Name: Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnych długoterminowych zapisów elektrofizjologicznych z dwóch neuropili mózgu pszczół miodnych. Technika ta umożliwia badanie przetwarzania węchowego i formowania pamięci u zachowujących się zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Isabelle Reus za stworzenie śledzenia strony wprowadzania elektrod, Tobiasowi Rosenbaumowi za programowanie LabView, Anneke Meyer za analizy danych i pomocne dyskusje. Dziękujemy Randolfowi Menzelowi za dyskusję i praktyczną pomoc na wczesnym etapie rozwoju elektrody. Ponadto dziękujemy Brianowi Smithowi za współpracę podoktorską z MS-B. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) na rzecz WR.

1. Budynek elektrody (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Produkcja adaptera elektrody pasującego do płytki interfejsu elektrody komercyjnych wielokanałowych systemów wzmacniaczy1,2,25.
	<ol>
		<li>Użyj małej płytki z pleksiglasu przyklejonej do 18-pinowej podstawy złącza.</li>
		<li>Podłącz podstawę za pomocą 3 krótkich odcinków izolowanego drutu do 3 oddzielnych końcówek lutowniczych przykręconych do płytki z pleksiglasu (Rysunek 1 A1-A3).</li>
		<li>Włóż rowek w płytkę z pleksiglasu, w którym szklana kapilara może się łatwo przesuwać i być utrzymywana na miejscu za pomocą (Rysunek 1 B1).</li>
		<li>Przedłuż szklaną kapilarnę o około 5 mm za pomocą szpilki do drobniczka.</li>
		<li>Przymocuj druty mikroelektrody wzdłuż maleńkiego kołka i szklanej kapilary, aby zagwarantować stabilizację i wsparcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wielokanałowa produkcja mikrodrutów (zaczerpnięta z Ryuichy Okada32,33)
	<ol>
		<li>Rozpięte są 3 mikrodruty (drut miedziany pokryty poliuretanem, średnica 15 μm) w taki sposób, aby były umieszczone obok siebie (Rysunek 1 B2).</li>
		<li>Za pomocą igły lutowniczej 12 V częściowo rozprowadź cienką warstwę niskotopliwego wosku dentystycznego (50 °C) wzdłuż drutów, aby je skleić (końcówka elektrody) (Rysunek 1 B3). Pozostaw kilka centymetrów nieprzyklejonych (koniec elektrody), ponieważ ta sekcja zostanie później wykorzystana do połączenia mikroprzewodów z adapterem elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz wielokanałowy mikroprzewód do adaptera elektrody
	<ol>
		<li>Wyjmij szklaną kapilarnę z uchwytu i przymocuj ją za pomocą kołka minutien do końcówki elektrody. Ustaw go w pozycji równoległej do mikroelektrody (rysunek 1 B3).</li>
		<li>Przyklej końcówkę elektrody do szpilki minutowej za pomocą niskotopliwego wosku dentystycznego i odetnij mikroelektrodę na końcówce, wystającą 2-3 cm z końcówki minuty i na końcu elektrody (małe strzałki Rysunek 1 B3).</li>
		<li>Lekko wsuń kapilarę z powrotem do adaptera elektrody. Użyj, aby go zamocować (Rysunek 1 B4).</li>
		<li>luźne końce trzech przewodów do końcówek lutowniczych za pomocą pistoletu lutowniczego o temperaturze około 360 °C, aby zapewnić stopienie izolacji (Rysunek 1 B4). Po należy upewnić się, że jest odpowiedni kontakt elektryczny (~300 kOhm).</li>
		<li>Zamontuj jedną z elektrod (master) na płytce interfejsu elektrody sceny głównej i zamocuj drugą elektrodę wielokanałową (podrzędną) na osobnym adapterze. Podłącz kanały urządzenia podrzędnego do elektrody głównej (Rysunek 1 C1). Dodatkowo elektrody odniesienia i mięśniowe do podstawy elektrody głównej (rysunek 1 C2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie pszczół (Rysunek 2)
W tych opisanych eksperymentach używana jest pszczoła miodna (Apis mellifera), która jest zwierzęciem bezkręgowym i dlatego nie wymaga specjalnych etycznych pozwoleń na użycie.
<ol>
	<li>Złap zbieraczkę pszczół miodnych (A. mellifera) przy wejściu do ula rano, jak pokazują inni34,35.</li>
	<li>Schłodź pszczoły na kruszonym lodzie do momentu unieruchomienia (5 do 10 minut) i zamocuj jedną w standardowym uchwycie z pleksiglasu lub metalowej rurce w taki sposób, aby głowa była odsłonięta (ryc. 2 A). Aby zminimalizować ruchy głowy, użyj niskotopliwego wosku dentystycznego (~50 °C) i ostrożnie przymocuj głowę do uchwytu wokół podstawy oczu złożonych i szyi.</li>
	<li>Użyj wosku o niskiej temperaturze topnienia, aby przymocować kości szkieletowej czułków do torebki głowy (ryc. 2 B) bez dotykania wici. Wić anteny musi być skierowana do przodu. Upewnij się, że pszczoła może swobodnie poruszać trąbką.</li>
	<li>Ogol kapsułkę na głowę, aby zapewnić niezakłócony widok i dostęp do czubka głowy.</li>
	<li>Nakarm pszczołę 30% roztworem sacharozy aż do nasycenia, aby zapewnić wystarczające nawilżenie tkanki mózgowej i dobrą żywotność zwierzęcia (ryc. 2 C).</li>
	<li>Wykonaj ostrożne nacięcia pionowo wzdłuż granic oczu złożonych i poziomo nad podstawami czułków, a także pod oczkami i usuń poluzowany kawałek naskórka (ryc. 2 D).</li>
	<li>Ostrożnie odłóż na bok gruczoły podgardłowe i usuń tchawicę, aby zapewnić wyraźny widok i dostęp do mózgu przed wprowadzeniem elektrod (ryc. 2E, 2F).</li>
</ol>
3. Wprowadzenie elektrody
W przykładowym przypadku zilustrowanym na rysunku 2, jedna elektroda jest skierowana na l-ALT, a druga na m-ALT2. Korzystając z określonych punktów orientacyjnych, możliwe są również inne regiony docelowe, na przykład obszary wyjściowe AL i MB1.
