Name: Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Odkryj metodę rejestracji multimodalnej aktywności neuronalnej za pomocą HD-MEA zintegrowanej z CMOS. Technika umożliwia analizę dynamiki dużych sieci neuronowych w hipokampie, opuszce węchowej oraz ludzkich neuronach iPSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze instytucjonalne (DZNE), Stowarzyszenie Helmholtza w ramach Funduszu Walidacji Helmholtza (HVF-0102) oraz Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). Chcielibyśmy również podziękować platformie do testów behawioralnych na zwierzętach w DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther i Jens Bergmann) za ich wsparcie. Pragniemy potwierdzić, że część rysunku 1 została stworzona przy użyciu platformy BioRender.com.

Multimodal Large-Scale Neural Recordings and Analysis on HD-MEA 

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Skomplikowana dynamika czasoprzestrzennej aktywności neuronalnej, wyłaniająca się z połączonych ze sobą zespołów neuronalnych, od dawna jest przedmiotem intryg w neurobiologii. Tradycyjne metodologie, takie jak patch-clamp, standardowe obrazowanie MEA i Ca2+, dostarczyły cennych informacji na temat złożoności mózgu. Jednak często nie są one w stanie uchwycić kompleksowej dynamiki obliczeniowej obejmującej całą sieć 21,22,23. Protokół techniczny platformy HD-MEA, szczegółowo opisany w tym badaniu JoVE, stanowi znaczący krok naprzód, oferując panoramiczny obraz dynamiki neuronalnej w różnych modalnościach, od zespołów komórkowych po ekspansywne sieci (tj. ostre, ex-vivo mysie wycinki mózgu i ludzkie sieci iPSC in vitro)26,29,30,32.
Ostre, ex-vivo wycinki mózgu myszy były podstawowym narzędziem w badaniach neuronalnych, ułatwiając badania molekularne i obwodowe 6,7. Jednak wyzwanie, jakim jest utrzymanie żywotności tkanek, jest stałym wąskim gardłem. Protokół opisany w tym badaniu wprowadza krytyczne modyfikacje w celu optymalizacji jakości i trwałości tych plastrów, aby wykorzystać ich zalety na platformie HD-MEA. Protokół ten podkreśla znaczenie - i) Osiągnięcia jednorodności plastrów, dla której użycie wibratomu jest preferowane w stosunku do rozdrabniacza tkanek ze względu na jego precyzję i zminimalizowane uszkodzenie tkanek, pomimo kompromisu w postaci dłuższego czasu krojenia. ii) Zapewnienie stałej karbonizacji w całym procesie, od ekstrakcji do rejestracji, w celu utrzymania żywotności tkanek. iii) Regulacja temperatury i zapewnienie odpowiedniego czasu na regenerację przed nagraniem. iv) Wykorzystanie bloku agarozy lub formy do stabilizacji mózgu, zapobiegania rozdarciom i zminimalizowania kontaktu z klejem. v) Utrzymanie optymalnych natężeń przepływu karbogenicznego aCSF w zbiorniku HD-MEA w celu zapewnienia zdrowia plastrów przy jednoczesnym unikaniu problemów, takich jak rozprzęganie, hałas i dryft (Tabela 2).
Zarówno w przypadku wycinków mózgu myszy, jak i preparatów iPSC u ludzi, poprawa sprzężenia między elektrodą a tkanką ma kluczowe znaczenie 30,46,47. Nasz protokół podkreśla znaczenie wykorzystania cząsteczki sprzyjającej adhezji poli-dl-ornityny (PDLO). Cząsteczka ta nie tylko zwiększa powierzchnię do wykrywania sygnałów elektrycznych, ale także zwiększa przewodność elektryczną46. W ten sposób wspomaga adhezję komórkową, wzrost i rozwój funkcjonalnych właściwości sieci. Taka optymalizacja odgrywa kluczową rolę w zwiększaniu skuteczności platformy HD-MEA. To z kolei zapewnia dokładną i spójną analizę konektomów ex-vivo i in vitro w mikroskali oraz ich czasoprzestrzennych sekwencji wypalania. Warto zauważyć, że wykazano, że PDLO przewyższa inne substraty, takie jak polietylenoimina (PEI) i poli-l-ornityna (PLO) w promowaniu spontanicznej aktywności wypalania i reagowaniu na bodźce elektryczne w hodowlach neuronów. Dodatkowo, PDLO został wykorzystany do funkcjonalizacji powierzchni w HD-MEA i wykazano, że poprawia interfejs sprzężenia elektroda-plasterek i zwiększa stosunek sygnału do szumu zarówno w warstwach OB, jak i HC26,29. Dodanie specjalnie zbudowanej platynowej kotwicy dodatkowo zwiększa sprzężenie interfejsu elektroda-plasterek, prowadząc do nagrań o wyższym stosunku sygnału do szumu.
Wykorzystanie HD-MEA zarówno do wycinków mózgu myszy ex-vivo, jak i ludzkich sieci iPSC in vitro wprowadza metodę biegłą w badaniu ekstensywnej, wieloskalowej i multimodalnej dynamiki. To innowacyjne podejście wiąże się jednak ze znacznymi wyzwaniami, zwłaszcza w zakresie zarządzania danymi 48,49,50,51. Pojedyncze nagranie HD-MEA uzyskane z częstotliwością próbkowania 18 kHz/elektrodę generuje oszałamiającą ilość danych 155 MB/s. Ilość danych gwałtownie rośnie, gdy weźmie się pod uwagę wiele wycinków, różne schorzenia farmakologiczne lub przedłużone okresy rejestracji. Taki napływ informacji wymaga solidnej infrastruktury pamięci masowej i zaawansowanych narzędzi obliczeniowych do usprawnienia przetwarzania. Zdolność platformy HD-MEA do jednoczesnego gromadzenia danych z tysięcy zespołów neuronalnych jest zarówno dobrodziejstwem, jak i przeszkodą. Zapewnia doskonały wgląd w dynamikę obliczeniową funkcji mózgu, ale wymaga również wyrafinowanych ram analitycznych. W tym protokole JoVE przedstawiliśmy przykłady strategii obliczeniowych, w tym wykrywania zdarzeń na dużą skalę, klasyfikacji, teorii grafów, analizy częstotliwości i uczenia maszynowego. Metody te podkreślają intensywne wysiłki podejmowane w celu sprostania wyzwaniom związanym z analizą złożonych danych neuronowych. Niemniej jednak nadal istnieje spore pole do opracowania bardziej zaawansowanych narzędzi obliczeniowych do analizy tych wielowymiarowych zestawów danych neuronowych. Uzbrojona w odpowiednie narzędzia i metodologie, potencjał platformy HD-MEA został zwiększony, oferując głęboki wgląd w zawiłości funkcji mózgu zarówno w zdrowych, jak i patologicznych warunkach.
