Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Nasze badania badają granice technologii neuronowej poprzez integrację układu mikroelektrod opartych na CMOS o dużej gęstości do dekodowania komunikacji neuronowej w dużych sieciach. Naszym celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób informacje neuronowe w różnych skalach są kodowane w unikalnych szczegółach, co zwiększa naszą wiedzę na temat funkcji/dysfunkcji mózgu w zdrowiu i chorobie. Poruszając się po złożonym terenie badań nad zespołami neuronalnymi, stawiamy czoła wyzwaniom, takim jak osiągnięcie precyzyjnej rozdzielczości sygnału w trakcie aktywności mózgu i zapewnienie biokompatybilności naszych obszarów mikroelektrod CMOS.

Przeszkody te mają kluczowe znaczenie dla dokładnego uchwycenia i interpretacji bogatego gobelinu interakcji neuronalnych za pomocą nagrań multimodalnych. Nasze badania dotyczą krytycznej luki w neurobiologii, jaką jest brak kompleksowej metody rejestrowania i analizowania dynamiki zespołu neuronalnego na większą skalę z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Ta luka utrudnia nam zrozumienie złożonych sieci mózgowych i ich funkcji w zdrowiu i chorobie.

Nasz protokół umożliwia multimodalne, bezznacznikowe nagrania w wysokiej rozdzielczości w hipokampie, opuszkach węchowych i ludzkich neuronach pochodzących z iPSC, zapewniając wszechstronne narzędzie do różnorodnych eksperymentów. To unikalne podejście ułatwia niezrównany wgląd w dynamikę neuronów, wypełniając lukę badawczą między różnymi regionami mózgu i systemami modelowymi, znacznie pogłębiając naszą wiedzę na temat funkcji i zaburzeń neuronalnych. Przyszłe przedsięwzięcia w naszym laboratorium będą dogłębnie badać obliczenia neuronowe i dynamikę od genów po sieci, mając na celu połączenie sygnatur molekularnych i funkcjonalnych w zdrowiu i chorobie za pomocą zaawansowanej biotroniki i neurotechnologii.

Skupimy się na neuroplastyczności, kodowaniu węchowym, rozwijaniu sztucznej inteligencji i strategiach poprawiających pamięć dla nowatorskich terapii i interfejsów mózg-maszyna. Aby rozpocząć, skonfiguruj obszar roboczy odzyskiwania i konserwacji wycinka mózgu. Przygotuj przestrzeń roboczą do przygotowywania wycinków mózgu i skonfiguruj wibratom.

Następnie skonfiguruj obszar roboczy ekstrakcji i przygotowania mózgu. Następnie przenieś wyekstrahowany mózg myszy do 90-milimetrowego plastikowego naczynia hodowlanego ze schłodzonym karbogenicznym roztworem tnącym w obszarze roboczym do przygotowywania mózgu. Ustaw mózg do pozycjonowania w formie agarozy.

Nałóż super klej na rostralny koniec formy agarozowej. Użyj szpatułki, aby umieścić mózg w formie grzbietem do dołu w celu poziomego krojenia. Pokrój tkanki hipokampa i opuszki węchowej.

Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbieraj plastry po każdej rundzie. Inkubować plastry w sztucznej komorze regeneracyjnej wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym w łaźni wodnej o temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 45 minut, a następnie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć, weź chip HD-MEA.

Przetrzyj chip szklanym pierścieniem chusteczką zwilżoną 96% etanolem. Umieść każde urządzenie na sterylnej szalce Petriego pod maską i napełnij zbiornik MEA 70% etanolem. Po zassaniu etanolu należy trzykrotnie umyć zbiornik sterylną, przefiltrowaną, podwójnie destylowaną wodą.

Dodaj jeden mililitr pożywki do kondycjonowania wstępnego i inkubuj przez noc. Następnego dnia wyjmij z urządzeń nośnik do przygotowania wstępnego. Pokryj obszar aktywny każdego urządzenia jednym mililitrem PDLO.

Następnego dnia odessaj PDLO z urządzeń. Umyj urządzenia trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną i pozostaw do wyschnięcia pod maską. Napełnij szalkę Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów sterylną, przefiltrowaną, podwójnie destylowaną wodą i umieść ją obok frytki.

Używając wstępnie podgrzanego podłoża, odpipetuj zawiesinę komórek na powierzchnię aktywnego obszaru chipa. Inkubuj chipsy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku z 5% dwutlenkiem węgla. Po 45 minutach delikatnie dodaj dwa mililitry pożywki podgrzanej do temperatury pokojowej do zbiornika HD-MEA.

Inkubuj frytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Na początek umieść wszystkie niezbędne narzędzia w wyznaczonych miejscach pracy. Pokryj chip HD-MEA PDLO, aby poprawić sprzężenie tkanka-chip

Umieść chip na platformie rejestrującej akwizycję. Napełnij jego zbiornik sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym i umieść kotwicę w zbiorniku na wióry, aby uzyskać równowagę. Wyjmij przygotowany wycinek mózgu myszy z komory regeneracyjnej i umieść go w 90-milimetrowym naczyniu hodowlanym z ciągłą karbonizacją.