<ol>
	<li>Umieść elektrody za pomocą mikromanipulatorów w obszarze zainteresowania (Rysunek 2G i 3A). Aby celować w m-ALT, umieść elektrodę między AL i przyśrodkowo od pionowego płata MB. Upewnij się, że miejsce wprowadzenia znajduje się powyżej punktu rozgałęzienia przyśrodkowych bocznych PN ALT. Wysuń elektrodę do mózgu na głębokość około 180 μm (ryc. 2E). W przypadku zapisu l-ALT PN umieść elektrodę poniżej bocznego protocerebrum (LH) w środku wyimaginowanej linii między boczną stroną płata pionowego a środkiem AL. Wprowadź elektrodę na głębokość około 300 μm (Rysunek 2E)</li>
	<li>Włóż odniesienie (srebrny drut o średnicy około 25 μm) do ipsilateralnego oka złożonego przez małe nacięcie w naskórku. Włóż kolejny srebrny drut do obszaru projekcji mięśni poniżej bocznej oczki. UWAGA: W razie potrzeby zachowanie pszczół w zakresie uczenia się może być monitorowane z dużą precyzją czasową, rejestrując mięsień M17, który bierze udział w odpowiedzi na wydłużenie trąbki (PER) pszczoły36, jak opisano w25.</li>
	<li>Aby solidnie zakotwiczyć elektrody w mózgu i torebce głowy, przykryj całą przestrzeń nad mózgiem dwuskładnikowym krzemem (ryc. 2H), co zapobiegnie wysychaniu mózgu. UWAGA: nagrania mogą trwać od wielu godzin do kilku dni, a pszczoły mogą być na przykład rejestrowane podczas klasycznej procedury kondycjonowania (ryc. 2H) lub stymulowane dużym panelem różnych zapachów.</li>
</ol>
4. Akwizycja danych i wstępne przetwarzanie
<ol>
	<li>Użyj odpowiedniego oprogramowania do akwizycji, które spełnia następujące wymagania: częstotliwość próbkowania min 25 kHz; analogowe1,25 lub cyfrowe 2 różnicowanie krzyżowe między kanałami elektrod; filtr pasmowo-przepustowy od 300 Hz do 8 000 Hz w celu wyodrębnienia zdarzeń skokowych.</li>
	<li>Użyj dostępnego oprogramowania do sortowania spajków, aby wyodrębnić aktywność pojedynczej jednostki, na przykład techniki dopasowywania szablonów zawarte w oprogramowaniu Spike2 (Rysunek 3).</li>
	<li>Do dalszej analizy należy wykorzystać znaczniki czasu wyodrębnionych jednostek do obliczenia uśrednionych reakcji na zapach pojedynczej jednostki (rysunek 4) lub do obliczenia wektorów populacji do analizy głównych składowych (PCA) (rysunek 5) przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania. Aby dokładniej przeanalizować opóźnienie odpowiedzi pojedynczej jednostki i populacji, porównaj najnowsze publikacje1,2,25.</li>
</ol>
5. Wizualizacja względnej pozycji elektrody (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Zanurz końcówki elektrod w roztworze 5% hydrazydu Alexa 568 lub 5% hydrazydu Alexa 488, który rozpuszcza się w 0,5 M roztworze chlorku potasu przed eksperymentami rejestracyjnymi.</li>
	<li>Po eksperymentach ostrożnie usunąć elektrody i pokrywający je krzem, przepłukać mózg roztworem Ringera pszczelego, usunąć gruczoły i tchawicę i wprowadzić drobne kryształki dekstranu tetrametylorhodaminy lub wprowadzić 5% roztwór rozpuszczony w 1,0 M octanie potasu do AL, aby oznaczyć ALT w kierunku następczym. Wykonaj następujące czynności w ciemności.</li>
	<li>Pozwól, aby barwnik został pobrany i przetransportowany przez neurony projekcyjne wzdłuż ich dróg aksonalnych (30-45 min) (ryc. 4A), a następnie umyj mózg roztworem Ringera pszczół trzy razy przez kolejne 30-45 minut.</li>
	<li>Schłodź pszczołę na lodzie do momentu unieruchomienia i ostrożnie wyjmij mózg z torebki głowy. Utrwalić mózg, płucząc go w 0,1 M roztworze PBS zawierającym 4% formaldehydu i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 12 godzin przed dwukrotnym umyciem mózgu w 0,1 M PBS (10 minut każdy).</li>
	<li>Myj mózg 3x przez 20 minut w 0,2% Triton X-100 rozcieńczonym w 0,1 M PBS przed odwodnieniem w serii alkoholi rosnących (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% etanolu, 20 min każdy krok).</li>
	<li>Osadź odwodniony mózg w salicylanie metylu na szkiełku mikroskopowym i uszczelnij go szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i skanuj mózg jako wycinki optyczne co 2-5 μm za pomocą obiektywu apochromatycznego Harmonic Compound Plan (zanurzenie 10X 0,4 NA). Wzbudzić tkankę za pomocą długości fali 568 nm dla dekstranu tetrametylorrodaminy i długości fali 488 nm dla położenia elektrody.</li>
	<li>Zrekonstruuj poplamione struktury mózgu i ścieżki elektrod ze stosów obrazów w 3D za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji (np. AMIRA lub Fidżi) (Rysunek 4).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule przedstawiono produkcję i zastosowanie specjalnie zaprojektowanych wielokanałowych mikroelektrod. Opisane elektrody nadają się do rejestrowania zarówno aktywności pojedynczej jednostki, jak i populacji, co jest szczególnie przydatne do pomiarów opóźnień i innych właściwości odpowiedzi czasowej różnych neuronów i różnych neuropils w obrębie jednej próbki (szczegóły patrz1,2,25). Dodatkowo pokazaliśmy, jak na stałe zaimplementować elektrody mikrodrutowe, aby umożliwić stabilne, długoterminowe zapisy u zachowujących się pszczół miodnych, które utrzymują się przez wiele godzin do kilku dni.
Zewnątrzkomórkowe nagrania wielojednostkowe stały się korzystnym narzędziem do osiągania wysokiej rozdzielczości czasowej w połączeniu z informacją przestrzenną. W naszym przypadku są to albo równoległe drogi neuronalne2, albo dwa różne neuropils1. Wiele neuronów może być rejestrowanych i analizowanych na poziomie pojedynczego neuronu równolegle i w wysokiej rozdzielczości czasowej. Zapisy wielojednostkowe zastosowano najpierw u ssaków38, a później także u owadów39-41. Znaczny postęp osiągnięto dzięki opracowaniu i udoskonaleniu zewnątrzkomórkowych technik zapisu wielokanałowego42,43. Obejmuje to na przykład opracowanie nowych elektrod44 lub nowatorskich algorytmów sortowania i grupowania spajków45. Ogólne metody zewnątrzkomórkowych technik zapisu wielojednostkowego są dobrze opisane46-48. Samodzielnie zbudowane elektrody pokazane na tym filmie można dodatkowo dostosować, dodając więcej mikrodrutów na elektrodę lub mikrodruty można skręcić, aby uzyskać mierzalne stałe odległości między końcówkami. Obie procedury prowadziłyby jednak do zmniejszenia elastyczności i zwiększenia grubości elektrody.
W porównaniu z sondami krzemowymi powszechnie stosowanymi do zapisów zewnątrzkomórkowych u znacznie większych owadów, takich jak jastrzębiowa, szarańcza i karaluch40,49–51 , opisane mikroelektrody drutowe są mniejsze, elastyczne i z łatwością radzą sobie z potencjalnymi ruchami mózgu, a zatem mogą być niezawodnie stosowane u małych owadów społecznych, takich jak pszczoły i mrówki, które wykazują znacznie szerszy repertuar behawioralny. Większość sond silikonowych ma struktury przypominające ostry trzpień, przecinające aksony i tkankę nerwową wzdłuż ich kanału wprowadzającego, podczas gdy opisane mikrodruty są okrągłe, elastyczne i mniejsze, a zatem są mniej szkodliwe dla otaczającej tkanki, co jest wyraźną zaletą, jeśli celem jest badanie długoterminowej plastyczności u nienaruszonego i zachowującego się zwierzęcia. Kolejną zaletą elektrod mikrodrutowych jest ich niski koszt produkcji i łatwa obsługa. Zamiast starannego czyszczenia drogiej sondy silikonowej, druty elektrod są świeżo cięte przed wprowadzeniem mózgu, dzięki czemu nie ma problemów z przekrwieniem. Ponadto możliwe jest użycie więcej niż jednej elektrody mikrodrutowej w tym samym preparacie, umieszczonej w różnych neurostosach1 lub drogach2 , jak pokazano tutaj. Takie podejście jest szczególnie korzystne do analizowania i porównywania aspektów czasowych, takich jak opóźnienia odpowiedzi i interakcje na różnych poziomach przetwarzania neuronowego.
