Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

Funkcja mięśni szkieletowych może być oceniana poprzez ilościowe określenie kurczliwości izolowanych włókien mięśniowych, tradycyjnie przy użyciu pracochłonnych, niskoprzepustowych metod. W tym miejscu opisujemy opartą na optyce, wysokoprzepustową metodę ilościowego określania kurczliwości włókien mięśniowych osadzonych w hydrożelu. Podejście to ma zastosowanie w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu terapii.

Protokół ten można wykorzystać do oceny wpływu mutacji genetycznych na funkcję włókien mięśniowych. Ponadto może być stosowany do badań przesiewowych leków mających na celu poprawę zdrowia mięśni. Technika ta może być stosowana do izolowania i mierzenia kurczliwości dużej liczby włókien mięśniowych w stosunkowo krótkim czasie bez konieczności zaawansowanego treningu.

Skład hydrożeli może być zmieniany, aby potwierdzić wpływ sygnałów środowiskowych zarówno na zdrowe, jak i chore mięśnie. Najtrudniejszą częścią zabiegu jest wstępne rozwarstwienie mięśnia. Jeśli nie zostanie zachowana wystarczająca ostrożność, uszkodzenie mięśni może prowadzić do zmniejszenia żywotności włókien mięśniowych.

Procedurę zademonstrują Leander Vonk, technik badawczy, i Osman Esen, doktorant w moim laboratorium. Zacznij od przecięcia dolnej tylnej nogi uświęconej myszy tuż nad kostką. Wykonaj nacięcie na skórze po grzbietowej stronie stopy w kierunku palców stóp.

Ostrożnie peeluj skórę w kierunku palców u stóp, uważając, aby nie uszkodzić mięśnia. Umieść wypreparowaną stopę w naczyniu uszczelniającym zawierającym 10 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża preparacyjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przypnij stopę przez skórę nadal przyczepioną do palców.

Przypnij dolną część nogi poza kostkę i ostrożnie wytnij tkankę łączną na górze mięśnia. Przetnij ścięgno na pięcie i unieś mięsień. Przetnij wzdłuż i pod mięśniem przez tkankę łączną, aż ścięgna palców zostaną odsłonięte.

Przetnij ścięgna, gdy odsłonięta jest połowa długości trzech ścięgien. Uwolnij mięsień ze stopy i przypnij ścięgna mięśni FDB. Usuń pozostałą tkankę łączną z mięśnia.

Przenieś czystą tkankę mięśniową do probówki zawierającej wstępnie podgrzane podłoże preparacyjne. Za pomocą pipety serologicznej przenieść mięsień brevis do probówki zawierającej pożywkę do trawienia mięśniowego. Umieść tkankę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla na 80 minut.

Przenieś mięsień do 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry pożywki preparującej. Korzystając z przygotowanych końcówek do rozcierania, odpipetuj mięsień od największego do najmniejszego i kontynuuj rozcieranie, aż włókna mięśniowe odpadną od ścięgna. Ścięgna można usunąć za pomocą końcówki P200.

Przenieś zdysocjowane włókna mięśniowe do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki preparyjnej. Pozwól włóknom osiąść w inkubatorze przez 20 minut, aż utworzy się osad. Ostrożnie odpipetować całe medium od góry granulki włókna.

Na lodzie ponownie zawieś komórki w 875 mikrolitrach mieszanki komórkowej na mięsień. Dodać 125 mikrolitrów mieszanki komórek matrycowych do probówek zawierających 125 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórkowej. Mieszać delikatnie pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków.

Ostateczną mieszankę natychmiast przenieś do studzienki. Sprawdź żywotność włókien mięśniowych pod mikroskopem. Umieść żele w inkubatorze na 30 do 45 minut, aby ułatwić zestalenie.

Po zakończeniu ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Włącz system pomiaru skurczu oparty na optyce, lampę fluorescencyjną, stymulator ogniw elektrycznych i komputer. Ustaw stymulator elektryczny na 1,0 Hz przy 10 woltach i czasie trwania impulsu wynoszącym pięć milisekund, aby stymulować izolowane włókna mięśniowe.

Włóż płytkę do układu pomiarowego. Podłącz stymulator do wkładu i włóż go do płytki hodowlanej. Otwórz program IonWizard.

Kliknij przycisk OK. Otwórz nowy plik, klikając ikonę Plik, a następnie kliknij Nowy. Wybierz opcję Zbierz eksperyment, aby sprawdzić, czy program znajduje się na właściwym eksperymentalnym sarkomerze szkieletowym. Aby zmienić eksperyment, kliknij żądany eksperyment, a następnie naciśnij Dodaj.

Zastosuj ustawienia SARC 20X, linie średnie, pojedynczy FFT, częstotliwość próbkowania 250 Hz i czas akwizycji 10 sekund. Zmień temperaturę systemu pomiarowego na 25 stopni Celsjusza. Kliknij wyszukiwarkę otwartych komórek, aby utworzyć nowe wyskakujące okienko ekranu.

Wybierz Typ płyty i Aktywne studnie. Ustaw ostrość włókien, regulując suwak ostrości. Włącz stymulację, aby wywołać stymulację elektryczną i obserwuj drganie włókien.

Utrzymując ostrość sarkomerów, upewnij się, że obszar pomiaru jest zamocowany na końcu włókna, tak aby sarkomery biegły pionowo. Gdy sarkomery są skupione, na pasku narzędzi widoczny jest pojedynczy pik, który po skurczeniu przesunie się w prawo. Zmierz włókna w układzie pomiarowym.

Kliknij Rozpocznij, aby rozpocząć eksperyment. Naciśnij Q, aby rozpocząć pomiar 10 stanów przejściowych skurczu. Jeśli więcej niż cztery stany nieustalone wyglądają na wolne od szumów, zaakceptuj pomiar, naciskając Z.

Jeśli stany nieustalone zawierają zbyt dużo szumu, odrzuć pomiary. Naciśnij przycisk Stop, aby zamknąć okno wyszukiwarki komórek po zakończeniu eksperymentu. Zapisz plik i utwórz nowy plik.

Otwórz program CytoSolver na pulpicie, a następnie kliknij Importuj i wybierz pliki do analizy. Po zakończeniu analizy zidentyfikuj niebieskie, czerwone i szare szczyty. Kliknij Eksportuj.

Zaznacz pola zatytułowane Dane uśrednione do przejściowych i wyeksportuj je do programu Excel. Wyższy odsetek użytecznych pomiarów mięśni kurczliwych uzyskano w hydrożelu 3D fibryny, ponieważ zapobiegał on ruchom bocznym i innym czynnikom wpływającym. Osadzanie włókien nie miało istotnego wpływu na maksymalną prędkość skurczu ani skrócenie sarkomeru.

Zaobserwowano zmniejszone skurcze w czystej macierzy podstawnej, prawdopodobnie z powodu sztywności żelu lub zwiększonej interakcji z macierzą komórkową. Podobnie, osadzanie macierzy podstawowej również zmniejszało skracanie sarkomeru w porównaniu z hydrożelem fibryny. Ważne jest, aby pamiętać, że izolowane włókna mięśniowe są dość delikatne i należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić ich podczas pipetowania.

Po procedurze izolacji można również wykonać takie metody, jak barwienie immunologiczne, izolacja białek i RNA. Rozwój tej techniki otworzył nowe możliwości badania funkcji dojrzałych włókien mięśniowych w sposób wysokoprzepustowy.