Name: Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej. Ta technika umożliwia badanie mitofagii w tkankach z ograniczoną ilością materiału biologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od JDRF (CDA-2016-189 i-2018-539), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), rodziny Brehm i rodziny Anthony. Nagroda JDRF Career Development Award dla S.A.S. jest częściowo wspierana przez Duńską Akademię Diabetologiczną, która jest wspierana przez Fundację Novo Nordisk.

Użycie zanonimizowanych ludzkich wysp trzustkowych dawcy odbywa się na podstawie zwolnienia od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) i jest zgodne z polityką IRB Uniwersytetu Michigan. Ludzkie wyspy trzustkowe zostały dostarczone przez sponsorowany przez NIH / NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP).
1. Przygotowanie próbki z ludzkich wysepek
<ol>
	<li>Dysocjacja pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Hodowla próbek ludzkich wysp trzustkowych (4000–6000 ekwiwalentów wysp trzustkowych/10 ml pożywki) przez co najmniej 1 dzień w temperaturze 37 °C w pożywce trzustkowej (PIM(S)) uzupełnionej 1 mM glutaminy (PIM(G)), 100 jednostek/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 1 mM pirogronianu sodu i 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub ludzkiej surowicy AB.</li>
		<li>Użyj mikroskopu mikroskopu mikroskopowego o 3-krotnym powiększeniu, aby policzyć poszczególne ludzkie wysepki z hodowli. Pobrać 40 wysepek na zabieg/stan zainteresowania (taki jak glukoliotoksyczność) do probówek o pojemności 1,5 ml w pożywce z wysp trzustkowych.</li>
		<li>Odwirować wysepki przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C do osadu.</li>
		<li>Przepłukać próbki, przez krótkie odwrócenie probówek w temperaturze pokojowej, dwukrotnie 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 50 μM PR619 (inhibitor deubikwitynazy; w celu zachowania oddziaływań białkowych zależnych od ubikwityny), z odwirowaniem między każdym płukaniem przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C.</li>
		<li>Dysocjuj wyspy trzustkowe na pojedyncze komórki za pomocą 125 μl 0,25% trypsyny zawierającej 50 μM PR619 poprzez inkubację wstępnie podgrzanej trypsyny (37 °C) przez 3 minuty z osadami wysp trzustkowych. W tym czasie delikatnie rozprowadzić wysepki, okresowo delikatnie pipetując za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Trypsynę ugasić 1 ml podgrzanej (37 °C) pożywki PIM(s) zawierającej 50 μM PR619, a następnie komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 min.</li>
		<li>Przemyć komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 minutę, dwukrotnie, za pomocą PBS + 50 μM PR619.</li>
		<li>Na koniec ponownie zawieś komórki w 150 μl PBS zawierającym 50 μM PR619.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyleganie i utrwalanie pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Po ponownym zamieszaniu odwirować roztwór komórek na oszronionych, naładowanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą cytowirówki o sile 28 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Po cytowirowaniu obrysuj obszar komórkowy za pomocą pisaka hydrofobowego (patrz Tabela materiałów), aby zminimalizować potrzebne objętości roztworu przeciwciała/PLA. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
		<li>Aby uzyskać najlepsze rezultaty, należy przeprowadzić barwienie/PLA natychmiast lub w ciągu 24 godzin. W razie potrzeby próbki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu barwienia nie dłużej niż 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Roztwór komórek blokowych, w celu wyeliminowania barwienia tła, z 10% surowicą osła w PBS zawierającą 0,3% detergentu (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Inkubować komórki z pierwotnymi przeciwciałami mysimi lub króliczymi przeciwko odpowiednio USP8 (1:250) i NRDP1 (1:250) (patrz tabela materiałów) rozcieńczonymi w buforowanym fosforanie soli fizjologicznej z detergentem (PBT, patrz tabela materiałów), w temperaturze 4 °C przez noc, w celu wykrycia sygnalizacji kompleksu mitofagii przez PLA.</li>