Zdajemy sobie sprawę z faktu, że zarejestrowany sygnał zewnątrzkomórkowy nie odzwierciedla aktywności pojedynczej komórki jako takiej. Jest to zawsze związek aktywności napięciowej wokół końcówki elektrody. Aby wskazać źródło sygnału, zawsze obliczana jest różnica dwóch sąsiednich kanałów mikroprzewodowych w obrębie jednej elektrody. W związku z tym źródło sygnałów szczytowych używanych do wyodrębniania aktywności pojedynczej jednostki było zawsze bardzo blisko jednego lub drugiego kanału elektrody, co skutkowało łatwymi do odróżnienia przebiegami skoków. Sygnały z większej odległości, takie jak aktywność mięśni lub aktywność sąsiednich neuropils, docierają do obu elektrod w tym samym czasie, wywołując porównywalne kształty i amplitudy i zostaną odrzucone przez tę procedurę. Korzystając z techniki dopasowywania szablonów Spike2, jesteśmy bardzo pewni, że uzyskamy aktywność pojedynczej jednostki, która nie jest taka sama, ale bardzo zbliżona do aktywności pojedynczego neuronu. Jednak problemu sortowania kolców można uniknąć, stosując techniki rejestracji wewnątrzkomórkowej.
Zapisy pojedynczych komórek za pomocą ostrych elektrod lub pipet plastrowych pozwalają na dogłębną wiedzę na temat właściwości fizjologicznych pojedynczego neuronu. Jednak ze względu na mały rozmiar neuronów owadów i ich neurytów (np. mniej niż 1 μm dla PN pszczół miodnych 52) możliwe jest przeprowadzenie tylko krótkoterminowych zapisów. Co więcej, zapisy wewnątrzkomórkowe mogą być inwazyjne i mogą uszkodzić komórkę, co może być kolejnym powodem ograniczeń czasowych. Zapisy wewnątrzkomórkowe in vivo u owadów rzadko trwają dłużej niż godzinę. Okno czasowe, które było wystarczające dla pionierskiej pracyMartina Hammera 53 , który zarejestrował wewnątrzkomórkowy z pojedynczego zidentyfikowanego neuronu, brzusznego niesparowanego neuronu szczękowego #1 (VUMmx1). Mógł powiązać jego aktywność bezpośrednio ze ścieżką nagrody. Juliane Mauelshagen54 zarejestrowała wewnątrzkomórkowo aktywność zidentyfikowanego zewnętrznego neuronu ciała grzyba, neuronu zewnętrznego szypułki #1 (PE1) podczas warunkowania klasycznego. Ten sam neuron był w centrum zainteresowania Menzela i Manza55 , kiedy znaleźli LTP po elektrycznej stymulacji komórek Kenyona. Jednak Okada i współpracownicy56 mogli wykorzystać dobrze scharakteryzowany wewnątrzkomórkowo wzór skoków (podwójne i potrójne kolce) do identyfikacji PE1 podczas nagrań zewnątrzkomórkowych. W końcu połączenie obu metod, wewnątrzkomórkowych zapisów ze zidentyfikowanych neuronów i zewnątrzkomórkowych zapisów długoterminowych może być potężnym narzędziem dla przyszłych badań.
Jednak użycie ostrych elektrod do jednoczesnego rejestrowania wielu komórek (jednostek) na różnych poziomach przetwarzania przez wiele godzin do kilku dni w celu analizy ich czasowych relacji reakcji i/lub nawet zmian plastycznych jest prawie niemożliwe.
Dzięki pierwszym metodom obrazowania wapnia u pszczoły miodnej57,58 przy użyciu barwników wrażliwych na wapń, analiza przestrzennych wzorców reakcji na zapach była dostępna59-62. Jednak w wielu przypadkach barwniki wrażliwe na wapń muszą zostać wprowadzone do tkanki mózgowej za pomocą inwazyjnych manipulacji, które ponownie ograniczają długość życia pszczół i wewnętrzne właściwości analizowanych komórek. Problem ten został rozwiązany w innych organizmach modelowych, takich jak muszka owocowa, przy użyciu genetycznie wprowadzonych czujników wapnia63,64. Jednak ogólnie rzecz biorąc, czujniki wapnia mogą wprowadzać inne ograniczenia, ponieważ mogą działać jako wapniowe, które prawdopodobnie wpływają na czasowe właściwości reakcji zapachowych. Jednoczesne zapisy wewnątrzkomórkowe w połączeniu z obrazowaniem wapnia lub podejściami obliczeniowymi mogą udowodnić właściwą rozdzielczość czasową procesów obrazowania65,66. Jednak rozdzielczość czasowa samego procesu obrazowania jest raczej ograniczona. Systemy akwizycji optycznej zwykle wykorzystują obrazowanie CCD z rozdzielczością czasową 5-20 Hz 67, chociaż obrazowanie 2-fotonowe może być w stanie uzyskać szybsze sekwencje68. Jednak zwiększenie częstotliwości próbkowania zawsze idzie w parze ze spadkiem rozdzielczości przestrzennej. Ponadto wrażliwe na wapń barwniki stosowane u pszczół miodnych ulegają bieleniu, co również skraca czas pozyskiwania69.
W porównaniu z innymi technikami rejestracji fizjologicznej u owadów, nasze elastyczne, wielokanałowe elektrody mikrodrutowe zapewniają długotrwały dostęp do pojedynczej jednostki i aktywności neuronalnej populacji u zachowujących się pszczół.
Pokazaliśmy, jak używać dwóch z tych elektrod na różnych etapach przetwarzania u tego samego zwierzęcia, co ułatwia analizę aspektów kodowania czasowego między różnymi miejscami rejestracji. W zależności od problemu badawczego i modelu owada, podstawowa metoda budowy elektrod zaprezentowana tutaj jest łatwa do rozbudowy i/lub adaptacji. Na przykład można sobie wyobrazić użycie więcej niż trzech pojedynczych przewodów do produkcji elektrod wielokanałowych. Ponadto liczba miejsc rejestracji może być rozszerzona i możliwa jest obserwacja aspektów czasowych więcej niż dwóch dróg lub neuropilsów. Mamy nadzieję, że ta metoda zainspiruje wielu naukowców i pozytywnie przyczyni się do zrozumienia zaawansowanego przetwarzania neuronów w małych mózgach.

Pszczoły miodne, podobnie jak większość innych owadów, w dużym stopniu polegają na węchu. Między innymi wykorzystują wskazówki węchowe do orientacji, krycia, komunikacji z przedstawicielami tego samego gatunku i żerowania. Ich dobrze opracowany układ węchowy przyczynia się do bogatego repertuaru zachowań edukacyjnych związanych z bodźcami zapachowymi kwiatów. Zachowania te można łatwo badać w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (przegląd patrz3-5). Ich "mini mózgi" (cp.6) ze stosunkowo niewielką liczbą neuronów sprawiają, że pszczoła miodna jest dobrze przystosowanym organizmem modelowym do badania kodowania węchowego i uczenia się podczas monitorowania aktywności neuronalnej.