Zasadniczo, platforma HD-MEA, po zintegrowaniu ze szczegółowymi protokołami i narzędziami obliczeniowymi, oferuje transformacyjne podejście do zrozumienia skomplikowanych operacji mózgu. Rejestrując dynamikę na dużą skalę, wieloskalową i multimodalną, zapewnia bezcenny wgląd w procesy, takie jak uczenie się, pamięć i przetwarzanie informacji. Co więcej, jego zastosowanie w sieciach iPSC u ludzi in vitro może zrewolucjonizować badania przesiewowe leków i medycynę spersonalizowaną. Jednak, chociaż platforma ta stanowi znaczący postęp w badaniach neurobiologicznych, ważne jest, aby uznać i zająć się nieodłącznymi wyzwaniami technicznymi. Dzięki ciągłemu doskonaleniu i integracji zaawansowanych narzędzi obliczeniowych, platforma HD-MEA jest gotowa zapoczątkować nową erę precyzyjnych narzędzi diagnostycznych, identyfikacji specyficznych biomarkerów i celowanych terapii zaburzeń neurologicznych.

Zespoły neuronalne, często nazywane zespołami komórek, odgrywają kluczową rolę w kodowaniu neuronowym, ułatwiając skomplikowane obliczenia do przetwarzania wieloskalowych informacji neuronowych1,2,3. Zespoły te leżą u podstaw tworzenia rozległych sieci neuronalnych i ich zniuansowanych mikroukładów4. Takie sieci i ich wzorce oscylacyjne napędzają zaawansowane funkcje mózgu, w tym percepcję i poznanie. Podczas gdy szeroko zakrojone badania dotyczyły konkretnych typów neuronów i ścieżek synaptycznych, głębsze zrozumienie, w jaki sposób neurony wspólnie tworzą zespoły komórkowe i wpływają na czasoprzestrzenne przetwarzanie informacji w obwodach i sieciach, pozostaje nieuchwytne5.
Ostre, ex-vivo wycinki mózgu są kluczowymi narzędziami elektrofizjologicznymi do badania nienaruszonych obwodów neuronalnych, oferując kontrolowane warunki do badania wzorców aktywności oscylacyjnej funkcji neuronalnych, transmisji synaptycznej i łączności, z implikacjami w testach farmakologicznych i modelowaniu chorób6,7,8. Ten protokół badania podkreśla dwa kluczowe obwody mózgowe - hipokampowo-korowy (HC) zaangażowany w procesy uczenia się i pamięci9,10, oraz opuszkę węchową (OB) odpowiedzialną za dyskryminację zapachów11,12,13. W tych dwóch regionach nowe funkcjonalne neurony są stale generowane przez neurogenezę dorosłego człowieka przez całe życie w mózgach ssaków14. Oba obwody wykazują wielowymiarowe dynamiczne wzorce aktywności neuronalnej i wrodzoną plastyczność, które uczestniczą w ponownym okablowaniu istniejącej sieci neuronowej i ułatwiają alternatywne strategie przetwarzania informacji, gdy jest to wymagane15,16.
Ostre, ex-vivo modele wycinków mózgu są niezbędne do zgłębienia funkcjonalności mózgu i zrozumienia mechanizmów choroby na poziomie mikroukładów. Jednak hodowle komórkowe in vitro pochodzące z sieci neuronalnych indukowanych przez ludzi pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oferują obiecującą drogę badań translacyjnych, płynnie łącząc wyniki eksperymentów na zwierzętach z potencjalnym leczeniem klinicznym u ludzi17,18. Te skoncentrowane na człowieku testy in vitro służą jako niezawodna platforma do oceny toksyczności farmakologicznej, umożliwiając precyzyjne badania przesiewowe leków i kontynuując badania nad innowacyjnymi strategiami terapeutycznymi opartymi na komórkach19,20. Uznając kluczową rolę modelu neuronalnego iPSC, poświęciliśmy trzeci moduł tego badania protokołu, aby dokładnie zbadać cechy funkcjonalne sieci pochodnych i dostroić powiązane protokoły hodowli komórkowych.
Te elektrogeniczne moduły neuronowe były powszechnie badane przy użyciu technik takich jak wapń (obrazowanie Ca2+), zapisy patch-clamp i matryce mikroelektrod o niskiej gęstości (LD-MEA). Podczas gdy obrazowanie Ca2 + oferuje mapowanie aktywności pojedynczej komórki, jest to metoda oparta na znakowaniu komórek, utrudniona ze względu na niską rozdzielczość czasową i wyzwania w długoterminowych zapisach. LD-MEA nie mają precyzji przestrzennej, podczas gdy patch-clamp, będąc inwazyjną techniką jednomiejscową i pracochłonną, często daje niski wskaźnik sukcesu21,22,23. Aby sprostać tym wyzwaniom i skutecznie badać aktywność w całej sieci, pojawiły się wielkoskalowe jednoczesne zapisy neuronowe, które stały się kluczowym podejściem do zrozumienia obliczeniowych zasad dynamiki neuronalnej leżących u podstaw złożoności mózgu i ich implikacji dla zdrowia i choroby24,25.
