Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych
July 21st, 2014
U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie powstawania powłoki węchowej i pamięci przy użyciu długoterminowego dostępu do dwóch niezależnych etapów przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych. Osiąga się to poprzez montaż tanich elektrod wielokanałowych z izolowanych mikrodrutów miedzianych i niestandardowych uchwytów. Następnym krokiem jest przygotowanie żywej pszczoły miodnej poprzez usunięcie części jej torebki piersiowej w celu wprowadzenia dwóch elektrod potraktowanych barwnikiem fluorescencyjnym do odsłoniętego mózgu.
Trzecim krokiem jest nagranie z dwóch niezależnych tabletek lub przewodów neurologicznych w szlaku węchowym, jednocześnie stymulując zapachami kwiatowymi i feromonami. Później, po rozbiorze mózgu, inny znacznik fluorescencyjny jest wstrzykiwany do płata anteny w celu wypełnienia docelowych neuronów. Zasypane ścieżki i ślady elektrod są następnie wizualizowane w celu uzyskania trójwymiarowej rekonstrukcji architektury neuronalnej.
Ostatecznie, dzięki tym technikom można lepiej zrozumieć relacje w powłoce zapachowej między dwiema populacjami neuronów na różnych poziomach przetwarzania, takich jak płat anteny i ciało grzyba. Tak więc główną zaletą tej techniki istniejących metod jest to, że nasze elektrody wielokanałowe są bardzo małe i mogą być używane w połączeniu, co oznacza, że możemy nagrywać jednocześnie w różnych obszarach mózgu po zakotwiczeniu. Elastyczne przewody pozwalają na stabilne przywołanie przez kilka godzin w zachowujących się zwierzętach.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neuropatologii, takie jak zrozumienie, w jaki sposób zwierzęta odbierają, postrzegają i ostatecznie obliczają fabryki olf w życiu na podstawie swojego środowiska. Ta technika podwójnego nagrywania może zapewnić wgląd w mechanizm leżący u podstaw kodowania zapachów i sieci neuronowych w ogóle. Może być również stosowany do innych organizmów modelowych w bezkręgowcach lub chorobie i neurobiologii.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ konieczne jest wiele treningu, aby zidentyfikować neurony pszczoły miodnej przy użyciu tylko morfologicznych punktów orientacyjnych, takich jak płat wewnętrzny lub pionowy płat ciała grzyba. W przypadku tego protokołu zbuduj adapter elektrody, który będzie pasował do standardowej płytki interfejsu elektrody. Najpierw trzy krótkie kawałki izolowanych przewodów do 18-pinowego złącza.
Następnie wytnij kawałek płyty z pleksi i włóż płytki rowek wzdłuż najdłuższego boku. Następnie wkręć końcówki lutownicze w płytkę z pleksi i przyklej płytkę do górnej części złącza. Następnie podłącz podstawę do końcówek za pomocą trzech krótkich przewodów.
Następnie umieść szklaną kapilarnę w rowku płyty z pleksi. Kapilara powinna być w stanie się przesunąć i być zabezpieczona śrubą Za pomocą szpilki minutowej wysuń szklaną kapilę na zewnątrz o około pięć milimetrów. Kapilara i trzpień posłużą do podparcia i stabilizacji mikrodrutów elektrody.
Następnie ułóż trzy mikroprzewody. Za pomocą taśmy klejącej dla lepszego dostępu szklaną kapilarnę można usunąć za pomocą 12-woltowego kleju igłowego do. Przewody wraz z woskiem dentystycznym LMP nie sklejają ostatniej trzeciej części drutów.
Teraz podłącz ten wielokanałowy zespół mikroprzewodów do adaptera elektrody. Ustaw przedłużoną szklaną kapilarnę równolegle do mikroprzewodów. Zabezpiecz to nasadkę woskiem dentystycznym wzdłuż zachodzącej na siebie szklanej kapilary i szpilki minutowej.
