Name: Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metodę elektromechanicznej oceny kardiomiocytów królikich z wykorzystaniem optogenetycznego narzędzia GtACR1. Protokół łączy technikę patch-clamp z pomiarami siły przy użyciu włókien węglowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stefanie Perez-Feliz za doskonałą pomoc techniczną, dr Jonasowi Wietkowi (Uniwersytet Humboldta, Berlin, Niemcy) za dostarczenie plazmidu pUC57-GtACR1, prof. dr Michaelowi Schuppowi (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) za produkcję adenowirusa oraz dr Anastasii Khokhlovej (Ural Federal University) za podzielenie się swoją wiedzą w celu ulepszenia protokołu izolacji komórek i przeprojektowania konfiguracji gięcia pipet. Projekt został sfinansowany przez Niemiecką Fundację Badawczą (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Stypendium Emmy-Noether: SCHN1486/2-1) oraz ERC Advanced Grant CardioNECT.

<ol><li>Harz, H., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-regulated+calcium+currents+in+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas.</a> Nature. 351, 489-491 (1991).</li>
<li>Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+electric+potential+in+the+phototaxis+of+the+alga+Haematococcus+pluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis.</a> Nature. 271, 476-478 (1978).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+A+Light-Gated+Proton+Channel+in+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriorhodopsin%3A+a+light-driven+proton+pump+in+Halobacterium+Halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium.</a> Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).</li>
<li>Schobert, B., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halorhodopsin+is+a+light-driven+chloride+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Halorhodopsin is a light-driven chloride pump.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).</li>
<li>Inoue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-driven+sodium+ion+pump+in+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A light-driven sodium ion pump in marine bacteria.</a> Nature Communications. 4, 1678(2013).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Light+Sensitivity+Optical+Neural+Silencer%3A+Development+and+Application+to+Optogenetic+Control+of+Non-Human+Primate+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties%2C+substrate+specificity+and+optogenetic+potential+of+the+engineered+light-driven+sodium+pump+eKR2%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2.</a> Scientific Reports. 8, 9316(2018).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103(2017).</li>
<li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Neuronal+Silencing+in+Drosophila+during+Visual+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing.</a> Scientific Reports. 7, 13823(2017).</li>
<li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530(2016).</li>
<li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806(2018).</li>
<li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanics+of+rat+cardiomyocytes+under+isometric%2C+unloaded%2C+and+physiologically+loaded+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).</li>
<li>Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials%2C+ion+channel+currents+and+transverse+tubule+density+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes+maintained+for+6+days+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).</li>
<li>Burton, R. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolae+in+Rabbit+Ventricular+Myocytes%3A+Distribution+and+Dynamic+Diminution+after+Cell+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation.</a> Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Janssen, P. M., Hunter, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force%2C+not+sarcomere+length%2C+correlates+with+prolongation+of+isosarcometric+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction.</a> The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).</li>
<li>Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+force+decline+from+calcium+decline+by+preload+in+isolated+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca+2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+to+fight+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
<li>Bernal Sierra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channel-based+optogenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Potassium channel-based optogenetic silencing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4611(2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9 (1), 3949(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy narzędzia optogenetyczne umożliwiają modulację elektrofizjologii komórek pobudliwych w sposób nieinwazyjny, wymagają one dokładnej charakterystyki w różnych typach komórek (np. CM), aby umożliwić wybór najlepszego dostępnego narzędzia dla konkretnego projektu eksperymentalnego. Technika patch-clamp jest standardową metodą oceny elektrofizjologii komórkowej. W konfiguracji całej komórki pozwala na rejestrowanie fotoaktywowanych prądów przez błonę plazmatyczną lub czasowych zmian napięcia błony po stymulacji/hamowaniu światła. Optogenetyczna manipulacja pobudzenia elektrycznego wpływa również na skurcze CM. Używamy śledzenia sarkomeru i pomiarów siły wspomaganych włóknem węglowym, aby określić ilościowo wpływ przesłuchania optycznego na aktywność mechaniczną miocytów.
Opisujemy protokół charakteryzujący podstawowe efekty kanału chlorkowego bramkowanego światłem, GtACR1, w CM. Jako system modelowy wybraliśmy CM królików, ponieważ ich cechy elektrofizjologiczne (np. kształt AP i okres refrakcji) bardziej przypominają te obserwowane u CM człowieka niż CM gryzoni. Co więcej, CM królika może być hodowany przez kilka dni, wystarczająco długo, aby dostarczyć adenowirusa i uzyskać ekspresję GtACR1-eGFP. Warto zauważyć, że izolowane CM zmieniają swoje właściwości strukturalne w hodowli w czasie, w tym zaokrąglanie zakończeń komórek i stopniową utratę prążkowania krzyżowego, układu T-rurkowego i kaweoli23,24. Zgodnie z tym, w hodowanym CM odnotowano zmiany funkcjonalne: depolaryzację spoczynkowego potencjału błonowego, wydłużenie AP i zmiany w komórkowej obsłudze Ca2 +. Aby zapoznać się z przeglądem adaptacji komórkowych w hodowli, zobacz Louch et al.25. Rysunek uzupełniający 2 przedstawia przykładowe pomiary AP i skurczu świeżo wyizolowanego CM w celu porównania z tymi obserwowanymi w hodowlanym CM (Figura 6, Ryc. 7) przy użyciu przedstawionego tutaj protokołu.
