Name: Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę tworzenia myszego modelu przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych. Technika symuluje objawy ostrej i przewlekłej postaci choroby oraz pozwala ocenić skuteczność terapii przeciwciałem anti-Ly6G.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81974056) dla R.Z. oraz z National Nature Youth Foundation of China (82101808) oraz Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr 202102020196) dla Z.L.

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), gdzie przeprowadzono wszystkie eksperymenty na zwierzętach.
1. Ustanowienie modelu myszy z przewlekłym zwłóknieniem BA
UWAGA: Wszystkie zwierzęta były trzymane w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF) w tym samym pomieszczeniu, a eksperymenty były prowadzone w konwencjonalnym środowisku. Myszy BALB/c w 12,5 dniu ciąży (wiek: 10-12 tygodni; waga 35-40 g) były trzymane w pomieszczeniu bez specyficznych patogenów w temperaturze 25°C w 12-godzinnym cyklu ciemności/światła i miały zapewniony swobodny dostęp do autoklawowanego pokarmu i wody. Nowonarodzone myszy, w ciągu 24 godzin po urodzeniu (średnia masa ciała: 1,5-1,6 g), zostały wybrane do mysiego modelu BA.
<ol>
	<li>Przygotuj RRV zgodnie z wcześniejszymi raportami16. 
	UWAGA: Ze względu na słaby status przeżywalności myszy modelowych, należy je rozdzielić w wieku 21 dni, aby uniknąć ugryzienia lub nawet zabicia przez inne myszy w tej samej klatce.</li>
	<li>Podziel nowonarodzone myszy na trzy grupy: grupę kontrolną, grupę RRV i grupę RRV + anty-Ly6G. Nowonarodzonym myszom wstrzyknąć dootrzewnowo 20 μl RRV (miano: 1,5 x 106 PFU/ml) (grupa RRV) lub soli fizjologicznej (grupa kontrolna) w ciągu 24 godzin po urodzeniu. Aby zubożyć komórki Gr-1+, należy wstępnie potraktować każdą mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 5 μg przeciwciała anty-Ly6G na 4 godziny przed wstrzyknięciem RRV. 
	UWAGA: Roztwór przeciwciała anty-Ly6G jest przechowywany w temperaturze 2-8 °C i nie należy go zamrażać. Wyjmij przeciwciało przed użyciem i umieść je w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby się rozgrzało.</li>
	<li>Wstrzyknij 10 μg przeciwciała anty-Ly6G do brzucha myszy co 3 dni do 12 dnia po wstrzyknięciu RRV (<silna klasa = "xfig">Figura 1A).</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj i rejestruj wygląd, wagę i przeżywalność wszystkich myszy.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie dootrzewnowe myszom
<ol>
	<li>Wyjmij nowonarodzone myszy z klatki. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml wstrzyknąć 20 μl roztworu RRV lub 50 μl roztworu przeciwciała anty-Ly6G. Ściśnij skórę szyi młodej myszy palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki i delikatnie przytrzymaj tylne nogi myszy palcem serdecznym i palcem ogonowym, aby odsłonić brzuch.</li>
	<li>Podnieś igłę pod kątem do góry. Wbić igłę w środkowe udo prawej tylnej nogi myszy pod kątem 15° ze skórą. Po poruszaniu się po ścieżce podskórnej, aż igła dotrze do prawej krawędzi żebrowej myszy, skieruj igłę w dół do jamy brzusznej. Następnie wstrzyknąć płyn pod wątrobę myszy. 
	UWAGA: Nowonarodzone myszy mają żołądek i śledzionę w lewym brzuchu. Jeśli igła zostanie wprowadzona po lewej stronie, łatwo jest przebić żołądek lub spowodować krwotok śledziony.</li>
	<li>Natychmiast po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę i obserwować, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma krwawienia lub wycieku. Jeśli tak, przetrzyj go autoklawizowaną bawełną. Umieść mysz z powrotem w klatce matki. 
	UWAGA: W celu zmniejszenia wpływu wycieku płynu podczas wstrzyknięcia na wyniki eksperymentu, należy upewnić się, że działanie iniekcji jest delikatne, powoli wyjmij igłę i uciskaj miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem przez 30 sekund.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbki tkanki
<ol>
	<li>W 12 dniu znieczulij myszy 4% inhalacją izofluranu i poddaj je sekcji pod mikroskopem. Włożyć strzykawkę z insuliną o pojemności 1 ml do lewej komory serca w celu pobrania krwi. Po pobraniu krwi należy poddać myszy eutanazji przez inhalację 4% izofluranu przez 10 minut. Odwirować krew o stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i oddzielić surowicę do pomiarów czynności wątroby. 