System węchowy zarówno u owadów, jak i u ssaków wykazuje analogiczną organizację w dużym stopniu (dla przeglądu patrz7,8). U pszczół miodnych około 80 000 neuronów receptorowych9 zlokalizowanych w czubkach wzdłuż czułków10,11 przekształca bodziec zapachowy w sygnał neuronalny. Aksony z neuronów receptorów węchowych unerwiają płat czułkowy (AL), który ma organizację kłębuszkową porównywalną z opuszką węchową kręgowców. AL składa się z około 164 kłębuszków nerkowych połączonych ze sobą około 4000 lokalnych interneuronów (LN) (przegląd patrz12). Szczególnie w przypadku pszczół miodnych wykazano niedawno, że LN zapewniają niejednolitą łączność boczną i że różne subpopulacje posiadają elementarne i konfiguracyjne właściwości kodowania węchowego13,14 . Wykazano, że AL jest podzielony na brzuszny i grzbietowy płat hemi, dając początek przyśrodkowej i bocznej drodze płata czułkowego (m- i l-ALT; wcześniej określane jako m- i l-APT dla przyśrodkowego i bocznego płata czułka protocerebral way15-17). W tym miejscu zostanie użyta nowa terminologia traktatowa, wprowadzona przez niedawne wysiłki na rzecz ujednolicenia nomenklatury mózgu owadów18. Oba ALT (l- i m-ALT) łączą 410 (l-ALT) lub 510 (m-ALT) neuronów projekcyjnych (PN) jednokłębuszkowych, odpowiednio15,16,19. Ostatnio wykazano, że PN obu szlaków kodują zapachy równolegle2 (dla przeglądu patrz17,20), a oba szlaki synaptycznie tworzą rozbieżne połączenia z komórkami Kenyona (KC), głównymi neuronami ciała grzyba (MB). Każdy MB zawiera około 172 000 KC21-23. Wiadomo, że MB są zaangażowane w integrację bodźców, uczenie się i tworzenie pamięci. Dendryty axo KC tworzą szypułkę (łodygę grzyba), która ma dwa główne obszary wyjściowe: wierzchołek lub płat alfa i płat poziomy lub beta22,24. Wynik MB zbiega się tylko do około 400 neuronów zewnętrznych (EN)24. EN odpowiedzialne za przetwarzanie informacji węchowych unerwiają głównie brzuszną część płata pionowego22. Ostatnio wykazano, że ENs zarejestrowane w tym obszarze kodują asocjację nagrody za zapach25.
Aspekty czasowe w systemie węchowym owadów i kręgowców stały się ważnym i znaczącym aspektem jako potencjalna zasada kodowania26-29. Aby móc jednocześnie rejestrować wiele neuronów z różnych miejsc w wysokiej rozdzielczości czasowej, opracowaliśmy techniki podwójnego nagrywania wielojednostkowego przy użyciu niestandardowych wielokanałowych elektrod drucianych wprowadzanych do różnych obszarów docelowych w układzie węchowym pszczoły. Takie podejście pozwala nam analizować i porównywać procesy czasowe w układzie węchowym pszczoły miodnej na poziomie pojedynczych neuronów i populacji neuronów między równoległymi szlakami węchowymi, podwójnym szlakiem węchowym2 lub między różnymi kolejnymi neuropilami1. Niedawno, dzięki podobnemu podejściu eksperymentalnemu w układzie węchowym szarańczy30 przy użyciu innej konfiguracji elektrod, byliśmy w stanie przeanalizować mechanizm kodowania czasoprzestrzennego w celu rozpoznawania zapachów niezmiennych w tle31. W ten sposób ustalone podwójne zapisy umożliwiają gromadzenie informacji przestrzennych o jednoczesnych profilach aktywności neuronalnej.
W porównaniu do szerszego próbkowania przestrzennego uzyskanego z obrazowania wapnia, ta metoda pozwala na zapis tylko z dwóch miejsc. Jednak zaletą w porównaniu z technikami obrazowania wapniowego jest wysoka precyzja czasowa zapisów potencjału czynnościowego, której nie można zapewnić ani przez konwencjonalne obrazowanie CCD, ani przez akwizycję obrazowania 2-fotonowego. Opisane tutaj elektrody zewnątrzkomórkowe są na stałe wszczepione i zamocowane względem mózgu i torebki głowy, unikając dryfu elektrody. Jest to wyraźna zaleta w porównaniu z zastosowaniem ostrych elektrod wewnątrzkomórkowych. Kolejną zaletą w porównaniu z zapisami wewnątrzkomórkowymi i obrazowaniem wapnia jest wydłużony czas obserwacji neuronalnej, wynoszący od wielu godzin do kilku dni. Jest to ważny warunek wstępny do zbadania neuronalnych korelatów uczenia się i tworzenia pamięci. Dodatkowe korzyści płynące z nagrań wielostanowiskowych są bardziej szczegółowo opisane w sekcji dyskusji.
W tym przeglądzie metodologicznym zostanie pokazana procedura produkcji elektrod drucianych o niestandardowych projektach, dostosowana z32,33 i dostosowana do długoterminowych zapisów wielojednostkowych w mózgu pszczoły miodnej. Dodatkowopokazano przykład, w jaki sposób tego typu elektrody są na stałe wszczepiane w dwóch różnych miejscach zapisu w układzie węchowym pszczoły miodnej, aby rejestrować jednocześnie l- i m-ALT przez długi czas, aby umożliwić wiele protokołów stymulacji. W celu weryfikacji pozycji zapisu podano przykład i protokół barwienia oraz wizualizacji miejsc rejestracji po nagraniu.

<table><tbody><tr><td>Olej parafinowy</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>Zapachy</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7,2</td></tr><tr><td>4% Formaldehyd</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td> Bez <td>metanolu</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>BioChemica</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Salicylan metylu</td><td>Roth</td><td>4529.1</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran tetrametylorolodaminy, 10 000 MW (mikrorubin)</td><td>Invitrogen</td><td>D7162</td><td>zachowaj ciemne</td></tr><tr><td>Alexa 488 hydrazyd</td><td>Invitrogen</td><td>A-10436</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Alexa 568 hydrazyd</td><td>Invitrogen</td><td>A-10437</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Bee Ringer Solution</td><td>patrz Brill et al.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut miedziany pokryty poliuretanem</td><td>Elektrisola</td><td>15 &micro; m średnicy i Izolacja</td><td></td>P155</tr><tr><td>Wosk dentystyczny&nbsp;</td><td>Densply Detrey</td><td>64103015S1</td><td>umiarkowana temperatura topnienia</td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Flexaponal&nbsp;</td><td>124-202-00</td><td>wosk niskotopliwy</td></tr><tr><td>KWIK SIl</td><td>WPI</td><td>03L</td><td></td></tr><tr><td>18 Pin Socket</td><td>Conrad Electronic</td><td>189634-62</td><td></td></tr><tr><td>Klej topliwy</td><td>Conrad Electronic</td><td>827673</td><td></td></tr><tr><td>Igła do</td><td>Conrad Electronics</td><td>830283</td><td>12 V</td></tr><tr><td>Końcówka lutownicza&nbsp;</td><td>Conrad Electronic</td><td>531901</td><td></td></tr><tr><td>Glaselectrodes</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>V2A 0,2 x 12 mm</td></tr><tr><td>Przełączana scena czołowa</td><td>Tucer Davis Technologies</td><td>SH16</td><td></td></tr><tr><td>Moduł połączeniowy stacji czołowej</td><td>NPI</td><td>INT-03M</td><td></td></tr><tr><td>Moduł wzmacniacza</td><td>NPI</td><td>PDA-2F</td><td></td></tr><tr><td>Tablice akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>NI-6123, Ni-6143</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>National Instruments</td><td>Lab View 8.2</td><td>niestandardowy projekt</td></tr><tr><td>Sortowanie kolców&nbsp;</td><td>CED&nbsp;</td><td>Spike 2 v7.11</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2008B</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>instrukcja</td></tr><tr><td>AG-wires</td><td>WPI</td><td>AGT05100</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>TCS SP2 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>AMIRA</td><td>Mercury Computer Systems&nbsp;</td><td>2000-02-05</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Zarówno u ssaków, jak i owadów, informacje neuronalne są przetwarzane w różnych ośrodkach mózgowych wyższego i niższego rzędu. Centra te są sprzężone za pomocą zbieżnych i rozbieżnych połączeń anatomicznych, w tym okablowania sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego. Co więcej, informacje tego samego pochodzenia są częściowo przesyłane równoległymi ścieżkami do różnych, a czasem do tych samych obszarów mózgu. Aby zrozumieć ewolucyjne korzyści, jak również obliczeniowe zalety tych strategii okablowania, a zwłaszcza ich czasowe zależności od siebie, konieczny jest jednoczesny dostęp do pojedynczych neuronów różnych dróg lub neurostosów w tym samym preparacie w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj koncentrujemy się na pszczołach miodnych, demonstrując unikalny zewnątrzkomórkowy długoterminowy dostęp do rejestrowania aktywności wielu jednostek w dwóch kolejnych neurostosach1, płacie antenowym (AL), pierwszym etapie przetwarzania węchowego i ciele grzyba (MB), centrum integracji wyższego rzędu zaangażowanym w uczenie się i tworzenie pamięci, lub dwóch równoległych szlakach neuronalnych2 połączenie AL z MB. Ten ostatni został wybrany jako przykład i zostanie w pełni opisany. Na filmie instruktażowym zademonstrowano budowę i trwałe wprowadzenie elastycznych wielokanałowych drutów elektrodowych. Różnicowe wzmocnienie parami kanałów elektrod mikrodrutowych drastycznie zmniejsza szum i sprawdza, czy źródło sygnału jest ściśle związane z położeniem końcówki elektrody. Elastyczność mechaniczna zastosowanych elektrod drucianych pozwala na stabilne, inwazyjne, długotrwałe zapisy przez wiele godzin do kilku dni, co stanowi wyraźną zaletę w porównaniu z konwencjonalnymi technikami poza- i wewnątrzkomórkowego zapisu in vivo.

