Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Z powodzeniem wykorzystaliśmy tę metodę do stworzenia modelu mysiego, który jest bardziej zgodny z patologicznymi zmianami atrezji dróg żółciowych. Technika ta może symulować objawy ostrej i przewlekłej atrezji dróg żółciowych, co jest pomocne w przyszłych badaniach nad mechanizmami choroby. Po zastosowaniu przeciwciał czas przeżycia myszy został wydłużony, a objawy złagodzone, co sugeruje terapeutyczny wpływ przeciwciała na atrezję dróg żółciowych.

Po podzieleniu nowonarodzonych myszy na różne grupy, zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy wstępnie potraktować każdą mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym pięciu mikrogramów przeciwciała anty-Ly6G na cztery godziny przed wstrzyknięciem rotawirusa rezus lub RRV w celu wyczerpania komórek Gr1-dodatnich. W ciągu 24 godzin po urodzeniu wstrzyknąć dootrzewnowo nowonarodzonej myszy 20 mikrolitrów rotawirusa rezus lub soli fizjologicznej. Po wstrzyknięciu RRV należy podać 20 mikrogramów przeciwciała anty-Ly6G do brzucha myszy.

Codziennie sprawdzaj i rejestruj wygląd, wagę i przeżywalność wszystkich myszy. W przypadku wstrzyknięcia dootrzewnowego należy odsłonić brzuch młodej myszy, ściskając skórę szyi palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki i delikatnie przytrzymując tylne nogi myszy palcem serdecznym i palcem ogonowym. Podnieś igłę strzykawki pod kątem do góry i wbij igłę w środkowe udo prawej tylnej nogi myszy pod kątem 15 stopni ze skórą.

Przesuwając igłę wzdłuż ścieżki podskórnej, aż dotrze do prawej krawędzi żebrowej myszy, skieruj igłę w dół do jamy brzusznej i wstrzyknij płyn pod wątrobę myszy. Natychmiast po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę. Zobserwować, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma krwawienia lub wycieku.

Po znieczuleniu myszy w 12 dniu należy ją przeciąć pod mikroskopem. Włóż jednomililitrową strzykawkę insulinową do lewej komory serca, aby pobrać krew. Odwirować krew o stężeniu 400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i oddzielić surowicę do pomiarów czynności wątroby.

Wypreparuj wątrobę i śledzionę myszy z otaczających tkanek za pomocą nożyczek i pęsety. Sfotografuj ogólny wygląd wątroby i dróg żółciowych. Po znieczuleniu wziewnym należy odsłonić wątrobę, woreczek żółciowy i pozawątrobowe drogi żółciowe nożyczkami i wacikami.

Pod mikroskopem postawy wstrzyknij od pięciu do 10 mikrolitrów barwnika fluorescencyjnego Rhodamina 123 do pęcherzyka żółciowego za pomocą jednomililitrowej strzykawki insulinowej i zrób zdjęcia. Zanurz świeżą tkankę wątroby myszy w 10% formalinie na 24 godziny. Po zatopieniu tkanki w parafinie za pomocą mikrotomu parafinowego pokrój blok parafiny na odcinki o grubości czterech mikrometrów i umieść dwie kolejne sekcje na tym samym szkiełku.

Następnie umieść plastry na stojaku do krojenia, odwoskuj je w ksylenie i uwodnij kolejno w absolutnym etanolu, 95% etanolu, 80% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej przez pięć minut każdy. Zabarwić skrawki roztworem hematoksyliny przez pięć minut i namoczyć je w 1% kwasie solnym i 75% alkoholu przez pięć sekund. Po spłukaniu skrawków czystą wodą zabarwić je roztworem eozyny na jedną minutę.

Przygotuj skrawki tkanki do barwienia, jak pokazano wcześniej, i wykonaj naprawę antygenu za pomocą buforu Tris-EDTA. Podgrzej sekcje w kuchence mikrofalowej w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie wyjmij je i schładzaj naturalnie do temperatury pokojowej. Aby usunąć endogenną peroksydazę, umieść skrawki tkanki w 3% nadtlenku wodoru na 10 minut i potraktuj plastry 5% kozim surowicą, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.

Następnie dodaj do skrawków pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne anty-mysie Cytokeratin 19 lub szczurze przeciwciało monoklonalne F4 / 80 przeciwko myszom i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj 3,3-prime-diaminobenzydyny jako środka chromogennego, aby obserwować reakcję chromogenną pod mikroskopem.

Obserwuj plastry pod mikroskopem 40x, aby uzyskać zdjęcia i przeanalizować je w razie potrzeby. Po przygotowaniu skrawków tkanek i barwieniu ich przeciwstawnym hematoksyliną, przykryj każdą tkankę 50 mikrolitrami roztworu barwnika sirius red w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Suszyć szkiełka w sposób naturalny w temperaturze pokojowej przez cztery godziny, dodawać kroplę neutralnej gumy do każdego szkiełka i używać szkiełka nakrywkowego, aby przykryć chusteczkę, aby uniknąć pęcherzyków.

Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na 24 godziny, aby zestalić neutralną gumę. Obserwuj szczegóły osadzania kolagenu za pomocą mikroskopii spolaryzowanego światła kontrastowego. Wybierz wyraźne i odpowiednie pole widzenia, a następnie dostosuj jasność i balans bieli pola widzenia mikroskopu.

Uzyskaj obrazy i analizuj je w razie potrzeby pod 40-krotnym mikroskopem. Po wstrzyknięciu RRV mediana czasu przeżycia w grupie RRV wynosiła 13 dni. U większości myszy leczonych przeciwciałem rozwinęła się łagodna żółtaczka i nie zaobserwowano utraty masy ciała.

Wątroby myszy BA wykazywały zmiany martwicze i pozawątrobowy odcinek atrezji dróg żółciowych. Rozmiar wątroby jest mniejszy niż w grupie kontrolnej. Analiza histologiczna wykazała, że terapia niskimi dawkami anty-Ly6G zmniejszyła stan zapalny żyły wrotnej.

Nagromadzenie komórek zapalnych nadal obserwowano w wycinkach tkanki wątroby w 42 dniu. W 12 dniu nastąpił niewielki wzrost odkładania się kolagenu w okolicy wrotnej. W 42 dniu ekspresja kolagenu została znacznie zwiększona i zaobserwowano znaczne odkładanie się kolagenu w tkance BA.

Komórki CK19-dodatnie obserwowano w 12 dniu. W 42 dniu liczba komórek CK19-dodatnich wzrosła, ale dojrzałych dróg żółciowych było niewiele. Pozawątrobowy przewód żółciowy u przewlekłych myszy BA był zablokowany i miał zapalne nacieki mikrofagów.

Poziomy ALT i ALP w wątrobie były wyższe w grupie przewlekłego BA niż w normalnej grupie kontrolnej. Poziomy bilirubiny całkowitej, bilirubiny bezpośredniej i bilirubiny pośredniej były podwyższone, co wskazuje, że czynność wątroby była znacznie zmniejszona w stadium przewlekłego zwłóknienia BA. Wstrzyknięcie należy wykonywać ostrożnie, aby nie przebić wątroby myszy. Po wstrzyknięciu powinniśmy poświęcić około 10 sekund na obserwację stanu myszy i oczyszczenie rany z krwi.