Name: Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę FLECS do analizy kurczliwości pojedynczych komórek w płytkach 24-dołkowych. Technika ta umożliwia ilościowe pomiary sił kontrakcyjnych komórek przy użyciu fluorescencyjnych mikrowzorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca laboratoryjna została przeprowadzona dzięki wsparciu UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR), gdzie Forcyte sponsoruje działalność badawczą, oraz Magnify Incubator w California NanoSystems Institute (CNSI), gdzie Forcyte Biotechnologies, Inc. jest rezydentem. Autorzy udzielą na żądanie dostępu do modułu analizy Biodock.ai FLECS wszystkim badaczom akademickim. L.H. i I.P. wnieśli równy wkład w tę pracę.

1. Dzień 1: Przygotowanie płytki 24-dołkowej
<ol>
	<li>Procedurę należy rozpocząć od dodania 20 ml pożywki do hodowli komórkowych do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W tym eksperymencie użyto pożywki na bazie szynki F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Uzyskać 24-dołkową płytkę przeznaczoną do oznaczania kurczliwości komórek. Ustawić pipetę na 500 μl i zaopatrzyć się w sitko do pasażowania komórek. 
	UWAGA: Płyta jest dostępna u autorów na życzenie.</li>
	<li>Podnieś i przytrzymaj talerz jedną ręką, a następnie delikatnie odklej plastikową folię od góry płytki. Następnie ostrożnie odłóż talerz z powrotem.</li>
	<li>Włącz aspirator próżniowy i odessaj górną warstwę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) ze studzienek, aby zapobiec rozlaniu. Usuwaj PBS po jednym wierszu na raz. Gdy studzienki nie są już całkowicie pełne, trzymaj płytkę w jednej ręce i ostrożnie wyjmij resztę PBS z dołków. Szybko napełnij 500 μl pożywki do hodowli komórkowych. Uważaj, aby uniknąć kontaktu aspiratora z dnem studzienki.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij płytką i postukaj w bok, aby upewnić się, że całe dno studzienki jest pokryte roztworem. Gdy wszystkie studzienki zostaną wypełnione podłożem, odłóż płytkę na bok.</li>
</ol>
2. Dzień 1: Zasiewanie komórek
<ol>
	<li>Pobrać kolbę hodowlaną z pasażowanymi przez 7 lub niższe pierwotne komórki mięśni gładkich ludzkiego pęcherza moczowego (BSM) z inkubatora o temperaturze 37 °C. Pod mikroskopem sprawdź morfologię komórek i upewnij się, że komórki osiągnęły co najmniej 90% konfluencji, ale mniej niż 100% konfluencji.</li>
	<li>Przeprowadź protokół dysocjacji komórek. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego trypsynizuj komórki przez 2,5 minuty, aż komórki zostaną odłączone, a następnie schładzaj je pożywką uzupełnioną surowicą (10% FBS).</li>
	<li>Po dysocjacji komórek użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę komórek do około 50 000 komórek/ml w pożywce uzupełnionej surowicą. Co ważne, komórki wymagają co najmniej 2% surowicy, aby przyłączyć się do mikrowzorów.</li>
	<li>Przed wysiewem należy szybko przecedzić zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 40 lub 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pipetą serologiczną, aby rozbić grudki komórek na pojedyncze komórki.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 500 μl zawiesiny komórek o objętości 50 000 komórek/ml do każdej z 24 studzienek na płytce za pomocą pipety P1000, dozując roztwór kroplami w różnych miejscach w studzienkach.</li>
	<li>Po wysianiu komórek pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 1 godzinę, aby komórki mogły osiąść bezpośrednio na mikrowzorach bez wpływu mikroprądów generowanych przez parowanie. Po upływie 1 godziny umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W tym czasie komórki samoorganizują się i rozprzestrzeniają po adhezyjnych mikrowzorach i zaczynają wywierać podstawowe poziomy skurczu.</li>
</ol>
3. Dzień 2: Dodanie testowanego leku
UWAGA: Końcowe stężenie dimetylosulfotlenku (DMSO) w studzienkach zawierających przylegające komórki nie może przekroczyć 1% i lek/DMSO nie może być dodany bezpośrednio do komórek, ale powinien być najpierw rozcieńczony i zmieszany z pośrednim roztworem pożywki komórkowej.
<ol>
	<li>Stwórz sześcioetapową, ośmiokrotną serię rozcieńczania leku, przenosząc 30 μl leku podstawowego do kolejnych 210 μl objętości DMSO i dokładnie mieszając między każdym etapem przenoszenia. W niniejszej pracy przygotowano sześcioetapową, ośmiokrotną serię rozcieńczeń blebbitatyny w dawkach w zakresie od 40 μM do 1 nM, w DMSO.</li>
	<li>Dla każdego podstawowego roztworu leku (z kroku 3.1) wymieszać 30 μl leku z 470 μl pożywki do hodowli komórkowych. Roztwór pośredni daje 16,7-krotne rozcieńczenie DMSO.</li>
	<li>Przenieść 200 μl każdego roztworu pośredniego do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej (która zawiera już 100 μl pożywki w każdym dołku). Daje to dodatkowe sześciokrotne rozcieńczenie DMSO.</li>
	<li>Kroki 3.2 i 3.3 łącznie dają 1% końcowe stężenie DMSO w odwiertach.</li>
	<li>Umieścić poddaną działaniu substancji płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na odpowiedni czas. W tym eksperymencie stosuje się 30-minutową inkubację.</li>
	<li>Bezpośrednio przed obrazowaniem dodać Hoechst 33342 żywego roztworu barwienia jądrowego do każdego dołka (końcowe rozcieńczenie 1:10 000). Pozostaw do inkubacji przez dodatkowe 15 minut, aby oznaczyć jądra komórkowe.</li>
</ol>
4. Dzień 2: Obrazowanie płytki studziennej
<ol>
	<li>Uzyskaj dostęp do mikroskopu, który jest wyposażony w obrazowanie kanałów zarówno dla jąder komórkowych (DAPI), jak i mikrowzorów (TRITC).</li>
	<li>Najpierw zobrazuj komórki tylko za pomocą DMSO.</li>
	<li>Następnie skoncentruj się i zobrazuj zarówno mikrowzorce, jak i znakowane jądra komórkowe, aby zidentyfikować pojedyncze komórki i upewnić się, że oba kanały są idealnie wyrównane, aby umożliwić automatyczną analizę obrazu.</li>
	<li>Powtórz w wielu pozycjach w każdym z 24 dołków na płytce. Zdjęcia mogą być wykonywane z obiektywem 4x (lub opcjonalnie wyższym, aby przyspieszyć obrazowanie i uzyskać maksymalną liczbę punktów danych na obraz).</li>
	<li>Wyeksportuj obrazy jako pliki TIF i otwórz je na komputerze podłączonym do sieci za pomocą ImageJ, aby przeanalizować dane.</li>
</ol>
5. Po eksperymencie: Analiza obrazu
UWAGA: Analiza obrazu została przeprowadzona przy użyciu portalu Biodock.ai i oprogramowania do obrazowania.