Zapisy typu patch-clamp dla całych komórek umożliwiają bezpośrednie pomiary właściwości fotoprądowych (np. amplitudy i kinetyki) oraz wywołanych światłem zmian potencjału błonowego lub charakterystyki AP w wysokiej rozdzielczości czasowej. Jednak takie zapisy mają kilka ograniczeń: po pierwsze, cytozol jest zastępowany roztworem pipety w nagraniach całych komórek, co jest korzystne dla kontrolowania jonowych gradientów elektrochemicznych, ale ma wewnętrzną wadę wypłukiwania organelli komórkowych, białek i innych związków, co potencjalnie wpływa na komórkowe odpowiedzi elektryczne. Po drugie, skutki uboczne, takie jak aktywacja dodatkowych kanałów jonowych wynikająca z niefizjologicznie długiej depolaryzacji (np. powolne stałe czasowe kanałów jonowych bramkowanych światłem) są trudne do oceny, ponieważ nasza metoda pozwala jedynie na wykrycie zmian w APD, ale nie pozwala na przeprowadzenie bezpośrednich pomiarów stężeń jonów w elektrofizjologicznie istotnych przedziałach komórkowych. Można to zrobić za pomocą wskaźników fluorescencyjnych (np. czujników Ca2+ ) lub elektrod jonoselektywnych. Dalsza charakterystyka może obejmować miareczkowanie natężenia światła, określenie zależności pH, kinetykę fotoprądów przy różnych potencjałach błonowych oraz kinetykę odzyskiwania podczas powtarzalnej stymulacji światłem.
W przeciwieństwie do nagrań patch-clamp, pomiary siły pojedynczej komórki umożliwiają analizę skurczów komórkowych nienaruszonych miocytów bez wpływu na ich środowisko wewnątrzkomórkowe. Wtórny wpływ na stężenia jonów (np. Ca2+) można pośrednio ocenić poprzez określenie generowanej amplitudy i dynamiki siły (np. maksymalna prędkość skurczu i relaksacji; tutaj nie analizowane). Pomiary siły techniką włókna węglowego mają przewagę nad swobodnie kurczącymi się ogniwami, ponieważ dostarczają bezpośrednich informacji o siłach biernych i czynnych w ogniwach wstępnie obciążonych (tj. w warunkach bardziej zbliżonych do warunków in situ lub in vivo). Mechaniczne napięcie wstępne jest szczególnie ważne przy analizie kurczliwości komórek, ponieważ rozciągliwość wpływa na wytwarzanie siły i relaksację26,27.
Podejścia optogenetyczne pozwalają na czasoprzestrzennie precyzyjną manipulację potencjałem błony komórkowej, zarówno w pojedynczym CM, jak i nienaruszonej tkance serca. Klasycznie, ChR2, nieselektywny kanał kationowy bramkowany światłem, został użyty do depolaryzacji potencjału błonowego, podczas gdy napędzane światłem pompy protonowe i / lub chlorkowe zostały użyte do hiperpolaryzacji błony. Obie grupy siłowników optogenetycznych wymagają wysokich poziomów ekspresji, ponieważ ChR2 charakteryzuje się wewnętrznie niską przewodnością jednokanałową28, a pompy napędzane światłem maksymalnie transportują jeden jon na pochłonięty foton. Ponadto przedłużona aktywacja ChR2 w CM może prowadzić do przeciążenia Na+ i/lub Ca2+, a pompy napędzane światłem mogą zmieniać transsarkolemmalne gradienty H+ lub Cl- 29,30. W poszukiwaniu alternatywnych narzędzi do optogenetycznej kontroli aktywności CM, niedawno przetestowaliśmy naturalną rodopsynę anionokanałową GtACR1, charakteryzującą się lepszą przewodnością jednokanałową i wyższą wrażliwością na światło w porównaniu z kationami ChR, takimi jak ChR2. Odkryliśmy, że aktywacja GtACR1 depolaryzuje CM i może być używana do stymulacji optycznej i hamowania, w zależności od czasu i czasu trwania impulsu świetlnego. Dodatkową zaletą stosowania ACR zamiast kationu ChR może być bardziej ujemny potencjał odwrócenia Cl- w porównaniu do Na+, redukujący sztucznie wprowadzane prądy jonowe. Jak pokazaliśmy wcześniej, stymulacja optyczna z GtACR1 może prowadzić do wydłużenia AP w wyniku powolnej składowej zamykania kanału GtACR1, którą można przezwyciężyć poprzez zastosowanie szybszych mutantów GtACR119. Jednak wydłużenie AP jest znacznie mniej wyraźne przy stosowaniu niższego, bardziej fizjologicznego wewnątrzkomórkowego stężenia Cl- (patrz ryc. 6). Co więcej, hamowanie za pośrednictwem GtACR1 przez przedłużone oświetlenie powoduje głęboką depolaryzację błony, która ponownie może aktywować wtórny napływ Na+ i Ca2+, zmieniając w ten sposób aktywność kanałów bramkowanych napięciem. W naszych pomiarach stwierdzamy, że parametry AP i skurczu wracają do wartości wyjściowej w ciągu 40 s po inhibicji wywołanej światłem przez 1 minutę (patrz Kopton i in. 2018, Rysunek 6, Rysunek 7). Bramkowane światłem kanały K+ stanowią potężną alternatywę dla wyciszania CM bez wpływu na spoczynkowy potencjał błonowy CM31.
W przyszłości chcielibyśmy ilościowo porównać różne narzędzia optogenetyczne pod kątem ich potencjału do hamowania czynności serca. W tym celu testujemy różne kanały jonowe bramkowane światłem, w tym ACR, ChR2 i warianty ChR z przesunięciem ku czerwieni32, a także aktywatory hiperpolaryzacyjne, takie jak halorodopsyna lub bramkowana światłem cyklaza adenylowa bPAC w połączeniu z kanałem potasowym SthK (PAC-K)31.
Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do dogłębnej charakterystyki właściwości elektromechanicznych CM. Ma ona zasadnicze zastosowanie również do CM innych gatunków oraz do CM wyizolowanego z chorego mięśnia sercowego. Stymulacja optyczna pozwala na nadawanie tempa CM na różnych częstotliwościach, a różne napięcia wstępne mogą być testowane podczas eksperymentów ze skurczem włókien węglowych. Ciekawym eksperymentem byłoby wykorzystanie oświetlenia o niskiej intensywności do depolaryzacji podprogowej, aby naśladować stopniowy wzrost spoczynkowego potencjału błonowego, co można zaobserwować podczas rozwoju przebudowy tkanki serca podczas progresji choroby. Wreszcie, pomiary funkcjonalne można połączyć z obrazowaniemCa2+ w celu uzyskania dalszego wglądu w sprzężenie wzbudzenia-skurczu lub z interwencjami farmakologicznymi w celu oceny wpływu różnych leków na aktywność CM.

Prądy fotologiczne za pośrednictwem ChR zostały po raz pierwszy zarejestrowane w plamce oka jednokomórkowych zielonych alg1,2. Wkrótce po klonowaniu genetycznym i heterologicznej ekspresji Chlamydomonas reinhardtii ChR1 i ChR2, ChR zostały użyte jako narzędzia do zmiany potencjału błonowego w oocytach Xenopus i komórkach ssaków za pomocą light3,4. Kationowe nieselektywne ChR depolaryzują błonę komórek o spoczynkowym potencjale błonowym, który jest ujemny w stosunku do potencjału odwrócenia ChR. W ten sposób można je wykorzystać do wywołania AP w pobudliwych komórkach, w tym neuronach i CM, umożliwiając stymulację optyczną5,6.
Komplementarne do kationów ChR, napędzane światłem pompy protonowe, chlorkowe i sodowe7,8,9 zostały użyte do hamowania aktywności neuronalnej10,11,12. Te ostatnie mają jednak ograniczenia, wymagające dużego natężenia światła i ciągłego oświetlenia, ponieważ jeden jon jest transportowany na pochłonięty foton. W 2014 roku dwa niezależne badania przeprowadzone przez Wietek i wsp. oraz Berndt i wsp. opisały konwersję ChR przewodzącego kationy do ACR poprzez mutacje w kanale pore13,14. Rok później odkryto naturalne ACR u kryptofitu Guillardia theta (GtACR)15. Ponieważ zmodyfikowane ACR wykazywały szczątkową przewodność kationową, zostały one zastąpione naturalnym ACR, charakteryzującym się dużą przewodnością jednokanałową i wysoką czułością na światło15. GtACR zostały użyte do wyciszenia aktywności neuronalnej poprzez polaryzację potencjału błonowego w kierunku potencjału odwrócenia chloride16,17. Govorunova i in. zastosowali GtACR1 do hodowli CM komory szczura i wykazali skuteczne hamowanie fotoinhibicyjne przy niskich poziomach natężenia światła, które nie były wystarczające do aktywacji wcześniej dostępnych narzędzi hamujących, takich jak pompa protonowa Arch18. Nasza grupa poinformowała niedawno, że fotoinhibicja CM za pośrednictwem GtACR1 opiera się na depolaryzacji i że GtACR1 może być również używany do stymulacji optycznej CM19.
Tutaj prezentujemy protokół do badania elektrofizjologicznych i mechanicznych efektów fotoaktywacji GtACR1 na CM komory hodowlanego królika. Najpierw opiszemy izolację komórek, hodowlę i transdukcję. Efekty elektrofizjologiczne są mierzone za pomocą zapisów z użyciem klamry krosowej całej komórki. Prądy zależne od światła przy danym napięciu membrany są oceniane w trybie V-clamp. Dynamika potencjału membrany jest mierzona podczas elektrycznego lub optycznego stymulowania CM (tryb I-clamp). Optyczne hamowanie elektrycznie wyzwalanego AP jest testowane przy użyciu długotrwałego światła. Efekty mechaniczne są mierzone za pomocą włókien węglowych w połączeniu ze śledzeniem długości sarkomeru opartym na obrazowaniu. Aby to zrobić, optycznie rozpędzone komórki są wstępnie obciążane mechanicznie poprzez przymocowanie dwóch włókien węglowych do błony plazmatycznej w pobliżu przeciwległych końców komórek. Zmiany długości sarkomeru są rejestrowane podczas stymulacji optycznej lub elektrycznej. Na koniec mierzy się fotoinhibicję podczas stymulacji komórek polem elektrycznym i analizuje generowane siły.