W tym protokole JoVE demonstrujemy metodę rejestracji neuronowej na dużą skalę, opartą na MEA O WYSOKIEJ GĘSTOŚCI (HD-MEA) do przechwytywania czasoprzestrzennej aktywności neuronalnej w różnych modalnościach mózgu, w tym w obwodach hipokampa i opuszki węchowej z ostrych wycinków mózgu myszy ex-vivo (<silna klasa="xfig">Rysunki 1A-C) oraz ludzkich sieci neuronalnych pochodzących z iPSC in vitro (<silna klasa="xfig">Rysunki 1D-E), wcześniej zgłoszone przez naszą grupę i innych kolegów26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, zbudowany w oparciu o technologię CMOS (Complementary-metal-oxide-semiconductor), może pochwalić się wbudowanymi obwodami i wzmocnieniem, umożliwiając zapisy w czasie poniżej milisekundy na matrycy 7mm2 rozmiar36. To nieinwazyjne podejście rejestruje wielomiejscowe, bezznacznikowe zewnątrzkomórkowe wzorce wypalania z tysięcy zespołów neuronalnych jednocześnie przy użyciu 4096 mikroelektrod w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, ujawniając skomplikowaną dynamikę lokalnych potencjałów pola (LFP) i wielojednostkowej aktywności impulsowej (MUA)26,29.
Biorąc pod uwagę ogrom danych generowanych przez tę metodologię, zaawansowane ramy analityczne są niezbędne, ale stanowią wyzwanie37. Opracowaliśmy narzędzia obliczeniowe, które obejmują automatyczne wykrywanie zdarzeń, klasyfikację, teorię grafów, uczenie maszynowe i inne zaawansowane techniki (Rysunek 1F)26,29,38,39. Integrując HD-MEA z tymi narzędziami analitycznymi, opracowano holistyczne podejście do badania skomplikowanej dynamiki od pojedynczych zespołów komórek do szerszych sieci neuronowych w różnych modalnościach neuronowych. To połączone podejście pogłębia naszą wiedzę na temat dynamiki obliczeniowej w normalnych funkcjach mózgu i oferuje wgląd w anomalie występujące w stanach patologicznych28. Co więcej, spostrzeżenia wynikające z tego podejścia mogą napędzać postępy w modelowaniu inspirowanym mózgiem, obliczeniach neuromorficznych i algorytmach uczenia się neuronowego. Ostatecznie metoda ta jest obiecująca, jeśli chodzi o odkrycie podstawowych mechanizmów stojących za zakłóceniami sieci neuronowych, potencjalną identyfikację biomarkerów i ukierunkowanie tworzenia precyzyjnych narzędzi diagnostycznych i ukierunkowanych metod leczenia schorzeń neurologicznych.

<table><tbody><tr><td>Szklana szalka Petriego 150 mm</td><td>ogólna</td><td></td> ogólna <td>przestrzeń robocza do przygotowania mózgu, przestrzeń robocza do nagrywania wycinków mózgu</td></tr><tr><td>0,22 i mu; m Sterylna jednostka filtrująca&nbsp;</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Plastikowe naczynie do hodowli</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Miejsce do przygotowywania mózgu, Miejsce do nagrywania wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>6351.5</td><td>Miejsce do przygotowywania mózgu</td></tr><tr><td>Forma agarozowa</td><td>NIESTANDARDOWE</td><td></td><td>Miejsce pracy do przygotowania mózgu; Specjalnie zaprojektowany projekt drukarki 3D, dostępny na życzenie</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>ogólna</td><td></td><td>ogólna przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu</td></tr><tr><td>Komora anestezjologiczna</td><td>ogólna</td><td></td><td>ogólna przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu; Różne zlewki, ściółki itp</td></tr>. <tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td>Miejsce pracy do przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>Różne zlewki</td><td>ogólne</td><td></td><td>Miejsce pracy do przygotowywania roztworów; 50 ml</td></tr><tr><td>Różne Luers</td><td>Cole Parmer</td><td>45511-00</td><td>Obszar nagrywania wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Różne kolby miarowe</td><td>ogólne</td><td></td><td>ogólne przygotowanie roztworu Obszar roboczy; 500 mL, 1 L</td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego z lampą UV</td><td>Różne</td><td></td> rodzaje <td>HD-MEA Powłoka, poszycie, konserwacja Przestrzeń robocza</td></tr><tr><td>BrainPhys Neuronal Medium&nbsp;</td><td>Technologie STEMCELL&nbsp;</td><td>05790&nbsp;</td><td>CDI i Protokół BrainXell dla dostawców komercyjnych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Brainwave</td><td>3Brain AG</td><td>Wersja 4</td><td>Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice i Human iPSC</td></tr><tr><td>BrainXell&nbsp; Test neuronów glutaminergiczne&nbsp;</td><td>MózgXell</td><td>&nbsp; BX-0300&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Przestrzeń robocza do przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>ogólny</td><td>ogólny</td><td>Wszystkie obszary robocze; 95%/5% mieszaniny O2 i CO2</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Układ HD-MEA oparty na CMOS</td><td>3Brain AG</td><td>CUSTOM</td><td>Brain Slice i Human iPSC Recording Workspace</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki, 50 mL, Falcon (probówki wirówkowe)&nbsp;</td><td>Technologie STEMCELL&nbsp;</td><td>38010&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego CDI</td></tr><tr><td>uziemiające z zaciskiem krokodylkowym</td><td>JWQIDI</td><td>B06WGZG17W</td><td>Obszar nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td>FST</td><td>11052-10</td><td>Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Technologie o średniej</td><td>żywotności</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Protokół dostawcy handlowego BrainXell</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (D-PBS)</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>37350&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego CDI</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Macherey-Nagel</td><td>531 011</td><td>Przygotowanie mózgu Przestrzeń robocza</td></tr><tr><td>Drobna szczotka</td><td>Leonhardy</td><td>773</td><td>Miejsce do przygotowania wycinków mózgu, Kleszcze do nagrywania fragmentów mózgu</td></tr><tr><td></td><td>VITLAB</td><td>67895</td><td>Miejsce do nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologie</td><td>A1413201</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Roth</td><td>4518</td><td>Miejsce robocze do przygotowania plasterków mózgu, miejsce do nagrywania wycinków mózgu</td></tr><tr><td></td><td>Glukoza Sigma Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>Przestrzeń robocza do przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>Oparty na grawitacji System perfuzyjny</td><td>ALA</td><td>VC3-8xG</td><td>Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>HD-MEA Platforma nagraniowa</td><td>3Brain AG</td><td>CUSTOM</td><td>Grzałka do pracy do nagrywania Brain Slice i iPSC</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td>Obszar roboczy do nagrywania wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Hemocytometr lub automatyczny licznik komórek</td><td>Różne</td><td></td> rodzaje <td>HD-MEA Powlekanie, galwanizacja, konserwacja Przestrzeń robocza</td></tr><tr><td>Hypo Needles</td><td>Warner Instruments</td><td>641489</td><td>Brain Slice Recording</td></tr><tr><td>Workspace iCell GlutaNeurons Kit, 01279&nbsp;</td><td>CDI</td><td>R1061&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego CDI</td></tr><tr><td>Irys Scissors</td><td>Vantage</td><td>V95-304</td><td>Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-250G</td><td>Miejsce przygotowania roztworu</td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L2020&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego CDI</td></tr><tr><td>Magazyn ciekłego azotu&nbsp;</td><td>Różne</td><td></td><td>Powlekanie, powlekanie, konserwacja Przestrzeń robocza HD-MEA</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Ogólne</td><td></td> ogólne <td>Przygotowanie roztworu Miejsce pracy</td></tr><tr><td>metalowe</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td><td>Obszar nagrywania plasterków mózgu MgCl</td></tr><tr><td>2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td>Obszar roboczy do przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138-250G</td><td>Przygotowanie roztworu</td></tr><tr><td>Uchwyt narzędziowy do mikrodysekcji w miejscu pracy&nbsp;</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>Miejsce do przygotowania plasterków mózgu, miejsce do nagrywania plasterków mózgu</td></tr><tr><td>Igła do mikrodysekcji</td><td>Braun&nbsp;</td><td>9186166</td><td>Obszar roboczy do przygotowania Brain Slice, Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>Modułowy mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>CUSTOM</td><td>Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice; niestandardowe specyfikacje i modyfikacje</td></tr><tr><td>N2 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>CDI i Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>Rozwiązanie NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-1KG</td><td> Miejsce pracy do przygotowania</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751-100G</td><td>Miejsce pracy do przygotowania roztworu</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td>Miejsce pracy do przygotowania roztworu</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego BrainXell</td></tr><tr><td>System klatek optycznych</td><td>Thorlabs</td><td>Assorted</td><td>Brain Slice Recording</td></tr><tr><td>Workspace Stół optyczny z płytką stykową</td><td>Thorlabs</td><td>SDA7590</td><td>Obszar roboczy do nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>PDLO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0671</td><td>Powłoka HD-MEA, miejsce do nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna, 100x&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>15140-122&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego CDI</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>TipONE</td><td>S1120-8810</td><td>Pipety do nagrywania Brain Slice w miejscu pracy</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa kotwica</td><td>NIESTANDARDOWE</td><td></td><td>Miejsce do nagrywania Brain Slice Rurki</td></tr> polietylenowe <tr><td></td><td>Różne</td><td></td> różne obszary <td>robocze do nagrywania plasterków mózgu</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>MasterFlex</td><td>78018-22</td><td>Miejsce do nagrywania Brain Slice</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td></td> Apollo <td>10179960</td><td>Przygotowanie mózgu</td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna Nasadka do hodowli komórek</td><td>CUSTOM CUSTOM</td><td></td><td>Przestrzeń robocza do nagrywania iPSC u ludzi; Specjalnie zaprojektowany projekt drukarki 3D, dostępny na żądanie</td></tr><tr><td>Gumowa żarówka do pipet</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>292000205</td><td>Obszar roboczy do przygotowania plasterków mózgu, obszar roboczy do nagrywania plasterków mózgu</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 ml</td><td>Różne</td><td></td> różne <td></td></tr><tr><td>Komora odzyskiwania plastrów</td><td>NIESTANDARDOWE</td><td>NIESTANDARDOWE</td><td>Obszar roboczy odzyskiwania wycinków mózgu; Specjalnie zaprojektowany projekt drukarki 3D, dostępny na życzenie</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>ISOLAB</td><td>047.06.150</td><td>Przestrzeń robocza do przygotowania mózgu</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100-1KG</td><td>Miejsce do przygotowywania roztworów</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>UHU</td><td>358221</td><td>Miejsce do przygotowania plasterków mózgu</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Peters Instruments</td><td>BC 344</td><td>Przestrzeń robocza do ekstrakcji mózgu</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa&nbsp;</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Różne TGF</td></tr><tr><td>-&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td>BrainXell Protokół dostawcy komercyjnego</td></tr><tr><td>Bibułka</td><td>Ogólny</td><td>ogólny</td><td>obszar roboczy do ekstrakcji mózgu</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 07050&nbsp;</td><td>Protokół dostawcy komercyjnego CDI</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>CUSTOM</td><td>Przestrzeń robocza do obrazowania; Niestandardowe specyfikacje i modyfikacje:</td></tr><tr><td>Vacusip</td><td>Integra</td><td>159010</td><td>Brain Slice Recording Workspace</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td>Brain Slice Preparation Workspace; Zawiera: Płytka na próbkę, taca buforowa, tacka na lód, narzędzie do trzymania płytki na próbkę, narzędzie do regulacji ostrza wibratomu</td></tr><tr><td>Vibratome Blade</td><td>Personna</td><td>N/A</td><td>Brain Slice Preparation Workspace</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Lauda</td><td>L000595</td><td>Brain Slice Recovery Workspace</td></tr></tbody></table>

rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z cmos matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array

Sieci neuronowe o dużej skali i ich złożone mikroobwody są niezbędne do generowania percepcji, poznania i zachowania, które wyłaniają się z wzorców czasoprzestrzennej aktywności neuronalnej. Te dynamiczne wzorce wyłaniające się z grup funkcjonalnych połączonych ze sobą zespołów neuronalnych ułatwiają precyzyjne obliczenia w zakresie przetwarzania i kodowania wieloskalowych informacji neuronowych, napędzając w ten sposób wyższe funkcje mózgu. Aby zbadać obliczeniowe zasady dynamiki neuronalnej leżące u podstaw tej złożoności i zbadać wieloskalowy wpływ procesów biologicznych na zdrowie i chorobę, zasadnicze znaczenie odegrały równoległe nagrania na dużą skalę. W tym przypadku matryca mikroelektrod o dużej gęstości (HD-MEA) została wykorzystana do badania dwóch modalności dynamiki neuronalnej - obwodów opuszki hipokampa i opuszki węchowej z wycinków mózgu myszy ex-vivo oraz sieci neuronowe z hodowli komórkowych in vitro ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Platforma HD-MEA, z 4096 mikroelektrodami, umożliwia nieinwazyjne, wielomiejscowe, bezznacznikowe zapisy zewnątrzkomórkowych wzorców wypalania z tysięcy zespołów neuronalnych jednocześnie w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Podejście to pozwala na scharakteryzowanie kilku cech elektrofizjologicznych obejmujących całą sieć, w tym wzorców aktywności impulsowej pojedynczej/wielu jednostek oraz lokalnych oscylacji potencjału pola. Aby przeanalizować te wielowymiarowe dane neuronowe, opracowaliśmy kilka narzędzi obliczeniowych obejmujących algorytmy uczenia maszynowego, automatyczne wykrywanie i klasyfikację zdarzeń, teorię grafów i inne zaawansowane analizy. Uzupełniając te potoki obliczeniowe o tę platformę, zapewniamy metodologię badania dużej, wieloskalowej i multimodalnej dynamiki od zespołów komórek do sieci. Może to potencjalnie poszerzyć naszą wiedzę na temat złożonych funkcji mózgu i procesów poznawczych w zdrowiu i chorobie. Zaangażowanie w otwartą naukę i wgląd w obliczeniową dynamikę neuronalną na dużą skalę może usprawnić modelowanie inspirowane mózgiem, obliczenia neuromorficzne i algorytmy uczenia się neuronowego. Co więcej, zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw upośledzonych wielkoskalowych obliczeń neuronowych i ich wzajemnie powiązanej dynamiki mikroobwodów może doprowadzić do identyfikacji konkretnych biomarkerów, torując drogę do dokładniejszych narzędzi diagnostycznych i celowanych terapii zaburzeń neurologicznych.

Multimodelowe mapowanie spatiotemporalne i ekstrakcja cech wyładowań oscylacyjnych 
Aby ilościowo określić zdarzenia LFP i kolców w całej sieci, które wyłoniły się z dynamicznych zespołów neuronalnych, zbadano synchroniczne, wielkoskalowe wzorce wyładowań w obwodach HC i OB oraz w sieciach ludzkich iPSC. Obwody z zapisów skrawków mózgu z kroku 3.2 oraz zapisane sieci iPSC z kroku 3.3 zostały przeanalizowane zgodnie z krokami 4.1-4.2 protokołu. Najpierw przeprowadzono detekcję zdarzeń i odszumianie dla wszystkich zapisanych zbiorów danych, z rozdzielczością regionalną zgodnie ze specyfikacją obwodów. Następnie wykreślono topograficzne mapy przestrzenne w pseudokolorach dla średnich wielkoskalowych wzorców wyładowań LFP i kolców, rastergramy wykrytych zdarzeń oraz reprezentatywne 5-s ślady przefiltrowanych przebiegów (Rysunki 3A-I). Topograficzne mapy pseudokolorowe wzorców częstotliwości wyładowań LFP i kolców w dużej skali nałożono na odpowiednie obrazy optyczne HC (Rysunek 3A), OB (Rysunek 3B) i ludzkiej sieci neuronalnej iPSC (Rysunek 3C) zarejestrowane za pomocą mikroskopu. Pozwala to na badanie poszczególnych wzorców oscylacyjnych i odpowiedzi w obrębie obwodów i sieci. Rastergramy HC i OB zawierają liczby wykrytych zdarzeń LFP posortowane według warstw DG, Hilus, CA3, CA1, EC i PC obwodu HC oraz warstw ONL, OCx, GL, PL i GCL sieci OB w 60-s przedziałach czasowych (Rysunki 3D,E). Rastergram ludzkich iPSC przedstawia synchroniczne wykryte zdarzenia kolców połączonej hodowanej sieci w 20-s przedziałach czasowych (Rysunek 3G). Następnie, reprezentatywne 5-s ślady zdarzeń z wielkoskalowych miejsc rejestracji HD-MEA pokazują zakres zarejestrowanych częstotliwości oscylacyjnych w obwodach HC (np. wybrana elektroda w CA3) (Rysunek 3G) i OB (np. wybrana elektroda w GL) (Rysunek 3H) oraz aktywność seryjną kolców wielojednostkowych w ludzkiej sieci iPSC z czterech wybranych aktywnych elektrod w matrycy (Rysunek 3I). Przykładowe sygnały te wykazują sygnatury biosygnałów, w tym niskoczęstotliwościowe oscylacje LFP (1-100 Hz) z przefiltrowanymi pasmowo pasmami częstotliwości δ, θ, β i γ; ripple sharp wave (SWR) (140-220 Hz) oraz wysokoczęstotliwościowe pojedyncze kolce i MUA (300-3500 Hz). Na koniec zastosowano analizę gęstości widmowej mocy (PSD), aby jednocześnie ilościowo określić amplitudę mocy konkretnego pasma oscylacyjnego w połączonych obwodach HC i OB zarejestrowanych za pomocą HD-MEA (Rysunki 3J,K).