<ol>
	<li>Prześlij pozyskane obrazy do komputera.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że odpowiednie pary obrazów mikrowzorców i obrazów jądrowych są prawidłowo nazwane.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie nazwy obrazów mikrowzorców mają postać "sharedCoreName_pt.tif".</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie nazwy obrazów jądr mają postać "sharedCoreName_dapi.tif".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konwertuj obrazy z TIF na PNG za pomocą ImageJ.
	<ol>
		<li>Po otwarciu ImageJ ładuj po jednym kanale na raz. W tym eksperymencie najpierw załaduj obrazy mikrowzorców jako stos do ImageJ.</li>
		<li>Korzystając z opcji Image > Adjust > Brightness/Contrastness, dostosuj jasność obrazu, aby uwydatnić mikrowzorce i zredukować tło do czerni. Oprócz tego wygładź obrazy.</li>
		<li>Korzystając z opcji Typ > obrazu > 8-bitowej, przekonwertuj obrazy na 8-bitowe.</li>
		<li>Następnie wyeksportuj obraz do formatu PNG i zaznacz pole poziom plasterka jako nazwę pliku. Teraz utwórz nowy folder PNG i zapisz tam pliki PNG o tej samej nazwie.</li>
		<li>Powtórz ten proces dla obrazów jąder.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prześlij pary obrazów PNG do oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu analizy.
	<ol>
		<li>Utwórz i zweryfikuj konto. Autorzy posiadają konto umożliwiające otwarty dostęp dla użytkowników akademickich.</li>
		<li>Zweryfikuj konto, kontaktując się z autorami.</li>
		<li>Zaloguj się do oprogramowania.</li>
		<li>Na karcie Dane po lewej stronie kliknij opcję Prześlij partię.</li>
		<li>Zaimportuj obrazy, przeciągając i upuszczając pary obrazów do wyskakującego okna i nazwij partię. Kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Zaznacz pole obok nazwy partii i kliknij przycisk Analizuj.</li>
		<li>Na następnym ekranie przewiń w dół i zaznacz pole obok Analiza kurczliwości i kliknij Wybierz. W dolnej części strony wybierz z menu rozwijanego 10x jako powiększenie, które zostało użyte do obrazowania.
		<ol>
			<li>Kliknij przycisk Prześlij. Gdy analiza danych odczyta Zakończono, kliknij nazwę partii. Na następnym ekranie kliknij Pobierz dane po prawej stronie strony. 
			UWAGA: Pobrane pliki będą zawierały obrazy, które zostały przeanalizowane, podsumowanie wyników informujące o średnim skurczu na każdym obrazie oraz szczegółową analizę każdego mikrowzoru, który został wykryty na dowolnym obrazie, podając ich rozmiary, pozycje, liczbę przylegających komórek i skurcz.</li>
			<li>Wykreśl wartości skurczu w stosunku do stężeń leku, aby wygenerować krzywą stężenie-odpowiedź i określić względne potencje różnych metod leczenia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease%3A+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Smooth+Muscle+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li>
<li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology%3A+On+the+way+to+tailored+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li>
<li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underactive+bladder%3A+Pathophysiology+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance.</a> Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).</li>
<li>Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+airway+smooth+muscle+cell+contractility+by+Ca2%2B+signaling+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).</li>
<li>Brozovich, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+vascular+smooth+muscle+contraction+and+the+basis+for+pharmacologic+treatment+of+smooth+muscle+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders.</a> Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+an+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Rokhzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+measurements+of+cell+contraction+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function.</a> Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).</li>
<li>Park, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li>
<li>Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+microarray+platform+for+correlative+analysis+of+cell+differentiation+and+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55362(2017).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+with+optimized+regularization+and+automated+Bayesian+parameter+selection+for+comparing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells.</a> Scientific Reports. 9, 539(2019).</li>
<li>Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+traction+force+microscopy%3A+A+new+tool+for+quantifying+cell-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions.</a> PLOS ONE. 6, 17833(2011).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-throughput+single-cell+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li>
<li>Pushkarsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLECS+technology+for+high-throughput+single-cell+force+biology+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PI3K+promotes+dilation+of+human+small+airways+in+a+rho+kinase-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).</li>
<li>Orfanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+increases+airway+smooth+muscle+responses+to+contractile+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).</li>
<li>Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallization+and+biopatterning+on+ultra-flexible+substrates+via+dextran+sacrificial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers.</a> PLOS ONE. 9, 106091(2014).</li>
<li>Yoo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B112+facilitates+shortening+in+human+airway+smooth+muscle+by+modulating+phosphoinositide+3-kinase-mediated+activation+in+a+RhoA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).</li>
<li>MacGlashan, D., Vilariño, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerization+of+actin+does+not+regulate+desensitization+in+human+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).</li>
<li>Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+integrin-mediated+cell+contractility+by+fibronectin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).</li>
<li>Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+in+smooth+muscle+cells+varies+with+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading.</a> Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).</li>
<li>Ye, G. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contractile+strength+of+vascular+smooth+muscle+myocytes+is+shape+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent.</a> Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).</li>
</ol>

I.P. jest wynalazcą w rodzinie patentów chroniących metody i systemy technologii FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C. i R.H. są pracownikami Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. jest profesorem na UCLA i współzałożycielem Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. i R.D. posiadają udziały finansowe w Forcyte Biotechnologies, Inc., która jest wyłącznym licencjobiorcą powyższych patentów i komercjalizuje technologię FLECS.