		<li>Współinkubuj komórki z markerem specyficznym dla identyfikacji komórek beta, który nie był hodowany u myszy lub królika, aby nie zakłócać sygnału PLA. W tym przypadku inkubuj komórki z anty-kozim PDX1 (1:500) w PBT. Inkubować wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C, używając folii z tworzywa sztucznego na wierzchu roztworu, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test ligacji zbliżeniowej
<ol>
	<li>Sonda PLA i przeciwbarwienie
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór sondy PLA zgodnie z instrukcjami producenta, tj. przygotować 20 μl roztworu sondy na próbkę, przygotowując końcowe stężenie roztworu sondy 1:5 zarówno anty-myszy, jak i anty-królika w PBT i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji umyj komórki dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut każda, na kołysce.</li>
		<li>Tuż przed inkubacją z roztworem sondy dodać wtórny anty-kozi Cy5 o końcowym stężeniu 1:600 do roztworu sondy (w celu wykrycia endogennego PDX1). Dodać 20 μl roztworu sondy do każdej komórki, delikatnie przykryć folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacji
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie, w temperaturze pokojowej, buforem A (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów) przez 5 minut każda, na kołysce.</li>
		<li>Przygotować roztwór do ligacji (część odczynników wykrywających, patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. W tym celu rozcieńczyć podwiązanie (5x) w stosunku 1:5 w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Bezpośrednio przed inkubacją dodać 0,025 U/ml ligazy. Dodać 20 μl roztworu do ligacji do komórek. Przykryć folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wzmocnienie
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie w temperaturze pokojowej z buforem A przez 2 minuty każda.</li>
		<li>Przygotować roztwór do amplifikacji (część odczynników do wykrywania, patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć bufor wzmacniający (5x) 1:5 w wodzie uzdatnionej DEPC i przechowywać w ciemności do momentu użycia. Dodać rozcieńczenie polimerazy w stosunku 1:80 (część odczynników wykrywających, patrz tabela materiałów) do roztworu bezpośrednio przed dodaniem roztworu do komórek.</li>
		<li>Dodać 20 μl roztworu amplifikacyjnego do komórek. Przykryj folią z tworzywa sztucznego i umieść w ciemności w temperaturze 37 °C na okres od 1 godziny, 40 minut do 2 godzin, aby uzyskać maksymalny sygnał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do obrazowania
	<ol>
		<li>Umyć komórki dwukrotnie buforem B (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, na kołysce.</li>
		<li>Na koniec umyj komórki raz w 0,01x buforze B, przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na bujaku.</li>
		<li>Mocować próbki, dodając kroplę podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) i ostrożnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na próbkach za pomocą ostrza skalpela w celu wyciśnięcia wszelkich powstałych pęcherzyków. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci na krawędziach.</li>
		<li>Próbki obrazu na mikroskopie zdolnym do uchwycenia wielu płaszczyzn ogniskowych, takim jak laserowy skaningowy mikroskop konfokalny lub odwrócony mikroskop fluorescencyjny z możliwością dekonwolucji, wykonujący co najmniej 9 różnych obrazów płaszczyzny ogniskowej.
		<ol>
			<li>Rejestruj obrazy w 100-krotnym powiększeniu, z wysokością stosu z około 0,45 μm. Wychwytywanie PLA przy wzbudzeniu 550 nm, emisja 570 nm; przeciwbarwienie przy wzbudzeniu 650 nm, emisja 670 nm; i DAPI przy wzbudzeniu 405 nm, emisji 450 nm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby zapewnić zminimalizowanie sygnałów tła obrazu fluorescencyjnego i światła rozproszonego na potrzeby dalszej analizy zdarzeń PLA (zwłaszcza w mikroskopach szerokokątnych), należy przetwarzać obrazy przy użyciu dwuwymiarowego algorytmu dekonwolucji (najbliższego sąsiada) za pomocą standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu. 
