Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Wykorzystanie protokołu jako biofizycznego wpływu różnych aktywatorów optogenetycznych na aktywność kardiomiocytów może być testowane w celu pomocy w rozwoju eksperymentów optogenetycznych w tkance serca i całych sercach. Łącząc technikę patch clamp ze śledzeniem sarkomeru i pomiarami siły wspomaganymi włóknem węglowym, możemy badać wpływ fotoaktywacji GtACR1 na elektrykę i mechanikę kardiomiocytów komorowych. Hamowanie optogenetyczne może być potencjalnie stosowane do defibrylacji optycznej.

GtACR1 jest narzędziem optogenetycznym, które umożliwia wyciszenie czynności serca. Technika ta ma pełne zastosowanie w innych dziedzinach badawczych, takich jak badania gładkich i jednokomórkowych komórek mięśniowych. Chociaż protokół ten nie może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, zapewnia on środki do kompleksowej analizy funkcji elektrycznych i mechanicznych kardiomiocytów.

Jak mówi przysłowie, obraz mówi więcej niż tysiąc słów. O ile więcej informacji możemy przekazać w formie wideo? Niektóre z naszych narzędzi i technik związanych z rozciąganiem pojedynczych miocytów i przygotowaniem sondy są bardzo skomplikowane i znacznie łatwiej jest przekazać je w filmie niż w opisie.

Po wypłukaniu krwi z serca z roztworem soli fizjologicznej od 9 do 10 tygodniowego białego królika nowozelandzkiego, zmień perfuzat na roztwór o niskiej zawartości wapnia i wysokiej zawartości potasu i perfekuj serce przez kolejne dwie minuty po tym, jak serce przestanie bić. Ukrwić roztwór enzymu, rozpocząć recyrkulację roztworu enzymu z powrotem do zbiornika po dwóch minutach trawienia i zmniejszyć prędkość do 16 mililitrów na minutę po pięciu minutach trawienia. Gdy tkanka stanie się miękka po 40-50 minutach trawienia, odetnij serce od kaniuli i natychmiast umieść serce w roztworze blokującym.

Dodawać roztwór blokujący, aż tkanka zostanie całkowicie pokryta. Odetnij prawą komorę i przegrodę i oddziel lewą komorę. Usuń mięśnie brodawkowate i użyj cienkich kleszczyków i pipety, aby delikatnie rozerwać tkankę, aby uwolnić komórki przez mechaniczną dysocjację.

Przefiltruj zawiesinę komórkową przez siatkę z porami o powierzchni jednego milimetra kwadratowego i osadź komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie wymieszać osad kardiomiocytów w świeżym roztworze blokującym. W przypadku eksperymentu z klamrą punktową, autoklawizowane szkiełka nakrywkowe pokryj 100 mikrogramami na mililitr lamininy bezpośrednio przed hodowlą komórkową.

W eksperymencie z włóknem węglowym pokryj szalki Petriego 0,12 grama na mililitr Poly-HEMA w roztworze etanolu do wody w proporcji 95 do pięciu. Dziesięć do 15 minut po ponownym wyparciu kardiomiocytów należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej. Po zliczeniu umieść komórki na szkiełku nakrywkowym na szalce Petriego o docelowej gęstości 1,75 razy 10 do czterech komórek na mililitr.

Inkubuj kultury przez trzy do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji zastąpić pożywkę z kultur szkiełka nakrywkowego świeżą pożywką zawierającą adenowirusa typu piątego kodującego GtACR1-eGFP przy wielokrotności infekcji 75. Umieść kultury z powrotem w inkubatorze na 48 godzin.

Aby przeprowadzić eksperyment z zaciskiem krosowym, użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć pipety krosowe o wielkości od 1,7 do 2,5 megaoma z kapilar ze szkła sodowo-wapniowego i zainicjuj oprogramowanie do akwizycji danych. Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami w komorze pomiarowej zawierającej roztwór zewnętrzny i wybierz kardiomiocyt na podstawie jego fluorescencji eGFP. Następnie napełnij pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym i przymocuj pipetę do uchwytu na pipetę, wprowadzając do roztworu wewnętrznego drut rejestrujący srebro pokryty chlorkiem srebra.

Ustaw test membranowy tak, aby stosował impulsy 10 miliwoltów przez 15 milisekund z linią bazową zero miliwoltów. Po osiągnięciu konfiguracji z podłączonym ogniwem przełącz się w tryb całego ogniwa z potencjałem utrzymywania minus 60 miliwoltów w oprogramowaniu do akwizycji danych. Następnie delikatnie zastosuj podciśnienie, aby uzyskać dostęp do całej konfiguracji komórek poprzez pęknięcie membrany.