Ta uproszczona metoda ilościowego pomiaru skurczu setek tysięcy komórek jednocześnie w różnych warunkach leczenia i przy użyciu wyłącznie standardowych instrumentów mikroskopowych stanowi dostępną alternatywę dla tradycyjnego TFM dla naukowców zajmujących się biologią sił komórkowych. Ponieważ prezentowana technologia zapewnia wizualne przedstawienie skurczu komórek poprzez analizę zmian w mikrowzorcach fluorescencyjnych o regularnym kształcie, wielkość skurczu wytwarzanego przez daną komórkę jest intuicyjnie rozumiana - im mniejszy mikrowzór, tym większa siła skurczu wywierana przez komórkę.
Warto zauważyć, że oferując kontrolę nad takimi czynnikami, jak kształt, obszar rozprzestrzeniania się i cząsteczka adhezyjna składająca się na mikrowzorce (wszystkie znane czynniki regulujące kurczliwość komórek 22,23,24), prezentowana technologia systematycznie eliminuje dodatkowe zmienne, które mogą zakłócać interpretacje badań skurczu komórek.
W tym eksperymencie zastosowano sztywność 10 kPa w żelu i zastosowano mikrowzór 70 μm (długość przekątnej) złożony z kolagenu typu IV. Oprócz tych parametrów cząsteczkę adhezji można zastąpić różnymi kolagenami, fibronektyną, żelatyną i innymi macierzami zewnątrzkomórkowymi (ECM). Sztywność żelu można zmniejszyć do 0,1 kPa, a nawet do zakresu MPa. Geometria mikrowzoru może być zaprojektowana de novo tak, aby miała dowolny kształt przy minimalnym rozmiarze elementu ~5 μm. Parametry te są oddzielone i mogą być niezależnie optymalizowane dla określonego kontekstu biologicznego.
Technologia ta została szeroko zwalidowana pod kątem kompatybilności z wysoce adhezyjnymi i kurczliwymi typami komórek fenotypu mezenchymalnego, w tym różnymi typami komórek mięśni gładkich (pierwotny ludzki pęcherz, jelita, tchawicy, oskrzela, macicy, aorty i tętnicy), mezenchymalnymi komórkami macierzystymi i ich zróżnicowanym potomstwem, różnymi fibroblastami (płucnymi, skórnymi i sercowymi), miofibroblastami i komórkami śródbłonka. Ponadto makrofagi pochodzące z monocytów będą również wytwarzać dużą mierzalną siłę fagocytarną na mikrowzorce, szczególnie jeśli mikrowzór składa się ze znanej opsoniny. Za pomocą tej metody można również oznaczyć różne linie nowotworowe.
Metoda ta może stanowić pewne wyzwanie w przypadku komórek, które są albo stosunkowo małe, takie jak limfocyty T i neutrofile, albo typów komórek o fenotypie z przewagą nabłonka. Głównym tego powodem jest to, że metoda opiera się na silnej adhezji i całkowitym rozprowadzeniu komórek po mikrowzorze w celu wygenerowania mierzalnego sygnału skurczowego. Komórki, które wiążą się słabo, wiążą się ze sobą lub nie rozprzestrzeniają się całkowicie, nie wytwarzają mierzalnych sygnałów skurczowych. Te zachowania, które są stosunkowo rzadkie, można złagodzić, dostosowując rozmiar mikrowzoru, aby był mniejszy, lub stosując alternatywne cząsteczki kleju w mikrowzorcach, które będą lepiej promować adhezję i rozprzestrzenianie się w tych komórkach.
Użytkownicy tej technologii muszą dokładnie ocenić różne możliwe formuły pożywek do hodowli komórkowych dla konkretnego typu komórek, ponieważ różne składniki, czynniki wzrostu, poziomy surowicy i wrażliwość pH mogą wpływać na różne zachowania w różnych komórkach. Optymalizacja protokołu powinna poprzedzać skalowanie wszelkich eksperymentalnych przepływów pracy, a komponenty pożywek powinny być zawsze świeże, sterylne i spójne z poprzednimi partiami.
Ostatecznie, jeśli rozdzielczość pojedynczej komórki nie jest konieczna do celów użytkownika lub jeśli docelowy typ komórki ma minimalną zdolność rozprowadzania, wówczas tradycyjny TFM może być równie lub bardziej odpowiedni do takich eksperymentów. Celem i nadzieją autorów jest to, że narzędzie to zapewni biologom komórkowym dodatkową drogę do badania skurczu komórek, szczególnie w kontekście zautomatyzowanych, wysokoprzepustowych fenotypowych badań przesiewowych leków.
Specyficzne dla przyszłych zastosowań w badaniach przesiewowych leków, mogą być stosowane płytki o większej przepustowości, takie jak 384-dołkowa płytka FLECS. Na takich płytach obiektywy 4x w wielu mikroskopach mogą uchwycić całą pojedynczą studzienkę w swoim polu widzenia, zapewniając uchwycenie wszystkich komórkowych reakcji skurczowych. Dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowego systemu obrazowania, cała 384-dołkowa płytka może zostać zobrazowana w ciągu około 5 minut, co czyni ten system znacznie szybszym niż inne opcje, a zatem nadaje się do wysokoprzepustowego odkrywania leków fenotypowych. Rzeczywiście, autorzy rutynowo przeprowadzają cotygodniowe badania przesiewowe narkotyków na ~50 384-dołkowych płytkach (w sumie ponad 19 000 dołków) przy użyciu automatyzacji.

Siły mechaniczne generowane przez komórki są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania wielu organów w całym organizmie, takich jak jelita, pęcherz moczowy, serce i inne. Organy te muszą generować stabilne wzorce skurczu i rozkurczu komórek, aby utrzymać wewnętrzny stan homeostazy. Nieprawidłowy skurcz komórek mięśni gładkich (SMC) może prowadzić do wystąpienia różnych zaburzeń, w tym na przykład dysmotoryki jelit, charakteryzującej się nieprawidłowymi wzorcami skurczu mięśni gładkich jelit1, a także schorzeń urologicznych, takich jak nadaktywny2 lub niedoczynny pęcherz moczowy3. W drogach oddechowych SMC wykazujące nieregularne wzorce skurczu mogą wywołać astmatyczną nadreaktywność4, co potencjalnie prowadzi do zwężenia dróg oddechowych i zmniejszenia przepływu tlenu do płuc. Innym powszechnym schorzeniem fizycznym jest nadciśnienie, wywołane wahaniami skurczu mięśni gładkich w naczyniach krwionośnych5. Wyraźnie widać, że mechanizmy kurczliwości w obrębie komórek i tkanek mogą prowadzić do chorób wymagających zastosowania metod leczenia. Ponieważ stany te bezsprzecznie wynikają z dysfunkcyjnych zachowań kurczliwych komórek, logiczne i konieczne staje się pomiar samej funkcji kurczliwej komórek podczas przesiewania potencjalnych kandydatów na leki.