	UWAGA: Pobieranie krwi należy przeprowadzić, gdy myszy żyją. Jeśli myszy umrą, krew zostanie zatrzymana w naczyniach krwionośnych i nie będzie można jej zebrać.</li>
	<li>Sfotografuj ogólny wygląd wątroby i dróg żółciowych. Następnie wypreparuj wątrobę i śledzionę myszy z otaczających tkanek za pomocą nożyczek i pęsety. 
	UWAGA: Wątroba i inne tkanki są pobierane i rezerwowane w temperaturze -80°C w celu ekstrakcji RNA i białek lub moczone w 10% formalinie w celu przygotowania próbek histologicznych.</li>
</ol>
4. Angiografia fluoresceinowa przewodu żółciowego pozawątrobowego
<ol>
	<li>Po eutanazji myszy całkowicie odsłoń wątrobę, woreczek żółciowy i pozawątrobowe drogi żółciowe nożyczkami i wacikami.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem postawy, wstrzyknij 5-10 μl barwnika fluorescencyjnego rodaminy 123 (20 mg/ml) do pęcherzyka żółciowego za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i zrób zdjęcia. Ten proces jest taki sam, jak ten zgłoszony w before16. 
	UWAGA: Różne myszy z tej samej grupy są używane do pobierania próbek tkanek i angiografii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
5. Barwienie H&E
<ol>
	<li>Zanurz świeżą tkankę wątroby myszy w 10% formalinie na 24 godziny.</li>
	<li>Po zatopieniu tkanki w parafinie za pomocą mikrotomu parafinowego pokrój blok parafiny na odcinki o grubości 4 μm i umieść dwa kolejne odcinki na tym samym szkiełku. Doświadczony personel jest zobowiązany do standaryzacji operacji, aby uniknąć skaleczeń palców17.</li>
	<li>Plastry ułożyć w kratce do krojenia, odparafisować w ksylenie, uwodnić kolejno w absolutnym etanolu, 95% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej i moczyć w każdym przez 5 minut.</li>
	<li>Skrawki barwić roztworem hematoksyliny przez 5 minut i moczyć je w 1% kwasie solnym i 75% alkoholu przez 5 s. Skrawki spłukać czystą wodą i zabarwić roztworem eozyny przez 1 minutę.</li>
</ol>
6. Barwienie immunohistochemiczne CK19 i F4/80
<ol>
	<li>Pierwsze trzy kroki są takie same, jak etapy osadzania, cięcia i odparafinowania tkanek w sekcji barwienia H&E.</li>
	<li>Wykonać naprawę antygenu za pomocą buforu Tris-EDTA (10 mmol/L zasady Tris, 1 mmol/L roztwór EDTA, pH 9,0), podgrzać sekcje w kuchence mikrofalowej w temperaturze 95°C przez 10 min, a następnie wyjąć i schłodzić w naturalny sposób do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umieść skrawki tkanki w 3% roztworze nadtlenku wodoru na 10 minut, aby usunąć endogenną peroksydazę.</li>
	<li>Potraktuj plastry 5% kozią surowicą, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.</li>
	<li>Dodać pierwszorzędowe szczurze przeciwciało monoklonalne anty-mysie cytokeratyna 19 lub szczurze przeciwciało monoklonalne F4/80 przeciwko myszom i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) jako środka chromogennego do obserwacji reakcji chromogennej pod mikroskopem.</li>
	<li>Obserwuj plastry pod mikroskopem 40x, aby uzyskać zdjęcia i analizuj je w razie potrzeby.</li>
</ol>
7. Czerwone zabarwienie Syriusza
<ol>
	<li>Wykonaj pierwsze trzy etapy osadzania, cięcia i odparafinowania tkanek zgodnie z opisem w sekcji Barwienie H&E.</li>
	<li>Po barwieniu skrawków tkanek hematoksyliną, przykryj każdą tkankę 50 μl roztworu barwnika Sirius Red w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Suszyć szkiełka w sposób naturalny w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, dodać kroplę neutralnej gumy do każdego szkiełka i użyć szkiełka nakrywkowego, aby powoli przykryć chusteczkę, aby uniknąć pęcherzyków. Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zestalić neutralną gumę.</li>
	<li>Użyj mikroskopii światła spolaryzowanego z kontrastem, aby obserwować szczegóły osadzania się kolagenu; wybierz wyraźne i odpowiednie pole view, a następnie dostosuj jasność i balans bieli pola widzenia mikroskopu. Uzyskuj obrazy i analizuj je w razie potrzeby pod 40-krotnym mikroskopem.</li>
</ol>