		UWAGA: W przypadku Olympusa użyj CellSens, Nikon użyj NIS-Elements, Leica użyj LAS X, Zeiss - ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, a także kilku wtyczek dostępnych za pośrednictwem Image-J. W celu analizy, całkowita liczba interakcji we wszystkich stosach z powinna być analizowana za pomocą oprogramowania Image-J, upewniając się, że analizowane są tylko komórki Pdx-1 dodatnie (sekcja 3.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja oddziaływań PLA
	<ol>
		<li>Otwórz darmową aplikację Image-J i otwórz obraz PLA. Zacznij od pierwszego, ostro ostrego obrazu PLA.</li>
		<li>Kliknij kartę obrazu i wybierz dostosuj, a następnie próg (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). Dostosuj próg, aby usunąć cały niespecyficzny sygnał PLA, zanotuj korektę progu i staraj się zachować spójność przez cały czas analizy.</li>
		<li>Kliknij kartę procesu i wybierz binarny, a następnie utwórz binarny (Rysunek 1B). Użyj obrazu binarnego do pomiaru cząstek, klikając zakładkę "analizuj" i naciskając analizuj cząstki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Na potrzeby analizy upewnij się, że ustawienia są następujące: Rozmiar = 0–Nieskończoność, Okrągłość = 0–1,0, Pokaż = Kontury, pola wyboru Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Kliknij przycisk OK. Zwróć uwagę na liczbę analizowanych cząstek w arkuszu kalkulacyjnym oznaczającą próbkę i pozycję stosu z.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 3.5.2–3.5.4, aż wszystkie ostre stosy z dla próbki zostaną przeanalizowane. Zsumuj całkowitą liczbę cząstek w próbce w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić ilościowo całkowitą liczbę interakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).</li>
<li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li>
<li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1%2FFLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li>
<li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li>
<li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).</li>
<li>Silva Xavier, D. a, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
<li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feat+of+metabolic+proportions%3A+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li>
<li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li>
<li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li>
<li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+alpha%2C+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li>
<li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type%E2%80%93specific+expression+changes+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of β cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li>
<li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li>
<li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+%C3%9F-Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li>
<li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+iron+triggers+PINK1%2FParkin-independent+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li>
<li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Parkin+Zone%3A+Mitophagy+without+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy proste i skuteczne podejście do wykorzystania NRDP1:USP8 PLA w tkankach/komórkach będących przedmiotem zainteresowania w celu ilościowego określenia tworzenia kompleksów mitofagii w górę. Wcześniej potwierdziliśmy tworzenie kompleksu mitofagii CLEC16A-NRDP1-USP8 w komórkach beta trzustki za pomocą kilku metodologii, w tym eksperymentów z koimmunoprecypitacją, badań interakcji bezkomórkowych oraz testów ubikwitynacji in vitro i komórkowych, i wykazaliśmy, w jaki sposób ten kompleks napędza regulowany strum...

Komórki beta trzustki produkują insulinę niezbędną do utrzymania prawidłowej homeostazy glukozy, a ich niepowodzenie powoduje rozwój wszystkich form cukrzycy. Komórki beta zachowują silną zdolność mitochondriów do generowania energii potrzebnej do sprzężenia metabolizmu glukozy z uwalnianiem insuliny. Ostatnio stało się jasne, że utrzymanie funkcjonalnej masy mitochondrialnej ma kluczowe znaczenie dla optymalnego funkcjonowania komórek beta1,2,3. Aby utrzymać funkcjonalną masę mitochondrialną, komórki beta polegają na mechanizmach kontroli jakości w celu usunięcia dysfunkcyjnych, uszkodzonych lub starzejących się mitochondriów4. My i inni wykazaliśmy wcześniej, że komórki beta polegają na wyspecjalizowanej formie obrotu mitochondrialnego, zwanej autofagią mitochondrialną (lub mitofagią), w celu utrzymania kontroli jakości mitochondriów zarówno w wysepkach gryzoni, jak i ludzkich1,2,5. Niestety, nie było prostej metody wykrywania mitofagii, czyli endogennie wyrażanych składników mitofagii, w ludzkich komórkach beta trzustki.
Ostatnio wykazaliśmy, że regulacja mitofagii w komórkach beta opiera się na tworzeniu kompleksu białkowego składającego się z ligaz E3 CLEC16A i NRDP1 oraz deubikwitynazy USP81. Wykazano, że NRDP1 i USP8 niezależnie wpływają na mitofagię poprzez działanie na kluczowy inicjator mitofagii PARKIN6,7. NRDP1 celuje w PARKIN pod kątem ubikwitynacji i degradacji, aby wyłączyć mitofagię6, a USP8 specyficznie deubikwitynuje PARKIN sprzężoną z K6, aby promować jej translokację do mitochondriów7. Technologia testu ligacji zbliżeniowej (PLA) jest najnowszym osiągnięciem w dziedzinie biologii interakcji białek8, umożliwiając wizualizację endogennych interakcji białkowych in situ w pojedynczych komórkach i nie jest ograniczona przez rzadki materiał próbki. Metodologia ta jest szczególnie kusząca dla biologii ludzkich wysp trzustkowych/komórek beta, ze względu na niewielką dostępność próbek, w połączeniu z potrzebą zrozumienia fizjologicznie istotnych kompleksów białkowych w heterogenicznych typach komórek.
