Name: Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego pomiaru kurczliwości włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu optycznego. Technika ta umożliwia badanie mutacji genetycznych i testowanie leków poprawiających zdrowie mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Sylvii Bogaards, Sannie Luijcx, Valentijnowi Jansenowi, Michielowi Helmesowi i Emmy Manders za ich techniczną wiedzę w pomocy w rozwoju tego protokołu. Praca ta została wsparta nagrodami Stowarzyszenia Dystrofii Mięśniowej (Nagroda za rozwój MDA603238 dla T.J.K.), Holenderskiego Sojuszu Sercowo-Naczyniowego (Grant dla T.J.K) oraz Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC, Australia; Stypendium APP1121651 do M.Y.).

Dla badań ex vivo, pośmiertne tkanki zostały pobrane od zwierząt uśmierconych do innych zatwierdzonych projektów badawczych i/lub nadwyżki hodowlanej Uniwersytetu VU zgodnie z Dyrektywą Rady Europejskiej (2010/63/UE) za zgodą holenderskiej ustawy o badaniach na zwierzętach.
1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Przygotuj pipety do rozcierania (przechowywać w 70% etanolu w komorze przepływowej do czasu użycia). Odetnij końce dwóch końcówek P1,000, aby utworzyć różne rozmiary otworów; Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby mięsień mógł przez niego przejść bez blokowania pipety. Przepuść odcięte końce przez płomień, aby stały się gładkie.</li>
	<li>Przygotuj potrawy Sylgard zgodnie z opisem w innym miejscu32, a następnie wysterylizuj 70% etanolem do użycia w celu zabezpieczenia łapy i mięśni podczas izolacji. 
	UWAGA: Naczynia Sylgard mogą być ponownie użyte po dokładnym oczyszczeniu wodą dejonizowaną i 70% etanolem.</li>
	<li>Przed procedurą izolacji należy przygotować następujące roztwory: pożywkę preparacyjną, pożywkę do hodowli fibryny i pożywkę do trawienia mięśni (patrz Tabela 1). 
	UWAGA: Pożywka do trawienia mięśni powinna być sterylizowana filtrem przy użyciu filtra 0,22 μm. Wszystkie przygotowane roztwory należy przed użyciem zrównoważyć w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Po wytrawieniu mięśniowym należy przygotować następujące roztwory do odlewania hydrożelu: mieszaninę komórek i mieszaninę matrycową (patrz Tabela 2). Połącz mieszankę komórkową i mieszankę matrycową w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie fibryny 2,5 mg/mL. 
	UWAGA: Przygotuj matrycę na lodzie i użyj wstępnie schłodzonych końcówek pipet, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji matrycy błony podstawnej. Zastosowany tutaj stosunek trombiny do fibrynogenu wynoszący 1:10 (jednostek na mg fibrynogenu) został zoptymalizowany pod kątem czasu polimeryzacji wynoszącego 30 minut. Jeśli żel polimeryzuje w ciągu 30 minut, należy zastosować niższe stężenie trombiny. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie mięśni FDB
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Zdezynfekuj tylną kończynę 70% alkoholem.</li>
	<li>Odetnij dolną tylną nogę powyżej kostki. Rozetnij skórę po grzbietowej stronie stopy w kierunku palców. 
	UWAGA: Odetnij dolną tylną nogę w stawie skokowym, aby zapobiec uszkodzeniu mięśni kończyn dolnych i kości piszczelowej, jeśli będą potrzebne później.</li>
	<li>Ostrożnie obierz skórę w kierunku palców stóp. Uważaj, aby nie uszkodzić mięśnia. FDB jest najbardziej powierzchownym mięśniem po brzusznej stronie stopy.</li>
	<li>Umieścić wypreparowaną stopę w naczyniu Sylgarda z 10 ml podgrzanego podłoża preparacyjnego w temperaturze 37 °C. Przygwoździć stopę przez skórę, która jest nadal przyczepiona do palców, i przygwoździć dolną część nogi poza kostkę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń tkankę łączną na górze mięśnia. Przetnij ścięgno na pięcie i unieś mięsień do góry za ścięgno.</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż i pod mięśniem przez tkankę łączną. Kontynuuj cięcie, aż ścięgna palców zostaną odsłonięte.</li>
	<li>Kiedy połowa długości trzech ścięgien jest odsłonięta, przetnij ścięgna i uwolnij mięsień ze stopy. OPCJONALNIE: Odetnij czwarte ścięgno boczne i jego włókna mięśniowe.</li>
	<li>Oczyść tkankę łączną z mięśnia i przenieś do rurki zawierającej podgrzane podłoże preparacyjne.</li>
</ol>
3. Trawienie mięśni FDB
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do trawienia mięśniowego zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Przenieść mięśnie FDB do pożywki do trawienia mięśni za pomocą pipety serologicznej. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 80 min. 
	UWAGA: Ten czas powinien być zoptymalizowany dla każdej partii kolagenazy. Trawienie jest zakończone, gdy mięsień zaczyna się strzępić i wygląda na powiększony. Zapoznaj się z dyskusją, aby zapoznać się z optymalizacją czasu trawienia.</li>
	<li>Po roztrawieniu przenieść mięsień do 15 ml probówki zawierającej 3 ml pożywki preparacyjnej i inkubować przez 30 minut przed rozcieraniem.</li>
</ol>
4. Tarcie mięśni FDB i sedymentacja grawitacyjna
<ol>
	<li>Rozetrzeć mięsień za pomocą wcześniej przygotowanych końcówek do rozcierania (krok 1.1), pipetując mięsień, przechodząc od największego do najmniejszego rozmiaru. Jeśli ten krok trwa dłużej niż 5 minut, umieść mięsień w inkubatorze na 5 minut, aby mógł odpocząć.</li>
	<li>Cierć, aż włókna mięśniowe w większości odpadną od ścięgna, a ścięgno może przejść przez końcówkę P200. Usuń ścięgna.</li>
	<li>Dodaj zdysocjowane włókna FDB do 15 ml probówki zawierającej 10 ml pożywki preparacyjnej i pozwól włóknom osiąść w inkubatorze przez 20 minut. Obserwuj uformowane osady.</li>
	<li>Opcjonalnie: Usuń 10 ml pożywki z góry i powtórz krok 4.3. Ten krok ułatwia usunięcie nadmiaru zanieczyszczeń i związanych z nimi komórek jednojądrowych.</li>
</ol>
5. Osadzanie światłowodów FDB
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń całe podłoże z wierzchu granulki włókna. Ponownie zawiesić komórki w 875 μl mieszanki komórkowej na mięsień FDB (na lodzie). 
	UWAGA: Jeden mięsień FDB daje wystarczającą ilość włókien dla siedmiu dołków 24-dołkowej płytki. Gęstość tę można dostosować do potrzeb eksperymentu. Poniższa objętość żelu (250 μl) jest zoptymalizowana dla formatu 24-dołkowego, ale może być odpowiednio skalowana dla innych formatów.</li>
	<li>Podwielokrotność 125 μl komórek wymieszać w pojedynczych probówkach do mikrowirówek.</li>
	<li>Raz po drugim dodawać 125 μl mieszaniny matrycowej do podwielokrotności zawiesiny komórek i mieszać, ostrożnie pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Natychmiast przenieś końcową mieszankę do studzienki. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby odpipetować mieszaninę do środka studzienki. Powtórz krok 5.3 i krok 5.4 dla każdej studzienki.</li>
	<li>Zestal żele w inkubatorze przez 30-45 minut. Po zestaleniu ostrożnie dodaj pożywkę hodowlaną do studzienek. 