<ol><li>Lakshminarayanan, B., Davenport, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia: A comprehensive review.</a> Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).</li>
<li>Bassett, M. D., Murray, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%3A+Recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia: Recent progress.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 42 (6), 720-729 (2008).</li>
<li>Bezerra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%3A+Clinical+and+research+challenges+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century.</a> Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).</li>
<li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia.</a> Lancet. 374 (9702), 1704-1713 (2009).</li>
<li>Lee, W. S., Looi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+a+scoring+system+in+the+interpretation+of+histology+in+neonatal+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis.</a> World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).</li>
<li>Russo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+histopathologic+features+of+liver+biopsies+that+distinguish+biliary+atresia+from+other+causes+of+infantile+cholestasis+and+their+correlation+with+outcome%3A+A+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).</li>
<li>Fickert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+animal+models+for+primary+sclerosing+cholangitis+%28PSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC).</a> Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia-specific+deciduous+pulp+stem+cells+feature+biliary+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582(2021).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+H19+contributes+to+cholangiocyte+proliferation+and+cholestatic+liver+fibrosis+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia.</a> Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).</li>
<li>Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+%28ANIT%29+induced+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li>
<li>Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signatures+associated+with+survival+times+of+pediatric+patients+with+biliary+atresia+identify+potential+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents.</a> Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).</li>
<li>Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+biliary+injury+and+altered+bile+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).</li>
<li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1%28%2B%29+cell+subpopulations+during+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).</li>
<li>McDermott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Gr-1%28%2B%29+cells+and+tumour+necrosis+factor-%CE%B1+signalling+during+Clostridium+difficile+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice.</a> Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neonatal+Gr-1%28%2B%29+myeloid+cells+in+a+murine+model+of+rhesus-rotavirus-induced+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia.</a> The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silver+nanoparticle+method+for+ameliorating+biliary+atresia+syndrome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58158(2018).</li>
<li>Sy, J., Ang, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtomy%3A+Cutting+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD177%28%2B%29+cells+produce+neutrophil+extracellular+traps+that+promote+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia.</a> Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).</li>
<li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+reduces+kidney+fibrosis+by+inhibiting+local+proliferation+of+profibrotic+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages.</a> Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+murine+model+of+systemic+sclerosis%3A+Bleomycin+given+by+pump+infusion+induced+skin+and+pulmonary+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis.</a> Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+sorafenib+on+liver+versus+tumor+fibrosis+mediated+by+stromal-derived+factor+1+alpha%2FC-X-C+receptor+type+4+axis+and+myeloid+differentiation+antigen-positive+myeloid+cell+infiltration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice.</a> Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).</li>
<li>Tomasson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+myeloproliferation%2C+induced+in+mice+by+TEL%2FPDGFbetaR+expression%2C+depends+on+PDGFbetaR+tyrosines+579%2F581%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).</li>
<li>Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+CD177%28%2B%29+cells+as+an+early+diagnostic+marker+for+biliary+atresia%3A+A+prospective+multicentre+study+in+pediatric+patients+with+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis.</a> Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W naszym badaniu użyliśmy przeciwciała anty-Ly6G w celu wyeliminowania lub zmniejszenia komórek Gr-1 + w mysim modelu atrezji dróg żółciowych zakażonych RRV w celu poprawy ostrego zespołu BA, przedłużenia wskaźnika przeżycia i umożliwienia myszom BA wejścia w fazę przewlekłą. Zmniejszenie dawki przeciwciał może prowadzić do przewlekłego BA ze zwłóknieniem wątroby, co wskazuje, że liczba komórek Gr-1+ zmienia wynik BA w fazie ostrej i przewlekłej. W naszym poprzednim badaniu komórki Gr-1 + zostały zmniejszone po podaniu przeciwciała anty-Ly6G, a ogólny stan przeżycia myszy BA uległ poprawie15. Jednocześnie doniesiono, że makrofagi Gr-1 + 19, neutrofile Gr-1 + 20, komórki mieloidalne Gr-1 + 21 i granulocyty Gr-1 + mogą nasilać zwłóknienie w niektórych modelach zwierzęcych22. Jednak w tym badaniu komórki Gr-1 + u myszy zostały częściowo zubożone niskimi dawkami przeciwciała anty-Ly6G, a złogi kolagenu pozostały. W rezultacie może być potrzebne więcej czasu, aby dokładniej zająć się chorobą.
Zastosowanie przeciwciała anty-Ly6G zmniejszyło stan zapalny, częściowo zachowało drogi żółciowe i zapobiegło ostrej śmierci wywołanej BA u myszy. Jednak tylko 20% do 30% myszy weszło w przewlekłą fazę BA; może to być związane z punktem czasowym i liczbą wstrzyknięć przeciwciała anty-Ly6G. Musimy dalej badać ten kluczowy punkt, aby poprawić wskaźnik sukcesu. Ponadto uważamy, że nie tylko komórki Gr-1 + , ale także inne komórki odpornościowe mogą odgrywać ważną rolę, takie jak komórki NK, limfocyty T, limfocyty B i makrofagi.
Jeśli chodzi o protokół, należy zwrócić uwagę na kilka szczegółów. (i) W celu uniknięcia wycieku wstrzykiwanych leków używamy strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą o średnicy 0,33 mm, ponieważ średnica igły jest mała, a otwór igły w strzykawce jest mały, co sprzyja zmniejszeniu możliwości wycieku leku. (ii) Przed wstrzyknięciem należy unieruchomić mysz, aby zapobiec jej ruchomości, uniknąć wycieku leku, a tym samym dodatkowo zapewnić efekt eksperymentalny. (iii) Podczas wstrzykiwania leku wstrzyknęliśmy lek w powierzchnię lub dolny margines wątroby myszy tak daleko, jak to możliwe, tak aby lek dostał się do jamy brzusznej i w pełni zetknął się z wątrobą, aby zadziałał. (iv) Wstrzyknięcie jest zwykle wykonywane z prawego górnego odcinka uda myszy, ponieważ żołądek i śledziona nowonarodzonej myszy znajdują się w lewym brzuchu, a żołądek jest pełen mleka. Jeśli igła zostanie wprowadzona z lewej strony, może łatwo przebić żołądek, powodując napływ mleka do jamy brzusznej, lub przebić śledzionę, powodując krwawienie.
CD177 jest homologiem Ly6G, a ekspresja CD177 u pacjentów z BA została zbadana. CD177 może być stosowany jako marker do wczesnej diagnostyki BA u dzieci, co wskazuje, że komórki CD177+ odgrywają znaczącą rolę w przebiegu BA23. Analizując dane sekwencjonowania RNA, nasz zespół odkrył, że komórki CD177 były dominującą populacją komórek Gr-1 + ; tymczasem myszy Cd177−/− BALB/c zaszczepione RRV wykazały opóźniony początek BA oraz zmniejszoną zachorowalność i śmiertelność18. Tak więc nasz mysi model przewlekłego BA ma oczywiste zalety w badaniu patogenezy i progresji choroby BA; zapewnia również odpowiedni model zwierzęcy do badania potencjalnych metod leczenia BA.