Multimodal funkcjonalny konektom w skali całej sieci 
Aby wywnioskować wielkoskalową łączność wielowarstwowych sieci neuronalnych na podstawie wzorców jednoczesnego wyładowywania aktywnych zespołów neuronów, obliczono kowariancję krzyżową między parami aktywnych elektrod w wykrytych zdarzeniach zgodnie z krokiem 4.2.6 protokołu. W tym przypadku współczynnik korelacji został posortowany według warstw w obwodzie HC i OB lub pozostawiony bez sortowania w sieci iPSC, a następnie zapisany w macierzy symetrycznej. Funkcjonalne konektomy obwodów HC i OB wygenerowano, stosując wielowymiarową przyczynowość Grangera oraz funkcję transferu kierunkowego (DTF), aby ilościowo określić wpływ jednego szeregu czasowego na drugi i ocenić kierunkowy przepływ informacji w skorelowanych połączeniach w poszczególnych sieciach. Mapowanie konektomu HC (Ryc. 4A) i OB (Ryc. 4B) oraz wizualizacja sieci zostały wykonane przy użyciu programu Gephi w wersji 9.2 (https://gephi.org). W celu porównania obwodów plastrów mózgu HC i OB zastosowano podobne ograniczenia parametrów, co zilustrowało 100 s funkcjonalnej łączności wykrytych zdarzeń LFP. Węzły są skalowane zgodnie z siłą stopnia, przy czym kolor węzła wskazuje warstwę, a kolor połączenia identyfikuje połączenia wewnątrz- i międzywarstwowe. Funkcjonalne konektomy ludzkich sieci iPSC wygenerowano poprzez zastosowanie filtrów czasowo-przestrzennych (STF) i progów opóźnienia zależnych od odległości (DdLT), aby usprawnić wybór istotnych połączeń i doprecyzować identyfikację znaczących relacji poprzez zastosowanie analizy filtrowanego i znormalizowanego histogramu korelacji krzyżowej (FNCCH). Mapowanie konektomu ludzkich sieci iPSC na całym chipie HD-MEA (Ryc. 4C) oraz wizualizacja zostały wykonane przy użyciu programu Gephi. Kolor węzła wskazuje wejście pobudzające lub hamujące, a kolor połączenia identyfikuje konkretne połączenia.
<img alt="Schemat multimodalnych biohybrydowych platform neuroelektronicznych; obwody neuronalne, obrazowanie optyczne, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd platformy eksperymentalnej i obliczeniowej opartej na wielkoskalowym HD-MEA. (A) Izometryczny schemat naszych multimodalnych biohybrydowych platform neuroelektronicznych zrealizowanych z wykorzystaniem HD-MEA w technologii CMOS w celu rejestracji dynamiki neuronalnej z obwodów i sieci neuronalnych HC, OB oraz ludzkich iPSC. (B) Schematyczny przebieg procesu przygotowania skrawków mózgu myszy oraz organizacji stanowiska pracy w celu uzyskania skrawków HC i OB. (C) Przedstawienia topograficzne wielkoskalowych wzorców wyładowań rejestrowanych jednocześnie z całych skrawków HC i OB, nałożone na optyczne obrazy skrawków wraz z wyekstrahowanymi zewnątrzkomórkowymi przebiegami potencjałów. (D) Schematyczne przedstawienie sieci neuronalnej iPSC pochodzącej od ludzi. (E) Mikrofotografie fluorescencyjne obrazujące komórkowe c-fos oraz somatyczne/dendrytyczne MAP-2 całej ludzkiej sieci neuronalnej na chipie HD-MEA (lewa) zestawione z mapą średniej aktywności wyładowań całej sieci (prawa). (F) Rama obliczeniowa obejmująca zaawansowaną analizę danych, mapowanie łączności oraz narzędzia sztucznej inteligencji i uczenia maszynowego do analizy wielowymiarowych danych neuronalnych uzyskanych z wielkoskalowych pomiarów na HD-MEAs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura preparowania skrawków mózgu ex-vivo na HD-MEA, układ do rejestracji i obrazowania sieci neuronalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Układy stanowisk pracy do przygotowania i rejestracji skrawków mózgu ex-vivo oraz hodowli ludzkich iPSC in-vitro. (A) Schematyczny przebieg procesu ilustrujący układ przygotowania skrawków HC i OB, zawierający niezbędne narzędzia i sprzęt na każdym stanowisku pracy. (B) Schematyczne przedstawienie przygotowania hodowli ludzkich iPSC, wraz z niezbędnymi narzędziami i urządzeniami. Pełna lista materiałów znajduje się w krokach 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 oraz w Tabeli materiałów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obwody hipokampalno-węchowe; mapy ciepła aktywności neuronalnej; wykresy impulsów; dane widma częstotliwości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Mapowanie i wyodrębnianie czasoprzestrzennych wzorców dynamiki sieci. (A-C) Przestrzenne mapy średniego LFP i częstotliwości impulsów, obliczone na podstawie pięciominutowych zapisów, nałożone na obraz świetlny z mikroskopu. (D-F) Wykresy rastrowe przedstawiające wykryte, odszumione zdarzenia LFP w 60-sekundowej podpróbce danych oraz impulsy w 20-sekundowej podpróbce danych. (G-I) Reprezentatywne wyodrębnienie śladu przebiegu z 5-sekundowego fragmentu podpróbki danych z wykresu rastrowego (zaznaczone na czerwono na wykresie rastrowym), przedstawione jako surowe pasma oscylacyjne LFP (1-100 Hz); pasma częstotliwości δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) i γ (35-100 Hz); SWR (140-220 Hz); oraz wysokoczęstotliwościowe impulsy pojedyncze i MUA (300-3500 Hz). (J,K) Mapy gęstości widmowej mocy szybkich i wolnych oscylacji LFP (1-100 Hz) oraz SWR (140-220 Hz). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy sieci neuronalnych hipokampa, opuszki węchowej i iPSC; mapa obwodów neuronalnych i łączności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Organizacja multimodalnych funkcjonalnych konektomów w skali całej sieci. (A-C) Mapy Gephi ilustrujące funkcjonalną łączność węzłów, gdzie węzły odpowiadają jednej z przykładowych legend paska kolorów (poniżej), natomiast połączenia (krawędzie) są zacieniowane tak, aby pasowały do łączonych węzłów. Przykładowe legendy dla warstw (A) HC, (B) OB i (C) iPSC są wyświetlane na macierzy 64 x 64. Warstwy HC i OB zostały wykreślone w 100-s przedziale czasowym, aby skutecznie zredukować liczbę widocznych węzłów i połączeń na potrzeby wizualizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Roztwory do przygotowania skrawków mózgu oraz pożywki dla kultur neuronalnych iPSC. (A) Roztwór do cięcia z wysoką zawartością sacharozy do przygotowania skrawków mózgu ex-vivo. (B) Roztwór aCSF do rejestracji, stosowany do przygotowania skrawków mózgu ex-vivo oraz rejestracji. (C-D) Protokół pożywek dla ludzkich neuronów iPSC, gdzie (C) to kompletna pożywka BrainPhys stosowana do rozmrażania komórek, powlekania chipów HD-MEA oraz utrzymania kultur na HD-MEA, a (D) to pożywka do nakładania kropel stosowana podczas wysiewania komórek na HD-MEA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Rozwiązywanie typowych problemów z akwizycją zapisów HD-MEA. Lista powszechnych problemów, ich potencjalnych przyczyn oraz rozwiązań związanych z chipami HD-MEA, platformą rejestracyjną, szumem systemowym i oprogramowaniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from ...