"Niniejszy protokół umożliwia jednoczesne rejestracje na dwóch różnych etapach przetwarzania w obrębie poszczególnych pszczół miodnych, a dodatkowo pozwala na badanie mechanizmów leżących u podstaw uczenia się i pamięci poprzez np. warunkowanie PER u unieruchomionych pszczół". Jest to warunek wstępny do analizy aspektów czasowych przetwarzania neuronalnego. Metoda ta jest łatwo dostosowywalna do różnych podejść naukowych w celu wyjaśnienia sieci neuronalnej układu węchowego pszczoły. Na przykład metoda ta jest stosowana (i) do analizy przetwarzania czasowego PN w obrębie podwójnej drogi węchowej pszczoły miodnej, PN l-ALT i m-ALT (Rysunek 5). Na Rysunku 5A przedstawiono przykład PN l-ALT rejestrowanego jednocześnie z PN m-ALT jako średnią z dziesięciu prób, co ilustruje siłę i latencję ich odpowiedzi w odniesieniu do pięciu różnych stężeń zapachów w formie kolorowej mapy ciepła. Średnia z siedmiu pszczół z 11 PN l-ALT i 13 PN m-ALT (Rysunki 5B, 5C) wykazuje, że zarówno siła odpowiedzi, jak i latencja odpowiedzi, w pewnym stopniu odzwierciedlają stężenie substancji zapachowej. W tym przykładzie PN zwiększyły siłę swojej odpowiedzi, podczas gdy wraz ze wzrostem stężenia substancji zapachowej ich latencja odpowiedzi malała (Rysunki 5B, 5C). Wynik ten jest dość ograniczony i dotyczy tylko analizowanej substancji zapachowej, ale jest spójny z niedawnymi modelami obliczeniowymi AL37. To, czy kodowanie stężenia zapachu w AL pszczoły opiera się na nieliniowych obliczeniach, czy na innych właściwościach kodowania, wciąż wymaga analizy w przyszłości. Ponadto metodę tę można wykorzystać (ii) do porównania aspektów czasowych w aktywności populacyjnej na dwóch kolejnych etapach przetwarzania: wyjściu z AL i MB (Rysunek 6). Analiza głównych składowych (PCA) wykazuje, że obliczenia zapachowe są przedłużone i trwają dłużej niż cała prezentacja zapachu na poziomie PN, podczas gdy w EN w aktywności populacyjnej reprezentowane były jedynie momenty początku i końca ekspozycji na zapach (Rysunek 6). W związku z tym populacja EN osiągnęła maksymalną aktywność już w punkcie czasowym, w którym aktywność PN wciąż się rozwijała (por. Film 1).
<img alt="Schemat równowagi statycznej dla kalibracji czujnika; zawiera światłowody i kolorowo oznaczone ścieżki sygnałowe." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wykonanie trzechkanałowych elektrod z mikrodrutów. A1) Końce trzech przewodów są przylutowane do złącza pinowego IC w pozycjach 11, 13 i 16. A2) Cztery wyprowadzenia lutownicze są przykręcone do podstawy z pleksiglasu; pin minutien jest wkładany do końcówki kapilary szklanej, która następnie zostaje przymocowana do plastikowej płytki. A3) Plastikowa płytka jest przyklejana na górze złącza pinowego IC, a wolny koniec każdego przewodu jest przylutowany do jednego z górnych wyprowadzeń lutowniczych. B1) Aby wyposażyć uchwyt elektrody w cienkie miedziane druty, kapilarę należy wyjąć ponownie. B2) Podstawa uchwytu zostaje następnie zamocowana w specjalnie wykonanym urządzeniu do wyrównywania. Trzy miedziane mikrodruty są wyrównywane wzdłuż rowka i utrwalane taśmą klejącą na obu końcach. B3) Równoległe mikrodruty są sklejane woskiem dentystycznym i kapilara jest wkładana z powrotem na miejsce (długie strzałki); sklejone mikrodruty są następnie mocowane do kapilary woskiem dentystycznym, a jej końce są odcinane (krótkie strzałki). B4) Trzy wolne końce miedzianych drutów są przylutowane do trzech górnych wyprowadzeń lutowniczych, co zapewnia im kontakt elektryczny ze złączem pinowym IC. C1) Dwie w pełni zmontowane elektrody mogą zostać połączone ze sobą do użytku z jednym przedwzmacniaczem głowicowym. C2) W tym celu piny jednej elektrody (lewa, slave) są łączone za pomocą izolowanych przewodów z drugą elektrodą (prawa, master), która jest podłączona do przedwzmacniacza głowicowego; elektroda podłączona do przedwzmacniacza może również odbierać sygnał z mięśnia (M17) i elektrody referencyjnej (Ref).
<img alt="Badanie równowagi statycznej pszczoły, schematy unieruchomienia głowy pszczoły w eksperymencie badawczym, odpowiedź sensoryczna." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie i trwałe wprowadzenie elektrod do mózgu pszczoły. A) Pszczoła zostaje umieszczona w uchwycie z pleksiglasu po unieruchomieniu na lodzie. Wskazano czułki z biczkiem (FL) i trzonkiem (SC). B) Głowa i czułki zostają unieruchomione za pomocą wosku dentystycznego. C) Kapsuła głowy zostaje ogolona, a pszczoła zostaje nakarmiona wodą z cukrem. D) Kapsuła głowy zostaje otwarta. E) Po usunięciu gruczołów i tchawki z górnej części mózgu, można łatwo rozróżnić poszczególne neuropile i główne punkty orientacyjne. Wskazano trajektorie ALT wraz z miejscem wprowadzenia elektrod. (MB: ciało grzybowate, AL: płat czułkowy, OL: płat optyczny, α: płat alfa lub płat pionowy, ALT: trakt płata czułkowego, E1: strona wprowadzenia elektrody do rejestracji z m-ALT, E2: strona wprowadzenia elektrody do rejestracji z l-ALT). F) Elektrody referencyjne (Ref) i mięśniowe (M17) zostają wprowadzone do kapsuły głowy przez niewielkie otwory w kutykuli lub złożonym oku. G) Drutowe elektrody zostają wprowadzone do mózgu w odpowiednich miejscach. H) Po unieruchomieniu elektrod za pomocą dwuskładnikowego silikonu, pszczoła nadal wykazuje PER i może być warunkowana (np. za pomocą wody z cukrem).