	UWAGA: Szybkie pipetowanie może odłączyć hydrożel od studzienki. Od tego momentu włókna mogą być stymulowane i mierzone. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że pozostawienie włókien do dostosowania się do warunków hodowli przez 24 godziny może poprawić kurczliwość włókien.</li>
	<li>W przypadku dłuższej hodowli należy uzupełniać pożywkę o pół zmiany co 2 dni. Aby to zrobić, usuń połowę pożywki hodowlanej i zastąp ją równą ilością świeżej pożywki.</li>
</ol>
6. Pomiary kurczliwości oparte na optyce
<ol>
	<li>Włącz system pomiaru kurczliwości oparty na optyce (patrz tabela materiałów), lampę fluorescencyjną, stymulator ogniw elektrycznych i komputer. Ustaw stymulator elektryczny na 1,0 Hz, 10,0 V i czas trwania impulsu 5,00 ms, aby stymulować izolowane włókna mięśniowe.</li>
	<li>Włóż płytkę do układu pomiarowego. Podłącz stymulator do wkładu stymulatora i włóż go do płytki hodowlanej.</li>
	<li>Otwórz program IonWizard i otwórz nowy plik, klikając Plik (lewy górny róg ekranu) | Nowy.</li>
	<li>Sprawdź, czy program jest w odpowiednim eksperymencie, Szkieletowy Sarkomer, klikając Nowy | Zbierz eksperyment. Aby zmienić eksperyment, kliknij żądany eksperyment i naciśnij dodaj. W eksperymencie z sarkomerem szkieletowym zastosuj następujące ustawienia: Sarc 20x, Linie średnie, pojedynczy FFT, częstotliwość próbkowania 250 Hz i czas akwizycji 10 s. 
	UWAGA: Ustawienia eksperymentalne powinny być przygotowane przed eksperymentem. Ustawienia można dostosować do potrzeb eksperymentu.</li>
	<li>Ustaw temperaturę układu pomiarowego na 25 °C. Kliknij otwórz wyszukiwarkę komórek pod paskiem narzędzi i poczekaj, aż pojawi się nowy ekran. W prawym górnym rogu tego ekranu wybierz typ płyty i aktywne studnie. 
	UWAGA: Pomiary są wykonywane w temperaturze 25 °C w celu zmniejszenia prędkości skurczu szybkokurczliwych włókien mięśniowych FDB, zapobiegając w ten sposób niedostatecznemu próbkowaniu zdarzenia skurczowego.</li>
	<li>Ustaw ostrość włókien, regulując suwak ostrości. Alternatywnie użyj W i S dla tej funkcji ustawiania ostrości.</li>
	<li>Włącz stymulację, aby rozpocząć stymulację elektryczną. Zauważ, że włókna zaczynają teraz drgać. 
	UWAGA: Jeśli żadne włókna nie drgają, upewnij się, że wszystkie przewody są podłączone, a stymulator jest całkowicie zanurzony. Jeśli po tym czasie nadal nie ma ruchu, włókna mogą nie reagować z powodu nadmiernego trawienia lub nadmiernego uszkodzenia podczas tryturacji.</li>
	<li>Skoncentruj obszar pomiaru na końcu włókna tak, aby sarkomery biegły pionowo. Upewnij się, że sarkomery są ostre. Jeśli sarkomery są aktywne, na pasku narzędzi widoczny jest pojedynczy pik. Podczas skurczu szczyt ten przesunie się w prawo, gdy sarkomer się skróci. 
	UWAGA: Fioletowy obszar pomiaru można dostosować przed rozpoczęciem eksperymentu. Aby zapewnić prawidłowy pomiar, dołącz ~20 sarkomerów. Jeśli ten pik zmieni kształt podczas skurczu, może to oznaczać, że sarkomer jest zasłonięty lub nieostry podczas skurczu, co wprowadza szum.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk Start na pasku narzędzi. Naciśnij Q, aby rozpocząć pomiar i poczekaj, aż program zmierzy 10 stanów przejściowych skurczu. Jeśli więcej niż cztery stany nieustalone wyglądają na wolne od szumów, zatwierdź pomiar, naciskając Z. Jeśli stany nieustalone mają zbyt duży szum, odrzuć pomiar, naciskając X.</li>
	<li>Zmierz od 10 do 20 włókien na warunek. Lokalizacje wcześniej zmierzonych włókien są zachowywane.</li>
	<li>Opcjonalnie: Dodaj związki, po czym włókna można w tym momencie ponownie zmierzyć.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu naciśnij przycisk zatrzymania na dolnym pasku narzędzi, aby zamknąć okno wyszukiwarki komórek. Zapisz plik i rozpocznij nowy plik.</li>
	<li>Aby przeanalizować dane, otwórz program "Pulpit Cytosolver". Kliknij import i wybierz pliki, które chcesz przeanalizować.</li>
	<li>Po zakończeniu analizy przez program poszukaj niebieskich, czerwonych i szarych szczytów. Niebieskie szczyty są stanami nieustalonymi, które są akceptowane przez program. Czerwone szczyty to stany nieustalone, które są odrzucane przez program, a szare szczyty to stany nieustalone odrzucane przez użytkownika. 
	UWAGA: Kryteria odrzucenia można dostosować w oprogramowaniu analitycznym. Ogólnie rzecz biorąc, wartości są odrzucane, jeśli przekraczają maksymalny limit pochodnej, a stany nieustalone są odrzucane na podstawie wartości dopasowania krzywej R2 wynoszących <0,95.</li>
	<li>Kliknij eksport. Zaznacz następujące pola: Uśrednione dane przejściowe i eksport do programu Excel.</li>
	<li>Po zakończeniu wyłącz wszystkie maszyny. Wyjmij płytkę hodowlaną i wyrzuć ją. Wyczyść elektrody stymulatora wodą dejonizowaną i 70% etanolem.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, L. R., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+explants%3A+Ex-vivo+models+to+study+cellular+behavior+in+a+complex+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment.</a> Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).</li>
<li>Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tissue-engineered+skeletal+muscle+models+for+studying+muscle+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498(2018).</li>
<li>Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+in+vitro+skeletal+muscles+as+new+tools+for+muscular+dystrophies+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies.</a> Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339(2021).</li>
<li>Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Available+in+vitro+models+for+human+satellite+cells+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221(2021).</li>
<li>Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -H., Rouger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+models+of+skeletal+muscle%3A+Myopshere%2C+myobundle+and+bioprinted+muscle+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct.</a> Veterinary Research. 52 (1), 72(2021).</li>
<li>Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+human+skeletal+muscle+progenitor+cells+from+fetal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle.</a> Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+functional+human+skeletal+myotubes+in+a+defined+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system.</a> Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).</li>
<li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).</li>
<li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+mature+myofibers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).</li>
<li>Khodabukus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+models+to+study+muscle+function%2C+plasticity%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease.</a> Frontiers in Physiology. 12, 619710(2021).</li>
<li>Engler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness%3A+Pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotube+assembly+on+nanofibrous+and+micropatterned+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers.</a> Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).</li>
<li>Earle, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+lamins+cause+nuclear+envelope+rupture+and+DNA+damage+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells.</a> Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).</li>
<li>Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+cultivation+of+single+myofibers+from+porcine+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).</li>
<li>Ravenscroft, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+flexor+digitorum+brevis+myofiber+culture+system--A+more+mature+muscle+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).</li>
<li>Ramsey, R. W., Street, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isometric+length-tension+diagram+of+isolated+skeletal+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).</li>
<li>Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+FDB+fibers+following+a+collagenase+digestion+for+studying+contractility%2C+fatigue%2C+and+pCa-sarcomere+shortening+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).</li>
<li>Renzini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+influence+satellite+cell+activation+and+survival+of+single+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Translational+Myology%22%5BJournal%5D)">Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers.</a> European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567(2018).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).</li>
