-VKSKL, aby zastosować stres ROS na peroksysomy. Uzyskaj obraz żądanej komórki. Kliknij Okno narzędzi i wybierz Stymulacja LSM.
Następnie kliknij przycisk elipsy i w oknie Live Image użyj myszki, aby narysować ROI o średnicy 15 mikrometrów zawierające żądane peroksysomy, do których zostanie zastosowany stres ROS. Aby zastosować stres ROS, użyj 561 nanometrów dla komórek z ligandem SLP znakowanym diKillerRed VKSKL lub TMR i użyj 640 nanometrów dla komórek wybarwionych ligandem SLP znakowanym Janelia Fluor 646. Wybierz długość fali lasera do zastosowania naprężenia ROS.
Wprowadź żądaną wartość procentową lasera i czas trwania. Aby uzyskać produkcję ROS w peroksysomach, kliknij przycisk Pobierz, a następnie Stymulacja, aby rozpocząć skanowanie światłem o długości 561 lub 640 nanometrów przez ROI przez 30 sekund każdy. Stymulacja ta odpowiada około 5% ustawieniom mocy lasera dla 561 i 640 nanometrów.
Po 30 sekundach świecenia laserowego peroksysomy w ROI tracą sygnały diKillerRed VKSKL, TMR lub Janelia Fluor 646. Ta utrata sygnału pozwala na rozróżnienie oświetlonych i nieoświetlonych peroksysomów w komórce. Aby monitorować żywe komórki pexofagean, śledź translokację znakowanego EGFP Stub1, Hsp70, ubikwityny, p62 lub LC3B na oświetlone lub zestresowane ROS peroksysomy za pomocą obrazowania poklatkowego w 10-minutowych odstępach między klatkami.
Oświetlenie ogniskowe prowadzi do natychmiastowej i miejscowej produkcji ROS w poszczególnych peroksysomach, jak wskazuje fluorescencyjny reporter roGFP2-VKSKL. Zdjęcie diKillerRed VKSKL zostało wykonane po wykonaniu wszystkich pomiarów roGFP2-VKSKL w celu wskazania lokalizacji uszkodzonych peroksysomów. Dane pokazują również, że nieoświetlone peroksysomy nie są dotknięte, co wskazuje na precyzję metodologii.
Metodologia ta została wykorzystana do monitorowania pexofagii, w której pośredniczy Stub1. Podczas tego procesu Hsp70, Stub1, ubikwitynowane białka, adaptery autofagii p62 i LC3B pojawiają się następnie w peroksysomach zestresowanych ROS, aby napędzać pekofagię. Stosując tę samą strategię, możliwe było jednoczesne uszkodzenie wszystkich peroksysomów na szalce hodowlanej w celu biochemicznej charakterystyki pexofagii, w której pośredniczy Stub1.
Przed oświetleniem LED fluorescencja EGFP-ubikwityny była jednorodna w cytoplazmie i nie kolokalizowała się z peroksysomami. Po dziewięciu godzinach świecenia diodami LED, sygnały EGFP-ubikwityny skumulowały się na wszystkich peroksysomach w komórkach hodowanych w naczyniu konfokalnym. Korzystając z tego protokołu, odkryliśmy, że peroksysomy zestresowane ROS są usuwane przez szlak degradacji zależny od ubikwityny.
Peroksysomy zestresowane ROS rekrutują ligazę ubikwityny E3 Stub1, aby umożliwić ich usunięcie przez peksofagię.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada mechanizm pexofagii pośredniczonej przez Stub1 w odpowiedzi na peroksysomy poddawane stresowi ROS w żywych ludzkich komórkach SHSY5Y i mysich komórkach NIH 3T3. Metodologia prezentuje nowatorskie podejście do monitorowania pexofagii i roli różnych białek w tym procesie, wykazując, że peroksysomy poddane stresowi ROS są kierunkowe do degradacji w sposób zależny od ubiquitinu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Pexofagi
- Odpowiedź komórki na stres oksydacyjny
- Ścieżki degradacji białek
Tło
- Peroksysomy to organelle zaangażowane w procesy metaboliczne, w tym w beta-oksydacje.
- Mogą ulec uszkodzeniu przez reaktywne formy tlenu (ROS), co wymaga odpowiedzi komórkowych.
- Stub1 to ligaza ubiquitinu E3, znana z uczestniczenia w pexofagii.
Zastosowane metody
- Techniki obrazowania na żywo z mikroskopem konfokalnym
- Ludzkie komórki SHSY5Y i mysie komórki NIH 3T3 jako systemy modelowe
- Protokoły transfekcji i generacji ROS wspomaganej barwnikiem
Główne wyniki
- Zlokalizowane generowanie ROS prowadzi do identyfikacji peroksysomów poddanych stresowi.
- Stub1 i inne białka jak Hsp70, p62 i LC3B translokują się do peroksysomów poddanych stresowi ROS.
- Ścieżki degradacji zależne od ubiquitinu są potwierdzone w usuwaniu peroksysomów.
Wnioski
- To badanie demonstruje nowatorską metodologię monitorowania pexofagii w żywych komórkach.
- Wyniki są istotne dla zrozumienia odpowiedzi komórkowych na stres oksydacyjny i kontroli jakości organelli.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Stub1-mediated pexophagy monitoring enables precise interrogation of peroxisome quality control mechanisms in mammalian cells, directly informing early discovery and target validation for organelle turnover pathways. The ability to induce and track selective peroxisome degradation at both population and single-organelle levels supports predictive confidence in mechanistic de-risking and portfolio triage for oxidative stress-related targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic dissection of peroxisome turnover in response to ROS stress.
- Supports functional validation of Stub1 and associated autophagy modules as therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing specific organelle responses to injury.
- Provides predictive confidence for advancing organelle quality control targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live-cell imaging assays for quantifying pexophagy events.
- Enables reproducible, quantitative measurement of protein translocation and ubiquitin accumulation.
- Supports assay standardization for screening modulators of peroxisome degradation.
- Permits scalable manipulation of peroxisomes for robust compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of oxidative stress and organelle dysfunction.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of autophagy pathways.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting peroxisome quality control.
- Provides translational biomarker opportunities via live-cell imaging readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for organelle turnover mechanisms.
- Discovery Biology: Enables targeted ROS induction and mechanistic validation of pexophagy regulators.
- Screening: Provides reproducible, quantitative live-cell imaging outputs for assay development.
- Analytics: Delivers time-resolved measurements of protein recruitment and peroxisome degradation.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant oxidative stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for interrogating organelle quality control across cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle turnover research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and ROS induction protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for autophagy and quality control targets, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates modulating peroxisome degradation pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy.
- Demands access to laser scanning confocal systems and dye-assisted ROS generation reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification protocols.
- Adaptable to multiple mammalian cell models with appropriate transfection optimization.
- Precision of ROS induction must be validated to avoid off-target organelle effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Preparation of Cells Expressing DiKillerRed or Self‐Labeling Proteins (SLPs) in the Peroxisome Lumen
2:52
Staining Peroxisomes with Dye‐Labeled SLP Ligands
3:39
ROS‐Stressing of Peroxisomes on a Laser‐Scanning Confocal Microscope
6:25
Results: Light‐Activated ROS Production and Stub1‐Mediated Pexophagy
7:50
Conclusion