<img alt="Schemat zestawu do rejestracji neuronalnej z danymi pociągu impulsów, wykresem przebiegów czasowych i histogramem liczby impulsów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rejestracja zewnątrzkomórkowa w dwóch traktach neuronalnych i ekstrakcja pojedynczych jednostek (sortowanie impulsów). A) Schematyczny rysunek zestawu eksperymentalnego. Pszczoła jest unieruchomiona w uchwycie z pleksiglasu. Stymulacja zapachowa odbywa się za pomocą szklanej rurki. Dwa trzpienie elektrod rejestrują aktywność z odsłoniętego mózgu pszczoły. B) Jednoczesne rejestracje z PN l-ALT i m-ALT (ślady zielone i fioletowe) wykazujące odpowiedzi pobudzające w obu traktach na 500 msec stymulację zapachową roztworem miodu w wodzie o stężeniu 1:100 w temperaturze 33 °C. Każda naniesiona linia reprezentuje zróżnicowane kanały, zgodnie z kodowaniem kolorystycznym wyprowadzeń elektrod w A. Pasek skali: 50 µV. C) Po przeprowadzeniu procedur sortowania impulsów pojedyncze potencjały czynnościowe zostają posortowane i zakodowane kolorystycznie. Nałożenie posortowanych jednostek ilustruje separację przebiegów czasowych. D) Histogram odstępów między impulsami wskazuje jakość separacji posortowanych jednostek jako dowód prawidłowego sortowania impulsów. Należy zauważyć brak impulsów w okresie refrakcji jednostki. E) Dwa widoki (E1, E2) z klastrowania 3D posortowanych jednostek z wykorzystaniem analizy głównych składowych, co wskazuje na odległość posortowanych jednostek od siebie. Okręgi wskazują 2,5-krotną odległość Mahalanobisa, która odpowiada SD w przestrzeni i wskazuje na znaczące zróżnicowanie klastrów w przestrzeni głównych składowych F) Zakodowane kolorystycznie jednostki przedstawiają potencjały czynnościowe widoczne w powiększeniu trzech kanałów z rejestracji jednego traktu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat śledzenia neuronów z barwieniem Microruby, Alexa Hydrazide 488, mapowaniem elektrod, szlaki neuronowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wizualizacja po rejestracji i rekonstrukcja 3D pozycji rejestracyjnej. A) Widok projekcji przekrojów ortogonalnych wzdłuż osi z z maksymalną intensywnością dopasowania dla przedniego i wstecznego wypełniania jednokłębuszkowych neuronów projekcyjnych rzutujących z AL do MB i LH. Wewnątrzkomórkowy znacznik Microruby (dekstran tetrametylorodaminowy) został wprowadzony do AL po eksperymentach rejestracyjnych. Obarwione kłębuszki wewnątrz AL potwierdzają prawidłowe barwienie PN. B) Widok projekcji przekrojów ortogonalnych wzdłuż osi z z maksymalną intensywnością dopasowania z barwienia dwóch elektrod znacznikiem Alexa hydrazide 488, wskazujący miejsce umieszczenia elektrod dla m-ALT (E1, strzałka) i l-ALT (E2, strzałka). Znacznik Alexa Hydrazide 488 migruje do tkanki otaczającej elektrodę i barwi miejsce jej wprowadzenia. Należy zauważyć, że wyraźne barwienie w AL jest artefaktem powierzchniowym. C) Rekonstrukcje 3D zbarwionych komórek docelowych (PN) oraz miejsca wprowadzenia elektrod z A, B (prawa strona) wraz ze schematycznym przeglądem systemu węchowego pszczoły miodnej (lewa strona) z zaznaczeniem przebiegu l- i m-ALT. Uwaga, przedstawiono jedynie drogi PN jednokłębuszkowych. AN: nerw czułkowy, AL: płat czułkowy, LH: róg boczny, MB: ciało grzybowate, E1, E2: miejsca wprowadzenia elektrod, m-ALT: przyśrodkowy trakt płata czułkowego, l-ALT: boczny trakt płata czułkowego, c: ogonowy, r: rostralny, m: przyśrodkowy, l: boczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Olfactory neuronal responses, diagram, m-ALT and l-ALT response to odor concentration logarithm." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Rysunek 5. Przykład kodowania stężenia zapachu w obrębie podwójnej drogi węchowej. A) Wykresy ciepła ilustrują odpowiedź pojedynczego l-ALT (zielony) oraz pojedynczego m-ALT PN (fioletowy), zarejestrowaną jednocześnie u pojedynczej pszczoły miodnej w odpowiedzi na substancję zapachową heksanal przy zwiększających się stężeniach zapachu (od 1: 10-6 do 1:100). Każda linia stanowi średnią z dziesięciu prób stymulacji. Częstotliwość wyładowań przedstawiono jako względną zmianę intensywności, która stanowi częstotliwość wyładowań w stosunku do odjętej aktywności spontanicznej. B) Latencja odpowiedzi populacyjnej 11 neuronów projekcyjnych (PN) z traktu l-ALT i 13 PN z traktu m-ALT u 7 badanych pszczół. U każdej pszczoły rejestrowano jednocześnie PN z obu traktów. Latencja odpowiedzi populacyjnej wykazuje tendencję spadkową wraz ze wzrostem stężenia zapachu w PN z obu traktów. Początek odpowiedzi zapachowej w czułkach, wynoszący 99 ms, zarejestrowano za pomocą elektroantenogramów i odjęto go od latencji odpowiedzi PN. Należy zauważyć, że przy najniższych stężeniach odpowiedzi były zbyt słabe do pomiaru latencji, w związku z czym zostały wykluczone. C) Częstotliwość wyładowań odpowiedzi populacyjnej z tych samych PN, co w B. Wraz ze wzrostem stężenia zapachu wzrasta siła odpowiedzi. l-ALT wykazuje silniejszą odpowiedź. W B i C podano średnią oraz odchylenie standardowe (SD).