Następnie przytnij druty elektrody, pozostawiając dwa do trzech centymetrów wystających z kołka minutowego i dwa do trzech centymetrów wystających z końca elektrody. Następnie przymocuj kapilarę do adaptera elektrody i za pomocą ustabilizuj wszystko na miejscu. W 360 stopniach Celsjusza.
końce przewodów prostopadle do końcówek. Następnie sprawdź, czy jest wystarczająco silny kontakt elektryczny, sprawdzając, czy ich impedancja wynosi około 300 kiloomów przy jednym kilohercu. Teraz podłącz kanały adaptera drugiej elektrody do elektrody głównej i elektrody odniesienia i mięśniowe do podstawy elektrod głównych.
Na koniec zamontuj elektrodę główną na płytce interfejsu stopnia głównego. Zamocuj drugą elektrodę na osobnym adapterze po uzyskaniu pszczoły miodnej schładzaj jedną na lodzie, aż zostanie unieruchomiona. Następnie zamocuj pszczołę w standardowym uchwycie z pleksi z odsłoniętą głową.
Nałóż podgrzany wosk dentystyczny na podstawę oczu i połączenie między głową a klatką piersiową, zabezpieczając w ten sposób głowę. Kontynuuj używanie wosku do unieruchomienia oka krajobrazowego czułków na kapsułce głowy. Unikaj nakładania wosku na fagel, który musi być skierowany do przodu.
Pro Bois powinien być wolny od uderzeń. Sprawdź, czy może się poruszać. Teraz ogol kapsułkę głowy, aby poprawić dostępność.
Następnie nakarm pszczołę całą 30% sacharozy, którą spożyje. Zapewnia to dobre przygotowanie, żywotność i wilgotność tkanek. Teraz za pomocą mikroskalpela przetnij pionowo wzdłuż granicy oka i poziomo nad podstawami anteny.
Kontynuuj cięcie pod okiem komórki O i usuń luźny naskórek. Gruczoły hipogardłowe należy odsunąć na bok, podobnie jak tchawicę. Spowoduje to oczyszczenie ścieżki do włożenia elektrody.
Zacznij od włożenia elektrody referencyjnej, srebrnego drutu o grubości 35 mikronów. Najpierw wykonaj małe nacięcie w ipsilateralnym oku złożonym. Następnie wsuń przez niego elektrodę.
Następnie włóż drugi drut do obszaru projekcji mięśni poniżej bocznego oka komórki O. Aby później zobrazować położenie elektrod, zanurz je w roztworze 0,5 molowego chlorku potasu i 5% Alexa Hydrocyte 4 88 na trzy minuty. Następnie, za pomocą mikromanipulatorów, umieść dwie elektrody w mózgu.
Zorientuj się, identyfikując płat anteny i pionowy płat korpusu grzyba. Tutaj jedna elektroda znajduje się w bocznym torze płata anteny o głębokości 180 mikronów, a druga w przyśrodkowym odcinku płata anteny. Włożony na głębokość około 300 mikronów.
Uzupełnij rozmieszczenie elektrod, zakotwiczając je za pomocą dwóch elementów. Krzem pokrywa całą przestrzeń nad mózgiem, co również zapobiegnie wysychaniu tkanek. Następnie kontynuuj nagrywanie, aby wyodrębnić aktywność jednostki z zarejestrowanego sygnału zewnątrzkomórkowego.
Użyj dostępnego oprogramowania do sortowania spajków. Korzystaj ze zróżnicowanych kanałów elektrod. Zastosuj techniki dopasowywania szablonów jednocześnie na wszystkich trzech kanałach elektrod, aby wykryć różne kombinacje przebiegów, które odpowiadają za pojedyncze zdarzenia spajków.
I wreszcie kontrola pod kątem prawidłowej separacji jednostek. Wykorzystanie analizy składowych głównych na pojedynczych impulsach trzech zarejestrowanych kanałów elektrod zróżnicowanych. Po wykonaniu nagrań ostrożnie usuń krzem i elektrody z pszczoły.
Następnie przepłucz mózg roztworem obrączki pszczół i usuń gruczoły i tchawicę. Następnie za pomocą mikropipety wstrzyknąć do płata anteny, 5% mikro rubinu rozpuszczonego w jednym molowym octanie potasu. Zapewni to następczą etykietę do ścieżek płata.
Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki w maksymalnej ciemności. Ponownie przepłucz mózg obrączkami pszczół trzy razy i pozwól barwnikowi inkubować przez 30 do 45 minut. Unieruchom pszczołę, schładzając ją w lodówce.
Następnie odizoluj mózg. Utrwal mózg w 4% Para aldehyd w 0,1 molowym PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i z delikatnym mieszaniem. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami odwodnienia i oczyszczania Po ponownym wypełnieniu neuronów projekcyjnych w płacie anteny mikro rubinowym znacznikiem, widok projekcyjny tych neuronów został złożony z orto warstw wzdłuż osi Z.
Barwnik Alexa Hydrocyte 4 88 na dwóch elektrodach pokazuje ich wprowadzenie w przyśrodkowym płatku anteny oraz w bocznym odcinku płata anteny. Rekonstrukcja 3D wybarwionych komórek docelowych i miejsc wprowadzenia elektrod została wykorzystana do stworzenia schematu trajektorii dwóch linii płatów antenowych, jednoczesnego rejestrowania z dwóch dróg płatów antenowych, podczas gdy stymulacja pszczoły różnymi stężeniami zapachu została wykorzystana do zbadania przetwarzania czasowego. Aktywność oceniano w kolejnych etapach przetwarzania.
Analiza głównych składowych wektorów populacji neuronów projekcyjnych płata anteny i neuronów zewnętrznych pokazuje, że zapach w neuronach projekcyjnych był przedłużony i trwał dłużej niż bodziec. Natomiast w populacji neuronów zewnętrznych reprezentowane były tylko typy zapachu i zapachu wyłączenia. Tak więc, obserwując aktywność w czasie, zewnętrzna populacja neuronów po prawej stronie wykazuje aktywność separacji zapachów na nieco przed tym, jak populacja neuronów projekcyjnych zacznie rozwijać swoją aktywność wywołaną zapachem.
Stymulacja zapachowa jest oznaczona kolorem szarym. Po opanowaniu zbudowanie elektrody zajmuje około 30 minut. Przygotowanie pszczoły i włożenie elektrod w obszary docelowe można wykonać w ciągu pół godziny, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.
Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że każdy krok wymaga dużo praktyki i cierpliwości, dopóki nie zostanie opanowany. Zachowaj szczególną ostrożność podczas przesuwania przewodów elektrod do ich punktów połączeń i nagrywania z pożądanego zasięgu mózgu. Wymagana jest solidna wiedza na temat anatomii mózgu pszczoły miodnej Po jego rozwoju.
Technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się neuropatologią i węchem owadów zbadanie dokładnych zależności czasowych między aktywnością różnych szlaków neuronalnych i ośrodków mózgowych u zachowujących się pszczół miodnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować i używać wielokanałowych elektrod mikroprzewodowych do jednoczesnego nagrywania z dwóch obszarów mózgu i zachowujących się pszczół miodnych. Powinieneś także być w stanie zwizualizować dokładne lokalizacje elektrod nagrywających.
Przegląd
To badanie przedstawia metodę jednoczesnych pozakomórkowych nagrań długoterminowych z dwóch różnych neuropilek mózgu pszczół miodnych. Technika ta umożliwia badanie przetwarzania neuronowego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczych neuronów, jak i zespołów w zwierzętach zachowujących się swobodnie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Biologia behawioralna
Tło
- Rozumienie przetwarzania węchowego u pszczół miodnych jest kluczowe dla poznania mechanizmów tworzenia pamięci.
- Poprzednie metody nie miały zdolności do jednoczesnych nagrań z wielu obszarów mózgu.
- Pszczoły miodne służą jako organizm modelowy do badania złożonych sieci neuronowych.
- Badanie mechanizmów kodowania zapachów może zwiększyć nasze zrozumienie przetwarzania sensorycznego.
Cel badania
- Badanie kodowania węchowego i tworzenia pamięci u pszczół miodnych.
- Rozwój techniki jednoczesnych nagrań z różnych etapów przetwarzania neuronowego.
- Zrozumienie relacji w kodowaniu zapachów między populacjami neuronów.