Uznając potrzebę stworzenia narzędzi do badania komórkowej siły skurczu, przez naukowców opracowano kilka ilościowych metod oceny skurczu, w tym mikroskopię sił trakcyjnych (TFM)6, TFM z mikrowzorowaniem7, testy z pływającymi żelami8 oraz testy z elastomerowymi mikrosłupkami9. Technologie te były wykorzystywane w licznych badaniach zarówno w formacie pojedynczych naczyń, jak i wielodobowych płytek, a nawet proponowano je do pomiarów sił w trzech wymiarach10,11,12,13,14. Choć technologie te umożliwiły pionierskie badania w szerokiej dziedzinie biologii sił komórkowych, większość z nich była ograniczona do laboratoriów posiadających specyficzne możliwości i zasoby, w szczególności: zdolność do wytwarzania podłoży TFM, umiejętność właściwego stosowania złożonych i nieintuicyjnych algorytmów do rozwiązywania map przemieszczeń TFM oraz stosunkowo precyzyjne systemy mikroskopowe, które potrafią zarejestrować obrazy wykonane przed i po zdjęciu próbki ze stolika (w celu dysocjacji komórek). W konsekwencji dla niewykwalifikowanego badacza bariera wejścia w stosowanie tych metod może być dość wysoka, biorąc pod uwagę szeroki zestaw wymagań niezbędnych do wdrożenia tych technologii. Ponadto rozdzielczość obrazowania wymagana dla wielu istniejących technologii (obiektywy 40x lub większe) może znacząco ograniczać przepustowość eksperymentalną, podczas gdy technologie pomiarów zbiorczych mogą maskować wkład komórek odstających i uniemożliwiać wykrycie subtelniejszych różnic w skurczu. Warto zauważyć, że z wiedzą autorów jedynie podejście o niskiej przepustowości i półilościowy test z pływającymi żelami osiągnął wystarczający stopień dojrzałości, aby stać się dostępnym dla badaczy (patrz Rycina 1).
<img alt="Kurczenie się komórek na fluorescencyjnych mikrowzorach; schemat obrazujący adhezję i kurczenie się w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ogólny schemat metody technologii FLECS. (A) Komórki przylegają do adhezyjnych mikrowzorów białkowych, które są kowalencyjnie osadzone w cienkiej warstwie elastomerowej wspartej szklaną podstawką. (B) Widok z góry różnych możliwych kształtów mikrowzorów oraz powiększenie komórki kurczącej się na mikrowzorze w kształcie litery „X”. (C) Nałożenie fluorescencyjnych mikrowzorów na obrazy w kontraście fazowym kurczącej się komórki. (D) Obrazy przebiegu czasowego pojedynczej kurczącej się komórki. Paski skali = 25 µm. Rycina ta została opracowana za zgodą Pushkarsky'ego i wsp.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Kierując się ostatnimi postępami w mikrotechnologii, autorzy opracowali technologię opartą na mikropłytkach, umożliwiającą ilościowe pomiary skurczu pojedynczych komórek w setkach tysięcy komórek, nazwaną FLECS (fluorescently labelled elastomeric contractible surfaces)15,16,17,18,19,20, jako alternatywę dla TFM. W tym podejściu fluorescencyjne mikrowzory białkowe są osadzone w miękkich filmach, które odkształcają się i kurczą w intuicyjny i mierzalny sposób, gdy komórki wywierają na nie siły trakcyjne. Co istotne, mikrowzory białkowe ograniczają pozycję, kształt i powierzchnię rozprzestrzenienia się komórek, co prowadzi do jednolitych warunków testowych. Pozwala to na proste pomiary oparte wyłącznie na zmianach wymiarowych, które są bardzo dobrze rozdzielone przestrzennie, nawet na obrazach przy 4-krotnym powiększeniu. Metoda obejmuje moduł analizy obrazu działający w przeglądarce i umożliwia bezpośrednią analizę siły skurczu komórek bez konieczności stosowania delikatnych procedur manipulacyjnych lub rejestracji markerów referencyjnych, dzięki czemu może być ona obsługiwana przez każdego badacza dysponującego podstawowym zapleczem do hodowli komórek i prostym mikroskopem fluorescencyjnym z niskim powiększeniem (Rycina 2). Technologia ta, gotowa do użycia i dostępna komercyjnie, została zaprojektowana z myślą o użytkowniku końcowym i ma na celu obniżenie bariery wejścia dla każdego naukowca laboratoryjnego chcącego badać biologię sił komórkowych.
<img alt="Płytka FLEXplate 24-dołkowa z wzorowaniem komórek do mikroskopii; siatka, mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat formatu płytki 24-dołkowej dla testu kurczliwości pojedynczych komórek. Ten format został wykorzystany w opisanych tutaj eksperymentach i przedstawiony w części wideo artykułu. Paski skali = 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół zastosowania formatu płytek 24-dołkowych platformy technologicznej FLECS w celu ilościowego określenia wpływu leków modulujących siłę na kurczliwość komórkową w pierwotnych komórkach mięśni gładkich pęcherza moczowego. Ten ogólny protokół może być adaptowany i modyfikowany w zależności od potrzeb, aby uwzględnić różne ramy czasowe, typy komórek i warunki traktowania, a także skalowany w celu odpowiedzi na inne pytania z zakresu biologii siły.