Atrezja dróg żółciowych (BA) jest poważną chorobą wątroby i dróg żółciowych, która często występuje u niemowląt i małych dzieci; w szczególności objawia się jako zacierająca się cholangiopatia z żółtaczką noworodków i bladymi stolcami1. Jego kliniczne cechy to zapalne uszkodzenie wewnątrzwątrobowych i zewnątrzwątrobowych dróg żółciowych oraz postępujące zwłóknienie, które ostatecznie przekształca się w niewydolność wątroby2. Według statystyk częstość występowania BA w krajach azjatyckich jest wyższa niż w krajach europejskich i amerykańskich, a częstość występowania BA w krajach azjatyckich wynosi 1/8 000. Etiologia BA obejmuje infekcję wirusową, nieprawidłowy rozwój dróg żółciowych, zaburzenia immunologiczne i różnice genetyczne3. Operacja Kasai jest najczęściej stosowaną metodą poprawy cholestazy u dzieci z BA, ale ostatecznie nie może zapobiec postępowi zwłóknienia4. Obecne leczenie BA opiera się głównie na przeszczepie wątroby, który jest ograniczony przez brak źródeł wątroby. Dogłębne badanie patogenezy BA jest najbardziej bezpośrednim sposobem rozwiązania problemów związanych z tą chorobą. Jednak badania nad patogenezą BA opierają się głównie na modelach zwierzęcych BA, a wybór odpowiedniego modelu zwierzęcego jest kluczowy.
Większość badań histopatologicznych BA wykazała, że przerost dróg żółciowych (BDP), zakrzepica żółci i zwłóknienie żyły wrotnej są najważniejszymi cechami patologicznymi BA, a inne patologiczne cechy różnego stopnia występują jednocześnie, takie jak naciekanie komórek zapalnych wrotnych i obrzęk hepatocytów5,6. Obecnie istnieje wiele modeli mysich, które naśladują BA, takich jak przewlekły model myszy karmiony 3,5-die-toksykarbonylo-1,4-dihydrokolidyną (DDC) z segmentalną niedrożnością dróg żółciowych i zapaleniem okołojęzykowym obejmującym pozawątrobowe drogi żółciowe7 oraz mysi model zwłóknienia wątroby z dootrzewnowym wstrzyknięciem czterochlorku węgla8. Model podwiązania dróg żółciowych (BDL) charakteryzuje się żółtaczką i szybkim zwłóknieniem żyły wrotnej9. Model myszy karmiony alfa-naftylizotiocyjanianem (ANIT) charakteryzuje się zapaleniem dróg żółciowych ograniczonym do wewnątrzwątrobowego przewodu żółciowego i uszkodzeniem hepatocytów10. Model mysi z przedłużoną żółtaczką jest indukowany przez szczepienie opóźnionym wirusem rotawirusa rezusów (RRV)11. Chociaż istnieje wiele modeli zwierzęcych, zwłaszcza modeli myszy, każdy model ma swoje własne ograniczenia. Mogą symulować tylko część cech chorobowych BA, takich jak ostre zapalenie lub zwłóknienie wątroby w procesie atrezji dróg żółciowych, i nie ma modelu, który byłby wysoce zgodny z procesem chorobowym i patologicznymi cechami BA.
Klasyczny model myszy BA jest indukowany przez RRV, a ten model jest najbardziej podobny do modelu BA u ludzi. Jednakże, podczas gdy myszy z modelem BA indukowanym RRV wykazują podobne objawy kliniczne i cechy patologiczne do niektórych z pozawątrobowego atrezji dróg żółciowych, model ten nie ma zwłóknienia wątroby, co znacznie ogranicza dogłębne badanie mechanizmów BA i rozwój nowych metod leczenia12. W związku z tym w ramach tego badania opracowano nowy mysi model BA przewlekłego zwłóknienia wątroby. Przeciwciało anty-Ly6G wstrzyknięto dootrzewnowo przed inokulacją RRV w dniu urodzenia. Następnie czterokrotnie wstrzyknięto 5-10 μg przeciwciała anty-Ly6G, z zachowaniem 2-dniowych odstępów między każdym wstrzyknięciem. Objawy BA u myszy uległy poprawie, czas przeżycia został wydłużony, a myszy weszły w stadium przewlekłego zwłóknienia. Model ten nie tylko symuluje ostrą odpowiedź fazową BA, ale także naśladuje procesy zachodzące w wątrobie i postępującym zwłóknieniu. W związku z tym jest to bardziej odpowiedni model zwierzęcy do mechanistycznych badań nad BA, a także może stanowić teoretyczną podstawę do opracowania przyszłych metod leczenia BA.
Cząsteczka Gr-1 to marker powierzchni komórki pochodzenia mieloidalnego, który pierwotnie stwierdzono ekspresję w neutrofilach13. Wyczerpanie przeciwciał anty-Ly6G zmniejsza krążące neutrofile o ponad 90% i zmienia odpowiedź aktywowaną przez inne komórki odpornościowe. Funkcje populacji komórek Gr-1 + zostały opisane w różnych badaniach z użyciem specyficznych przeciwciał wymiatających, z różnymi zidentyfikowanymi efektami na cytokiny i ochronę immunologiczną za pośrednictwem 14. Badaliśmy funkcję komórek Gr-1 + w mysich modelach BA zaszczepionych RRV. Ponieważ jednak nie stwierdzono, aby cząsteczka Gr-1 ulegała ekspresji u ludzi, podobna cząsteczka, CD177, została przebadana u pacjentów z BA15. Nasze dane dowodzą znaczenia populacji komórek Gr-1+, szczególnie w przewlekłej fazie zwłóknienia choroby, i zapewniają odpowiedni model zwierzęcy do zbadania potencjalnych terapii BA.