Korzystając z podejścia PLA, jesteśmy w stanie obserwować kluczowe endogenne kompleksy mitofagii w pierwotnych ludzkich komórkach beta trzustki i liniach komórkowych neuronów, a także zademonstrować wpływ środowiska cukrzycowego na szlak mitofagii1. Podsumowując, nadrzędnym celem tego protokołu jest analiza specyficznych kompleksów białkowych mitofagii w tkankach pozbawionych obfitego materiału lub tam, gdzie konwencjonalne badania interakcji białkowych nie są możliwe.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA 1X</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Antybiotykowy</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokowy</td><td>Domowe</td><td></td><td>zastosowanie 1X PBS, dodaj 10% surowicy osła i 0,3% detergentu Triton X-100.</td></tr><tr><td>Bufor A</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Aby zrobić 1L: Wymieszaj 8,8 g NaCl, 1,2 g bazy Tris, 500ul Tween-20 z 750 ml ddH20. pH do 7,5 z HCl i napełnij do 1 l. Filtruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4C. Przynieś do RT przed użyciem eksperymentalnym</td></tr><tr><td>Bufor B</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Aby zrobić 1L: Wymieszaj 5,84 g NaCl, 4,24 g bazy Tris, 26 g Tris-HCl z 500 ml ddH20. pH do 7,5, i napełnić do 1L. Przefiltruj roztwór i przechowuj 4C. Przynieś do RT przed użyciem eksperymentalnym</td></tr><tr><td>AffiniPure sprzężony z Cy5 osłem anty-kozy</td><td>Jackson Labs</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do wykrywania Red</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092008-100RXN</td><td>Zestaw zawierający: roztwór do ligacji (5X), ligazę, roztwór do amplifikacji (5X) i polimerazę.</td></tr><tr><td>Sonda DuoLink PLA anty-mysia MINUS</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092004-100RXN</td><td></td></tr><tr><td>Sonda DuoLink PLA anty-królik PLUS</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092002-100RXN</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica</td><td></td><td></td><td></td>bydlęca</tr><tr><td>Kozia poliklonalna anty-PDX1 (klon A17)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-14664</td><td>RRID: AB_2162373</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa trzustki MIN6</td><td>Prezent od D. Stoffers</td><td></td><td>Linia komórkowa insulinoma myszy, wykorzystywana do testów komórkowych.</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-USP8 (klon US872)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>SAB200527</td><td></td></tr><tr><td>Pap-pen</td><td>Research Products International</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Służy do uszczelniania przeciwciał i sondowania roztworów na komórkach, aby zapobiec parowaniu przy użyciu małych objętości roztworu.</td></tr><tr><td>PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem)</td> <td>Domowej roboty</td><td></td><td>Aby zrobić 50 ml: 43,5 ml DDH2O, 5 ml 10 razy PBS, 0,5 ml 10 razy BSA (100 mg / ml roztwór), 1 ml 10% roztwór trytona X-100 w ddH20)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>PIM(ABS) Ludzka surowica AB</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-ABS001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PIM(G) (glutamina)</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-G001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PIM(S) media</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PR619</td><td>Apex Bio</td><td>A812</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Life Technologies (sondy molekularne)</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-FLRF / RNF41 (Nrdp1)</td> <td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-049A</td><td>RRID: AB_2181251</td></tr><tr><td>Komórki SH-SY5Y</td><td>Prezent od L. Satin</td><td></td><td>Ludzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego, wykorzystywana do testów komórkowych.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Woda do pracy z RNA (woda DEPC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP361-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitofagia jest niezbędnym szlakiem kontroli jakości mitochondriów, który jest kluczowy dla bioenergetyki komórek beta wysp trzustkowych do napędzania stymulowanego glukozą uwalniania insuliny. Ocena mitofagii jest trudna i często wymaga reporterów genetycznych lub wielu uzupełniających technik, które nie są łatwe do wykorzystania w próbkach tkanek, takich jak pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe. W tym miejscu demonstrujemy solidne podejście do wizualizacji i ilościowego określania powstawania kluczowych endogennych kompleksów mitofagii w pierwotnych ludzkich wyspach trzustkowych. Wykorzystując czułą technikę ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji regulatorów mitofagii NRDP1 i USP8, jesteśmy w stanie specyficznie określić ilościowo powstawanie niezbędnych kompleksów mitofagii in situ. Łącząc to podejście z przeciwbarwieniem dla czynnika transkrypcyjnego PDX1, możemy określić ilościowo kompleksy mitofagiczne i czynniki, które mogą upośledzać mitofagię, szczególnie w komórkach beta. Metodologia, którą opisujemy, przezwycięża potrzebę dużych ilości ekstraktów komórkowych wymaganych do innych badań interakcji białko-białko, takich jak immunoprecypitacja (IP) lub spektrometria mas, i jest idealna dla cennych próbek ludzkich wysp trzustkowych, które na ogół nie są dostępne w wystarczających ilościach dla tych podejść. Co więcej, metodologia ta eliminuje potrzebę stosowania technik sortowania przepływowego w celu oczyszczenia komórek beta z heterogenicznej populacji wysp trzustkowych do dalszych zastosowań białkowych. W ten sposób opisujemy cenny protokół wizualizacji mitofagii, wysoce kompatybilny do stosowania w heterogenicznych i ograniczonych populacjach komórek.