<li>Holmberg, J., Durbeej, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin-211+in+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">Laminin-211 in skeletal muscle function.</a> Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).</li>
<li>Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+immunostaining+of+skeletal+muscle+myofibers+from+wildtype+and+nestin-GFP+mice+as+a+means+to+analyze+satellite+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).</li>
<li>Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+the+isolated+soleus+muscle+during+long-term+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physiology%2C+Nutrition%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation.</a> Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).</li>
<li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+maximum+isometric+force+generated+by+permeabilized+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).</li>
<li>Ottenheijm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+myofilament+function+depresses+force+generation+in+patients+with+nebulin-based+nemaline+myopathy+%28NEM2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2).</a> Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).</li>
<li>Rausch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+skeletal+muscle+fiber+contractility+with+high-speed+traction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).</li>
<li>de Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).</li>
<li>Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-specific+pathology+and+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy+in+patients%2C+mouse+models+and+human+engineered+heart+tissue.+Biochimica+et+Biophysica+Acta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta.</a> Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774(2020).</li>
<li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation%2C+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+%5BCa%282%2B%29%5D+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li>
<li>Cao, L., Manders, E., Helmes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+detection+of+adult+cardiomyocyte+for+high+throughput+measurements+of+calcium+and+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility.</a> PLoS One. 16 (9), e0256713(2021).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2022 (8), Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2022).</li>
<li>Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+sarcomere+lengths+and+sarcomere+elongations+are+not+uniform+across+an+intact+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle.</a> Frontiers in Physiology. 7, 187(2016).</li>
<li>Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sarcomere+force-length+relationship+in+an+intact+muscle-tendon+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit.</a> Journal of Experimental Biology. 223, 215020(2020).</li>
<li>Schuler, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+aging+contributes+to+age-dependent+impairments+of+muscle+stem+cell+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality.</a> Cell Reports. 35 (10), 109223(2021).</li>
<li>Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveals+drastic+increase+of+extracellular+matrix+proteins+collagen+and+dermatopontin+in+the+aged+mdx+diaphragm+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).</li>
<li>Tarpey, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+utilization+of+the+flexor+digitorum+brevis+for+assessing+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function.</a> Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół przeprowadzania enzymatycznej izolacji i hodowli włókien mięśniowych FDB w formacie hodowli 3D, a następnie pomiarów kurczliwości przy użyciu systemu pomiaru kurczliwości opartego na optyce. Protokół ten ma wiele zalet, w tym: 1) prostą i terminową izolację wielu nienaruszonych włókien mięśniowych z jednego mięśnia; 2) osadzenie włókien mięśniowych w przestrajalnej matrycy hydrożelowej; 3) wykonywanie wysokoprzepustowych pomiarów kurczliwości z wykorzystaniem układu optycznego; oraz 4) zdolność do przeprowadzania powtarzających się pomiarów tych samych włókien mięśniowych po interwencji. Izolacja pojedynczych żywych włókien mięśniowych zapewnia dojrzałe komórki mięśniowe, które zachowują swoją funkcję skurczową. Ponieważ włókna mięśniowe uzyskane z mysiego FDB są stosunkowo małe, można nimi łatwo manipulować podczas izolacji i zachowują swój prosty kształt, co pozwala na dalsze pomiary skurczu. Chociaż system został opracowany przede wszystkim do badania skurczu kardiomiocytów, włókna mięśni szkieletowych zawierają tę samą maszynerię kurczliwą z łatwo rozpoznawalnym wzorem sarkomerowym, a zatem mogą być również mierzone za pomocątego systemu. Sprzężenie pomiarów kurczliwości pojedynczych komórek z żywymi hodowlami włókien mięśniowych ex vivo jest potężnym narzędziem do oceny zdrowia i funkcji dojrzałych włókien mięśniowych w odpowiedzi na aktywację elektryczną. 
Ograniczeniem stosowania zdysocjowanych włókien mięśniowych jest brak sił zewnętrznych (tj. biernego rozciągania) przyłożonych do włókien, co skutkuje mniejszymi długościami spoczynkowych sarkomerów w porównaniu do tych występujących in vivo. Chociaż długość sarkomeru wynosząca 2,4-2,5 μm zapewnia optymalne wytwarzanie siły, długość spoczynkowego sarkomeru może się znacznie różnić33. Chociaż spoczynkowa długość sarkomeru in vivo FDB nie została jeszcze opisana, nasze własne niepublikowane dane sugerują średnią długość 2,2 μm. Obecne wyniki pokazują średnią długość spoczynkowego sarkomeru wynoszącą ~1,95 μm w nieobciążonych włóknach FDB po 24 godzinach w hodowli (ryc. 3). Chociaż ta mniejsza długość spoczynkowego sarkomeru skutkowałaby mniejszą produkcją siły, długość ~1,95 μm powinna nadal wytwarzać >90% maksymalnej siły34. W związku z tym te długości sarkomerów powinny być wystarczające do określenia różnic w funkcji włókien między różnymi modelami genetycznymi lub po leczeniu farmakologicznym. Dodatkowo zatopienie włókien w hydrożelu zapewnia wiele dodatkowych punktów przyczepności w porównaniu ze swobodnie pływającymi włóknami hodowlanymi 2D, co ograniczyłoby dalsze skracanie sarkomeru w czasie.
Jedną z zalet tego protokołu izolacji włókien mięśniowych jest wykorzystanie łatwego do wypreparowania mięśnia szybkokurczliwego składającego się ze stosunkowo małych włókien mięśniowych w porównaniu z innymi mięśniami, takimi jak prostownik długi palca (EDL). Ich mniejszy rozmiar sprawia, że izolacja mięśni jest bardziej odpowiednia do separacji opartej na trituracji, zmniejszając w ten sposób ryzyko uszkodzenia włókien mięśniowych wywołanego pipetowaniem lub splątaniem. Macierz zewnątrzkomórkowa mięśni FDB może być łatwo trawiona enzymatycznie za pomocą kolagenazy, co pozwala na izolację setek włókien mięśniowych w krótkim czasie. Jednak nadmierne trawienie może prowadzić do uszkodzenia włókien mięśniowych. Nadmierne trawienie włókien mięśniowych można rozpoznać, gdy mięsień rozpada się niemal natychmiast podczas rozcierania mięśnia lub gdy duża część objętości komórki jest nadmiernie skurczona podczas procedury wysiewu komórek. Aby zapobiec nadmiernemu trawieniu mięśni, czas trawienia musi być zoptymalizowany dla każdej partii kolagenazy. Aby to sprawdzić, dwa mięśnie FDB powinny być trawione równolegle, z rozłożonym czasem trawienia wynoszącym 5 minut między nimi. Należy wybrać czas trawienia z najwyższym plonem żywotnych włókien mięśniowych. Tę optymalizację należy następnie przeprowadzić po raz drugi, ponownie z 5-minutową separacją w czasie trawienia. Czas trawienia, w którym powstają najbardziej żywotne włókna mięśniowe, powinien być stosowany jako optymalny czas trawienia dla obecnej partii kolagenazy. Innym sposobem ograniczenia zmienności kolagenazy między partiami byłoby bezpośrednie obliczenie jednostek aktywności na mililitr roztworu podstawowego, a następnie odtworzenie kolejnych partii kolagenazy do tej samej ilości. Wreszcie, może być konieczne zoptymalizowanie czasu trawienia u różnych szczepów myszy, na przykład w przypadku badania starych lub chorych zwierząt, które wykazują zwiększone odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej35,36.