<img alt="Analiza częstotliwości wyładowań neuronalnych i separacji zapachów, mapa ciepła, wykresy PCA, badanie odpowiedzi węchowej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Porównanie aktywności populacji na dwóch kolejnych etapach przetwarzania w obrębie drogi węchowej pszczoły miodnej. Dane zarejestrowano u 20 zwierząt stymulowanych 1-heksanolem i 2-oktanonem. A) Każda linia reprezentuje średnią częstotliwość wyładowań jednego neuronu projekcyjnego (PN) zakodowaną kolorami fałszywymi, obliczoną dla 10 powtórzeń zapachu 1-heksanolu. Prezentacja zapachu rozpoczyna się w czasie 0 i trwa trzy sekundy. B) Przedstawia to samo co w A), ale dla zewnętrznych neuronów ciała grzybowatego (EN). Macierz pokazana w A) można traktować jako wektor populacyjny PN podczas stymulacji zapachowej 1-heksanolem. Obliczyliśmy analogiczny wektor populacyjny podczas stymulacji zapachowej 2-oktanonem i wykorzystaliśmy oba wektory w analizie głównych składowych (PCA) z zachowaniem wymiaru czasowego. C) Trzy pierwsze główne składowe (PC1, 2 i 3) zostały naniesione względem siebie, aby zilustrować separację zapachów w aktywności zespołu PN na wyjściu z płata czułkowego. Czas przed wystąpieniem zapachu oznaczono kolorem czarnym. Aktywność podczas trzech sekund stymulacji 1-heksanolem pokazano w kolorze niebieskim. Aktywność podczas stymulacji 2-oktanolem pokazano w kolorze czerwonym. Ponadto przedstawiono 1,5 sekundy aktywności po ustaniu zapachu 1-heksanolu (jasnoniebieski) i 2-oktanonu (różowy). Należy zauważyć, że na poziomie zespołu PN oba zapachy wywołują bardzo wyraźne trajektorie, które stabilizują się w „punkcie stałym” utrzymującym się dłużej niż cały okres stymulacji zapachowej. Dopiero po ustaniu zapachu trajektorie powracają do aktywności bazowej bez stymulacji. D) Tę samą analizę przeprowadzono na poziomie zespołu EN, reprezentującym aktywność na wyjściu z ciała grzybowatego. W porównaniu do aktywności PN, zapachy wywołują mniej wyraźne trajektorie. Ponadto nie obserwuje się „punktu stałego”. Trajektorie początkowo indukowane zapachem mieszają się z aktywnością bazową, mimo że zapach jest nadal obecny. Dopiero ustanie zapachu wywołało dodatkową trajektorię.
<a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">Film 1.</a> Analiza czasowa trajektorii indukowanej zapachem po analizie głównych składowych wektora populacji PN (lewa strona) i wektora populacji EN (prawa strona; por. Rycina 6). Górne części zawierają trzy pierwsze składowe główne (PC1, 2 i 3) naniesione względem siebie. Dolne panele ilustrują przebieg PC1, 2 i 3 w czasie. Stymulację zapachem zaznaczono szarym paskiem. Wszystkie panele zostały zsynchronizowane. Należy zauważyć, że aktywność populacji EN rozpoczyna się nieco wcześniej niż aktywność populacji PN; zjawisko to wydaje się sprzeczne z intuicją, ale można je wyjaśnić łącznością i właściwościami zaangażowanych warstw, co zostało omówione wcześniej1.

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie kodowania zapachowego i tworzenia pamięci przy użyciu długoterminowego dostępu do dwóch niezależnych etapów przetwarzania neuronalnego u aktywnych pszczół miodnych. Jest to realizowane poprzez wstępny montaż niskokosztowych elektrod wielokanałowych z izolowanych miedzianych mikrodrutów i specjalnie wykonanych uchwytów. Kolejnym krokiem jest przygotowanie żywej pszczoły miodnej poprzez usunięcie fragmentu jej torebki głowowej w celu wprowadzenia do odsłoniętego mózgu dwóch elektrod potraktowanych barwnikiem fluorescencyjnym.Trzecim krokiem jest rejestracja sygnałów z dwóch niezależnych „neuro pigułek” lub traktów w drodze węchowej podczas stymulacji zapachami kwiatowymi oraz feromonami. Następnie, po wypreparowaniu mózgu, do płata antenowego wstrzykuje się inny znacznik fluorescencyjny w celu wstecznego wypełnienia neuronów docelowych. Wypełnione wstecznie ścieżki oraz zapisy z elektrod są następnie wizualizowane, aby stworzyć trójwymiarową rekonstrukcję architektury neuronalnej.Ostatecznie, dzięki zastosowaniu tych technik można lepiej zrozumieć zależności w kodowaniu zapachów między dwiema populacjami neuronów na różnych poziomach przetwarzania, takich jak płat antenowy i ciało grzybowate. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że nasze elektrody wielokanałowe są bardzo małe i mogą być używane w kombinacjach, co oznacza, że po zakotwiczeniu możemy jednocześnie rejestrować sygnały z różnych obszarów mózgu. Elastyczne przewody umożliwiają stabilną rejestrację przez kilka godzin u zwierząt wykazujących określoną aktywność behawioralną.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuropatologii, takie jak zrozumienie, w jaki sposób zwierzęta odbierają, postrzegają i ostatecznie przetwarzają bodźce zapachowe z otoczenia. Technika podwójnej rejestracji może dostarczyć informacji na temat mechanizmów kodowania zapachów oraz sieci neuronalnych w ujęciu ogólnym. Można ją również zastosować do innych organizmów modelowych w badaniach nad bezkręgowcami oraz w neurobiologii.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ identyfikacja neuronów pszczoły miodnej wyłącznie na podstawie punktów orientacyjnych morfologicznych, takich jak płat wewnętrzny lub płat pionowy ciała grzybiastego, wymaga intensywnego przeszkolenia. W ramach niniejszego protokołu należy zbudować adapter elektrody pasujący do standardowej płyty interfejsu elektrod. W pierwszej kolejności przylutuj trzy krótkie odcinki izolowanych przewodów do złącza 18-pinowego.Następnie należy wyciąć kawałek płyty z pleksiglasu i wyciąć w niej płytki rowek wzdłuż najdłuższego boku. Dalej, wkręć kostki przyłączeniowe w płytę z pleksiglasu i przyklej płytę do górnej części złącza. Następnie połącz podstawę z kostkami za pomocą trzech krótkich przewodów.Następnie umieść kapilarę szklaną w rowku płytki z pleksiglasu. Kapilara powinna móc się przesuwać i być zabezpieczona śrubą. Za pomocą cienkiej igły wysuń kapilarę szklaną na zewnątrz o około pięć milimetrów. Kapilara i igła posłużą do podparcia i stabilizacji mikrodrutów elektrody.Następnie ustaw trzy mikrodruciki. Za pomocą taśmy klejącej, aby uzyskać lepszy dostęp, kapilarę szklaną można usunąć, używając igły lutowniczej 12 V. Druciki wraz z woskiem dentystycznym LMP nie powinny być zaklejone na ostatniej jednej trzeciej swojej długości.Następnie podłącz ten wielokanałowy zespół mikrodrutów do adaptera elektrody. Ustaw wysuniętą kapilarę szklaną równolegle do mikrodrutów. Zabezpiecz to połączenie woskiem dentystycznym wzdłuż nakładającej się kapilary szklanej i pinu minutian.Następnie przytnąć przewody elektrod, pozostawiając dwa do trzech centymetrów wystających z pinu minutian oraz dwa do trzech centymetrów wystających z końca elektrody. Dalej, osadzić kapilarę w adapterze elektrody i za pomocą śruby ustabilizować całość w jednej pozycji. W temperaturze 360 °C.Przylutuj końce przewodów prostopadle do konektorów. Następnie sprawdź, czy kontakt elektryczny jest wystarczająco silny, weryfikując, czy ich impedancja wynosi około 300 kilo ohms przy częstotliwości jednego kilohertz. Teraz połącz kanały drugiego adaptera elektrod z elektrodą główną, a elektrody referencyjną i mięśniową przylutuj do podstawy elektrod głównych.Na koniec zamocuj elektrodę główną do płyty interfejsu stopnia głowicowego. Drugą elektrodę zamocuj na oddzielnym adapterze po schłodzeniu pszczół miodnych na lodzie do czasu ich unieruchomienia. Następnie przymocuj pszczołę w standardowym uchwycie