Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Reakcje neuronalne dają wgląd w aktywność mózgu, ale mogą się różnić w zależności od eksperymentów i osób. Protokół ten pomaga, automatyzując rejestrowanie i analizę stymulacji oraz upraszczając programowanie różnych typów i wzorców bodźców. Zautomatyzowana technika umożliwia równoległe nagrywanie wielu neuronów i organizmów w tym samym formacie mikroprzepływowym.

Poprawia to powtarzalność zapisów i umożliwia badanie zmienności neuronalnej w różnych populacjach. Do ujawnienia zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja i integracja sensoryczna, potrzebne są różne wzorce stymulacji. Metodę tę można uogólnić na inne dynamiczne sygnały z komórek i organoidów na organizmy i rośliny.

Aby rozpocząć, włącz mikroskop, napełnij i usuń pęcherzyki powietrza z rurki zbiornika za pomocą strzykawki zalewającej, a następnie napełnij rurkę odpływową buforem. Wyjąć urządzenie mikroprzepływowe z eksykatora próżniowego. Umieść urządzenie na mikroskopie i szybko włóż rurkę wylotową.

Delikatnie nacisnąć strzykawkę wylotową, aby wstrzyknąć płyn do urządzenia, aż kropla wypłynie z wlotu. W momencie pojawienia się kropli na wlocie użyj połączenia kropla-kropla, aby włożyć odpowiednią rurkę wlotową płynu, upewniając się, że krople cieczy są obecne zarówno na rurce wlotowej, jak i iluminatorze urządzenia, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyka. Podłącz następną rurkę wlotową do następnej kropli.

W razie potrzeby wstrzyknij więcej płynu z wylotu i powtarzaj, aż wszystkie wloty zostaną wypełnione. Włóż solidny kołek blokujący do nieużywanych wlotów i portu ładowania ślimaka. Sprawdź przepływ na ekranie, aby upewnić się, że przepływ idzie w żądanym kierunku.

Przekręć zawór pierwszy na sterowniku zaworu i obserwuj przepływ bodźca wpływający do areny mikroprzepływowej. Jeśli przepływ jest niezrównoważony, wyreguluj wysokość zbiornika. Przenieś młode dorosłe zwierzęta na niewysiewane podłoże wzrostowe nicieni lub płytkę agarową NGM za pomocą szpikulca z drucianą końcówką, a następnie zalej płytkę około pięcioma mililitrami jednego buforu podstawowego XS, aby zwierzęta mogły pływać.

Wciągnij robaki do strzykawki ładującej o pojemności od jednego do trzech mililitrów za pomocą dołączonej rurki wstępnie wypełnionej jednym buforem podstawowym XS. Za pomocą stereoskopu przesuń rurkę poniżej powierzchni cieczy jedną ręką do każdego pożądanego zwierzęcia i wciągnij ją do rurki za pomocą strzykawki trzymanej w drugiej ręce. Zamknij obrys wylotu, wyjmij kołek ładujący ślimak i podłącz strzykawkę ładującą ślimak do urządzenia za pomocą połączenia drop-to-drop.

Następnie delikatnie wprowadź zwierzęta na arenę. Ustalić przepływ buforowy i odczekać do jednej godziny na unieruchomienie przez tetraizol. Korzystając z edytora tekstu, utwórz plik tekstowy definicji bodźca o nazwie userdefinedacquisitionsettings.

TXT zawierający ustawienia stymulacji dla automatycznej akwizycji obrazu. Plik ten definiuje parametry akwizycji mikroskopu, takie jak czas ekspozycji i wzbudzenia, czas trwania próby, interwały i katalog zapisu. Określa również typ eksperymentu i ustawienia czasu stymulacji.

W przypadku eksperymentu z pojedynczym bodźcem należy użyć formatu z tylko jednym powtarzającym się poleceniem stymulacji. W przypadku eksperymentu z wieloma wzorcami użyj formatu z wieloma poleceniami stymulacji, dołączając sekwencję cyfr wzorca, która reprezentuje kolejność wzorców bodźców. Dla każdego wzorca wprowadź polecenie stymulacji w osobnym wierszu.

Następnie uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Sprawdź, czy wszystkie wloty płynów są otwarte, przepływ jest pożądany w obrębie areny, a neurony będące przedmiotem zainteresowania są w centrum uwagi w oknie na żywo. Następnie zamknij okno na żywo i uruchom skrypt multipatternrunscript.

