Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie powstawania powłoki węchowej i pamięci przy użyciu długoterminowego dostępu do dwóch niezależnych etapów przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych. Osiąga się to poprzez montaż tanich elektrod wielokanałowych z izolowanych mikrodrutów miedzianych i niestandardowych uchwytów. Następnym krokiem jest przygotowanie żywej pszczoły miodnej poprzez usunięcie części jej torebki piersiowej w celu wprowadzenia dwóch elektrod potraktowanych barwnikiem fluorescencyjnym do odsłoniętego mózgu.

Trzecim krokiem jest nagranie z dwóch niezależnych tabletek lub przewodów neurologicznych w szlaku węchowym, jednocześnie stymulując zapachami kwiatowymi i feromonami. Później, po rozbiorze mózgu, inny znacznik fluorescencyjny jest wstrzykiwany do płata anteny w celu wypełnienia docelowych neuronów. Zasypane ścieżki i ślady elektrod są następnie wizualizowane w celu uzyskania trójwymiarowej rekonstrukcji architektury neuronalnej.

Ostatecznie, dzięki tym technikom można lepiej zrozumieć relacje w powłoce zapachowej między dwiema populacjami neuronów na różnych poziomach przetwarzania, takich jak płat anteny i ciało grzyba. Tak więc główną zaletą tej techniki istniejących metod jest to, że nasze elektrody wielokanałowe są bardzo małe i mogą być używane w połączeniu, co oznacza, że możemy nagrywać jednocześnie w różnych obszarach mózgu po zakotwiczeniu. Elastyczne przewody pozwalają na stabilne przywołanie przez kilka godzin w zachowujących się zwierzętach.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neuropatologii, takie jak zrozumienie, w jaki sposób zwierzęta odbierają, postrzegają i ostatecznie obliczają fabryki olf w życiu na podstawie swojego środowiska. Ta technika podwójnego nagrywania może zapewnić wgląd w mechanizm leżący u podstaw kodowania zapachów i sieci neuronowych w ogóle. Może być również stosowany do innych organizmów modelowych w bezkręgowcach lub chorobie i neurobiologii.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ konieczne jest wiele treningu, aby zidentyfikować neurony pszczoły miodnej przy użyciu tylko morfologicznych punktów orientacyjnych, takich jak płat wewnętrzny lub pionowy płat ciała grzyba. W przypadku tego protokołu zbuduj adapter elektrody, który będzie pasował do standardowej płytki interfejsu elektrody. Najpierw trzy krótkie kawałki izolowanych przewodów do 18-pinowego złącza.

Następnie wytnij kawałek płyty z pleksi i włóż płytki rowek wzdłuż najdłuższego boku. Następnie wkręć końcówki lutownicze w płytkę z pleksi i przyklej płytkę do górnej części złącza. Następnie podłącz podstawę do końcówek za pomocą trzech krótkich przewodów.

Następnie umieść szklaną kapilarnę w rowku płyty z pleksi. Kapilara powinna być w stanie się przesunąć i być zabezpieczona śrubą Za pomocą szpilki minutowej wysuń szklaną kapilę na zewnątrz o około pięć milimetrów. Kapilara i trzpień posłużą do podparcia i stabilizacji mikrodrutów elektrody.

Następnie ułóż trzy mikroprzewody. Za pomocą taśmy klejącej dla lepszego dostępu szklaną kapilarnę można usunąć za pomocą 12-woltowego kleju igłowego do. Przewody wraz z woskiem dentystycznym LMP nie sklejają ostatniej trzeciej części drutów.

Teraz podłącz ten wielokanałowy zespół mikroprzewodów do adaptera elektrody. Ustaw przedłużoną szklaną kapilarnę równolegle do mikroprzewodów. Zabezpiecz to nasadkę woskiem dentystycznym wzdłuż zachodzącej na siebie szklanej kapilary i szpilki minutowej.

Następnie przytnij druty elektrody, pozostawiając dwa do trzech centymetrów wystających z kołka minutowego i dwa do trzech centymetrów wystających z końca elektrody. Następnie przymocuj kapilarę do adaptera elektrody i za pomocą ustabilizuj wszystko na miejscu. W 360 stopniach Celsjusza.

końce przewodów prostopadle do końcówek. Następnie sprawdź, czy jest wystarczająco silny kontakt elektryczny, sprawdzając, czy ich impedancja wynosi około 300 kiloomów przy jednym kilohercu. Teraz podłącz kanały adaptera drugiej elektrody do elektrody głównej i elektrody odniesienia i mięśniowe do podstawy elektrod głównych.

Na koniec zamontuj elektrodę główną na płytce interfejsu stopnia głównego. Zamocuj drugą elektrodę na osobnym adapterze po uzyskaniu pszczoły miodnej schładzaj jedną na lodzie, aż zostanie unieruchomiona. Następnie zamocuj pszczołę w standardowym uchwycie z pleksi z odsłoniętą głową.

Nałóż podgrzany wosk dentystyczny na podstawę oczu i połączenie między głową a klatką piersiową, zabezpieczając w ten sposób głowę. Kontynuuj używanie wosku do unieruchomienia oka krajobrazowego czułków na kapsułce głowy. Unikaj nakładania wosku na fagel, który musi być skierowany do przodu.

Pro Bois powinien być wolny od uderzeń. Sprawdź, czy może się poruszać. Teraz ogol kapsułkę głowy, aby poprawić dostępność.

Następnie nakarm pszczołę całą 30% sacharozy, którą spożyje. Zapewnia to dobre przygotowanie, żywotność i wilgotność tkanek. Teraz za pomocą mikroskalpela przetnij pionowo wzdłuż granicy oka i poziomo nad podstawami anteny.