Możliwość pipetowania żywotnych izolowanych włókien mięśniowych otwiera możliwości hodowli włókien mięśniowych FDB w różnych warunkach hodowli. Jedną z takich opcji jest hodowla tych włókien w hydrożelach w celu naśladowania natywnego środowiska hodowli tkankowej. Ten protokół zatapiania zapewnia, że włókna pozostają na miejscu podczas pomiarów skurczu i został zoptymalizowany, aby umożliwić włóknom osadzenie się na dnie płytki przed związaniem żelu. Jednak protokół ten może wymagać dostosowania w celu uwzględnienia różnic w zapasach trombiny i fibrynogenu. Jeśli aktywność trombiny jest zbyt wysoka, żel przedwcześnie stwardnieje, a włókna mogą pozostać zawieszone w wyższych miejscach poza płaszczyzną ogniskowej mikroskopu. Jeśli tak się stanie, należy dostosować stosunek trombiny do fibrynogenu. Można to sprawdzić, platerując włókna w coraz niższych stężeniach trombiny i zwracając uwagę na to, jak długo trwa polimeryzacja. Zazwyczaj nie powinno to nastąpić szybciej niż 30 minut. Jednak zbyt niskie stężenie trombiny może również upośledzać proces polimeryzacji. Inną metodą upewnienia się, że włókna znajdują się we właściwej płaszczyźnie ogniskowej, jest najpierw wysiew ich za pomocą protokołu 2D, a następnie dodanie warstwy hydrożelu na włókna po ich przyklejeniu do płytki hodowlanej. Należy jednak mieć świadomość, że usunięcie podłoża z włókien może wywołać hiperskurcz, ponieważ są one wrażliwe na wysychanie. Nie jest również jasne, czy hydrożel w pełni przyczepi się do płytki hodowlanej i może łatwiej się poluzować. Dlatego ta procedura osadzania jest preferowana do utrzymania żywotności włókien i na miejscu do pomiarów skurczu.
Zastosowanie tego protokołu umożliwia badanie dynamiki kurczliwości dojrzałych włókien mięśniowych ex vivo i może być stosowane zarówno u zdrowych myszy, jak i tych będących nosicielami mutacji genetycznych w chorobach mięśni. Umożliwia również testowanie, w jaki sposób warunki hodowli lub dodawanie związków wpływa na funkcję włókien mięśniowych. Dane dotyczące kurczliwości uzyskane za pomocą systemu opartego na optyce wskazują na zdolność skurczową żywych pojedynczych włókien mięśniowych, a zmiany tej zdolności mogą być skorelowane ze zdrowiem włókien. Same te dane nie są jednak wystarczające do określenia, czy zmiany te zachodzą na etapach mostkowania krzyżowego aktyna-miozyna lub uwalniania wapnia podczas skurczu mięśni. Chociaż w tym protokole nie opisujemy metod pomiaru sygnalizacji wapniowej, ta konfiguracja jest również w stanie mierzyć stany przejściowe wapnia na bazie Fura w kurczących się komórkach mięśniowych29. Wadą tego systemu jest to, że mięsień FDB zawiera tylko szybkokurczliwe włókna mięśniowe typu IIa/IIx, a mięśnie zawierające wolnokurczliwe włókna typu I tej wielkości nie zostały jeszcze opisane37. Eliminuje to możliwość badania funkcjonowania specyficznego dla danego rodzaju włókien za pomocą tej metody. Protokół, który tutaj proponujemy, może potencjalnie zostać zaadaptowany do innych mięśni, takich jak EDL lub płaszczkowaty, w celu zbadania różnic między rodzajami włókien. Ze względu na ich większy rozmiar, protokół ten musiałby zostać jeszcze bardziej zoptymalizowany dla tych mięśni. Dłuższe włókna mają tendencję do plątania się na etapie sedymentacji grawitacyjnej i pękają, jeśli są manipulowane przez pipetowanie, co doprowadziłoby do niższej wydajności. Ze względu na ich niekompatybilność z pipetowaniem, dłuższe włókna są również mniej kompatybilne z techniką zatapiania żelu. Pomiary tych włókien można nadal wykonywać w formacie hodowli 2D, ale włókna mogą się bardziej poruszać podczas skurczu ze względu na swój rozmiar, wpływając w ten sposób na stosunek sygnału do szumu. Innym ograniczeniem tego systemu jest brak możliwości wykonywania pomiarów siły równolegle z pomiarami skurczu, takich jak pomiary siły, które można uzyskać przy użyciu innych nienaruszonych preparatów włókien mięśniowych28. Ograniczenie to można jednak obejść, szacując siłę generowaną przez włókno mięśniowe. Siłę generowaną przez włókna mięśniowe można oszacować, jeśli znany jest kształt włókien mięśniowych w stanach skurczu i rozluźnienia, a także moduł Younga macierzy25. Niemniej jednak ten system optyczny zapewnia łatwe w użyciu, wysokowydajne podejście do badania funkcji skurczu mięśni i otwiera szereg nowych możliwości badania genetycznych chorób mięśni i interwencji terapeutycznych.

Postępy w technikach hodowli komórkowych in vitro otworzyły nowe możliwości badania zdolności regeneracyjnych tkanek, patofizjologicznych mechanizmów komórkowych i późniejszych strategii terapeutycznych, a wszystko to przy użyciu tkanek ssaków w dobrze kontrolowanych warunkach1,2,3. Stosowanie systemów hodowli in vitro jest dobrze ugruntowane w dziedzinie badań nad mięśniami4,5. Ogólnie rzecz biorąc, stosuje się niedojrzałe miorurki z miogennych komórek progenitorowych różnicowane in vitro2,6,7,8. Chociaż poczyniono postępy w protokole różnicowania w celu wygenerowania bardziej dojrzałych włókien mięśniowych9, ich niedojrzałość nadal ogranicza translację wyników na ustawienie in vivo1,10. Jednym z głównych problemów w dziedzinie biologii mięśni jest niezdolność zróżnicowanych in vitro miotub do pełnego uosobienia złożonych struktur wewnątrzkomórkowych, procesów sygnalizacji komórkowej i interakcji zewnątrzkomórkowych obserwowanych w natywnej tkance mięśniowej i, co ważne, rekapitulacji sił skurczowych wytwarzanych przez włókna mięśniowe1,2,10,11,12. Ponadto, nieskoordynowane kurczenie się miotub podczas procesu różnicowania często powoduje spontaniczne oderwanie się od szalek hodowlanych, co sprawia, że ocena kurczliwości miotub zróżnicowanych in vitro jest trudna i ograniczona do oceny jakościowej lub półilościowej8,11,12,13. Ograniczenia te często wymagają regularnych eksperymentów in vivo na zwierzętach, szczególnie jeśli głównym wynikiem eksperymentu jest kurczliwość mięśni1.
