Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Siły mechaniczne generowane przez komórki są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania różnych narządów w całym ciele. Do tego jelita, pęcherz moczowy, serce i inne. Narządy te muszą generować stabilne wzorce skurczu i relaksacji komórek, aby utrzymać wewnętrzny stan hemostatyczny.

Nieprawidłowy skurcz komórek mięśni gładkich może prowadzić do wystąpienia różnych zaburzeń, w tym dysmotoryki jelit charakteryzującej nieprawidłowe wzorce jelit ze skurczem mięśni, a także stany takie jak nadaktywny lub niedoaktywny pęcherz. A w drogach oddechowych niektóre komórki mięśniowe, które kurczą się nieregularnymi wzorcami, mogą wywoływać nadreaktywność astmatyków. Oczywiste jest, że mechanizmy skurczowe w komórkach i tkankach mogą prowadzić do chorób, które wymagają opcji leczenia.

A ponieważ te warunki mogą bezpośrednio wynikać z dysfunkcyjnych zachowań skurczowych komórek, staje się zarówno logiczne, jak i konieczne, aby zmierzyć samą funkcję kurczliwości komórek podczas badań przesiewowych potencjalnych kandydatów na leki. Podążając za najnowszymi osiągnięciami w dziedzinie mikrotechnologii, opracowaliśmy przyjazny dla użytkownika test oparty na mikropłytkach, który umożliwia ilościowe pomiary skurczu pojedynczych komórek. W setkach tysięcy komórek zwanych elastycznymi, znanych również jako fluorescencyjnie znakowane elastomerowe powierzchnie kurczliwe się.

W tym podejściu osadzamy fluorescencyjne mikrowzory białek, a więc miękkie filmy, które odkształcają się i kurczą, gdy komórki przykładają do nich siły ciągnące. Co ważne, mikrowzorce białek ograniczają położenie, kształt i obszar rozprzestrzeniania się komórek. Jednolite warunki testowe i pozwalają na proste pomiary oparte tylko na ich zmianach wymiarów.

Ogólnie rzecz biorąc, platforma, która zawiera moduł analizy obrazu oparty na przeglądarce, umożliwia prostą analizę kurczalnej siły komórek bez konieczności stosowania delikatnych procedur obsługi lub rejestracji markerów powierniczych i może być obsługiwana przez każdego badacza posiadającego podstawowe hodowle komórkowe i prosty mikroskop fluorescencyjny o małym powiększeniu. Technologia ta została zaprojektowana z myślą o użytkowniku końcowym i ma na celu zmniejszenie bariery wejścia dla każdego naukowca laboratoryjnego do badania biologii sił komórkowych Zacznij od dodania 20 mililitrów pożywki do probówki przewlekłej, uzyskaj 24-dołkową płytkę przeznaczoną do oznaczania kurczliwości komórek. Ustaw pipetę na 500 mikrolitrów i uzyskaj sitko do komórek dla patogenu komórkowego.

Zdejmij pokrywkę z płytki 24-dołkowej, przytrzymaj płytkę w ten sposób, a następnie przystąp do delikatnego zdejmowania warstwy plastiku z wierzchu płytki. Ostrożnie odłóż płytkę z powrotem. Odessać tylko górną warstwę PBS z każdej studzienki, aby zapobiec rozlaniu.

Teraz, jeden rząd na raz, usuń pozostały PBS ze studzienki i szybko napełnij 500 mikrolitrami pożywki komórkowej. Delikatnie potrząśnij płytką i postukaj w bok, aby upewnić się, że całe dno studzienki jest pokryte roztworem. Gdy wszystkie studzienki zostaną napełnione pożywką, odłóż płytkę na bok.

W tym momencie pobierz kulturę komórkową z inkubatora. Będziemy przeprowadzać solidny protokół stowarzyszeniowy. Celem tego protokołu jest stworzenie zawiesiny 50 000 komórek na mililitr.

Przed wysianiem komórek upewnij się, że przecedziłeś je raz przez sitko, aby rozbić kępy komórek na pojedyncze komórki, ostrożnie umieść 500 mikrolitrów roztworu komórkowego w każdym dołku. Po wysianiu komórek ważne jest, aby pozostawić płytki na godzinę, aby komórki mogły osiąść bezpośrednio na wzorach. Po upływie godziny umieść na noc płytkę w inkubatorze.

Druga część eksperymentu polega na dodaniu leków do 24-dołkowej płytki i obrazowaniu fluorescencyjnym płytki. W przypadku tej części protokołu mamy dwa ważne wymagania, aby zapewnić solidną żywotność i odpowiedź komórki. Pierwszym z nich jest to, że końcowe stężenie DMSO w studzienkach z komórką wynosi nie więcej niż 1%, co oznacza, że musimy wykonać 100 pełne rozcieńczenie z naszych zapasów leków.