<table><tbody><tr><td>Mysz Balb/c</td><td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td><td>20221000112</td><td></td></tr><tr><td>szczur anty-mysz Ly6G</td><td>Bio X Cell</td><td>klon 1A8</td><td>Zachodni Liban, NH</td></tr><tr><td>szczur anty-mysia cytokeratyna 19</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>klon TROMA III</td><td>Iowa City, IA</td></tr><tr><td>szczur anty-mysz F4/80</td><td>R& D Systems</td><td>MAB5580</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>Szczep RRV&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>MMU 18006</td><td>Manassas, Wirginia</td></tr><tr><td>Stereoskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia świetlna</td><td>Leica Leica Microsystems</td><td>Leica DMI8+DFC7000T</td><td>Wetzlar, Niemcy</td></tr><tr><td>System automatyzacji procesów przedanalitycznych Hitachi</td><td>Analizator kliniczny Hitachi</td><td>7600</td><td>Tokio, Japonia</td></tr><tr><td>Znieczulenie izofluranem</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83702</td><td></td></tr><tr><td>czerwony barwnik sirius</td><td>Leagene</td><td>DC0041</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom parafinowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>guma neutralna</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Atrezja dróg żółciowych (BA) jest śmiertelną chorobą polegającą na żółtaczce obturacyjnej i jest najczęstszym wskazaniem do przeszczepu wątroby u dzieci. Ze względu na złożoną etiologię i nieznaną patogenezę nadal nie ma skutecznych metod leczenia farmakologicznego. Obecnie klasyczny mysi model BA indukowany przez rotawirusa rezusa (RRV) jest najczęściej stosowanym modelem do badania patogenezy BA. Model ten charakteryzuje się opóźnieniem wzrostu, żółtaczką skóry i błony śluzowej, gliniastymi stolcami i ciemnożółtym moczem. Histopatologia wykazuje ciężkie zapalenie wątroby i niedrożność wewnątrzwątrobowych i zewnątrzwątrobowych dróg żółciowych, które są podobne do objawów BA u człowieka. Jednak wątroby myszy w końcowym stadium rozwoju w tym modelu nie mają zwłóknienia i nie mogą w pełni symulować charakterystyki zwłóknienia wątroby w klinicznym BA. W prezentowanym badaniu opracowano nowy mysi model BA przewlekłego zwłóknienia wątroby poprzez czterokrotne wstrzyknięcie 5-10 μg przeciwciała anty-Ly6G, z przerwami 2 dni po każdym wstrzyknięciu. Wyniki pokazały, że niektóre myszy z powodzeniem wytworzyły przewlekłe BA z typowym zwłóknieniem po upływie czasu, co oznacza, że myszy te stanowią odpowiedni model zwierzęcy do indukowanego wirusem mechanistycznego badania zwłóknienia wątroby BA i platformę do opracowania przyszłych metod leczenia BA.

Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 5 μg przeciwciała anty-Ly6G w ciągu 24 godzin od urodzenia, a następnie dootrzewnowo wstrzyknięto 20 μL RRV 4 godziny później. Następnie wstrzykiwano 10 μg przeciwciała anty-Ly6G co 3 dni do 12 dnia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Mediana czasu przeżycia w grupie RRV wynosiła 13 dni. Wręcz przeciwnie, u większości myszy leczonych przeciwciałem rozwinęła się łagodna żółtaczka i nie zaobserwowano utraty masy ciała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Około 20%-30% myszy miało zespół BA z długotrwałą żółtaczką i niską masą ciała, ale przeżyło dłużej niż 42 dni. Po leczeniu przeciwciałami anty-Ly6G liczba komórek Gr-1 + zmniejszyła się15, a myszy weszły w fazę przewlekłego zwłóknienia, określanego jako przewlekłe BA. Próbki pobrano w 12 i 42 dniu, a wycinki tkanek barwione czerwienią Syriusza wykazywały stopniowy wzrost zwłóknienia wątroby. Do szczegółowych analiz wykorzystano przewlekłe myszy BA, które przeżyły 42 dni. Oprócz niewielkich rozmiarów, uszy, stopy i skóra ogona wykazywały wyraźną żółtaczkę (niebieskie strzałki w <silna klasa="xfig">Ryc. 1E). W 6 dniu po wstrzyknięciu RRV kolor kału myszy stał się jaśniejszy, a kolor moczu stał się ciemniejszy; Stało się to znacząco odmienne od grupy kontrolnej w 12 dniu, kiedy myszy z grupy RRV wykazywały biały kał i ciemnożółty mocz. W 42 dniu mocz i kał myszy z przewlekłym BA również wykazywały oczywiste cechy żółtaczki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, E). Wątroby myszy BA usunięto i porównano z wątrobami kontrolnymi. Wątroby były mniejsze (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B), zmiany martwicze były widoczne gołym okiem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A, trójkąt), a odcinek atrezji dróg żółciowych obserwowano również pozawątrobowo (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A, białe gwiazdki).</silna></silna></silna></silna></silna></silna></silna>
Analiza przekroju tkanki wątroby wykazała, że niska dawka anty-Ly6G zmniejszyła stan zapalny żyły wrotnej. Jednak akumulację komórek zapalnych nadal obserwowano w wycinkach tkanki wątroby w 42 dniu (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A). Barwienie Sirius Red wykazało niewielki wzrost odkładania się kolagenu w obszarze wrotnym w 12 dniu po wstrzyknięciu RRV. Co więcej, nie zaobserwowano istotnych zmian w ekspresji kolagenu po leczeniu przeciwciałem anty-Ly6g, ale ekspresja kolagenu w próbkach tkanek BA w 42 dniu była znacznie zwiększona (<silna klasa="xfig">Figura 3B). Podczas badania pod mikroskopem światła spolaryzowanego zaobserwowano, że włókna kolagenowe nagromadziły się w sąsiedniej tkance wątroby. Znaczne odkładanie się kolagenu, głównie zielonego, zaobserwowano w próbkach tkanek BA w 42 dniu (<silna klasa="xfig">Ryc. 3C), a odkładanie kolagenu wzrosło jeszcze bardziej u myszy, które przeżyły 42 dni bez przyrostu masy ciała. Wraz ze zmniejszeniem stanu zapalnego wrotnego, w 12. dniu obserwowano komórki dróg żółciowych CK19+. Jednak w 42 dniu dojrzałe drogi żółciowe były ledwo wykrywalne, mimo że zaobserwowano wzrost komórek dróg żółciowych CK19 + (<silna klasa="xfig">Ryc. 4A, czerwone strzałki wskazują komórki nabłonka dróg żółciowych). W przypadku pozawątrobowych dróg żółciowych u myszy z przewlekłym BA, seryjna sekcja obszaru wrotnego myszy ujawniła, że pozawątrobowe drogi żółciowe były zablokowane i miały zapalne nacieki makrofagów (<silna klasa="xfig">Figura 4B, czarne strzałki wskazują makrofagi).</silna></silna></silna></silna></silna>
W porównaniu z samym RRV, leczenie niską dawką przeciwciała anty-Ly6G zmniejszyło uszkodzenie wątroby pod względem poziomu enzymów wątrobowych w dniu 12 po inokulacji RRV. Poziomy aminotransferazy alaninowej i fosfatazy alkalicznej w wątrobie były wyższe w grupie przewlekłego BA niż w normalnej grupie kontrolnej. Najbardziej wyraźne zmiany stwierdzono w poziomach bilirubiny, przy czym myszy RRV + anty-Ly6G wykazywały obniżone poziomy TBIL, DBIL i IBIL w ostrym BA w przeciwieństwie do samego RRV. U myszy z przewlekłym BA poziomy TBIL, DBIL i IBIL były zwiększone (<silna klasa="xfig">Ryc. 5), co wskazuje, że czynność wątroby była znacznie zmniejszona w stadium przewlekłego zwłóknienia BA.</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 1: Efekty leczenia przeciwciałami anty-Ly6G w mysim modelu atrezji dróg żółciowych zakażonych RRV. (A) Schematyczna ilustracja niskich dawek przeciwciał w celu wywołania ostrej i przewlekłej fazy BA u myszy ze strzałkami wskazującymi czas wstrzyknięcia przeciwciała i RRV. (B) Krzywe przeżycia myszy w grupie normalnej kontroli (Cont.), grupie rotawirusa rezusa (RRV) i grupie przeciwciał RRV + anty-Ly6G. (C) Krzywe masy ciała myszy w każdej grupie. (D) Reprezentatywne obrazy myszy oraz ich kału i moczu w każdej grupie w dniu 12. (E) Reprezentatywne obrazy myszy oraz ich kału i moczu w każdej grupie w 42 dniu. Niebieskie strzałki wskazują żółte uszy i ogon. Ten rysunek został przedrukowany za zgodą Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 2: Wpływ leczenia przeciwciałami anty-Ly6G na wątrobę w mysim modelu atrezji dróg żółciowych zakażonych RRV. (A) Porównanie anatomii wątroby i angiografii fluorescencyjnej pozawątrobowych dróg żółciowych między myszami z przewlekłym BA (po prawej) a normalnymi myszami w 42 dniu. (B) Porównanie wielkości wątroby między myszami z przewlekłym BA a normalnymi myszami. trójkąt wskazuje na martwicę wątroby u myszy z przewlekłym BA. Biała gwiazdka wskazuje na pozawątrobowe atrezję dróg żółciowych. Ten rysunek został przedrukowany za zgodą Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 3: Wycinki tkanki wątroby myszy w grupie normalnej kontroli (Cont.), grupie rotawirusa rezusa (RRV) i grupie przeciwciał RRV + anty-Ly6G w dniu 12 i 42. (A) Obrazy wycinków tkanki wątroby barwionych hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). (B) Barwienie Syriusza Czerwienią wykazało odkładanie się kolagenu (PSR). (C) Dalsza obserwacja wycinków za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego (Pol. Light). Skrót: PV = żyła wrotna. Podziałka = 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 4: Immunohistochemiczne barwienie wycinków tkanki wątroby z grupy normalnej kontrolnej (Cont.), grupy rotawirusa rezusa (RRV) i grupy przeciwciał RRV + anty-Ly6G w dniu 12 i 42. (A) Ekspresja markera komórek nabłonka dróg żółciowych (CK19) w różnych grupach leczenia. (B) Infiltracja komórek zapalnych makrofagów wykazano w różnych grupach leczenia. Skrót: PV = żyła wrotna. Czerwona strzałka wskazuje komórki nabłonka dróg żółciowych. strzałka wskazuje makrofagi. Podziałka = 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 5: Porównanie funkcji wątroby u myszy w różnych grupach leczenia. Krew myszy została pobrana po eksperymencie i przebadana w laboratorium szpitala. Każda grupa składała się z trzech do pięciu myszy. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001. Skróty: ALT = aminotransferaza alaninowa; AspAT = aminotransferaza asparaginianowa; ALP = fosfataza alkaliczna; TBIL = bilirubina całkowita; DBIL = bilirubina bezpośrednia; IBIL = bilirubina pośrednia. Ten rysunek został zmodyfikowany z Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>