Protokół obejmuje następujące kroki pokazane na schemacie blokowym na rysunku 1: głębokie znieczulenie królika, wstrzyknięcie przedawkowania tiopentalu, wycięcie serca, perfuzja Langendorffa i trawienie tkanek, mechaniczna dysocjacja tkanki w celu uwolnienia komórek, analiza mikroskopowa wydajności CM, hodowla CM, transdukcja adenowirusem typu 5, a następnie inkubacja i eksperymenty funkcjonalne.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> 
Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu używanego do uzyskania elektrycznego i optycznego tempa CM. Serca są wycinane od królików w wieku 9-10 tygodni, a tkanka serca jest trawiona podczas perfuzji za pomocą zestawu Langendorffa. Komórki są uwalniane przez mieszanie mechaniczne. Wydajność CM jest liczona pod mikroskopem. CM są hodowane, transdukowane adenowirusem typu 5, a eksperymenty funkcjonalne są wykonywane 48-72 godziny po transdukcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment - Izolacja komórek/Hodowla/Transdukcja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adeno-X Adeno-X Adenoviral System 3 CMV</td><td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, Kalifornia, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaniula aorty</td><td>Radnoti</td><td></td><td>4,8 OD x 3,6 ID x 8-9 L</td></tr><tr><td>mm Szkiełka nakrywkowe i ukośniki 16 mm, grubość nr 0</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgia</td><td>631-0151</td><td>Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>Griffin Silk, czarne, 2 m długości, rozmiar 3, 0,5 mm</td><td>Samuel Findings, Londyn, Wielka Brytania</td> Inkubator <td>TSGBL3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nowy Brunszwik, Eppendorf, Sch&ouml; nenbuch, Szwajcaria</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff-perfuzja</td><td>konfiguracja Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&auml; serei, Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td></td><td>Pompa</td></tr><tr><td>Langendorff</td><td>na zamówienie Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Z&uuml; bogaty, Szwajcaria</td><td>ISM444</td><td></td></tr><tr><td>Siatka: Nylonowa tkanina filtracyjna Monodur</td><td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td><td></td><td>800 & m otworów, 1 m</td></tr><tr><td>szerokości Komora Neubauera</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgia</td><td>717806</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit, Nowa Zelandia White</td><td>Charles River</td><td>Kod szczepu: 052</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>BC774R</td><td>Bauchdeckenschere ger. 18cm</td></tr><tr><td>Filtr sterylny, 0,22 &mikro; m</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Patch-clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplfier</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, Stany Zjednoczone</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe i ukośnik; 50 mm, grubość nr 1</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgia</td><td>631-0178</td><td>Digitizer ze szkła borokrzemianowego</td></tr><tr><td>Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, San José, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td> Filtr <td>1550A</td><td></td></tr><tr><td>(530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>11513878</td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Filter (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Stany Zjednoczone</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, Stany Zjednoczone</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Interface</td><td>Scientifica, Uckfield, Wielka Brytania</td><td>Rack 1U, 352036</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone</td> Oprogramowanie sterujące diodami LED <td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Essel Research and Development, Toronto, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System sterowania LED</td><td>wykonany</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige Co., Tokio, Japonia</td><td>Mikroskop PP-830</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany mikromanipulator</td><td>Scientifica, Uckfield, Wielka Brytania</td><td>Miernik</td> mocy optycznej PatchStar <td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, Newton, NJ, Stany Zjednoczone</td> Smar silikonowy <td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RS Components, Corby, Wielka Brytania</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>A-M Systems, Sequim, WA, Stany Zjednoczone</td><td>787500</td><td>Srebrny, goły 0,015 '', powlekany 0,0190 '', długość 25 stóp</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła sodowo-wapniowego</td><td>Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Dania</td><td>160213 BRIS, ISO12772</td><td>1,55 OD x 1,15 ID x 75 L mm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, Stany Zjednoczone</td><td>Wersja 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr sceniczny</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, Wielka Brytania</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt - włókno węglowe</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>włókna węglowe</td><td>dostarczone przez Prof. Jean-Yves Le Guennec</td><td></td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Digitizer Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone</td> Filtr <td>1550B</td><td></td></tr><tr><td>(530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>11513878</td><td></td></tr><tr><td>Filter (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, Stany Zjednoczone</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs systemu fluorescencji</td><td>IonOptix, Milton, MA Stany Zjednoczone</td><td>FSI-800</td><td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L</td></tr> mm System <tr><td>przetwornika siły</td><td>Aurora Scientific Inc., Ontario, Kanada</td><td>406A</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary do pomiaru siły pomiary</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>GC200F-10</td><td></td></tr><tr><td>Interface National Instruments</td><td>National Instruments, Budapeszt, Węgry</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone</td> Skrzynka kontrolna LED <td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Essel Research and Development, Toronto, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterowanie LED system</td><td>na</td><td></td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>Mikrokontroler</td><td>Parallax Inc., Rocklin, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td> Ściągacz do mikropipet <td>śmigłowych</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige Co., Tokio, Japonia</td> Mikroskop <td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Kamera MyoCam-S</td><td>IonOptix, Dublin, Irlandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera MyoCam-S Power</td><td>IonOptix, Milton, MA, Stany Zjednoczone</td><td>MCS-100</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator pola MyoPacer</td><td>IonOptix Cooperation, Milton, MA, Stany Zjednoczone</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Motor</td><td>Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>E-501.00</td><td></td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>RS Components, Corby, Wielka Brytania</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, Stany Zjednoczone</td><td>Wersja 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie IonWizard</td><td>IonOptix, Dublin, Irlandia</td><td>Wersja 6.6.10.125</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr sceniczny</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, Wielka Brytania</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>A9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, Stany Zjednoczone</td><td>21114-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-karnityny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>C9500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2, 315 U/mg</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Creatine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>C0780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna-&beta;- D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek esketaminy, Ketanest S 25 mg/ml</td><td>Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>PZN-07829486</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna 50 mg/ml</td><td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa, 5,000 IU/ml</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>PZN-03029843</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Insulina (bydlęca trzustka)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>I6634-50MG</td><td></td></tr><tr><td>K-asparaginian</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>A6558-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgia</td><td>26764.260</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td><td>35113-1L</td><td></td></tr><tr><td>Laminina z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm membrana podstawna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medium</td><td>Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>A9187-1G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Loughborough, Leics., Wielka Brytania</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Solution 0,9%, Izoton Kochsalz-L&ouml; sung 0.9%</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Niemcy</td><td>A6579</td><td>bez Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Na-pyruvat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>P2256-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli(2-hydroksyetylometakrylan)</td><td>Sigma, Poole, Wielka Brytania</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza XIV ze Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>T0625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tiopental Inresa 0,5 g</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Fryburg, Niemcy</td><td>PZN-11852249</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny, Rompun 2%</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy</td><td>PZN-01320422</td><td></td></tr></tbody></table>

elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

W ciągu ostatnich dwóch dekad, narzędzia optogenetyczne stały się skutecznymi środkami do modulowania specyficznej dla danego typu komórki aktywności w tkankach pobudliwych, w tym w sercu. Podczas gdy rodopsyna kanałowa-2 (ChR2) jest powszechnym narzędziem do depolaryzacji potencjału błonowego w kardiomiocytach (CM), potencjalnie wywołując potencjały czynnościowe (AP), brakuje skutecznego narzędzia do niezawodnego wyciszania aktywności CM. Zasugerowano stosowanie rodopsyn anionokanałowych (ACR) do inhibicji optogenetycznej. W tym miejscu opisujemy protokół oceny skutków aktywacji naturalnego ACR GtACR1 z Guillardia theta u hodowanych królików CM. Podstawowymi odczytami są elektrofizjologiczne zapisy patch-clamp i optyczne śledzenie skurczów CM, oba wykonywane przy zastosowaniu różnych wzorców stymulacji świetlnej. Protokół obejmuje izolację CM z serca królika, wysiew i hodowlę komórek przez okres do 4 dni, transdukcję za pomocą kodowania adenowirusa dla kanału chlorkowego bramkowanego światłem, przygotowanie układów patch-clamp i włókien węglowych, gromadzenie i analizę danych. Zastosowanie techniki patch-clamp w konfiguracji całoogniwowej pozwala na rejestrację prądów aktywowanych światłem (w trybie cęgowym napięciem, V-cęgowym) i AP (tryb cęgowy prądu, I-cęgi) w czasie rzeczywistym. Oprócz eksperymentów z użyciem patch-clamp przeprowadzamy pomiary kurczliwości w celu funkcjonalnej oceny aktywności CM bez naruszania środowiska wewnątrzkomórkowego. W tym celu komórki są wstępnie obciążane mechanicznie za pomocą włókien węglowych, a skurcze są rejestrowane poprzez śledzenie zmian długości sarkomeru i odległości włókna węglowego. Analiza danych obejmuje ocenę czasu trwania AP na podstawie nagrań I-clamp, prądów szczytowych na podstawie nagrań V-clamp oraz obliczenia siły na podstawie pomiarów włókna węglowego. Opisany protokół może być zastosowany do badania biofizycznego wpływu różnych siłowników optogenetycznych na aktywność CM, co jest warunkiem wstępnym dla rozwoju mechanistycznego zrozumienia eksperymentów optogenetycznych w tkance serca i całych sercach.