<table><tbody><tr><td>Hodowla komórek mięśni gładkich pęcherza moczowego</td><td>Sciencell</td><td>#4310</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Thermofisher</td><td>11765054</td><td>Pożywka F12 szynki uzupełniona 10% <mocnym> FBS </mocnym>i 1% p/s</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>7201432</td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td> <td>stożkowaFisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FB012941</tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1284</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-31</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>ImageXpress Confocal</td><td></td></tr><tr><td>Forcyte wyprodukowana przez Forcyte 24-dołkowa płytka</td><td>Forcyte Biotechnologies</td><td>24-HC4R-X1-QB12</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 3342 Żywa plama jądrowa</td><td>Thermofisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td></td></tr></tbody></table>

uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Generowanie siły skurczu komórek jest podstawową cechą wspólną dla praktycznie wszystkich komórek. Te siły skurczu mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju, funkcjonują zarówno na poziomie komórkowym, jak i tkankowym oraz regulują systemy mechaniczne w organizmie. Wiele procesów biologicznych jest zależnych od siły, w tym ruchliwość, adhezja i podział pojedynczych komórek, a także skurcz i rozluźnienie narządów, takich jak serce, pęcherz moczowy, płuca, jelita i macica. Biorąc pod uwagę jej znaczenie w utrzymaniu prawidłowych funkcji fizjologicznych, kurczliwość komórkowa może również napędzać procesy chorobowe, gdy jest przesadzona lub zakłócona. Astma, nadciśnienie, przedwczesny poród, zwłóknienie i niedoczynność pęcherza moczowego to przykłady procesów chorobowych napędzanych mechanicznie, które można potencjalnie złagodzić dzięki odpowiedniej kontroli siły skurczu komórek. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół wykorzystania nowatorskiej technologii oznaczania kurczliwości opartej na mikropłytkach, znanej jako fluorescencyjnie znakowane elastomerowe powierzchnie skurczowe (FLECS), która zapewnia uproszczoną i intuicyjną analizę kurczliwości pojedynczych komórek w sposób masowo skalowany. W niniejszym dokumencie przedstawiamy krok po kroku protokół uzyskiwania dwóch sześciopunktowych krzywych dawka-odpowiedź opisujących wpływ dwóch inhibitorów kurczliwości na skurcz pierwotnych komórek mięśni gładkich ludzkiego pęcherza moczowego w prostej procedurze wykorzystującej tylko pojedynczą mikropłytkę testową FLECS, aby zademonstrować właściwą technikę użytkownikom metody. Korzystając z technologii FLECS, wszyscy badacze posiadający podstawowe laboratoria biologiczne i systemy mikroskopii fluorescencyjnej uzyskują dostęp do badania tego podstawowego, ale trudnego do określenia funkcjonalnego fenotypu komórki, skutecznie obniżając barierę wejścia w dziedzinę biologii sił i fenotypowych badań przesiewowych siły skurczu komórek.

Obszary obrazów uzyskanych z studni traktowanych wyłącznie DMSO oraz tych traktowanych 40 µM blebbistatyną przedstawiono obok siebie na Rysunku 3. Można wyraźnie zaobserwować, że komórki traktowane wyłącznie DMSO wykazują znaczny stopień skurczu, co wynika z bardzo wyraźnych deformacji mikrowzorców, do których przylegają komórki mięśni gładkich pęcherza moczowego (BSMCs) w tej studni. Przeciwnie, na obrazie studni traktowanej 40 µM blebbistatyną obserwuje się znaczną relaksację komórek7, ponieważ mikrowzorce, do których przylegają BSMCs, są niemal nieodróżnialne pod względem rozmiaru od mikrowzorców, do których nie przylegają komórki, co wskazuje na minimalny skurcz. Obrazy te demonstrują intuicyjną i przejrzystą wizualną reprezentację kurczliwości pojedynczych komórek, oferowaną przez metodę fluorescencyjnego mikrowzorowania. W przeciwieństwie do metod opartych na TFM, w których wielokierunkowy ruch licznych cząsteczek fluorescencyjnych rozproszonych losowo pod gęstą monowarstwą komórek ma przekazywać względną siłę skurczu, tutaj jednorodne i wyraźne skurczone geometrie mikrowzorców dostarczają bezpośrednich i łatwych do zinterpretowania informacji jakościowych o skurczu poszczególnych komórek. Można je bezpośrednio ilościowo określić, stosując standardowe binarne operacje na obiektach obrazu.
<img alt="Porównanie obrazowania fluorescencyjnego, lewo: DMSO, prawo: blebbistatyna; analiza morfologii komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Porównanie obrazów pobranych z dołków zawierających wyłącznie 1% DMSO (lewo) lub 40 µM blebbistatyny (prawo). Wyraźnie widać, że zastosowanie blebbistatyny znacząco zmniejsza kurczliwość pojedynczych komórek, na co wskazują większe, nieskurczone mikowzory. Niebieskie jądra wskazują, które mikowzory są związane z komórkami. Pasek skali = 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Poprzez zastosowanie przeglądarkowego modułu analizy do badania uzyskanych par obrazów mikrowzorców i jąder komórkowych, otrzymano rozkłady kurczliwości pojedynczych komórek dla każdej populacji, jak pokazano na Rysunku 4. Analiza ta, szczegółowo opisana w poprzednim raporcie dotyczącym metodologii FLECS15, polega na lokalizacji pozycji i orientacji każdego mikrowzorca w kształcie litery „X”, przeliczeniu liczby jąder przywierających bezpośrednio nad centrum każdego mikrowzorca, obliczeniu średniej długości każdego mikrowzorca oraz wyznaczeniu odległości w pikselach skurczu każdego mikrowzorca w stosunku do średniej długości pustych mikrowzorców (referencja zerowego skurczu). W związku z tym puste mikrowzorce służą do ważnego celu, jakim jest normalizacja danych o skurczu. Co istotne, komórki, które nie wiążą się z mikrowzorcami, będą gromadzić się na krawędziach studzienki z powodu mikroprądów, gdzie nie będą wpływać na analizę obrazu. Jak widać na tych wykresach, niezakłócona kurczliwość populacji komórek traktowanych wyłącznie kontrolnie DMSO obejmuje szeroki zakres, sięgający aż 20 pikseli, z centrum znajdującym się w okolicy 10 pikseli. Tymczasem komórki traktowane blebbistatyną kurczą się znacznie mniej, a ich rozkład jest przesunięty w dół, do centrum wynoszącego nieco ponad 6 pikseli. Ważne jest to, że każdy pojedynczy mikrowzorzec znaleziony na obrazie, do którego przywiązała się dokładnie jedna komórka, jest reprezentowany w tych rozkładach. Dowodzi to zdolności tej metody do przekazywania różnicowych odpowiedzi komórkowych na działanie leków.