Stworzyliśmy mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby, który dostarcza odpowiedniego modelu zwierzęcego do mechanistycznego badania atrezji dróg żółciowych (BA) wywołanego przez wirusa i platformy dla przyszłych terapii BA.

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Z powodzeniem wykorzystaliśmy tę metodę do stworzenia modelu mysiego, który jest bardziej zgodny z patologicznymi zmianami atrezji dróg żółciowych. Technika ta może symulować objawy ostrej i przewlekłej atrezji dróg żółciowych, co jest pomocne w przyszłych badaniach nad mechanizmami choroby. Po zastosowaniu przeciwciał czas przeżycia myszy został wydłużony, a objawy złagodzone, co sugeruje terapeutyczny wpływ przeciwciała na atrezję dróg żółciowych.Po podzieleniu nowonarodzonych myszy na różne grupy, zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy wstępnie potraktować każdą mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym pięciu mikrogramów przeciwciała anty-Ly6G na cztery godziny przed wstrzyknięciem rotawirusa rezus lub RRV w celu wyczerpania komórek Gr1-dodatnich. W ciągu 24 godzin po urodzeniu wstrzyknąć dootrzewnowo nowonarodzonej myszy 20 mikrolitrów rotawirusa rezus lub soli fizjologicznej. Po wstrzyknięciu RRV należy podać 20 mikrogramów przeciwciała anty-Ly6G do brzucha myszy.Codziennie sprawdzaj i rejestruj wygląd, wagę i przeżywalność wszystkich myszy. W przypadku wstrzyknięcia dootrzewnowego należy odsłonić brzuch młodej myszy, ściskając skórę szyi palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki i delikatnie przytrzymując tylne nogi myszy palcem serdecznym i palcem ogonowym. Podnieś igłę strzykawki pod kątem do góry i wbij igłę w środkowe udo prawej tylnej nogi myszy pod kątem 15 stopni ze skórą.Przesuwając igłę wzdłuż ścieżki podskórnej, aż dotrze do prawej krawędzi żebrowej myszy, skieruj igłę w dół do jamy brzusznej i wstrzyknij płyn pod wątrobę myszy. Natychmiast po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę. Zobserwować, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma krwawienia lub wycieku.Po znieczuleniu myszy w 12 dniu należy ją przeciąć pod mikroskopem. Włóż jednomililitrową strzykawkę insulinową do lewej komory serca, aby pobrać krew. Odwirować krew o stężeniu 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i oddzielić surowicę do pomiarów czynności wątroby.Wypreparuj wątrobę i śledzionę myszy z otaczających tkanek za pomocą nożyczek i pęsety. Sfotografuj ogólny wygląd wątroby i dróg żółciowych. Po znieczuleniu wziewnym należy odsłonić wątrobę, woreczek żółciowy i pozawątrobowe drogi żółciowe nożyczkami i wacikami.Pod mikroskopem postawy wstrzyknij od pięciu do 10 mikrolitrów barwnika fluorescencyjnego Rhodamina 123 do pęcherzyka żółciowego za pomocą jednomililitrowej strzykawki insulinowej i zrób zdjęcia. Zanurz świeżą tkankę wątroby myszy w 10% formalinie na 24 godziny. Po zatopieniu tkanki w parafinie za pomocą mikrotomu parafinowego pokrój blok parafiny na odcinki o grubości czterech mikrometrów i umieść dwie kolejne sekcje na tym samym szkiełku.Następnie umieść plastry na stojaku do krojenia, odwoskuj je w ksylenie i uwodnij kolejno w absolutnym etanolu, 95% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej przez pięć minut każdy. Zabarwić skrawki roztworem hematoksyliny przez pięć minut i namoczyć je w 1% kwasie solnym i 75% alkoholu przez pięć sekund. Po spłukaniu skrawków czystą wodą zabarwić je roztworem eozyny na jedną minutę.Przygotuj skrawki tkanki do barwienia, jak pokazano wcześniej, i wykonaj naprawę antygenu za pomocą buforu Tris-EDTA. Podgrzej sekcje w kuchence mikrofalowej w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie wyjmij je i schładzaj naturalnie do temperatury pokojowej. Aby usunąć endogenną peroksydazę, umieść skrawki tkanki w 3% nadtlenku wodoru na 10 minut i potraktuj plastry 5% kozim surowicą, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.Następnie dodaj do skrawków pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne anty-mysie Cytokeratin 19 lub szczurze przeciwciało monoklonalne F4 / 80 przeciwko myszom i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj 3,3-prime-diaminobenzydyny jako środka chromogennego, aby obserwować reakcję chromogenną pod mikroskopem.Obserwuj plastry pod mikroskopem 40x, aby uzyskać zdjęcia i przeanalizować je w razie potrzeby. Po przygotowaniu skrawków tkanek i barwieniu ich przeciwstawnym hematoksyliną, przykryj każdą tkankę 50 mikrolitrami roztworu barwnika sirius red w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Suszyć szkiełka w sposób naturalny w temperaturze pokojowej przez cztery godziny, dodawać kroplę neutralnej gumy do każdego szkiełka i używać szkiełka nakrywkowego, aby przykryć chusteczkę, aby uniknąć pęcherzyków.Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zestalić neutralną gumę. Obserwuj szczegóły osadzania kolagenu za pomocą mikroskopii spolaryzowanego światła kontrastowego. Wybierz wyraźne i odpowiednie pole widzenia, a następnie dostosuj jasność i balans bieli pola widzenia mikroskopu.Uzyskaj obrazy i analizuj je w razie potrzeby pod 40-krotnym mikroskopem. Po wstrzyknięciu RRV mediana czasu przeżycia w grupie RRV wynosiła 13 dni. U większości myszy leczonych przeciwciałem rozwinęła się łagodna żółtaczka i nie zaobserwowano utraty masy ciała.Wątroby myszy BA wykazywały zmiany martwicze i pozawątrobowy odcinek atrezji dróg żółciowych. Rozmiar wątroby jest mniejszy niż w grupie kontrolnej. Analiza histologiczna wykazała, że terapia niskimi dawkami anty-Ly6G zmniejszyła stan zapalny żyły wrotnej.Nagromadzenie komórek zapalnych nadal obserwowano w wycinkach tkanki wątroby w 42 dniu. W 12 dniu nastąpił niewielki wzrost odkładania się kolagenu w okolicy wrotnej. W 42 dniu ekspresja kolagenu została znacznie zwiększona i zaobserwowano znaczne odkładanie się kolagenu w tkance BA.Komórki CK19-dodatnie obserwowano w 12 dniu. W 42 dniu liczba komórek CK19-dodatnich wzrosła, ale dojrzałych dróg żółciowych było niewiele. Pozawątrobowy przewód żółciowy u przewlekłych myszy BA był zablokowany i miał zapalne nacieki mikrofagów.Poziomy ALT i ALP w wątrobie były wyższe w grupie przewlekłego BA niż w normalnej grupie kontrolnej. Poziomy bilirubiny całkowitej, bilirubiny bezpośredniej i bilirubiny pośredniej były podwyższone, co wskazuje, że czynność wątroby była znacznie zmniejszona w stadium przewlekłego zwłóknienia BA. Wstrzyknięcie należy wykonywać ostrożnie, aby nie przebić wątroby myszy. Po wstrzyknięciu powinniśmy poświęcić około 10 sekund na obserwację stanu myszy i oczyszczenie rany z krwi.