GtACR1-eGFP wyrażono w hodowli królików CM (<silna klasa="xfig">Figura 6 insert), a fotoprądy zostały zmierzone techniką patch-clamp. Fotoaktywacja GtACR1 wykazuje duże prądy skierowane do wewnątrz przy -74 mV. W <silnej klasie="xfig">Rysunek 6Prąd szczytowy (IP) przy 4 mW/mm2 wynosi 245 pA. AP były wyzwalane elektrycznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B) lub optycznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C) z zastrzykami prądu odpowiednio 1,5 razy przekraczającymi próg, lub krótkimi depolaryzującymi impulsami świetlnymi o długości 10 ms. Analizując wartości APD, CM z impulsem elektrycznym pokazują APD 20 wynoszące 0,24 ± 0,08 s i APD 90 wynoszące 0,75 ± 0,17 s, podczas gdy CM ze stymulacją optyczną pokazują APD 20 wynoszące 0,31 ± 0,08 s i APD 90 wynoszące 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, w przedstawionym przykładzie APD 20electrical = 0,17 s; APD 20optyczny = 0,27 s i APD 90elektryczny = 0,61 s; APD 90optyczny = 0,68 s; <silna klasa="xfig">Rysunek 6D). Optycznie sterowany CM wykazuje wolniejszy początek AP (<silna klasa="xfig">Rysunek 6D). Aktywacja CM została zahamowana przy długotrwałym oświetleniu (przez 64 s, 4 mW/mm2) poprzez polaryzację potencjału błonowego w kierunku potencjału odwrócenia chlorku, tutaj -58 mV (<silna klasa="xfig">Rysunek 6E). Wyższe wstrzyknięcia prądu niż 1,5-krotność progu nie wywołują generowania AP (<silna klasa="xfig">Rysunek 6F). Wygenerowane siły szczytowe zostały określone na podstawie zginania włókna węglowego (<klasa wytrzyma>Rysunek 7B,C,E). CM wygenerował 232 μN/mm2 po stymulacji elektrycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B) i 261 μN/mm2 po stymulacji optycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C). Przedłużone impulsy zielonego światła hamują skurcze (<silna klasa="xfig">Rysunek 7E). Po zahamowaniu optycznym przez 64 s, powtarzające się skurcze generują mniejszą siłę skurczu, a wartości siły wracają do wartości wyjściowej po ~10 skurczach (tempo przy 0,25 Hz, <silna klasa="xfig">Rysunek 7D) zgodnie z rozkurczową utratą wapnia z CM królika.</silna></silna></silna></silna></klasa></silna></silna></silna></silna></silna></silna></silnej></silna>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne nagrania patch-clamp CM o stymulacji elektrycznej i optycznej/hamowaniu. (A) Reprezentatywny prąd fotologiczny przy napięciu -74 mV przy impulsie świetlnym 300 ms, 4 mW/mm2. IP oznacza prąd szczytowy. Wkładka pokazuje komórkę dodatnią GtACR1-eGFP. (B) Reprezentatywny zapis AP przy 0 pA przy użyciu rampy prądowej 10 ms, 0,6 nA w celu elektrycznego nadążania CM. (C) Reprezentatywny zapis AP przy 0 pA przy użyciu impulsów świetlnych 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) Górny wykres pokazuje nakładanie się 10-tego AP aktywowanego elektrycznie (niebieski) i optycznie (zielonego) CM. AP zostały wyrównane przez maksymalną zmianę potencjału błony (dV/dt max). Dolny wykres przedstawia różnicę potencjału błonowego między optycznie i elektrycznie wyzwalanym AP (Eoptical-E electrical). (E) Elektrycznie wyzwalane AP były hamowane w ciągłym świetle 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP są hamowane przez wstrzyknięcia prądu wyższego niż 1,5-krotność progu (od 0,7 nA w krokach od 0,1 nA do 2,2 nA) w świetle ciągłym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> 
Rysunek 7: Reprezentatywne dane z zapisów włókien węglowych optycznie i elektrycznie przyspieszonego/zahamowanego CM. (A) Wyświetlanie w oprogramowaniu do akwizycji danych. Rysunek (I) przedstawia zmierzony CM z okienkiem do obliczania długości sarkomeru. Szerokość komórki jest oznaczona kolorem pomarańczowym. (1) Zakres odpowiednich częstotliwości. (2) Widmo mocy FFT pokazuje częstotliwość odstępów sarkomerowych na komórce. Średnia długość sarkomeru jest obliczana na podstawie częstotliwości szczytowej. (3) Okno śledzenia długości sarkomeru. (4) Ślad intensywności. (5) Ślad intensywności pomnożony przez okno Hamminga jest śladem intensywności w okienku. Schemat (II) przedstawia eliptyczny przekrój komórki. Szerokość w kolorze pomarańczowym i grubość w przerywanym kolorze niebieskim. Rysunek (III) pokazuje położenie włókien węglowych wraz z odpowiednimi polami detekcji, po lewej stronie na czerwono, a po prawej na zielono. (6) Ślad intensywności. (7) Pierwsza pochodna śladu intensywności (zob. instrukcja obsługi oprogramowania do akwizycji danych). (B) Reprezentatywny ślad skurczów wywołanych elektrycznie. Panel (I) pokazuje skrócenie długości sarkomeru, panel (II) odległość między dwoma włóknami węglowymi. (C) Reprezentatywny ślad optycznie wywołanych skurczów (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) pokazuje skrócenie długości sarkomeru, panel (II) odległość między dwoma włóknami węglowymi. (D) Wygenerowana siła szczytowa od skurczu 1 do 11 po przerwie spowodowanej zahamowaniem wytwarzania AP. (E) Reprezentatywny ślad optycznego hamowania skurczów przy stałym oświetleniu (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) pokazuje skrócenie długości sarkomeru, panel (II) długość między dwoma włóknami węglowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ZA</td>
			<td>obszar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Konferencja ACR</td>
			<td>Anion kanałrrodopsyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ap</td>
			<td>potencjał czynnościowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APD (Dawka Przeciw</td>
			<td>Czas trwania potencjału czynnościowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jednostka CFU</td>
			<td>Jednostka tworząca kolonie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chr</td>
			<td>Rodopsyna kanałowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centymetr</td>
			<td>kardiomiocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certyfikat eGFP</td>
			<td>Wzmocnione białko zielonej fluorescencji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esd</td>
			<td>koniec skurczowej deformacji komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UE</td>
			<td>Jednostki endotoksyn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>siła</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fft</td>
			<td>szybka transformata Fouriera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GtACR (GtACR)</td>
			<td>Guillardia theta anion channelrhodopsyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interfejs graficzny</td>
			<td>Graficzny interfejs użytkownika</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zacisk dwuteowy</td>
			<td>cęgi prądowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J.m.</td>
			<td>Jednostki międzynarodowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOI (Urząd Miasta)</td>