<img alt="Wykres kurczliwości komórek, histogram skurczu mikrowzorców w komórkach traktowanych DMSO lub 40μM blebbistatyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Histogramy przedstawiające dane dotyczące kurczliwości pojedynczych komórek otrzymane z analizy obrazów studzienek zawierających tylko 1% DMSO (kolor niebieski) lub 40µM blebbistatyny. Rozkład komórek traktowanych DMSO jest szeroki i skupiony wokół znacznie większej wartości skurczu (~10 pikseli) niż rozkład komórek traktowanych blebbistatyną, co wykazuje ilościowe efekty traktowania komórek blebbistatyną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Wykorzystując wszystkie dołki na jednej płytce 24-dołkowej i obrazując co najmniej 3 miejsca na dołek, jednocześnie generowane są sześciopunktowe krzywe zależności odpowiedzi od dawki dla dwóch związków leków. Rycina 5 przedstawia dane dotyczące zależności odpowiedzi od stężenia dla BSMC traktowanych tym samym zakresem dawek blebbistatyny lub cytochalazyny D (obu znanych inhibitorów kurczliwości). Z profili zależności odpowiedzi od stężenia wynika, że cytochalazyna D jest silniejszym inhibitorem skurczu tonicznego w tych komórkach. Poprzez dopasowanie krzywej sigmoidalnej do punktów danych można obliczyć wartości IC50 dla każdego leku. Nasze eksperymenty wskazują, że wartości IC50 wynoszą odpowiednio 7,9 µM dla blebbistatyny i 100 nM dla cytochalazyny D po około 30 min ekspozycji na leki. Co istotne, wartości te są ogólnie zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, co potwierdza dokładność ilościową metody wyznaczania siły działania inhibitorów skurczu7,21.
<img alt="Wykres zależności odpowiedzi od dawki z 6 punktami; skurcz vs stężenie (µM); Blebbistatyna i Cytochalazyna D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Krzywe zależności odpowiedzi od stężenia przedstawiające wpływ blebbistatyny i cytochalazyny D na kurczliwość komórkową w pojedynczych komórkach. Każdy punkt danych składa się z trzech obrazów dla danego warunku. Do każdego zestawu danych dopasowano krzywą sigmoidalną. Wyniki wskazują, że cytochalazyna D jest silniejsza, wykazując niższą wartość IC50. Dane te można zebrać z jednej 24-dołkowej płytki FLECS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Siły mechaniczne generowane przez komórki są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania różnych narządów w całym ciele. Do tego jelita, pęcherz moczowy, serce i inne. Narządy te muszą generować stabilne wzorce skurczu i relaksacji komórek, aby utrzymać wewnętrzny stan hemostatyczny.Nieprawidłowy skurcz komórek mięśni gładkich może prowadzić do wystąpienia różnych zaburzeń, w tym dysmotoryki jelit charakteryzującej nieprawidłowe wzorce jelit ze skurczem mięśni, a także stany takie jak nadaktywny lub niedoaktywny pęcherz. A w drogach oddechowych niektóre komórki mięśniowe, które kurczą się nieregularnymi wzorcami, mogą wywoływać nadreaktywność astmatyków. Oczywiste jest, że mechanizmy skurczowe w komórkach i tkankach mogą prowadzić do chorób, które wymagają opcji leczenia.A ponieważ te warunki mogą bezpośrednio wynikać z dysfunkcyjnych zachowań skurczowych komórek, staje się zarówno logiczne, jak i konieczne, aby zmierzyć samą funkcję kurczliwości komórek podczas badań przesiewowych potencjalnych kandydatów na leki. Podążając za najnowszymi osiągnięciami w dziedzinie mikrotechnologii, opracowaliśmy przyjazny dla użytkownika test oparty na mikropłytkach, który umożliwia ilościowe pomiary skurczu pojedynczych komórek. W setkach tysięcy komórek zwanych elastycznymi, znanych również jako fluorescencyjnie znakowane elastomerowe powierzchnie kurczliwe się.W tym podejściu osadzamy fluorescencyjne mikrowzory białek, a więc miękkie filmy, które odkształcają się i kurczą, gdy komórki przykładają do nich siły ciągnące. Co ważne, mikrowzorce białek ograniczają położenie, kształt i obszar rozprzestrzeniania się komórek. Jednolite warunki testowe i pozwalają na proste pomiary oparte tylko na ich zmianach wymiarów.Ogólnie rzecz biorąc, platforma, która zawiera moduł analizy obrazu oparty na przeglądarce, umożliwia prostą analizę kurczalnej siły komórek bez konieczności stosowania delikatnych procedur obsługi lub rejestracji markerów powierniczych i może być obsługiwana przez każdego badacza posiadającego podstawowe hodowle komórkowe i prosty mikroskop fluorescencyjny o małym powiększeniu. Technologia ta została zaprojektowana z myślą o użytkowniku końcowym i ma na celu zmniejszenie bariery wejścia dla każdego naukowca laboratoryjnego do badania biologii sił komórkowych Zacznij od dodania 20 mililitrów pożywki do probówki przewlekłej, uzyskaj 24-dołkową płytkę przeznaczoną do oznaczania kurczliwości komórek. Ustaw pipetę na 500 mikrolitrów i uzyskaj sitko do komórek dla patogenu komórkowego.Zdejmij pokrywkę z płytki 24-dołkowej, przytrzymaj płytkę w ten sposób, a następnie przystąp do delikatnego zdejmowania warstwy plastiku z wierzchu płytki. Ostrożnie odłóż płytkę z powrotem. Odessać tylko górną warstwę PBS z każdej studzienki, aby zapobiec rozlaniu.Teraz, jeden rząd na raz, usuń pozostały PBS ze studzienki i szybko napełnij 500 mikrolitrami pożywki komórkowej. Delikatnie potrząśnij płytką i postukaj w bok, aby upewnić się, że całe dno studzienki jest pokryte roztworem. Gdy wszystkie studzienki zostaną napełnione pożywką, odłóż płytkę na bok.W tym momencie pobierz kulturę komórkową z inkubatora. Będziemy