Alternatywą dla hodowli in vitro zróżnicowanych miotub jest hodowla ex vivo izolowanych dojrzałych włókien mięśniowych1,14. Podczas hodowli ex vivo dojrzała rozwojowo tkanka mięśniowa jest wycinana z organizmu, a następnie izolowana jednokomórkowa do hodowli w warunkach laboratoryjnych1,14. Izolowane dojrzałe włókna mięśniowe zachowują swoje złożone struktury komórkowe obserwowane w natywnej <tkance sup class="xref">14,15, a ta metoda otwiera możliwość bezpośrednich interwencji, takich jak manipulacja genetyczna i badania przesiewowe leków, w dobrze zdefiniowanym i kontrolowanym środowisku hodowli. Jedno z pierwszych doniesień dotyczących izolacji włókien mięśni szkieletowych i hodowli ex vivo pochodzi z lat 30. XX wieku; Jednak wydajność żywotnych włókien z tego protokołu była niska16. Dzięki ciągłej optymalizacji procedury izolacji i warunków hodowli, możliwa jest teraz znaczna poprawa ilości żywotnych i funkcjonalnych włókien mięśniowych14,15,17,18,19. Jednym z takich ulepszeń warunków hodowli jest powlekanie szalek hodowlanych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej w celu promowania przylegania izolowanych włókien mięśniowych do szalki hodowlanej15,18,20. Zwykle stosuje się powłokę lamininy, ponieważ laminina jest jednym z najobficiej występujących pierwiastków w macierzy zewnątrzkomórkowej mięśni20,21. Optymalizacja procedury izolacji w połączeniu z powlekaniem szalek hodowlanych umożliwiła badaczom mięśni utrzymanie izolowanych żywotnych włókien mięśniowych z nienaruszoną architekturą komórkową i funkcjonalnością kurczliwości w hodowli przez krótki okres czasu1,15,18,22.
Najbardziej konwencjonalnym podejściem stosowanym w polu mięśniowym do pomiaru siły i zdolności skurczowych jest zamontowanie pojedynczych włókien mięśniowych pomiędzy długotrwałym silnikiem sterującym a przetwornikiem siły23,24. Ogólnie rzecz biorąc, włókna mięśniowe używane w tych konfiguracjach napędzanych silnikiem są wycinane z zamrożonej lub świeżej tkanki, a następnie następuje przepuszczalność lub "skórowanie", co pozwala na zewnętrzną aktywację wapnia, gdzie różne stężenia wapnia są używane do wywołania skurczu włókien mięśniowych24. Chociaż ta metoda jest złotym standardem w pomiarach kurczliwości włókien mięśniowych, tylko jedno włókno mięśniowe może być mierzone na raz, co sprawia, że technika ta jest pracochłonną i czasochłonną procedurą25. Co więcej, procedura izolacji i skórowania włókien mięśniowych zaburza różne struktury zaangażowane w sprzężenie wzbudzenie-skurcz (tj. uwalnianie wapnia i późniejszy wychwyt zwrotny do retikulum sarkoplazmatycznego), uniemożliwiając w ten sposób badanie kinetyki relaksacji i wszelkich chorób, które mogą wpływać na ten proces26,27. Alternatywą dla preparatu włókien ze skórą jest zastosowanie mechanicznej preparacji w celu wyizolowania nienaruszonych włókien mięśniowych, gdzie siły skurczu mogą być mierzone w odpowiedzi na aktywację elektryczną28; Jednak takie podejście jest technicznie trudne i bardzo czasochłonne, co skutkuje pomiarami o niskiej przepustowości. Wreszcie, zarówno w preparatach bez skóry, jak i nienaruszonych, komórki mięśniowe są całkowicie usuwane ze środowiska zewnątrzkomórkowego podczas pomiarów kurczliwości24, co uniemożliwia badanie wpływu składu/sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na skurcz włókien mięśniowych24. W związku z tym konieczne jest opracowanie alternatywnych metod, aby umożliwić pomiary kurczliwości włókien mięśniowych izolowanych nienaruszonych włókien mięśniowych w sposób wysokoprzepustowy, przy jednoczesnym odtworzeniu połączenia między włóknami mięśniowymi a macierzą zewnątrzkomórkową.
Niedawno opracowano nowe podejście oparte na optyce do wysokoprzepustowych pomiarów kurczliwości włókien mięśniowych29. Ten oparty na optyce system mierzy okresowość sarkomerów w celu oceny długości sarkomeru podczas skurczu za pomocą szybkiego obrazowania. W tym systemie komórki pozostają na miejscu w naczyniu hodowlanym, podczas gdy optyka jest poruszana, minimalizując w ten sposób czas potrzebny między pomiarami wielu komórek29. Główną zaletą stosowania tego wysokoprzepustowego podejścia opartego na optyce jest to, że pozwala ono na opracowanie warunków hodowli podobnych do tych panujących w tkance natywnej. Podejściem stosowanym do naśladowania natywnych warunków in vivo jest osadzanie komórek w hydrożelach30. Zazwyczaj hydrożel jest materiałem lepkosprężystym, który jest w stanie zachować swoją objętość i kształt, a hydrożele mają właściwości zarówno materiałów stałych, jak i ciekłych31. Część stała składa się z połączonych ze sobą łańcuchów polimerowych, tworząc strukturę, która wygląda podobnie do net30,31. Właściwości materiałowe hydrożeli można dostroić tak, aby naśladowały osadzanie się matrycy mięśni30,31. W ten sposób połączenie wysokowydajnego systemu opartego na optyce z komórkami osadzonymi w hydrożelach otwiera nowe możliwości oceny wpływu składu macierzy zewnątrzkomórkowej i właściwości mechanicznych na funkcjonalność włókien mięśniowych.
Ogólnym celem tego artykułu jest: 1) opisanie metodologii enzymatycznej izolacji i hodowli ex vivo włókien mięśniowych w warunkach naśladujących środowisko tkanek natywnych oraz 2) ocena kurczliwości włókien mięśniowych przy użyciu podejścia wysokoprzepustowego. Opisujemy szczegółową metodologię łatwego izolowania dużej liczby pojedynczych włókien mięśniowych od mięśnia zginacza palca brevis (FDB) za pomocą trawienia enzymatycznego. Ponadto opisujemy technikę osadzania izolowanych włókien mięśniowych w hydrożelu na bazie fibryny w celu naśladowania natywnego środowiska mięśni i poprawy żywotności i kurczliwości włókien mięśniowych. Następnie przedstawiamy wysokoprzepustową metodę pomiaru żywych skurczów włókien mięśniowych in vitro przy użyciu tego niedawno opracowanego systemu. Dodatkową zaletą tej procedury osadzania jest unieruchomienie włókien podczas skurczu, co może poprawić stosunek sygnału do szumu w tych pomiarach. Ta metoda zatapiania żelu ma zastosowanie zarówno do procedur enkapsulacji pojedynczym polimerem, jak i kompozytowym żelem, ułatwiając ocenę wpływu składu macierzy zewnątrzkomórkowej na kurczliwość włókien mięśniowych.