Przeprowadziliśmy wstępne eksperymenty w linii komórkowej beta trzustki MIN6 oraz linii komórkowej neuroblastoma SH-SY5Y, aby zoptymalizować i potwierdzić zarówno specyficzność przeciwciał, jak i wizualizowane oddziaływania białek. Komórki MIN6 wysiano na szkiełka nakrywkowe w zagęszczeniu 30 000 komórek/mL i pozostawiono do przywarcia na 48 h, natomiast komórki SH-SY5Y wysiano na szkiełka nakrywkowe w zagęszczeniu 15 000 komórek/mL i pozostawiono do przywarcia na 24 h. Następnie zastosow...

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Protokół ten pozwala nam monitorować endogenne kompleksy mitofagiczne w tkankach ludzkich, takich jak komórki beta, ułatwiając badania nad mitofagią w kluczowych tkankach istotnych translacyjnie. Jedną z zalet tej techniki jest jej zdolność do wizualizacji ważnych kompleksów mitofagii in vivo w tkankach o rzadkiej dostępności lub w małej liczbie próbek. Po izolacji zgodnie ze standardowymi protokołami, posiew od czterech do sześciu razy od 10 do trzech równoważników ludzkich wysp trzustkowych w 10 mililitrach kompletnej pożywki trzustkowej przez co najmniej jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia użyj mikroskopu mikroskopu mikroskopowego o trzykrotnym powiększeniu, aby policzyć poszczególne ludzkie wysepki w kulturze. Wybierz 40 wysepek na zabieg lub stan zainteresowania do 1,5 mililitrowych probówek pożywki z wysepek. Osadzaj wysepki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze PBS uzupełnionym 50 mikromolami PR619.Odwrócić probówkę i zebrać wysepki przez odwirowanie do ponownego przepłukania w świeżym PBS i inhibitorze deubikwitynazy. Po drugim odwirowaniu rozdziel wyspy na pojedyncze komórki za pomocą 125 mikrolitrów 0,25% trypsyny i inhibitora przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza z okresowym delikatnym pipetowaniem. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą jednego mililitra podgrzanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza pożywki z wyspami trzustkowymi uzupełnionej PR619.Zebrać wysepki przez odwirowanie przez dwa przemycia w świeżym PBS plus inhibitor na przemycie. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić zdysocjowane wyspy w 150 mikrolitrach świeżego PBS plus inhibitor. W celu przylegania i utrwalenia poszczególnych wysp trzasnkowych, cytospin roztwór komórkowy na matowych, naładowanych szkiełkach mikroskopowych i obrysuj obszar komórkowy hydrofobowym pisakiem.Następnie utrwal otoczone komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W celu analizy immunohistochemicznej próbek wysp trzustkowych należy przemyć komórki dwoma pięciominutowymi płukaniami w PBS w temperaturze pokojowej, a następnie niespecyficzne blokowanie wiązania 10% surowicą osła i PBS plus 0,3% detergentu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej należy połączyć komórki z pierwszorzędowym mysim przeciwciałem przeciwko peptydazie 8 specyficznej dla ubikwityny, pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym przeciwko białku degradacji receptora neureguliny-1 oraz markerem specyficznym do identyfikacji komórek beta, który nie został podniesiony u myszy lub królika, aby nie zakłócać sygnału testu ligacji zbliżeniowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego ranka umyj próbki dwoma pięciominutowymi płukaniami w PBS na bujaku. Dodać przeciwciało drugorzędowe anty-kozie Cy5 do świeżo przygotowanego roztworu do testu ligacji zbliżeniowej. Po drugim przemyciu oznaczyć każdą próbkę z wysepek 20 mikrolitrami roztworu sondy i odzyskać szkiełka folią z tworzywa sztucznego na jednogodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwoma pięciominutowymi płukaniami w buforze A na kołysce, a następnie inkubować z 20 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu do ligacji uzupełnionego o 0,25 jednostki na mikrolitr ligazy na szkiełko przez 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec podwiązania przemyj komórki dwa razy buforem A przez dwie minuty na płukanie. Przykryj każdą próbkę 20 mikrolitrami roztworów amplifikacyjnych uzupełnionych polimerazą na 100 do 120 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby przygotować komórki do obrazowania, należy umyć próbki dwa razy w świeżym buforze A przez 10 minut na przemycie na kołysce, a następnie raz przemyć je w 0,1-krotnym buforze B przez dwie minuty na bujaku. Po ostatnim przemyciu zamocuj szkiełka z kroplą podłoża montażowego zawierającego DAPI i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na każdej próbce za pomocą skalpela, aby wycisnąć wszelkie pęcherzyki. Następnie uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci wokół krawędzi.Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu zdolnego do uchwycenia wielu płaszczyzn ogniskowych i wybierz 100-krotne powiększenie. Ustaw wysokość stosu Z na około 0,45 mikrometra i odpowiednie parametry barwienia, barwienia przeciwstawnego oraz wzbudzenia i emisji sygnału komórki pod napięciem. Uzyskaj co najmniej dziewięć różnych obrazów płaszczyzny ogniskowej.Aby upewnić się, że sygnały tła obrazu fluorescencyjnego i światło rozproszone są zminimalizowane, przetwarzaj obrazy za pomocą dwuwymiarowego algorytmu dekonwolucji najbliższego sąsiada przy użyciu standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Aby określić ilościowo interakcje testu ligacji zbliżeniowej, otwórz ImageJ i otwórz obraz testu ligacji zbliżeniowej. Zaczynając od pierwszego ostrego obrazu, kliknij Obraz i wybierz Dostosuj i próg.Dostosuj próg, aby usunąć cały niespecyficzny sygnał testu ligacji zbliżeniowej i zanotuj korektę progu, aby spróbować utrzymać spójność sygnału przez całą analizę. Kliknij Przetwarzaj i wybierz Binarny i Utwórz binarny. Upewnij się, że Rozmiar jest ustawiony na zero do nieskończoności, Kołowość jest ustawiona na zero do jednego, Pokaż jest ustawiony na Kontury i zaznacz pola Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki.Zwróć uwagę na liczbę analizowanych cząstek w arkuszu kalkulacyjnym oznaczającą próbkę i pozycję stosu Z. Następnie kliknij przycisk Analizuj i Analizuj cząstki, aby zmierzyć cząstki. Po przeanalizowaniu wszystkich ostrych stosów Z dla próbki wyślij całkowitą liczbę cząstek dla próbki w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić ilościowo całkowitą liczbę interakcji.Przeciwciała stosowane w teście zbliżeniowym są specyficzne dla ligandów i nie wykazują żadnego nakładania się. Jak zaobserwowano, protokół dyspersji jest bardzo skuteczny w uzyskiwaniu pojedynczych komórek w polu widzenia mikroskopu do dalszej analizy, a barwienie komórek beta jest zachowywane po barwieniu testem ligacji zbliżeniowej w pierwotnych ludzkich wyspach trzustkowych. Korzystając z zademonstrowanych technik, można było ustalić, że interakcja białka degradacji receptora neureguliny-1 i peptydazy 8 specyficznej dla ubikwityny jest zmniejszona po 48-godzinnej ekspozycji na palmitynian, co podkreśla wykonalność tego testu do oceny kluczowych endogennych czynników mitofagii po bodźcach cukrzycowych.Skuteczne i łagodne rozproszenie ludzkich wysp trzustkowych ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia ilościowego określenia prawidłowych populacji komórek w dalszej części rzeki. PLA pozwala na ocenę ważnych kompleksów mitofagii w próbkach ludzkich wysp trzustkowych, umożliwiając analizę mitofagii i biologicznie ważnych próbek pobranych od ludzi, posuwając naprzód dziedzinę badań nad cukrzycą.

visualization-endogenous-mitophagy-complexes-situ-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Poniższy protokół przedstawia proces wycinania trzustki do obrazowania wirtualnych przekrojów oraz następującą po nim kwantyfikację wszystkich komórek beta znakowanych GFP w całej trzustce.

Ilościowe oznaczanie masy komórek beta trzustki u myszy in situ

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Poznaj metodę wizualizacji endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej. Ta technika umożliwia badanie mitofagii w tkankach z ograniczoną ilością materiału biologicznego.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Przeglądaj więcej filmów