Kontynuuj cięcie pod okiem komórki O i usuń luźny naskórek. Gruczoły hipogardłowe należy odsunąć na bok, podobnie jak tchawicę. Spowoduje to oczyszczenie ścieżki do włożenia elektrody.

Zacznij od włożenia elektrody referencyjnej, srebrnego drutu o grubości 35 mikronów. Najpierw wykonaj małe nacięcie w ipsilateralnym oku złożonym. Następnie wsuń przez niego elektrodę.

Następnie włóż drugi drut do obszaru projekcji mięśni poniżej bocznego oka komórki O. Aby później zobrazować położenie elektrod, zanurz je w roztworze 0,5 molowego chlorku potasu i 5% Alexa Hydrocyte 4 88 na trzy minuty. Następnie, za pomocą mikromanipulatorów, umieść dwie elektrody w mózgu.

Zorientuj się, identyfikując płat anteny i pionowy płat korpusu grzyba. Tutaj jedna elektroda znajduje się w bocznym torze płata anteny o głębokości 180 mikronów, a druga w przyśrodkowym odcinku płata anteny. Włożony na głębokość około 300 mikronów.

Uzupełnij rozmieszczenie elektrod, zakotwiczając je za pomocą dwóch elementów. Krzem pokrywa całą przestrzeń nad mózgiem, co również zapobiegnie wysychaniu tkanek. Następnie kontynuuj nagrywanie, aby wyodrębnić aktywność jednostki z zarejestrowanego sygnału zewnątrzkomórkowego.

Użyj dostępnego oprogramowania do sortowania spajków. Korzystaj ze zróżnicowanych kanałów elektrod. Zastosuj techniki dopasowywania szablonów jednocześnie na wszystkich trzech kanałach elektrod, aby wykryć różne kombinacje przebiegów, które odpowiadają za pojedyncze zdarzenia spajków.

I wreszcie kontrola pod kątem prawidłowej separacji jednostek. Wykorzystanie analizy składowych głównych na pojedynczych impulsach trzech zarejestrowanych kanałów elektrod zróżnicowanych. Po wykonaniu nagrań ostrożnie usuń krzem i elektrody z pszczoły.

Następnie przepłucz mózg roztworem obrączki pszczół i usuń gruczoły i tchawicę. Następnie za pomocą mikropipety wstrzyknąć do płata anteny, 5% mikro rubinu rozpuszczonego w jednym molowym octanie potasu. Zapewni to następczą etykietę do ścieżek płata.

Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki w maksymalnej ciemności. Ponownie przepłucz mózg obrączkami pszczół trzy razy i pozwól barwnikowi inkubować przez 30 do 45 minut. Unieruchom pszczołę, schładzając ją w lodówce.

Następnie odizoluj mózg. Utrwal mózg w 4% Para aldehyd w 0,1 molowym PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i z delikatnym mieszaniem. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami odwodnienia i oczyszczania Po ponownym wypełnieniu neuronów projekcyjnych w płacie anteny mikro rubinowym znacznikiem, widok projekcyjny tych neuronów został złożony z orto warstw wzdłuż osi Z.

Barwnik Alexa Hydrocyte 4 88 na dwóch elektrodach pokazuje ich wprowadzenie w przyśrodkowym płatku anteny oraz w bocznym odcinku płata anteny. Rekonstrukcja 3D wybarwionych komórek docelowych i miejsc wprowadzenia elektrod została wykorzystana do stworzenia schematu trajektorii dwóch linii płatów antenowych, jednoczesnego rejestrowania z dwóch dróg płatów antenowych, podczas gdy stymulacja pszczoły różnymi stężeniami zapachu została wykorzystana do zbadania przetwarzania czasowego. Aktywność oceniano w kolejnych etapach przetwarzania.

Analiza głównych składowych wektorów populacji neuronów projekcyjnych płata anteny i neuronów zewnętrznych pokazuje, że zapach w neuronach projekcyjnych był przedłużony i trwał dłużej niż bodziec. Natomiast w populacji neuronów zewnętrznych reprezentowane były tylko typy zapachu i zapachu wyłączenia. Tak więc, obserwując aktywność w czasie, zewnętrzna populacja neuronów po prawej stronie wykazuje aktywność separacji zapachów na nieco przed tym, jak populacja neuronów projekcyjnych zacznie rozwijać swoją aktywność wywołaną zapachem.

Stymulacja zapachowa jest oznaczona kolorem szarym. Po opanowaniu zbudowanie elektrody zajmuje około 30 minut. Przygotowanie pszczoły i włożenie elektrod w obszary docelowe można wykonać w ciągu pół godziny, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że każdy krok wymaga dużo praktyki i cierpliwości, dopóki nie zostanie opanowany. Zachowaj szczególną ostrożność podczas przesuwania przewodów elektrod do ich punktów połączeń i nagrywania z pożądanego zasięgu mózgu. Wymagana jest solidna wiedza na temat anatomii mózgu pszczoły miodnej Po jego rozwoju.

Technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się neuropatologią i węchem owadów zbadanie dokładnych zależności czasowych między aktywnością różnych szlaków neuronalnych i ośrodków mózgowych u zachowujących się pszczół miodnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować i używać wielokanałowych elektrod mikroprzewodowych do jednoczesnego nagrywania z dwóch obszarów mózgu i zachowujących się pszczół miodnych. Powinieneś także być w stanie zwizualizować dokładne lokalizacje elektrod nagrywających.