			<td>Mnogość infekcji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poli-HEMA</td>
			<td>poli(metakrylan 2-hydroksyetylu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zacisk V</td>
			<td>cęgi napięciowe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Lista skrótów.
<img alt="Rysunek uzupełniający 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> 
Rysunek uzupełniający 1: Pomiary natężenia światła za pomocą miernika mocy optycznej. (A) Pomiar impulsów świetlnych o długości 10 ms przy 4 mW/mm2. (B) Pomiar ciągłego natężenia oświetlenia przez 64 s przy 4 mW/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek uzupełniający 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> 
Rysunek uzupełniający 2: Właściwości świeżo wyizolowanego CM i ich adaptacja strukturalna w hodowli. (A) Zapis AP świeżo wyizolowanego CM (APD 20 z 1,11 ± 0,34 s, APD 90 z 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Średni spoczynkowy potencjał błonowy: -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Zapis z włókna węglowego świeżo odizolowanego CM z napędem elektrycznym. Średnia siła szczytowa 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). (C) Obrazy konfokalne świeżo wyizolowanego CM (I); nietransdukowany (II) i transdukowany (III) CM po 48 godzinach w hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Materiał uzupełniający: Skrypt MatLab do określania APD i spoczynkowego potencjału błony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Wykorzystanie protokołu jako biofizycznego wpływu różnych aktywatorów optogenetycznych na aktywność kardiomiocytów może być testowane w celu pomocy w rozwoju eksperymentów optogenetycznych w tkance serca i całych sercach. Łącząc technikę patch clamp ze śledzeniem sarkomeru i pomiarami siły wspomaganymi włóknem węglowym, możemy badać wpływ fotoaktywacji GtACR1 na elektrykę i mechanikę kardiomiocytów komorowych. Hamowanie optogenetyczne może być potencjalnie stosowane do defibrylacji optycznej.GtACR1 jest narzędziem optogenetycznym, które umożliwia wyciszenie czynności serca. Technika ta ma pełne zastosowanie w innych dziedzinach badawczych, takich jak badania gładkich i jednokomórkowych komórek mięśniowych. Chociaż protokół ten nie może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, zapewnia on środki do kompleksowej analizy funkcji elektrycznych i mechanicznych kardiomiocytów.Jak mówi przysłowie, obraz mówi więcej niż tysiąc słów. O ile więcej informacji możemy przekazać w formie wideo? Niektóre z naszych narzędzi i technik związanych z rozciąganiem pojedynczych miocytów i przygotowaniem sondy są bardzo skomplikowane i znacznie łatwiej jest przekazać je w filmie niż w opisie.Po wypłukaniu krwi z serca z roztworem soli fizjologicznej od 9 do 10 tygodniowego białego królika nowozelandzkiego, zmień perfuzat na roztwór o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości potasu i perfekuj serce przez kolejne dwie minuty po tym, jak serce przestanie bić. Ukrwić roztwór enzymu, rozpocząć recyrkulację roztworu enzymu z powrotem do zbiornika po dwóch minutach trawienia i zmniejszyć prędkość do 16 mililitrów na minutę po pięciu minutach trawienia. Gdy tkanka stanie się miękka po 40-50 minutach trawienia, odetnij serce od kaniuli i natychmiast umieść serce w roztworze blokującym.Dodawać roztwór blokujący, aż tkanka zostanie całkowicie pokryta. Odetnij prawą komorę i przegrodę i oddziel lewą komorę. Usuń mięśnie brodawkowate i użyj cienkich kleszczyków i pipety, aby delikatnie rozerwać tkankę, aby uwolnić komórki przez mechaniczną dysocjację.Przefiltruj zawiesinę komórkową przez siatkę z porami o powierzchni jednego milimetra kwadratowego i osadź komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie wymieszać osad kardiomiocytów w świeżym roztworze blokującym. W przypadku eksperymentu z klamrą punktową, autoklawizowane szkiełka nakrywkowe pokryj 100 mikrogramami na mililitr lamininy bezpośrednio przed hodowlą komórkową.W eksperymencie z włóknem węglowym pokryj szalki Petriego 0,12 grama na mililitr Poly-HEMA w roztworze etanolu do wody w proporcji 95 do pięciu. Dziesięć do 15 minut po ponownym wyparciu kardiomiocytów należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej. Po zliczeniu umieść komórki na szkiełku nakrywkowym na szalce Petriego o docelowej gęstości 1,75 razy 10 do czterech komórek na mililitr.Inkubuj kultury przez trzy do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji zastąpić pożywkę z kultur szkiełka nakrywkowego świeżą pożywką zawierającą adenowirusa typu piątego kodującego GtACR1-eGFP przy wielokrotności infekcji 75. Umieść kultury z powrotem w inkubatorze na 48 godzin.Aby przeprowadzić eksperyment z zaciskiem krosowym, użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć pipety krosowe o wielkości od 1,7 do 2,5 megaoma z kapilar ze szkła sodowo-wapniowego i zainicjuj oprogramowanie do akwizycji danych. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze pomiarowej zawierającej roztwór zewnętrzny i wybierz kardiomiocyt na podstawie jego fluorescencji eGFP. Następnie napełnij pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym i przymocuj pipetę do uchwytu na pipetę, wprowadzając do roztworu wewnętrznego drut rejestrujący srebro pokryty chlorkiem srebra.Ustaw test membranowy tak, aby stosował impulsy 10 miliwoltów przez 15 milisekund z linią bazową zero miliwoltów. Po osiągnięciu konfiguracji z podłączonym ogniwem przełącz się w tryb całego ogniwa z potencjałem utrzymywania minus 60 miliwoltów w oprogramowaniu do akwizycji danych. Następnie delikatnie zastosuj podciśnienie, aby uzyskać dostęp do całej konfiguracji komórek poprzez pęknięcie membrany.O udanym pęknięciu świadczy natychmiastowy wzrost mierzonej pojemności. Rejestruj protokoły fotoaktywacji w trybie cęgów napięciowych przy napięciu minus 74 miliwoltach z impulsami świetlnymi 300 milisekund lub potencjały czynnościowe w bieżącym trybie cęgowym przy zeru pikoamperów. Aby wyprodukować włókna węglowe, najpierw zamontuj pipetę na uchwytach na pipety ściągacza.Wyciągnąć szklane kapilary do dwóch pipet o całkowitej długości zwężającej się około 11 milimetrów i końcowej średnicy wewnętrznej około 30 mikrometrów. Następnie za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyrównaj jedną kapilarnę w okręgu orientacyjnym i zgnij ją o maksymalnie 45 