BSH w oprogramowaniu. Aby przeanalizować dane, uruchom NeuroTracker, klikając kolejno wtyczki, następnie śledzenie, a następnie NeuroTracker. Wybierz folder zawierający pliki wideo TIFF do śledzenia i wybierz zakres plików do przetworzenia.

Następnie, korzystając z menu obrazu i dostosowywania, otwórz okna sterowania jasnością, kontrastem i progiem. Sprawdź ciemne tło i nie resetuj zakresu w oknie progu, ustawiając metodę progowania na domyślną, a wizualizację na kolor czerwony. Następnie kliknij auto w oknie kontrastu jasności, aby zobaczyć neurony.

W oknie kontrastu jasności dostosuj suwaki minimum i maksimum, aż neurony będą wyraźnie rozróżnialne. Następnie dostosuj poziom progu, aż wszystkie neurony pojawią się jako małe czerwone plamki oddzielone od innych obiektów. Dostosuj suwak klatki, aby obserwować zmiany ruchu i intensywności neuronów, zwracając uwagę na zwierzęta, które mają zostać wykluczone ze śledzenia, na przykład z powodu nakładania się na siebie innych zwierząt.

Po zidentyfikowaniu neuronów do śledzenia, w razie potrzeby dostosuj poziom progu dla każdego zwierzęcia, tak aby czerwony obszar progowy nad neuronem był widoczny w każdej klatce. Kliknij neuron, aby zapisać jego położenie i poziom progowy. Po wybraniu wszystkich neuronów naciśnij spację, aby rozpocząć śledzenie.

Monitoruj proces śledzenia każdego zwierzęcia i wprowadzaj wszelkie niezbędne poprawki. Jeśli NeuroTracker zatrzyma się, oznacza to, że utracił neuron. Dostosuj poziom progowy zgodnie z potrzebami i ponownie kliknij neuron.

Jeśli pole integracji przeskoczy do innego pobliskiego zwierzęcia lub struktury nieneuronalnej, naciśnij spację, aby wstrzymać. Przesuń suwak z powrotem do pierwszej błędnej klatki i ponownie kliknij właściwą lokalizację neuronu. Uruchom neurotrackersummarypdf.

m w MATLABie i wybierz folder zawierający pliki tekstowe danych NeuroTracker. Poczekaj na wygenerowanie pliku PDF z podsumowaniem, który pozwoli na weryfikację procesu śledzenia. Zwierzęta można zidentyfikować na podstawie liczb i odpowiedzi neuronalnych każdego zwierzęcia i próby, a następnie można je oglądać w celu oceny zmienności populacji.

Użyj funkcji Databrowse. M, aby eksplorować dane neuronowe pogrupowane według numeru badania, liczby zwierząt, wzorca stymulacji lub według innej kategorii. Zjawisko hamowania czasowego przetestowano w eksperymencie z parami impulsów, w którym uzyskano osiem wzorów składających się z dwóch jednosekundowych impulsów zapachowych oddzielonych interwałem od zera do 20 sekund.

Pierwszy jednosekundowy impuls zapachowy wywołał równą wielkość odpowiedzi w neuronach AWA wykrywających diacetyl, a odpowiedzi w drugim impulsie różniły się w zależności od interwału między bodźcami. Odhamowanie oceniano w eksperymencie catch trial, w którym zaobserwowano adaptację do bodźca diacetylowego, ale prezentacja nowego bodźca 2-metylopirazyny nie wywołała silnego efektu odhamowania. Testowana stymulacja multimodalna wykazała, że sama stymulacja chemiczna powoduje adaptację, podczas gdy sama stymulacja optyczna nie.

Jednak połączony wzorzec bodźców multimodalnych wykazał, że reakcje optogenne były podatne na adaptację wywołaną chemicznie. Modyfikując projekt mikroprzepływowy tak, aby obejmował dwie areny, możemy porównać zaburzenia genetyczne lub inne perturbacje z dopasowanym odniesieniem w tym samym czasie. Po skonfigurowaniu system można modyfikować na wiele sposobów.

Na przykład automatycznie zmierzyliśmy reakcje na dawkę chemiczną i zależne od stanu zmiany aktywności neuronalnej, takie jak stan snu i czuwania.