a-mouse-model-chronic-liver-fibrosis-for-study-biliary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zakłócenie przepływu żółci powoduje ciężkie zapalne cholestatyczne uszkodzenie wątroby z charakterystyczną, zależną od czasu sekwencją zmian morfologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół chirurgicznego podwiązania przewodu żółciowego wspólnego u myszy, który pozwala na wywołanie silnej odpowiedzi zwłóknieniowej po 21 do 28 dniach.

Podwiązanie dróg żółciowych u myszy: indukcja zapalnego uszkodzenia wątroby i zwłóknienia przez chalestazę obturacyjną

Tutaj opisujemy powszechną metodę wywoływania przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy poprzez karmienie dietą ubogą w cholinę i uzupełnioną etyoniną (CDE). Pokazujemy monitorowanie stanu zdrowia, perfuzję wątroby, izolację i konserwację. Sześciotygodniowy przebieg może informować o uszkodzeniu wątroby, patohistologii, zwłóknieniu, zapaleniu i odpowiedziach komórek progenitorowych wątroby.

Model przewlekłego uszkodzenia wątroby z niedoborem choliny i etyoniną (CDE)

Tutaj prezentujemy częściowe podwiązanie dróg żółciowych jako chirurgiczny model uszkodzenia i regeneracji wątroby u gryzoni.

Częściowe podwiązanie dróg żółciowych u myszy: kontrolowany model zlokalizowanej cholestazy obturacyjnej

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Przewlekłe zapalenie trzustki (CP) to choroba charakteryzująca się stanem zapalnym i zwłóknieniem trzustki, często związana z nieuleczalnym bólem brzucha. Ten artykuł koncentruje się na udoskonaleniu techniki generowania mysiego modelu CP poprzez infuzję dróg żółciowych z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).

Mysi model przewlekłego zapalenia trzustki poprzez infuzję TNBS z dróg żółciowych

Wykazano, że powiązanie podziału wątroby i podwiązania żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS) powoduje niezwykłą regenerację wątroby po kilku tygodniach od operacji pierwszego etapu. Modele zwierzęce, które przeszły ALPPS, zostały opracowane w celu zbadania potencjalnej zdolności regeneracji wątroby i osiągnięcia korzystnych wyników klinicznych.

Mysi model skojarzonej partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowego zabiegu hepatektomii wspomaganego mikroskopią

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać u myszy poprzez wstrzyknięcie ekstraktu z białek przysadki mysiej.

Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Poznaj metodę tworzenia myszego modelu przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych. Technika symuluje objawy ostrej i przewlekłej postaci choroby oraz pozwala ocenić skuteczność terapii przeciwciałem anti-Ly6G.

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Przeglądaj więcej filmów