<table><tbody><tr><td>Aprotynina firmy Bovine Lung</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAJ63039MC</td><td>100 mM roztwór podstawowy w PBS może być przechowywana w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Wysterylizuj roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington</td><td>77336</td><td>10% (w/v) roztwór podstawowy może być przechowywana w temperaturze -20 °C. Ważenie kolagenazy powinno odbywać się w komorze bezpieczeństwa, ponieważ wdychanie jest niebezpieczne.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen z osocza bydlęcego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-176-5054</td><td>20 mg/ml roztwór podstawowy w PBS można przechowywać w temperaturze -80 °C. Sterylizować roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1413201</td> 4 <td>mg/ml roztwór podstawowy przygotowuje się w MEM i przechowuje w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Gibco MEM Wysoka glukoza + pirogronian</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Thermo Fisher</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>CB-40230</td><td>4 mg/ml roztwór podstawowy przygotowuje się w MEM i przechowuje w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana surowicy 2 (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9388</td><td></td></tr><tr><td>Trombina, Osocze bydlęce</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAJ63383EXP</td><td>125 U/ml zapas w PBS można przechowywać w temperaturze -20 °C. Sterylizować roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.</td></tr><tr><td>Kwas traneksamowy</td><td>Thermo Scientific AC228042500</td><td></td><td>80 mM roztwór podstawowy w PBS może być przechowywany w temperaturze -20 °C. Wysterylizuj roztwór podstawowy za pomocą 0,22 &mikro; m filtr.</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowy stymulator elektryczny</td><td>IonOptix</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra cienkie nożyczki Bonn</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>MultiCell Cytocypher</td><td>IonOptix</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S3</td><td>IonOptix</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer</td><td>IonOptix</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 elastomer silikonowy, baza i Utwardzacz&nbsp;</td><td>Dow corning&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoSolver</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IonWizard IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

Hodowla komórkowa in vitro to potężne narzędzie do oceny procesów komórkowych i testowania strategii terapeutycznych. W przypadku mięśni szkieletowych najczęstsze podejścia obejmują albo różnicowanie miogennych komórek progenitorowych w niedojrzałe miotuby, albo krótkoterminową hodowlę ex vivo izolowanych pojedynczych włókien mięśniowych. Kluczową zaletą hodowli ex vivo w porównaniu z in vitro jest zachowanie złożonej architektury komórkowej i cech kurczliwości. W tym miejscu szczegółowo opisujemy eksperymentalny protokół izolacji nienaruszonych włókien mięśniowych zginacza palca brevis od myszy i ich późniejszej hodowli ex vivo. W tym protokole włókna mięśniowe są osadzone w hydrożelu macierzy macierzy na bazie fibryny i błony podstawnej, aby unieruchomić włókna i utrzymać ich funkcję skurczową. Następnie opisujemy metody oceny funkcji kurczliwości włókien mięśniowych za pomocą opartego na optyce, wysokoprzepustowego systemu kurczliwości. Osadzone włókna mięśniowe są stymulowane elektrycznie w celu wywołania skurczów, po czym ich właściwości funkcjonalne, takie jak skrócenie sarkomeru i prędkość skurczu, są oceniane za pomocą kwantyfikacji opartej na optyce. Sprzężenie hodowli włókien mięśniowych z tym systemem pozwala na wysokoprzepustowe badania wpływu środków farmakologicznych na funkcję skurczową oraz badania ex vivo genetycznych zaburzeń mięśni. Wreszcie, protokół ten można również dostosować do badania dynamicznych procesów komórkowych we włóknach mięśniowych za pomocą mikroskopii żywych komórek.

Zgodnie z tym protokołem, pojedyncze włókna mięśniowe FDB zostały wyizolowane i osadzone w hydrożelu. Przegląd procedury sekcji mięśnia przedstawiono na Rysunku 1. Mięsień FDB zostaje odsłonięty z nienaruszonymi ścięgnami i odcięty od powięzi. Zachowanie ścięgien mięśni jako punktów mocowania minimalizuje potencjalne uszkodzenia włókien mięśniowych podczas procedury izolacji. Nadmiar tkanki łącznej można usunąć, aby ograniczyć obecność zanieczyszczeń i wzrost wtórnych typów komórek. Po wycięciu i odpowiednim oczyszczeniu mięśnia, poddaje się go trawieniu enzymatycznemu przy użyciu kolagenazy, a pojedyncze włókna mięśniowe są uwalniane poprzez tryturację przed osadzeniem wyizolowanych komórek w hydrożelach. Izolacja włókien mięśni FDB pozwala na uzyskanie stosunkowo krótkich włókien mięśniowych, co ułatwia ich manipulację. Ze względu na swój rozmiar, włókna mięśniowe FDB mogą być bezpiecznie przenoszone pipetą bez ryzyka uszkodzeń spowodowanych splątaniem i są łatwo osadzane w hydrożelu. Ponieważ pojedyncze włókna mięśniowe nie przylegają dobrze do płytek hodowlanych, osadzenie ich w hydrożelu gwarantuje, że włókna pozostaną na miejscu podczas hodowli komórkowej i pomiarów skurczu. Ponadto dodanie macierzy błony podstawnej do żelu fibrynowego umożliwia interakcje między włóknami mięśniowymi a macierzą, naśladując naturalne środowisko in vivo. Wyizolowane pojedyncze włókna mięśniowe mogą być manipulowane i utrzymywane w hodowli przez kilka dni po izolacji. Na Rysunku 2 przedstawiono przykład wyizolowanych włókien FDB osadzonych w macierzy hydrożelowej. Zdrowe włókna mają widoczne sarkomery i są wyprostowane (niebieska strzałka), natomiast włókna zakrzywione są zazwyczaj uszkodzone lub nieżywe (żółta strzałka) i powinny zostać wykluczone z pomiarów. Włókna hiperkontrakcyjne pojawiają się w macierzy jako ciemne, zwinięte obiekty (czerwona strzałka). Jeśli procedura izolacji przebiegła pomyślnie, odsetek zdrowych włókien powinien wynosić ok. 75%. Większy odsetek włókien hiperkontrakcyjnych zazwyczaj wskazuje na uszkodzenia podczas procedury izolacji. Błona włókien mięśniowych może zostać uszkodzona albo wskutek nadmiernego trawienia mięśnia, albo w wyniku uszkodzeń włókien podczas tryturacji. Uszkodzenia podczas tryturacji występują głównie wtedy, gdy mięsień nie został wystarczająco strawiony i w związku z tym nie rozpada się łatwo.
Funkcjonalność i żywotność włókien oceniono poprzez pomiary skurczowe włókien mięśniowych przy użyciu optycznego, wysokoprzepustowego systemu pomiaru skurczów. System generuje kilka parametrów, takich jak długość sarkomeru, procentowe skrócenie sarkomeru, prędkość skurczu oraz prędkość rozkurczu. Dzięki zastosowaniu systemu pomiaru skurczów można zmierzyć skurcz sarkomerów dla poszczególnych włókien mięśniowych. Rysunek 3 przedstawia przykłady skurczów włókien mięśniowych zmierzonych za pomocą systemu pomiarowego. Z pojedynczego przejścia skurczowego uzyskuje się następujące parametry: długość sarkomeru w punkcie wyjściowym, czas trwania skurczu, długość sarkomeru przy maksymalnym skurczu oraz czas trwania rozkurczu (Rysunek 3A). Parametry te służą do obliczenia procentowego skrócenia sarkomeru oraz prędkości skurczu i rozkurczu. W razie potrzeby można również obliczyć średnie wartości prędkości na podstawie czasu trwania i wartości bezwzględnego skrócenia. Prawidłowy pomiar skurczu charakteryzuje się prostą linią bazową, po której następuje spadek do szczytu i powrót do linii bazowej (Rysunek 3A). Szum, brak ostrości sarkomerów lub aberracyjny ruch włókna mogą wpływać na przebieg pomiaru (Rysunek 3B,C); takie pomiary mogą zostać odrzucone ręcznie lub zostaną odrzucone przez program analityczny. W tym podejściu wyraźna wizualizacja sarkomerów jest kluczowa dla pomiaru skurczów; zatem wszystko, co ogranicza widoczność sarkomerów, może wprowadzać szum. Może to wystąpić, gdy podczas skurczu sarkomer przemieszcza się poza płaszczyznę ogniskowania. Z zestawu danych należy również wykluczyć pomiary, w których seria skurczów różni się prędkością lub głębokością.