Po drugie, nie możemy dodać DMSO tak bezpośrednio do studzienek, ponieważ rozbije się on o dno tego mieszania, a następnie uszkodzi komórki o wysokim stężeniu. Zamiast tego musimy stworzyć pośredni roztwór leku DMS0 i pożywki, które możemy dokładnie wymieszać ze sobą, aby uniknąć wysokiej lokalnej ekspozycji DSSO na komórki. W tym protokole będziemy wykonywać sześciostopniowe ośmiokrotne rozcieńczanie, które obejmuje zakres od 40 mikromolów do jednego nanomolowca Utwórz sześcioetapową ośmiokrotną serię rozcieńczeń, przenosząc 30 mikrolitrów podstawowego roztworu leku do kolejnych 210 mikrolitrowych objętości DMSO i dokładnie mieszając między każdym etapem przenoszenia W naszym eksperymencie, Będziemy oceniać działanie blebbistatyny.

na pęcherze ludzkie przez komórki mięśniowe. Aby spełnić oba wymagania, najpierw stworzymy pośrednie rozwiązanie DMSO i pożywki dla leków. Daje to 16,7-krotne rozcieńczenie DMSO.

Następnie dodamy ten pośredni roztwór leku do naszych komórek, stosując proporcje dające dodatkowe sześciokrotne rozcieńczenie, co daje w sumie 100 pełnych rozcieńczeń i końcowe stężenie 1% DMSO Aby to osiągnąć, dla każdego podstawowego roztworu leku wymieszaj 30 mikrolitrów leku z 470 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych, a następnie przenieś 200 mikrolitrów tego roztworu pośredniego do odpowiedniego dołka na 24-dołkowej płytce, który zawiera 1000 mikrolitrów w każdej studzience. Daje to łącznie 1% końcowe stężenie inkubacji DMSO przez odpowiedni okres czasu. W naszym eksperymencie inkubujemy przez 30 minut, kiedy jesteś gotowy do obrazu, dodaj żywą plamę jądrową na całe swoje studnie, dodaj jeden do 10 000 rozcieńczeń z bulionu.

Pozostaw do inkubacji przez dodatkowe 15 minut. Kiedy będziesz gotowy do obrazowania, będziesz potrzebować mikroskopu fluorescencyjnego, który jest wyposażony w obrazowanie kanałów fluorescencyjnych zarówno dla znakowanych jąder komórkowych, jak i barwnika fluorescencyjnego. Oznaczone są mikrowzory, które w naszym przykładzie obejmują kanał tri C.

Teraz będziemy obrazować fluorescencyjnie jądra blabistatyny w celu identyfikacji pojedynczych komórek, pamiętaj, aby zobrazować jądra komórek barwiących dokładnie w tej samej pozycji, w której oglądasz mikrowzór, aby można je było wyrównać podczas analizy. Prześlij pozyskane obrazy do komputera, upewnij się, że obrazy są prawidłowo oznaczone, tak aby kanały wzorca kończyły się podkreśleniem PT. A obrazy w kanale jądrowym kończą się podkreśleniem dapi. Teraz będziemy konwertować obrazy tif na obrazy PNG, używając obrazu J Po otwarciu obrazu J ładuj jeden kanał na raz.

Najpierw załadujemy kanał wzorca i dostosujemy kontrast, aby zmaksymalizować sygnał i zminimalizować tło. Ponadto będziemy wygładzać obraz. Gdy obraz zostanie zmodyfikowany zgodnie z naszymi upodobaniami, zmienimy typ obrazu na ośmiobitowy.

Następnie wyeksportuj obraz jako typ PNG. Następnie zaznacz pole, użyj etykiet plasterków jako nazw plików. Utwórz nowy folder o nazwie PNG.

Następnie zapisz tam pliki PNG, Aby przeanalizować obrazy, przejdź do Biodock dot AI, utwórz konto i skontaktuj się z autorami, aby uzyskać bezpłatny dostęp do modułu analizy. Zaloguj się po utworzeniu konta. Tutaj będziesz mógł przesyłać nowe obrazy.

Nazwiemy tę nową partię danych eksperymentu internetowego JoVE. Teraz możemy zaimportować obrazy, przeciągając je, a następnie upuszczając, naciśnij OK.At tym momencie wybierz swoje dane. Następnie kliknij analizuj, przewiń w dół do modułu oznaczonego jako analiza kurczliwości, a następnie naciśnij wybierz.

Ustaw powiększenie na tę samą wartość, której użyłeś do obrazowania Po uzupełnieniu danych kliknij na nie, a następnie możemy wybrać opcję Pobierz dane. Po pobraniu danych możemy zobaczyć nałożone pary obrazów dla każdego wprowadzonego obrazu. Mamy również dostęp do statystyki podsumowującej, która da nam średni skurcz dla każdego zestawu komórek.

Jednostką miary skurczu są piksele. Patrząc na dane, widzimy tutaj, że w studzienkach traktowanych tylko DMSO nastąpił znacznie większy skurcz komórek w porównaniu z komórkami, które były traktowane bróbstatyną. Mamy również dostęp do danych dla każdego pojedynczego wzorca, który został wykryty na którymkolwiek z obrazów.