stopni, naciskając na końcówkę kapilary za pomocą gięcia. Podgrzej żarnik, aż kapilara utrzyma kąt 45 stopni nawet po wyjęciu giętarki.Po zgięciu kapilary użyj cienkich kleszczyków wyposażonych w miękką rurkę, aby wyjąć jedno włókno węglowe z rurki i dopasować je do cienkiej końcówki kapilary. Popchnij włókno w kapilarze do zgięcia. Wytnij włókna węglowe tak, aby wystawały na dwa mililitry z końcówki kapilary i użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować włókna do przedniej części każdej kapilary.Aby skalibrować włókna, przymocuj jedną kapilarnę do uchwytu sterowanego przez mikromanipulator i silnik piezoelektryczny. Przesuń kapilarę w kierunku czujnika i wyrównaj ją względem czujnika. Umieść końcówkę światłowodu w kontakcie z czujnikiem siły, nie wytwarzając żadnej siły.Całkowity ruch silnika piezoelektrycznego wynosi 60 mikrometrów. Przesuń silnik piezoelektryczny w sześciu krokach po 10 mikrometrów w kierunku czujnika siły. Czujnik ma czułość 0,05 miliniutona na wolt i zakres siły od zera do 0,5 miliniutonów.Odczytaj zmierzone napięcie dla każdego kroku i usuń włókno węglowe z czujnika. Aby zarejestrować siłę kurczenia się kardiomiocytów, pokryj powierzchnię szkła nakrywkowego Poly-HEMA i umieść go w komorze pomiarowej. Napełnij komorę zewnętrznym roztworem do kąpieli.Przymocuj obie kapilary obciążone włóknem węglowym do mikromanipulatora stolika i ustaw je pod kątem, tak aby włókna węglowe znajdowały się prawie poziomo do powierzchni komory pomiarowej. Aby sprawdzić, czy włókna są prawidłowo wyrównane, skup się na powierzchni komory pomiarowej, opuść pierwsze włókno i przesuń włókno w poziomie. Końcówka włókna powinna ślizgać się po powierzchni komory pomiarowej.Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla drugiego włókna. Przy zgaszonych światłach dodaj kilka kropli zawiesiny komórek hodowlanych do komory i zastosuj krótkie impulsy zielonego światła, aby wybrać komórki, które kurczą się w odpowiedzi na stymulację zielonym światłem. Aby przymocować pierwsze włókno, delikatnie ściśnij ogniwo, opuszczając włókno, a następnie zwolnij nacisk.Podłącz drugie włókno równolegle do pierwszego na drugim końcu kardiomiocytu, aby uzyskać maksymalną liczbę sarkomerów między dwoma włóknami. Po przymocowaniu obu włókien podnieś włókna tak, aby ogniwo nie stykało się już z powierzchnią komory. Ustaw ostrość sarkomerów, ustaw okno śledzenia długości sarkomeru między włóknami i użyj modułu wykrywania krawędzi, aby śledzić wyginanie włókien.Ustaw obszary detekcji z czerwonymi i zielonymi oknami i zdefiniuj próg przy pierwszej pochodnej śladu natężenia światła. Optycznie nadaj tempo komórce, śledząc długość sarkomeru i wygięcie włókien. W tym przypadku poruszaliśmy się z częstotliwością 0,25 Hz.Po zarejestrowaniu co najmniej 15 optycznie wywołanych skurczów, pole stymuluje komórkę elektrycznie. Znajdź próg wywoływania skurczów i zastosuj 1,5-krotność napięcia progowego dla stymulacji elektrycznej. W przypadku protokołu hamowania zastosuj bodźce elektryczne w celu wywołania skurczów, a następnie wystawij komórkę na ciągły impuls świetlny o różnym natężeniu światła.Zapisz co najmniej 15 skurczów po zahamowaniu wywołanym światłem. GtACR1 ulega ekspresji w hodowanych kardiomiocytach królików. Fotoaktywacja GtACR1 przy natężeniu światła wynoszącym cztery miliwaty na milimetr do kwadratu przez 300 milisekund powoduje duże prądy skierowane do wewnątrz przy minus 74 miliwoltach przy zmierzonym prądzie szczytowym 245 pikoamperów.W tym reprezentatywnym eksperymencie potencjały czynnościowe były wyzwalane albo elektrycznie za pomocą wstrzyknięć prądu 1,5 razy powyżej progu, albo optycznie za pomocą 10-milisekundowych impulsów świetlnych. Kardiomiocyty o stymulacji optycznej wykazywały wolniejszy początek potencjału czynnościowego. Elektrycznie wyzwalane potencjały czynnościowe były hamowane w świetle ciągłym.Wstrzyknięcia o wyższym prądzie i 1,5-krotne przekroczenie progu podczas długotrwałej aplikacji światła również nie wywołują potencjałów czynnościowych. Kardiomiocyt wygenerował siłę skurczu wynoszącą 232 mikroniutony na milimetr do kwadratu po stymulacji elektrycznej i 261 mikroniutonów na milimetr do kwadratu po stymulacji optycznej. Przedłużone impulsy zielonego światła hamowały skurcze, a nawracające skurcze po zahamowaniu generowały mniejszą siłę skurczu, zgodnie z rozkurczową utratą wapnia z kardiomiocytów królika.Zalecamy przećwiczenie technik przed przeprowadzeniem eksperymentu, zwłaszcza że ustawienie mikrosond w ciemności może być trudne. jest bardzo ważne podczas analizy kurczliwości kardiomiocytów, ponieważ może wpływać na wytwarzanie siły i relaksację. Różne obciążenia następcze mogą być również stosowane do analizy skurczów izotonicznych i auksotonicznych.Techniki te pozwalają na scharakteryzowanie biofizycznych efektów aktywacji nowo opracowanych aktywatorów optogenetycznych w kardiomiocytach, co ma kluczowe znaczenie dla wyboru najbardziej odpowiedniego narzędzia optogenetycznego dla każdego eksperymentu. Należy pamiętać, że transdukcja adenowirusa i wszystkie etapy następujące po transdukcji powinny być wykonywane w warunkach II poziomu bezpieczeństwa biologicznego.

electromechanical-assessment-optogenetically-modulated-cardiomyocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ta praca opisuje metodę kontrolowania rytmu serca nienaruszonych mysich serc transgenicznych myszy z rodopsyną kanałową-2 (ChR2) za pomocą lokalnej fotostymulacji za pomocą mikro-LED i jednoczesnego optycznego mapowania potencjału błony nasierdziowej.

Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Ten protokół ilustruje metodę optogenetycznej stymulacji wewnętrznych neuronów serca w transgenicznych sercach myszy. Opisane podejście służy do badania kinetyki nagłej aktywacji neuronów sercowych w sercach perfundowanych ex vivo oraz interakcji między aktywnością cholinergiczną i katecholaminergiczną.

Optogenetyczna aktywacja wewnętrznych autonomicznych neuronów serca w wyciętych perfundowanych sercach myszy

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Poznaj metodę elektromechanicznej oceny kardiomiocytów królikich z wykorzystaniem optogenetycznego narzędzia GtACR1. Protokół łączy technikę patch-clamp z pomiarami siły przy użyciu włókien węglowych.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Przeglądaj więcej filmów