przeprowadzać solidny protokół stowarzyszeniowy. Celem tego protokołu jest stworzenie zawiesiny 50 000 komórek na mililitr.Przed wysianiem komórek upewnij się, że przecedziłeś je raz przez sitko, aby rozbić kępy komórek na pojedyncze komórki, ostrożnie umieść 500 mikrolitrów roztworu komórkowego w każdym dołku. Po wysianiu komórek ważne jest, aby pozostawić płytki na godzinę, aby komórki mogły osiąść bezpośrednio na wzorach. Po upływie godziny umieść na noc płytkę w inkubatorze.Druga część eksperymentu polega na dodaniu leków do 24-dołkowej płytki i obrazowaniu fluorescencyjnym płytki. W przypadku tej części protokołu mamy dwa ważne wymagania, aby zapewnić solidną żywotność i odpowiedź komórki. Pierwszym z nich jest to, że końcowe stężenie DMSO w studzienkach z komórką wynosi nie więcej niż 1%, co oznacza, że musimy wykonać 100 pełne rozcieńczenie z naszych zapasów leków.Po drugie, nie możemy dodać DMSO tak bezpośrednio do studzienek, ponieważ rozbije się on o dno tego mieszania, a następnie uszkodzi komórki o wysokim stężeniu. Zamiast tego musimy stworzyć pośredni roztwór leku DMS0 i pożywki, które możemy dokładnie wymieszać ze sobą, aby uniknąć wysokiej lokalnej ekspozycji DSSO na komórki. W tym protokole będziemy wykonywać sześciostopniowe ośmiokrotne rozcieńczanie, które obejmuje zakres od 40 mikromolów do jednego nanomolowca Utwórz sześcioetapową ośmiokrotną serię rozcieńczeń, przenosząc 30 mikrolitrów podstawowego roztworu leku do kolejnych 210 mikrolitrowych objętości DMSO i dokładnie mieszając między każdym etapem przenoszenia W naszym eksperymencie, Będziemy oceniać działanie blebbistatyny.na pęcherze ludzkie przez komórki mięśniowe. Aby spełnić oba wymagania, najpierw stworzymy pośrednie rozwiązanie DMSO i pożywki dla leków. Daje to 16,7-krotne rozcieńczenie DMSO.Następnie dodamy ten pośredni roztwór leku do naszych komórek, stosując proporcje dające dodatkowe sześciokrotne rozcieńczenie, co daje w sumie 100 pełnych rozcieńczeń i końcowe stężenie 1% DMSO Aby to osiągnąć, dla każdego podstawowego roztworu leku wymieszaj 30 mikrolitrów leku z 470 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych, a następnie przenieś 200 mikrolitrów tego roztworu pośredniego do odpowiedniego dołka na 24-dołkowej płytce, który zawiera 1000 mikrolitrów w każdej studzience. Daje to łącznie 1% końcowe stężenie inkubacji DMSO przez odpowiedni okres czasu. W naszym eksperymencie inkubujemy przez 30 minut, kiedy jesteś gotowy do obrazu, dodaj żywą plamę jądrową na całe swoje studnie, dodaj jeden do 10 000 rozcieńczeń z bulionu.Pozostaw do inkubacji przez dodatkowe 15 minut. Kiedy będziesz gotowy do obrazowania, będziesz potrzebować mikroskopu fluorescencyjnego, który jest wyposażony w obrazowanie kanałów fluorescencyjnych zarówno dla znakowanych jąder komórkowych, jak i barwnika fluorescencyjnego. Oznaczone są mikrowzory, które w naszym przykładzie obejmują kanał tri C.Teraz będziemy obrazować fluorescencyjnie jądra blabistatyny w celu identyfikacji pojedynczych komórek, pamiętaj, aby zobrazować jądra komórek barwiących dokładnie w tej samej pozycji, w której oglądasz mikrowzór, aby można je było wyrównać podczas analizy. Prześlij pozyskane obrazy do komputera, upewnij się, że obrazy są prawidłowo oznaczone, tak aby kanały wzorca kończyły się podkreśleniem PT. A obrazy w kanale jądrowym kończą się podkreśleniem dapi. Teraz będziemy konwertować obrazy tif na obrazy PNG, używając obrazu J Po otwarciu obrazu J ładuj jeden kanał na raz.Najpierw załadujemy kanał wzorca i dostosujemy kontrast, aby zmaksymalizować sygnał i zminimalizować tło. Ponadto będziemy wygładzać obraz. Gdy obraz zostanie zmodyfikowany zgodnie z naszymi upodobaniami, zmienimy typ obrazu na ośmiobitowy.Następnie wyeksportuj obraz jako typ PNG. Następnie zaznacz pole, użyj etykiet plasterków jako nazw plików. Utwórz nowy folder o nazwie PNG.Następnie zapisz tam pliki PNG, Aby przeanalizować obrazy, przejdź do Biodock dot AI, utwórz konto i skontaktuj się z autorami, aby uzyskać bezpłatny dostęp do modułu analizy. Zaloguj się po utworzeniu konta. Tutaj będziesz mógł przesyłać nowe obrazy.Nazwiemy tę nową partię danych eksperymentu internetowego JoVE. Teraz możemy zaimportować obrazy, przeciągając je, a następnie upuszczając, naciśnij OK.At tym momencie wybierz swoje dane. Następnie kliknij analizuj, przewiń w dół do modułu oznaczonego jako analiza kurczliwości, a następnie naciśnij wybierz.Ustaw powiększenie na tę samą wartość, której użyłeś do obrazowania Po uzupełnieniu danych kliknij na nie, a następnie możemy wybrać opcję Pobierz dane. Po pobraniu danych możemy zobaczyć nałożone pary obrazów dla każdego wprowadzonego obrazu. Mamy również dostęp do statystyki podsumowującej, która da nam średni skurcz dla każdego zestawu komórek.Jednostką miary skurczu są piksele. Patrząc na dane, widzimy tutaj, że w studzienkach traktowanych tylko DMSO nastąpił znacznie większy skurcz komórek w porównaniu z komórkami, które były traktowane bróbstatyną. Mamy również dostęp do danych dla każdego pojedynczego wzorca, który został wykryty na którymkolwiek z obrazów.Daje nam to szczegółowe informacje dotyczące lokalizacji obrazu, pochodzenia obrazu, typu pozycji, liczby komórek, zera jeden lub więcej niż jednego, rozmiaru mikrowzoru i obliczonego skurczu komórek. Ten układ składa się z każdego zidentyfikowanego wzoru na mikropłytce. Wzorce pojedynczych komórek z