Daje nam to szczegółowe informacje dotyczące lokalizacji obrazu, pochodzenia obrazu, typu pozycji, liczby komórek, zera jeden lub więcej niż jednego, rozmiaru mikrowzoru i obliczonego skurczu komórek. Ten układ składa się z każdego zidentyfikowanego wzoru na mikropłytce. Wzorce pojedynczych komórek z tej listy były uśrednione w celu obliczenia średniego skurczu obrazu PNG w drugim pliku.

Dane z pojedynczej komórki można sortować i analizować zgodnie z potrzebami eksperymentu. W tej części filmu będziemy wyświetlać reprezentatywne dane, które można zebrać z 24-dołkowej płytki, pokazujące dane dotyczące odpowiedzi komórek mięśni gładkich pęcherza moczowego leczonych dwoma różnymi lekami. Są to obrazy studzienek poddanych działaniu odpowiednio DMSO i blebbistatyny.

Tutaj widzimy, że komórki leczone tylko DMSO wykazują dużą liczbę mikrowzorców skurczowych, ale komórki leczone blebbistatyną były większe i otwarte na zauważenie, że jest mniejszy skurcz. Dane na tym histogramie pokazują zmienność kurczliwości komórek w wyniku różnych zabiegów na komórki. Centrum dystrybucji dla komórek leczonych blebbistatyną jest niższe niż centrum dystrybucji dla komórek, które były leczone DMSO.

Jest to zgodne z informacjami wyświetlanymi na poprzednich obrazach. Ponieważ komórki, które były traktowane blebbistatyną, wykazywały znacznie mniejszy skurcz. Oznacza to, że leczenie blebbistatyną znacznie rozluźnia komórki.

Każdy z tych zestawów danych przyczynia się do punktu na krzywej odpowiedzi na dawkę, który można zebrać z pojedynczej płytki 24-dołkowej, zgodnie z protokołami pokazanymi na filmie. Tutaj widzimy, że cytochalazyna D jest silniejsza niż blebbistan, o czym świadczą niższe wartości skurczu, biorąc pod uwagę wyższe stężenia leku. Jeśli chcesz znacznie skalować swoje eksperymenty, dostępna jest wersja z płytką 384-dołkową, którą można wykorzystać z automatyzacją do radykalnego skalowania eksperymentów.

Dane te można zebrać z płytki 384-dołkowej, zamiast sześciu etapów rozcieńczania dla każdego leku na płytce 24-dołkowej, płytka 384-dołkowa pozwala nam przeprowadzić 20 etapów rozcieńczania dla każdego leku z wieloma powtórzeniami. Technologia płatków śniegu jest wyjątkowa. Pozwala na wizualizację skurczu pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii, co do tej pory było niemożliwe.

Tak więc technologia opiera się na formie metryk, która jest wzorowana na białku znakowanym fluorescencyjnie. Systematyczny wzorzec ma się uformować dla skurczu komórkowego i pozwala na precyzyjny pomiar modulacji kontraktu fenotypu przez dowolny lek. Oczywiście, technologia ta jest nadal aktywnie rozwijana pod kątem zastosowań i wielu różnych obszarów chorobowych, takich jak astma, choroby sercowo-naczyniowe, stany zapalne, onkologia immunologiczna i oczywiście wszelkie nasze wskazania chorobowe, w których nieprawidłowy skurcz komórek odgrywa kluczową rolę w postępie choroby.

Jak pokazujemy, ta oparta na mikrowzorcach technologia pomiaru kurczliwości komórek stanowi uproszczoną alternatywę dla tradycyjnej mikroskopii sił trakcyjnych, zapewniając intuicyjną analizę, obserwowanie kurczenia się wzoru i zapewniając rozdzielczość pojedynczych komórek w dużych populacjach komórek. Biorąc pod uwagę pewne kwestie, metoda ta może stanowić wyzwanie przy użyciu komórek, które są albo zbyt małe, takie jak limfocyty T i neutrofile, albo typów komórek, które nie przylegają. Ponadto komórki, które co tydzień wiążą się, wiążą ze sobą głównie lub nie rozprzestrzeniają się całkowicie, nie będą wytwarzać mierzalnych sygnałów skurczowych.

Użytkownicy tej technologii muszą dokładnie ocenić różne możliwe formuły pożywek do hodowli komórkowych dla danego typu komórek, ponieważ różne składniki, czynniki wzrostu, poziomy w surowicy i wrażliwość pH mogą wpływać na różne zachowania. Optymalizacja protokołów powinna przebiegać wraz ze skalowaniem wszelkich eksperymentalnych przepływów pracy.

Ostatecznie, jeśli rozdzielczość pojedynczej komórki nie jest konieczna lub jeśli docelowy typ komórki ma minimalną zdolność rozprzestrzeniania się, wówczas do takich eksperymentów można zastosować tradycyjne metody mikroskopii sił przyciągania. W przeciwnym razie mamy nadzieję, że to narzędzie zapewni biologom komórkowym dodatkową drogę do badania skurczu komórek i przeprowadzania swoich badań.