Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Protokół ten pozwala nam monitorować endogenne kompleksy mitofagiczne w tkankach ludzkich, takich jak komórki beta, ułatwiając badania nad mitofagią w kluczowych tkankach istotnych translacyjnie. Jedną z zalet tej techniki jest jej zdolność do wizualizacji ważnych kompleksów mitofagii in vivo w tkankach o rzadkiej dostępności lub w małej liczbie próbek. Po izolacji zgodnie ze standardowymi protokołami, posiew od czterech do sześciu razy od 10 do trzech równoważników ludzkich wysp trzustkowych w 10 mililitrach kompletnej pożywki trzustkowej przez co najmniej jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia użyj mikroskopu mikroskopu mikroskopowego o trzykrotnym powiększeniu, aby policzyć poszczególne ludzkie wysepki w kulturze. Wybierz 40 wysepek na zabieg lub stan zainteresowania do 1,5 mililitrowych probówek pożywki z wysepek. Osadzaj wysepki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze PBS uzupełnionym 50 mikromolami PR619.

Odwrócić probówkę i zebrać wysepki przez odwirowanie do ponownego przepłukania w świeżym PBS i inhibitorze deubikwitynazy. Po drugim odwirowaniu rozdziel wyspy na pojedyncze komórki za pomocą 125 mikrolitrów 0,25% trypsyny i inhibitora przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza z okresowym delikatnym pipetowaniem. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą jednego mililitra podgrzanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza pożywki z wyspami trzustkowymi uzupełnionej PR619.

Zebrać wysepki przez odwirowanie przez dwa przemycia w świeżym PBS plus inhibitor na przemycie. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić zdysocjowane wyspy w 150 mikrolitrach świeżego PBS plus inhibitor. W celu przylegania i utrwalenia poszczególnych wysp trzasnkowych, cytospin roztwór komórkowy na matowych, naładowanych szkiełkach mikroskopowych i obrysuj obszar komórkowy hydrofobowym pisakiem.

Następnie utrwal otoczone komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W celu analizy immunohistochemicznej próbek wysp trzustkowych należy przemyć komórki dwoma pięciominutowymi płukaniami w PBS w temperaturze pokojowej, a następnie niespecyficzne blokowanie wiązania 10% surowicą osła i PBS plus 0,3% detergentu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej należy połączyć komórki z pierwszorzędowym mysim przeciwciałem przeciwko peptydazie 8 specyficznej dla ubikwityny, pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym przeciwko białku degradacji receptora neureguliny-1 oraz markerem specyficznym do identyfikacji komórek beta, który nie został podniesiony u myszy lub królika, aby nie zakłócać sygnału testu ligacji zbliżeniowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka umyj próbki dwoma pięciominutowymi płukaniami w PBS na bujaku. Dodać przeciwciało drugorzędowe anty-kozie Cy5 do świeżo przygotowanego roztworu do testu ligacji zbliżeniowej. Po drugim przemyciu oznaczyć każdą próbkę z wysepek 20 mikrolitrami roztworu sondy i odzyskać szkiełka folią z tworzywa sztucznego na jednogodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwoma pięciominutowymi płukaniami w buforze A na kołysce, a następnie inkubować z 20 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu do ligacji uzupełnionego o 0,25 jednostki na mikrolitr ligazy na szkiełko przez 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec podwiązania przemyj komórki dwa razy buforem A przez dwie minuty na płukanie. Przykryj każdą próbkę 20 mikrolitrami roztworów amplifikacyjnych uzupełnionych polimerazą na 100 do 120 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby przygotować komórki do obrazowania, należy umyć próbki dwa razy w świeżym buforze A przez 10 minut na przemycie na kołysce, a następnie raz przemyć je w 0,1-krotnym buforze B przez dwie minuty na bujaku. Po ostatnim przemyciu zamocuj szkiełka z kroplą podłoża montażowego zawierającego DAPI i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na każdej próbce za pomocą skalpela, aby wycisnąć wszelkie pęcherzyki. Następnie uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci wokół krawędzi.

Aby zobrazować próbki, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu zdolnego do uchwycenia wielu płaszczyzn ogniskowych i wybierz 100-krotne powiększenie. Ustaw wysokość stosu Z na około 0,45 mikrometra i odpowiednie parametry barwienia, barwienia przeciwstawnego oraz wzbudzenia i emisji sygnału komórki pod napięciem. Uzyskaj co najmniej dziewięć różnych obrazów płaszczyzny ogniskowej.

Aby upewnić się, że sygnały tła obrazu fluorescencyjnego i światło rozproszone są zminimalizowane, przetwarzaj obrazy za pomocą dwuwymiarowego algorytmu dekonwolucji najbliższego sąsiada przy użyciu standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Aby określić ilościowo interakcje testu ligacji zbliżeniowej, otwórz ImageJ i otwórz obraz testu ligacji zbliżeniowej. Zaczynając od pierwszego ostrego obrazu, kliknij Obraz i wybierz Dostosuj i próg.

Dostosuj próg, aby usunąć cały niespecyficzny sygnał testu ligacji zbliżeniowej i zanotuj korektę progu, aby spróbować utrzymać spójność sygnału przez całą analizę. Kliknij Przetwarzaj i wybierz Binarny i Utwórz binarny. Upewnij się, że Rozmiar jest ustawiony na zero do nieskończoności, Kołowość jest ustawiona na zero do jednego, Pokaż jest ustawiony na Kontury i zaznacz pola Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki.

Zwróć uwagę na liczbę analizowanych cząstek w arkuszu kalkulacyjnym oznaczającą próbkę i pozycję stosu Z. Następnie kliknij przycisk Analizuj i Analizuj cząstki, aby zmierzyć cząstki. Po przeanalizowaniu wszystkich ostrych stosów Z dla próbki wyślij całkowitą liczbę cząstek dla próbki w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić ilościowo całkowitą liczbę interakcji.

Przeciwciała stosowane w teście zbliżeniowym są specyficzne dla ligandów i nie wykazują żadnego nakładania się. Jak zaobserwowano, protokół dyspersji jest bardzo skuteczny w uzyskiwaniu pojedynczych komórek w polu widzenia mikroskopu do dalszej analizy, a barwienie komórek beta jest zachowywane po barwieniu testem ligacji zbliżeniowej w pierwotnych ludzkich wyspach trzustkowych. Korzystając z zademonstrowanych technik, można było ustalić, że interakcja białka degradacji receptora neureguliny-1 i peptydazy 8 specyficznej dla ubikwityny jest zmniejszona po 48-godzinnej ekspozycji na palmitynian, co podkreśla wykonalność tego testu do oceny kluczowych endogennych czynników mitofagii po bodźcach cukrzycowych.

Skuteczne i łagodne rozproszenie ludzkich wysp trzustkowych ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia ilościowego określenia prawidłowych populacji komórek w dalszej części rzeki. PLA pozwala na ocenę ważnych kompleksów mitofagii w próbkach ludzkich wysp trzustkowych, umożliwiając analizę mitofagii i biologicznie ważnych próbek pobranych od ludzi, posuwając naprzód dziedzinę badań nad cukrzycą.