Po wyizolowaniu hipokampa lub opuszki węchowej przenieś plasterek do zbiornika HD-MEA za pomocą szklanej pipety. Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie wyrównaj plasterek na aktywnym obszarze MEA. Odessać wszystkie roztwory z chipa dobrze.

Za pomocą kleszczy delikatnie umieść kotwicę na plasterku. Po delikatnym dodaniu roztworu do zbiornika na wióry, zainicjować system perfuzyjny. Następnie uruchom oprogramowanie BrainWave.

Wybierz Plik i kliknij Nowa sesja nagrywania. Ustaw parametry nagrywania na częstotliwość nagrywania jednego herca i częstotliwość próbkowania 14 kiloherców na elektrodę. Naciśnij przycisk Nagraj, aby rozpocząć akwizycję z ustawionymi warunkami eksperymentalnymi.

Na koniec, po ostatnim nagraniu, uchwyć obrazowanie świetlne ostrego wycinka mózgu. Następnie przenieś plasterek z powrotem do komory regeneracji. Usuń wszelki materiał organiczny przyczepiony do wióra za pomocą pędzla i przejdź do następnego plasterka.

Aby rozpocząć, weź chip HD-MEA zawierający iPSC. Pod maską ostrożnie umieść nasadkę opartą na PDM w odniesieniu do pierścienia HD-MEA. Następnie umieść chip HD-MEA na platformie akwizycyjnej.

Uruchom oprogramowanie BrainWave, wybierz Plik i kliknij Nowa sesja nagrywania. Ustaw parametry nagrywania na częstotliwość nagrywania 50 Hz i częstotliwość próbkowania 18 kiloherców na elektrodę. Rejestrować spontaniczną aktywność wypalania lub reakcje farmakologicznie indukowane z sieci iPSC w każdym określonym dniu planu eksperymentalnego.

Inkubuj HD-MEA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w trakcie trwania eksperymentu. Na początek zarejestruj czasoprzestrzenną aktywność neuronalną z ostrych wycinków mózgu myszy ex-vivo i ludzkich sieci neuronalnych pochodzących z iPSC in vitro. Otwórz nagrany plik z danymi surowymi w oprogramowaniu BrainWave, wybierz opcję Analysis (Analiza) i kliknij LFP Detection (Wykrywanie LFP) lub Spike Detection (Wykrywanie spajków).

W przypadku nagrań obwodów opuszki hipokampowej i węchowej należy zintegrować opcję zaawansowanej przestrzeni roboczej do importowania obrazu światła strukturalnego z mikroskopu stereoskopowego do pliku wykrytego zdarzenia. Utwórz warstwy strukturalne do badania obwodów kory hipokampa na dużą skalę. Użyj niestandardowego skryptu Pythona, aby odczytać plik BXR.

Wyodrębnij ciągi kolców z nagrań sieciowych iPSC i pociągi zdarzeń LFP z nagrań obwodu hipokampa i opuszki węchowej wycinka mózgu. Zapisz wynikowe dane trenowania zdarzeń z informacjami czasowo-przestrzennymi w formacie pliku NPY. Oblicz kowariancję krzyżową między parami aktywnych elektrod w tablicy 64 na 64, korzystając z danych szeregów czasowych z pliku BRW.

Przekształć każdą macierz połączeń w dynamiczny plik wykresu. W przypadku map łączności sieciowej zastosuj układ geograficzny do tworzenia map przestrzennych i ustaw ograniczenia parametrów dotyczące zakresu stopni i wagi krawędzi dla porównania. Przypisz kolor węzła, rozmiar krawędzi i rozmiar stopnia, aby uzyskać lepszą wizualizację.

Topograficzne mapowanie przestrzenne średnich wielkoskalowych wzorców LFP lub kolców jest nakładane na odpowiednie obrazy optyczne zarejestrowane pod mikroskopem. Wykresy rastergramowe wyświetlają synchronicznie wykryte zdarzenia LFP lub skokowe w określonym przedziale czasowym. Reprezentatywne ślady zdarzeń z elektrod rejestrujących HD-MEA wykazały zakres zarejestrowanych częstotliwości oscylacyjnych w obwodach hipokampa, kory mózgowej i opuszki węchowej oraz wielojednostkową aktywność impulsów kolców w ludzkiej sieci iPSC.

Mapy konektomu obwodu hipokampa, kory mózgowej i opuszki węchowej ujawniły różne węzły reprezentujące różne warstwy, przy czym rozmiar wskazywał stopień siły, a kolor oznaczał warstwę. W ludzkich sieciach iPSC identyfikacja połączeń została udoskonalona za pomocą przestrzennych filtrów czasowych i progów opóźnień, gdzie kolor węzłowy wskazywał, czy sygnał wejściowy był pobudzający czy hamujący.