Stosowane metody
- Zestawienie tanich wielokanałowych elektrod z izolowanych mikrodrutu miedziowego.
- Przygotowanie pszczół miodnych do włożenia elektrod poprzez usunięcie części kapsuły głowowej.
- Rejestrowanie aktywności neuronowej podczas stymulacji zapachami kwiatowymi i feromonami.
- Wizualizacja architektury neuronowej poprzez fluorescencyjne środki śledzące i rekonstrukcję 3D.
Główne wyniki
- Udane jednoczesne nagrania z płatka czułkowego i ciała grzybowego.
- Ulepszone zrozumienie mechanizmów kodowania zapachów u pszczół miodnych.
- Wykazana stabilność wielokanałowych elektrod na potrzeby długotrwałych nagrań.
- Dostarczenie wglądu w sieci neuronowe zaangażowane w przetwarzanie węchowe.
Wnioski
- Ta technika pozwala na głębsze zrozumienie, w jaki sposób pszczoły miodne przetwarzają informacje węchowe.
- Może być dostosowana do zastosowania u innych organizmów modelowych w neuronaukach.
- Przyszłe zastosowania mogą dotyczyć kluczowych pytań z dziedziny neuropatologii i przetwarzania sensorycznego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous long-term extracellular recordings from two distinct neuronal processing stages in behaving honeybees, providing a unique capability to investigate temporal dynamics in olfactory processing pathways. By capturing multi-unit activity from both the antennal lobe and mushroom body—or parallel tracts connecting them—researchers can de-risk mechanistic hypotheses about sensory integration and memory formation. The approach supports predictive confidence in target validation by revealing how odor-evoked signals propagate across brain regions over time, informing translational models of neural circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking odor-evoked activity across sequential neuropils to clarify pathway-specific contributions to behavior.
- Operational Value: Provides stable, multi-channel recordings over many hours, reducing variability in longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing sustained versus transient neuronal responses, informing target selectivity and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-resolved neurophysiological outputs that can serve as biomarkers for compound effects on olfactory processing.
- Operational Value: Uses differentially amplified micro-wire electrodes to minimize noise and verify signal origin, enhancing assay reproducibility.
- Scalability: Electrode assembly from insulated copper wires allows low-cost, replicable preparation for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early sensory processing in the antennal lobe to higher-order integration in the mushroom body, modeling perceptual-to-memory transformation.
- Predictive Confidence: Reveals temporal dissociation in odor responses between neuron populations, supporting biomarker alignment for cognitive or sensory-modulating compounds.
- Disease-Relevant System: Offers a genetically tractable invertebrate model to study conserved principles of sensory gating and adaptive filtering.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of neural circuit dynamics, supporting lead identification through functional readouts of target engagement, and informing preclinical decisions via mechanistic de-risking of sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by comparing activity in antennal lobe (early processing) and mushroom body (integration center) during odor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, multi-unit extracellular recordings that allow comparison of compound effects across independent neuronal tracts.
- Analytics: Employs spike sorting, template matching, and principal component analysis to resolve single-spike events and population-level dynamics.
- Translational Research: Connects immediate odor responses to longer-term neuronal plasticity, relevant for modeling learning and memory processes.
- Enterprise Reuse: Electrode design is adaptable across model organisms and brain regions, promoting platform-level standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing how odor identity and timing are represented across sequential processing stages.
- Operational Value: Electrode flexibility enables stable recordings in behaving animals for hours to days, improving data yield and reducing attrition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation in vivo, decreasing reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on temporal coding fidelity in sensory pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in honeybee brain anatomy and microsurgical techniques for head capsule preparation and electrode targeting.
- Depends on micro-manipulation tools, fluorescent tracers, and spike sorting software for signal validation and 3D reconstruction.
- Necessitates standardization across teams for electrode impedance testing (~300 kΩ at 1 kHz) and reference electrode placement.
- Adaptation to other model systems requires adjustment of electrode size, insertion depth, and brain stabilization methods.
- Practical limitations include the need for extensive training to identify neuronal tracts via anatomical landmarks and the invasiveness of chronic implantation.