z pleksiglasu w taki sposób, aby głowa pozostała odsłonięta.Nanieś podgrzany wosk dentystyczny na podstawę oczu oraz na połączenie głowy z tułowiem, aby unieruchomić głowę. Następnie użyj wosku, aby przymocować scape oczu czułków do torebki głowy. Unikaj nakładania wosku na flagellum, które powinno być skierowane do przodu.Sonda Pro Bois nie powinna być blokowana. Należy sprawdzić, czy może się ona poruszać. Następnie należy ogolić torebkę głowową, aby poprawić dostęp.Następnie podaj pszczole całą ilość 30% sucrose, którą jest w stanie spożyć. Zapewni to odpowiednie przygotowanie, żywotność oraz wilgotność tkanek. Teraz, używając mikroskalpela, wykonaj cięcie pionowe wzdłuż krawędzi oka oraz cięcie poziome nad nasadami anten.Kontynuuj nacinanie pod okiem komórki O i usuń luźny kutykula. Gruczoły podgardłowe oraz tchawka powinny zostać odsunięte na bok. Udrożni to drogę do wprowadzenia elektrody.Zacznij od wprowadzenia elektrody odniesienia, którą stanowi srebrny drut o grubości 35 mikronów. Najpierw wykonaj niewielkie nacięcie w ipsilateralnym oku złożonym, a następnie wsuń przez nie elektrodę.Następnie wprowadź drugi drut do obszaru projekcji mięśniowej poniżej bocznego oka komórki O. Aby umożliwić późniejszą wizualizację położenia elektrod, zanurz je na trzy minuty w roztworze 0,5 M chlorku potasu i 5% Alexa Hydrocyte 4 88. Następnie, korzystając z mikromanipulatorów, umieść obie elektrody w mózgu.Zorientuj się w przestrzeni, identyfikując płat antenowy oraz płat pionowy ciała grzybiastym. W tym przypadku jedna elektroda znajduje się w bocznym torze płata antenowego na głębokości 180 mikronów, a druga w przyśrodkowym torze płata antenowego. Wprowadzone na głębokość około 300 mikronów.Zakończ rozmieszczenie elektrod, mocując je za pomocą dwóch komponentów. Silikon pokrywa całą przestrzeń nad mózgiem, co zapobiegnie również wysychaniu tkanek. Następnie przystąp do rejestracji w celu wyekstrahowania aktywności jednostek z sygnału zarejestrowanego z przestrzeni zewnątrzkomórkowej.Użyj dostępnego oprogramowania do sortowania impulsów (spike sorting). Wykorzystaj zróżnicowane kanały elektrod. Zastosuj techniki dopasowania szablonów (template matching) jednocześnie na wszystkich trzech kanałach elektrod, aby wykryć różne kombinacje kształtów fali odpowiadające pojedynczym zdarzeniom impulsowym.Na koniec należy sprawdzić prawidłowość separacji jednostek. W tym celu zastosowano analizę głównych składowych (PCA) dla pojedynczych zdarzeń impulsowych z trzech zarejestrowanych kanałów elektrod różnicowych. Po zakończeniu pomiarów należy ostrożnie usunąć krzem oraz elektrody z pszczoły.Następnie przemyj mózg roztworem bee ringer i usuń gruczoły oraz tchawki. Potem, używając mikropipety, wstrzyknij do płata antenalnego 5% micro ruby rozpuszczonego w jednomolowym octanie potasu. Zapewni to transport anterogradny znacznika wzdłuż dróg płata.Od tego momentu wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w maksymalnym zaciemnieniu. Ponownie przepłukać mózg roztworem bee ringers trzy razy, a następnie inkubować barwnik przez 30 do 45 minut. Unieruchomić pszczołę poprzez schłodzenie jej w lodówce.Następnie należy wyizolować mózg. Mózg utrwala się w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PBS przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu. Następnie stosuje się standardowe protokoły odwadniania i przejaśniania. Po wstecznym wypełnieniu neuronów projekcyjnych w płacie antenalnym markerem micro ruby, z ortogonalnych przekrojów wzdłuż osi Z zmontowano widok projekcyjny tych neuronów.Barwnik Alexa Hydrocyte 4 88 na dwóch elektrodach wskazuje na ich wprowadzenie do traktu przyśrodkowego płata antenowego oraz do traktu bocznego płata antenowego. Do stworzenia schematu dwóch trajektorii w płatach antenowych wykorzystano rekonstrukcję 3D zabarwionych komórek docelowych i miejsc wprowadzenia elektrod. W celu zbadania przetwarzania czasowego przeprowadzono jednoczesną rejestrację z dwóch traktów płata antenowego podczas stymulowania pszczoły różnymi stężeniami zapachów. Aktywność oceniano w kolejnych etapach przetwarzania.Analiza głównych składowych wektorów populacyjnych neuronów projekcyjnych płata antenowego oraz neuronów zewnętrznych wykazuje, że odpowiedź na zapach w neuronach projekcyjnych była przedłużona i trwała dłużej niż sam bodziec. W przeciwieństwie do nich, w populacji neuronów zewnętrznych reprezentowane były jedynie typy odpowiedzi typu „zapach włączony” (odor on) oraz „zapach wyłączony” (odor off). Zatem obserwując aktywność w czasie, populacja neuronów zewnętrznych po prawej stronie wykazuje aktywność rozdzielającą zapachy nieco wcześniej, niż populacja neuronów projekcyjnych zaczyna rozwijać aktywność indukowaną zapachem.Stymulacja zapachowa została zaznaczona na szaro. Po opanowaniu techniki, zbudowanie elektrody zajmuje około 30 minut. Przygotowanie pszczoły i wprowadzenie elektrod do docelowych obszarów można przeprowadzić w ciągu kolejnego pół godziny, jeśli proces ten jest wykonany prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każdy krok wymaga dużej wprawy i cierpliwości, aż do momentu pełnego opanowania techniki. Należy zachować szczególną ostrożność podczas lutowania przewodów elektrod do punktów połączenia oraz podczas rejestracji z pożądanego obszaru mózgu. Wymagana jest solidna wiedza z zakresu anatomii mózgu pszczoły miodnej po jego rozwoju.Technika ta umożliwiła badaczom z dziedziny neuropatologii i węchu owadów zbadanie precyzyjnych zależności czasowych między aktywnością różnych szlaków neuronalnych i ośrodków mózgowych u pszczół miodnych podczas wykonywania określonych zachowań. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat konstruowania i wykorzystywania wielokanałowych elektrod z mikrodrutów do jednoczesnego rejestrowania aktywności z dwóch obszarów mózgu u pszczół miodnych w trakcie ich aktywności. Powinni Państwo być również w stanie zwizualizować dokładne położenie zastosowanych elektrod rejestrujących.

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednoczesne długotrwałe rejestrowanie na dwóch etapach przetwarzania neuronowego u pszczół miodnych w czasie zachowania

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Uczenie się nowych powiązań bodziec-reakcja angażuje szeroki zakres procesów neuronalnych, które ostatecznie znajdują odzwierciedlenie w zmianie wydajności skoków poszczególnych neuronów. Tutaj opisujemy protokół behawioralny pozwalający na ciągłą rejestrację aktywności pojedynczego neuronu, podczas gdy zwierzęta nabywają, wygaszają i ponownie nabywają warunkową reakcję w ciągu jednej sesji eksperymentalnej.

Rejestrowanie potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów od swobodnie poruszających się gołębi na trzech etapach uczenia się

Ten film opisuje Radio-Frequency Identification (RFID) i metody nagrywania wideo wrażliwe na ruch w celu monitorowania zachowań trzmieli.

Identyfikacja radiowa i wideo wrażliwe na ruch skutecznie automatyzują rejestrowanie nienagradzanych zachowań wybranych przez trzmiele

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.

Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa

Poznaj metodę jednoczesnych długoterminowych zapisów elektrofizjologicznych z dwóch neuropili mózgu pszczół miodnych. Technika ta umożliwia badanie przetwarzania węchowego i formowania pamięci u zachowujących się zwierząt.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Przeglądaj więcej filmów