tej listy były uśrednione w celu obliczenia średniego skurczu obrazu PNG w drugim pliku.Dane z pojedynczej komórki można sortować i analizować zgodnie z potrzebami eksperymentu. W tej części filmu będziemy wyświetlać reprezentatywne dane, które można zebrać z 24-dołkowej płytki, pokazujące dane dotyczące odpowiedzi komórek mięśni gładkich pęcherza moczowego leczonych dwoma różnymi lekami. Są to obrazy studzienek poddanych działaniu odpowiednio DMSO i blebbistatyny.Tutaj widzimy, że komórki leczone tylko DMSO wykazują dużą liczbę mikrowzorców skurczowych, ale komórki leczone blebbistatyną były większe i otwarte na zauważenie, że jest mniejszy skurcz. Dane na tym histogramie pokazują zmienność kurczliwości komórek w wyniku różnych zabiegów na komórki. Centrum dystrybucji dla komórek leczonych blebbistatyną jest niższe niż centrum dystrybucji dla komórek, które były leczone DMSO.Jest to zgodne z informacjami wyświetlanymi na poprzednich obrazach. Ponieważ komórki, które były traktowane blebbistatyną, wykazywały znacznie mniejszy skurcz. Oznacza to, że leczenie blebbistatyną znacznie rozluźnia komórki.Każdy z tych zestawów danych przyczynia się do punktu na krzywej odpowiedzi na dawkę, który można zebrać z pojedynczej płytki 24-dołkowej, zgodnie z protokołami pokazanymi na filmie. Tutaj widzimy, że cytochalazyna D jest silniejsza niż blebbistan, o czym świadczą niższe wartości skurczu, biorąc pod uwagę wyższe stężenia leku. Jeśli chcesz znacznie skalować swoje eksperymenty, dostępna jest wersja z płytką 384-dołkową, którą można wykorzystać z automatyzacją do radykalnego skalowania eksperymentów.Dane te można zebrać z płytki 384-dołkowej, zamiast sześciu etapów rozcieńczania dla każdego leku na płytce 24-dołkowej, płytka 384-dołkowa pozwala nam przeprowadzić 20 etapów rozcieńczania dla każdego leku z wieloma powtórzeniami. Technologia płatków śniegu jest wyjątkowa. Pozwala na wizualizację skurczu pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii, co do tej pory było niemożliwe.Tak więc technologia opiera się na formie metryk, która jest wzorowana na białku znakowanym fluorescencyjnie. Systematyczny wzorzec ma się uformować dla skurczu komórkowego i pozwala na precyzyjny pomiar modulacji kontraktu fenotypu przez dowolny lek. Oczywiście, technologia ta jest nadal aktywnie rozwijana pod kątem zastosowań i wielu różnych obszarów chorobowych, takich jak astma, choroby sercowo-naczyniowe, stany zapalne, onkologia immunologiczna i oczywiście wszelkie nasze wskazania chorobowe, w których nieprawidłowy skurcz komórek odgrywa kluczową rolę w postępie choroby.Jak pokazujemy, ta oparta na mikrowzorcach technologia pomiaru kurczliwości komórek stanowi uproszczoną alternatywę dla tradycyjnej mikroskopii sił trakcyjnych, zapewniając intuicyjną analizę, obserwowanie kurczenia się wzoru i zapewniając rozdzielczość pojedynczych komórek w dużych populacjach komórek. Biorąc pod uwagę pewne kwestie, metoda ta może stanowić wyzwanie przy użyciu komórek, które są albo zbyt małe, takie jak limfocyty T i neutrofile, albo typów komórek, które nie przylegają. Ponadto komórki, które co tydzień wiążą się, wiążą ze sobą głównie lub nie rozprzestrzeniają się całkowicie, nie będą wytwarzać mierzalnych sygnałów skurczowych.Użytkownicy tej technologii muszą dokładnie ocenić różne możliwe formuły pożywek do hodowli komórkowych dla danego typu komórek, ponieważ różne składniki, czynniki wzrostu, poziomy w surowicy i wrażliwość pH mogą wpływać na różne zachowania. Optymalizacja protokołów powinna przebiegać wraz ze skalowaniem wszelkich eksperymentalnych przepływów pracy.Ostatecznie, jeśli rozdzielczość pojedynczej komórki nie jest konieczna lub jeśli docelowy typ komórki ma minimalną zdolność rozprzestrzeniania się, wówczas do takich eksperymentów można zastosować tradycyjne metody mikroskopii sił przyciągania. W przeciwnym razie mamy nadzieję, że to narzędzie zapewni biologom komórkowym dodatkową drogę do badania skurczu komórek i przeprowadzania swoich badań.

simplified-high-throughput-analysis-single-cell-contractility-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Ten protokół opisuje użycie mikroskalowych wsporników krzemowych jako giętkich powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje zginanie wspornika, które można zmierzyć, zarejestrować i przekształcić w odczyty siły, zapewniając nieinwazyjny i skalowalny system pomiaru funkcji skurczu in vitro.

Wykorzystanie mikroskalowych wsporników krzemowych do oceny funkcji kurczliwości komórkowej in vitro

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Przedstawiamy dynamiczną i odwracalną platformę do testowania sztywności wykonaną z ultramiękkiego silikonowego elastomeru (polidimetylosiloksan, PDMS) z osadzonymi cząstkami żelaza. Ten nowatorski test nadaje się do badania pojawiających się czasowo zależnych zmian fizycznych w fenotypach komórek, w tym naprowadzania kontaktowego. Tutaj mierzymy wyrównanie kardiomiocytów noworodków szczurów po usztywnieniu macierzy za pomocą magnetyki.

Mikrowzorowane elastomery magneto-reologiczne do wywoływania zmian w ustawieniu kardiomiocytów

Poznaj uproszczoną metodę FLECS do analizy kurczliwości pojedynczych komórek w płytkach 24-dołkowych. Technika ta umożliwia ilościowe pomiary sił kontrakcyjnych komórek przy użyciu fluorescencyjnych mikrowzorów.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Przeglądaj więcej filmów