Dane kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych uzyskane za pomocą tego systemu mogą być wykorzystane do porównania różnych warunków hodowli. Skuteczność systemu przedstawiono na Rysunku 4. W tym przypadku zmierzono skurcze włókien mięśnia FDB w formatach hodowli 2D (płytki hodowlane pokryte lamininą) oraz 3D (hydrożel fibrynowy). W hodowli 3D uzyskano wyższy odsetek użytecznych pomiarów, ponieważ osadzenie włókien w żelu zapobiegło wpływowi ruchów bocznych i innych artefaktów ruchowych na pomiar (Rysunek 4A). Osadzenie włókien nie miało istotnego wpływu ani na skrócenie sarkomerów, ani na wartości maksymalnej prędkości skurczu w porównaniu z włóknami hodowanymi w 2D (Rysunek 4B). Aby zilustrować, jak różne macierze wpływają na skurcz włókien mięśnia FDB, porównano ten hydrożel fibrynowy z czystą macierzą błony podstawnej (4 mg/mL) (Rysunek 4C). Obserwowana w czystej macierzy błony podstawnej zmniejszona kurczliwość wynikała prawdopodobnie ze sztywności żelu lub zwiększonych oddziaływań komórka-macierz. Przetestowano również stężenia fibryny do 7 mg/mL, które nie wywarły istotnego wpływu na prędkość skurczu i skrócenie (dane niepublikowane). Zastosowanie tego hydrożelu na bazie fibryny zapewnia minimalne zakłócenia parametrów kurczliwości.
<img alt="Metoda wyodrębniania ścięgna myszy; eksperyment krok po kroku; schemat sekcji; badania anatomiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd procedury sekcji mięśnia FDB. (A) Kończyna tylna jest przecinana powyżej kostki (czerwona przerywana linia), a (B) skóra jest usuwana poprzez nacięcie wzdłuż górnej części stopy wzdłuż niebieskiej przerywanej linii. (C) Stopa jest unieruchomiona szpilkami przez kostkę oraz skórę w obrębie palców. (D) Widok mikroskopowy odsłoniętego mięśnia i otaczającej go tkanki łącznej. Powięź jest widoczna jako biała nieprzezroczysta warstwa, przez którą przebiega układ naczyniowy. (E) Powięź jest usuwana z mięśnia, a ścięgno jest przecinane wzdłuż czerwonej przerywanej linii. (F) Mięsień FDB jest oddzielany od tkanki podkładowej poprzez podnoszenie i przecinanie pod mięśniem oraz wzdłuż niego. (G) Gdy ścięgna palców są wyraźnie widoczne, mięsień FDB jest uwalniany poprzez przecięcie wzdłuż czerwonej przerywanej linii. (H) Mięsień FDB jest zabezpieczony przez ścięgna; czwarte ścięgno boczne i jego włókna mogą zostać usunięte poprzez przecięcie wzdłuż czerwonej przerywanej linii. Nadmiar powięzi można teraz odciąć. (I) Po oczyszczeniu mięsień FDB jest przenoszony do roztworu kolagenazy. Paski skali = (D-I) 2 mm. Skrót: FDB = flexor digitorum brevis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza włókien mięśniowych, obraz mikroskopowy; oznaczone włókna zdrowe, skręcone i hiperkurczliwe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obraz mikroskopowy włókien mięśnia FDB zatopionych w hydrożelu po 24 h hodowli. Niebieska strzałka: Przykład żywego włókna mięśnia FDB. Żółta strzałka: Przykład skręconego włókna mięśnia FDB. Skręcone włókna mięśniowe mogą wykazywać obniżoną żywotność i upośledzone skurcze, dlatego powinny być wykluczone z pomiarów. Czerwona strzałka: Przykład hiperkurczliwego włókna mięśnia FDB. Nadmierna hiperkurczliwość występuje, gdy trituracja jest przeprowadzana zbyt intensywnie, lub może być spowodowana nadmiernym trawieniem kolagenazą bądź użyciem nieuzrównoważonego medium hodowlanego. Pasek skali = 100 µm. Skrót: FDB = flexor digitorum brevis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza elektrofizjologiczna, transienty absorpcji w aktywności neuronów, trzy wykresy porównawcze, dane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykład transientów skurczu włókna zmierzonych przy użyciu wysokoprzepustowego systemu skurczowego opartego na optyce. (A) Przykład normalnego transientu skurczu. Transient ten uzyskano z sarkomerów zamkniętych w fioletowym kwadracie pokazanym na dolnym pasku narzędzi. Transient składa się z następujących komponentów: długości sarkomeru w linii bazowej (zielony), czasu trwania skurczu (niebieski), długości sarkomeru przy maksymalnym skurczu (fioletowy) oraz czasu trwania rozkurczu (czerwony). Parametry takie jak prędkość i procent skurczu są obliczane na podstawie tych wartości. (B) Przykład nieprawidłowego transientu skurczu. Pomiary te występują, gdy sygnał sarkomeru nie jest rejestrowany z powodu szumu (patrz czerwone strzałki). (C) Przykład transientu skurczu z artefaktem ruchowym (patrz zielone strzałki). Artefakty ruchowe występują, gdy włókno mięśniowe przemieszcza się poza obszar ostrości podczas skurczu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wskaźniki odrzucenia i prędkość skurczu w 2D vs. 3D; skrócenie sarkomerów w Matrigel/fibrynie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne dane uzyskane przy użyciu optycznego wysokoprzepustowego systemu skurczowego podczas porównywania warunków 2D i 3D oraz różnych hydrożeli. (A) Procent zaakceptowanych i odrzuconych pomiarów skurczu znalezionych przez program analizy danych w hodowli 2D i hodowli 3D na podstawie 30 pomiarów. (B) Porównanie maksymalnej prędkości skurczu włókien mięśniowych hodowanych w 2D i 3D, izolowanych od trzech myszy po 24 h hodowli. (C) Porównanie skrócenia sarkomerów we włóknach mięśniowych hodowanych w 2D i 3D, izolowanych od trzech myszy po 24 h hodowli. (D) Porównanie maksymalnej prędkości skurczu włókien mięśniowych osadzonych w czystej macierzy błony podstawnej (Matrigel) oraz w hydrożelu fibrynowym, izolowanych od trzech myszy po 24 h hodowli. (E) Porównanie skrócenia sarkomerów we włóknach mięśniowych osadzonych w czystej macierzy błony podstawnej (Matrigel) oraz w hydrożelu fibrynowym, izolowanych od trzech myszy po 24 h hodowli. Dane przeanalizowano za pomocą testu t Studenta i przedstawiono jako średnia ± SD. Każdy punkt danych reprezentuje jedno włókno mięśniowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Skład medium do sekcji stosowanego do preparowania mięśnia, medium hodowlanego z fibryną używanego do hodowli wyizolowanych włókien mięśniowych oraz medium do trawienia mięśni stosowanego do enzymatycznego trawienia wyizolowanych mięśni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103_JoVE%20Table%201.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Skład mieszaniny komórkowej wykorzystywanej do odlewania hydrożeli oraz skład mieszaniny macierzy wykorzystywanej do odlewania hydrożeli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103_JoVE%20Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Funkcja mięśni szkieletowych może być oceniana poprzez ilościowe określenie kurczliwości izolowanych włókien mięśniowych, tradycyjnie przy użyciu pracochłonnych, niskoprzepustowych metod. W tym miejscu opisujemy opartą na optyce, wysokoprzepustową metodę ilościowego określania kurczliwości włókien mięśniowych osadzonych w hydrożelu. Podejście to ma zastosowanie w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu terapii.