Nasze badania badają granice technologii neuronowej poprzez integrację układu mikroelektrod opartych na CMOS o dużej gęstości do dekodowania komunikacji neuronowej w dużych sieciach. Naszym celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób informacje neuronowe w różnych skalach są kodowane w unikalnych szczegółach, co zwiększa naszą wiedzę na temat funkcji/dysfunkcji mózgu w zdrowiu i chorobie. Poruszając się po złożonym terenie badań nad zespołami neuronalnymi, stawiamy czoła wyzwaniom, takim jak osiągnięcie precyzyjnej rozdzielczości sygnału w trakcie aktywności mózgu i zapewnienie biokompatybilności naszych obszarów mikroelektrod CMOS.Przeszkody te mają kluczowe znaczenie dla dokładnego uchwycenia i interpretacji bogatego gobelinu interakcji neuronalnych za pomocą nagrań multimodalnych. Nasze badania dotyczą krytycznej luki w neurobiologii, jaką jest brak kompleksowej metody rejestrowania i analizowania dynamiki zespołu neuronalnego na większą skalę z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Ta luka utrudnia nam zrozumienie złożonych sieci mózgowych i ich funkcji w zdrowiu i chorobie.Nasz protokół umożliwia multimodalne, bezznacznikowe nagrania w wysokiej rozdzielczości w hipokampie, opuszkach węchowych i ludzkich neuronach pochodzących z iPSC, zapewniając wszechstronne narzędzie do różnorodnych eksperymentów. To unikalne podejście ułatwia niezrównany wgląd w dynamikę neuronów, wypełniając lukę badawczą między różnymi regionami mózgu i systemami modelowymi, znacznie pogłębiając naszą wiedzę na temat funkcji i zaburzeń neuronalnych. Przyszłe przedsięwzięcia w naszym laboratorium będą dogłębnie badać obliczenia neuronowe i dynamikę od genów po sieci, mając na celu połączenie sygnatur molekularnych i funkcjonalnych w zdrowiu i chorobie za pomocą zaawansowanej biotroniki i neurotechnologii.Skupimy się na neuroplastyczności, kodowaniu węchowym, rozwijaniu sztucznej inteligencji i strategiach poprawiających pamięć dla nowatorskich terapii i interfejsów mózg-maszyna. Aby rozpocząć, skonfiguruj obszar roboczy odzyskiwania i konserwacji wycinka mózgu. Przygotuj przestrzeń roboczą do przygotowywania wycinków mózgu i skonfiguruj wibratom.Następnie skonfiguruj obszar roboczy ekstrakcji i przygotowania mózgu. Następnie przenieś wyekstrahowany mózg myszy do 90-milimetrowego plastikowego naczynia hodowlanego ze schłodzonym karbogenicznym roztworem tnącym w obszarze roboczym do przygotowywania mózgu. Ustaw mózg do pozycjonowania w formie agarozy.Nałóż super klej na rostralny koniec formy agarozowej. Użyj szpatułki, aby umieścić mózg w formie grzbietem do dołu w celu poziomego krojenia. Pokrój tkanki hipokampa i opuszki węchowej.Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbieraj plastry po każdej rundzie. Inkubować plastry w sztucznej komorze regeneracyjnej wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym w łaźni wodnej o temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 45 minut, a następnie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć, weź chip HD-MEA.Przetrzyj chip szklanym pierścieniem chusteczką zwilżoną 96% etanolem. Umieść każde urządzenie na sterylnej szalce Petriego pod maską i napełnij zbiornik MEA 70% etanolem. Po zassaniu etanolu należy trzykrotnie umyć zbiornik sterylną, przefiltrowaną, podwójnie destylowaną wodą.Dodaj jeden mililitr pożywki do kondycjonowania wstępnego i inkubuj przez noc. Następnego dnia wyjmij z urządzeń nośnik do przygotowania wstępnego. Pokryj obszar aktywny każdego urządzenia jednym mililitrem PDLO.Następnego dnia odessaj PDLO z urządzeń. Umyj urządzenia trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną i pozostaw do wyschnięcia pod maską. Napełnij szalkę Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów sterylną, przefiltrowaną, podwójnie destylowaną wodą i umieść ją obok frytki.Używając wstępnie podgrzanego podłoża, odpipetuj zawiesinę komórek na powierzchnię aktywnego obszaru chipa. Inkubuj chipsy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku z 5% dwutlenkiem węgla. Po 45 minutach delikatnie dodaj dwa mililitry pożywki podgrzanej do temperatury pokojowej do zbiornika HD-MEA.Inkubuj frytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Na początek umieść wszystkie niezbędne narzędzia w wyznaczonych miejscach pracy. Pokryj chip HD-MEA PDLO, aby poprawić sprzężenie tkanka-chip.Umieść chip na platformie rejestrującej akwizycję. Napełnij jego zbiornik sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i umieść kotwicę w zbiorniku na wióry, aby uzyskać równowagę. Wyjmij przygotowany wycinek mózgu myszy z komory regeneracyjnej i umieść go w 90-milimetrowym naczyniu hodowlanym z ciągłą karbonizacją.Po wyizolowaniu hipokampa lub opuszki węchowej przenieś plasterek do zbiornika HD-MEA za pomocą szklanej pipety. Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie wyrównaj plasterek na aktywnym obszarze MEA. Odessać wszystkie roztwory z chipa dobrze.Za pomocą kleszczy delikatnie umieść kotwicę na plasterku. Po delikatnym dodaniu roztworu do zbiornika na wióry, zainicjować system perfuzyjny. Następnie uruchom oprogramowanie BrainWave.Wybierz Plik i kliknij Nowa sesja nagrywania. Ustaw parametry nagrywania na częstotliwość nagrywania jednego herca i częstotliwość próbkowania 14 kiloherców na elektrodę. Naciśnij przycisk Nagraj, aby rozpocząć akwizycję z ustawionymi warunkami eksperymentalnymi.Na koniec, po ostatnim nagraniu, uchwyć obrazowanie świetlne ostrego wycinka mózgu. Następnie przenieś plasterek z powrotem do komory regeneracji. Usuń wszelki materiał organiczny przyczepiony do wióra za pomocą pędzla i przejdź do następnego plasterka.Aby rozpocząć, weź chip HD-MEA zawierający iPSC. Pod maską ostrożnie umieść nasadkę opartą na PDM w odniesieniu do pierścienia HD-MEA. Następnie umieść chip HD-MEA na platformie akwizycyjnej.Uruchom oprogramowanie BrainWave, wybierz Plik i kliknij Nowa sesja nagrywania. Ustaw parametry nagrywania na częstotliwość nagrywania 50 Hz i częstotliwość próbkowania 18 kiloherców na elektrodę. Rejestrować spontaniczną aktywność wypalania lub reakcje farmakologicznie indukowane z sieci iPSC w każdym określonym dniu planu eksperymentalnego.Inkubuj HD-MEA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w trakcie trwania eksperymentu. Na początek zarejestruj czasoprzestrzenną aktywność neuronalną z ostrych wycinków mózgu myszy ex-vivo i ludzkich sieci neuronalnych pochodzących z iPSC in vitro. Otwórz nagrany plik z danymi surowymi w oprogramowaniu BrainWave, wybierz opcję Analysis (Analiza) i kliknij LFP Detection (Wykrywanie LFP) lub Spike Detection (Wykrywanie spajków).W przypadku nagrań obwodów opuszki hipokampowej i węchowej należy zintegrować opcję zaawansowanej przestrzeni roboczej do importowania obrazu światła strukturalnego z mikroskopu stereoskopowego do pliku wykrytego zdarzenia. Utwórz warstwy strukturalne do badania obwodów kory hipokampa na dużą skalę. Użyj niestandardowego skryptu Pythona, aby odczytać plik BXR.Wyodrębnij ciągi kolców z nagrań sieciowych iPSC i pociągi zdarzeń LFP z nagrań obwodu hipokampa i opuszki węchowej wycinka mózgu. Zapisz wynikowe dane trenowania zdarzeń z informacjami czasowo-przestrzennymi w formacie pliku NPY. Oblicz kowariancję krzyżową między parami aktywnych elektrod w tablicy 64 na 64, korzystając z danych szeregów czasowych z pliku BRW.Przekształć każdą macierz połączeń w dynamiczny plik wykresu. W przypadku map łączności sieciowej zastosuj układ geograficzny do tworzenia map przestrzennych i ustaw ograniczenia parametrów dotyczące zakresu stopni i wagi krawędzi dla porównania. Przypisz kolor węzła, rozmiar krawędzi i rozmiar stopnia, aby uzyskać lepszą wizualizację.Topograficzne mapowanie przestrzenne średnich wielkoskalowych wzorców LFP lub kolców jest nakładane na odpowiednie obrazy optyczne zarejestrowane pod mikroskopem. Wykresy rastergramowe wyświetlają synchronicznie wykryte zdarzenia LFP lub skokowe w określonym przedziale czasowym. Reprezentatywne ślady zdarzeń z elektrod rejestrujących HD-MEA wykazały zakres zarejestrowanych częstotliwości oscylacyjnych w obwodach hipokampa, kory mózgowej i opuszki węchowej oraz wielojednostkową aktywność impulsów kolców w ludzkiej sieci iPSC.Mapy konektomu obwodu hipokampa, kory mózgowej i opuszki węchowej ujawniły różne węzły reprezentujące różne warstwy, przy czym rozmiar wskazywał stopień siły, a kolor oznaczał warstwę. W ludzkich sieciach iPSC identyfikacja połączeń została udoskonalona za pomocą przestrzennych filtrów czasowych i progów opóźnień, gdzie kolor węzłowy wskazywał, czy sygnał wejściowy był pobudzający czy hamujący.

recording-analyzing-multimodal-large-scale-neuronal-ensemble-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niezawodna metoda badania lawin neuronalnych, czyli niezależnych od skali czasowo-przestrzennych wybuchów aktywności, które świadczą o dynamice stanu krytycznego w korze mózgu. Lawiny pojawiają się spontanicznie w rozwijających się warstwach powierzchownych hodowli kory, co umożliwia długoterminowe pomiary aktywności przy użyciu planarnych zintegrowanych matryc wieloelektrodowych (MEA) w ściśle kontrolowanych warunkach.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Opisujemy metody wielkoskalowej rejestracji wielu pojedynczych jednostek oraz lokalnych potencjałów polowych u gryzoni podczas zachowań, z wykorzystaniem sond krzemowych. Procesy wykonania napędu, mocowania sondy do napędu oraz implantacji sondy zostały przedstawione w wystarczających szczegółach, aby umożliwić łatwą replikację.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Odkryj metodę rejestracji multimodalnej aktywności neuronalnej za pomocą HD-MEA zintegrowanej z CMOS. Technika umożliwia analizę dynamiki dużych sieci neuronowych w hipokampie, opuszce węchowej oraz ludzkich neuronach iPSC.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości (Wideo) | JoVE Journal

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Przeglądaj więcej filmów