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Protokół ten można wykorzystać do oceny wpływu mutacji genetycznych na funkcję włókien mięśniowych. Ponadto może być stosowany do badań przesiewowych leków mających na celu poprawę zdrowia mięśni. Technika ta może być stosowana do izolowania i mierzenia kurczliwości dużej liczby włókien mięśniowych w stosunkowo krótkim czasie bez konieczności zaawansowanego treningu.Skład hydrożeli może być zmieniany, aby potwierdzić wpływ sygnałów środowiskowych zarówno na zdrowe, jak i chore mięśnie. Najtrudniejszą częścią zabiegu jest wstępne rozwarstwienie mięśnia. Jeśli nie zostanie zachowana wystarczająca ostrożność, uszkodzenie mięśni może prowadzić do zmniejszenia żywotności włókien mięśniowych.Procedurę zademonstrują Leander Vonk, technik badawczy, i Osman Esen, doktorant w moim laboratorium. Zacznij od przecięcia dolnej tylnej nogi uświęconej myszy tuż nad kostką. Wykonaj nacięcie na skórze po grzbietowej stronie stopy w kierunku palców stóp.Ostrożnie peeluj skórę w kierunku palców u stóp, uważając, aby nie uszkodzić mięśnia. Umieść wypreparowaną stopę w naczyniu uszczelniającym zawierającym 10 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża preparacyjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przypnij stopę przez skórę nadal przyczepioną do palców.Przypnij dolną część nogi poza kostkę i ostrożnie wytnij tkankę łączną na górze mięśnia. Przetnij ścięgno na pięcie i unieś mięsień. Przetnij wzdłuż i pod mięśniem przez tkankę łączną, aż ścięgna palców zostaną odsłonięte.Przetnij ścięgna, gdy odsłonięta jest połowa długości trzech ścięgien. Uwolnij mięsień ze stopy i przypnij ścięgna mięśni FDB. Usuń pozostałą tkankę łączną z mięśnia.Przenieś czystą tkankę mięśniową do probówki zawierającej wstępnie podgrzane podłoże preparacyjne. Za pomocą pipety serologicznej przenieść mięsień brevis do probówki zawierającej pożywkę do trawienia mięśniowego. Umieść tkankę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla na 80 minut.Przenieś mięsień do 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry pożywki preparującej. Korzystając z przygotowanych końcówek do rozcierania, odpipetuj mięsień od największego do najmniejszego i kontynuuj rozcieranie, aż włókna mięśniowe odpadną od ścięgna. Ścięgna można usunąć za pomocą końcówki P200.Przenieś zdysocjowane włókna mięśniowe do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki preparyjnej. Pozwól włóknom osiąść w inkubatorze przez 20 minut, aż utworzy się osad. Ostrożnie odpipetować całe medium od góry granulki włókna.Na lodzie ponownie zawieś komórki w 875 mikrolitrach mieszanki komórkowej na mięsień. Dodać 125 mikrolitrów mieszanki komórek matrycowych do probówek zawierających 125 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórkowej. Mieszać delikatnie pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków.Ostateczną mieszankę natychmiast przenieś do studzienki. Sprawdź żywotność włókien mięśniowych pod mikroskopem. Umieść żele w inkubatorze na 30 do 45 minut, aby ułatwić zestalenie.Po zakończeniu ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Włącz system pomiaru skurczu oparty na optyce, lampę fluorescencyjną, stymulator ogniw elektrycznych i komputer. Ustaw stymulator elektryczny na 1,0 Hz przy 10 woltach i czasie trwania impulsu wynoszącym pięć milisekund, aby stymulować izolowane włókna mięśniowe.Włóż płytkę do układu pomiarowego. Podłącz stymulator do wkładu i włóż go do płytki hodowlanej. Otwórz program IonWizard.Kliknij przycisk OK. Otwórz nowy plik, klikając ikonę Plik, a następnie kliknij Nowy. Wybierz opcję Zbierz eksperyment, aby sprawdzić, czy program znajduje się na właściwym eksperymentalnym sarkomerze szkieletowym. Aby zmienić eksperyment, kliknij żądany eksperyment, a następnie naciśnij Dodaj.Zastosuj ustawienia SARC 20X, linie średnie, pojedynczy FFT, częstotliwość próbkowania 250 Hz i czas akwizycji 10 sekund. Zmień temperaturę systemu pomiarowego na 25 stopni Celsjusza. Kliknij wyszukiwarkę otwartych komórek, aby utworzyć nowe wyskakujące okienko ekranu.Wybierz Typ płyty i Aktywne studnie. Ustaw ostrość włókien, regulując suwak ostrości. Włącz stymulację, aby wywołać stymulację elektryczną i obserwuj drganie włókien.Utrzymując ostrość sarkomerów, upewnij się, że obszar pomiaru jest zamocowany na końcu włókna, tak aby sarkomery biegły pionowo. Gdy sarkomery są skupione, na pasku narzędzi widoczny jest pojedynczy pik, który po skurczeniu przesunie się w prawo. Zmierz włókna w układzie pomiarowym.Kliknij Rozpocznij, aby rozpocząć eksperyment. Naciśnij Q, aby rozpocząć pomiar 10 stanów przejściowych skurczu. Jeśli więcej niż cztery stany nieustalone wyglądają na wolne od szumów, zaakceptuj pomiar, naciskając Z.Jeśli stany nieustalone zawierają zbyt dużo szumu, odrzuć pomiary. Naciśnij przycisk Stop, aby zamknąć okno wyszukiwarki komórek po zakończeniu eksperymentu. Zapisz plik i utwórz nowy plik.Otwórz program CytoSolver na pulpicie, a następnie kliknij Importuj i wybierz pliki do analizy. Po zakończeniu analizy zidentyfikuj niebieskie, czerwone i szare szczyty. Kliknij Eksportuj.Zaznacz pola zatytułowane Dane uśrednione do przejściowych i wyeksportuj je do programu Excel. Wyższy odsetek użytecznych pomiarów mięśni kurczliwych uzyskano w hydrożelu 3D fibryny, ponieważ zapobiegał on ruchom bocznym i innym czynnikom wpływającym. Osadzanie włókien nie miało istotnego wpływu na maksymalną prędkość skurczu ani skrócenie sarkomeru.Zaobserwowano zmniejszone skurcze w czystej macierzy podstawnej, prawdopodobnie z powodu sztywności żelu lub zwiększonej interakcji z macierzą komórkową. Podobnie, osadzanie macierzy podstawowej również zmniejszało skracanie sarkomeru w porównaniu z hydrożelem fibryny. Ważne jest, aby pamiętać, że izolowane włókna mięśniowe są dość delikatne i należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić ich podczas pipetowania.Po procedurze izolacji można również wykonać takie metody, jak barwienie immunologiczne, izolacja białek i RNA. Rozwój tej techniki otworzył nowe możliwości badania funkcji dojrzałych włókien mięśniowych w sposób wysokoprzepustowy.

high-throughput-contractile-measurements-hydrogel-embedded-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Poznaj metodę wysokoprzepustowego pomiaru kurczliwości włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu optycznego. Technika ta umożliwia badanie mutacji genetycznych i testowanie leków poprawiających zdrowie mięśni.

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

Przeglądaj więcej filmów