O udanym pęknięciu świadczy natychmiastowy wzrost mierzonej pojemności. Rejestruj protokoły fotoaktywacji w trybie cęgów napięciowych przy napięciu minus 74 miliwoltach z impulsami świetlnymi 300 milisekund lub potencjały czynnościowe w bieżącym trybie cęgowym przy zeru pikoamperów. Aby wyprodukować włókna węglowe, najpierw zamontuj pipetę na uchwytach na pipety ściągacza.

Wyciągnąć szklane kapilary do dwóch pipet o całkowitej długości zwężającej się około 11 milimetrów i końcowej średnicy wewnętrznej około 30 mikrometrów. Następnie za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyrównaj jedną kapilarnę w okręgu orientacyjnym i zgnij ją o maksymalnie 45 stopni, naciskając na końcówkę kapilary za pomocą gięcia. Podgrzej żarnik, aż kapilara utrzyma kąt 45 stopni nawet po wyjęciu giętarki.

Po zgięciu kapilary użyj cienkich kleszczyków wyposażonych w miękką rurkę, aby wyjąć jedno włókno węglowe z rurki i dopasować je do cienkiej końcówki kapilary. Popchnij włókno w kapilarze do zgięcia. Wytnij włókna węglowe tak, aby wystawały na dwa mililitry z końcówki kapilary i użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować włókna do przedniej części każdej kapilary.

Aby skalibrować włókna, przymocuj jedną kapilarnę do uchwytu sterowanego przez mikromanipulator i silnik piezoelektryczny. Przesuń kapilarę w kierunku czujnika i wyrównaj ją względem czujnika. Umieść końcówkę światłowodu w kontakcie z czujnikiem siły, nie wytwarzając żadnej siły.

Całkowity ruch silnika piezoelektrycznego wynosi 60 mikrometrów. Przesuń silnik piezoelektryczny w sześciu krokach po 10 mikrometrów w kierunku czujnika siły. Czujnik ma czułość 0,05 miliniutona na wolt i zakres siły od zera do 0,5 miliniutonów.

Odczytaj zmierzone napięcie dla każdego kroku i usuń włókno węglowe z czujnika. Aby zarejestrować siłę kurczenia się kardiomiocytów, pokryj powierzchnię szkła nakrywkowego Poly-HEMA i umieść go w komorze pomiarowej. Napełnij komorę zewnętrznym roztworem do kąpieli.

Przymocuj obie kapilary obciążone włóknem węglowym do mikromanipulatora stolika i ustaw je pod kątem, tak aby włókna węglowe znajdowały się prawie poziomo do powierzchni komory pomiarowej. Aby sprawdzić, czy włókna są prawidłowo wyrównane, skup się na powierzchni komory pomiarowej, opuść pierwsze włókno i przesuń włókno w poziomie. Końcówka włókna powinna ślizgać się po powierzchni komory pomiarowej.

Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla drugiego włókna. Przy zgaszonych światłach dodaj kilka kropli zawiesiny komórek hodowlanych do komory i zastosuj krótkie impulsy zielonego światła, aby wybrać komórki, które kurczą się w odpowiedzi na stymulację zielonym światłem. Aby przymocować pierwsze włókno, delikatnie ściśnij ogniwo, opuszczając włókno, a następnie zwolnij nacisk.

Podłącz drugie włókno równolegle do pierwszego na drugim końcu kardiomiocytu, aby uzyskać maksymalną liczbę sarkomerów między dwoma włóknami. Po przymocowaniu obu włókien podnieś włókna tak, aby ogniwo nie stykało się już z powierzchnią komory. Ustaw ostrość sarkomerów, ustaw okno śledzenia długości sarkomeru między włóknami i użyj modułu wykrywania krawędzi, aby śledzić wyginanie włókien.

Ustaw obszary detekcji z czerwonymi i zielonymi oknami i zdefiniuj próg przy pierwszej pochodnej śladu natężenia światła. Optycznie nadaj tempo komórce, śledząc długość sarkomeru i wygięcie włókien. W tym przypadku poruszaliśmy się z częstotliwością 0,25 Hz.

Po zarejestrowaniu co najmniej 15 optycznie wywołanych skurczów, pole stymuluje komórkę elektrycznie. Znajdź próg wywoływania skurczów i zastosuj 1,5-krotność napięcia progowego dla stymulacji elektrycznej. W przypadku protokołu hamowania zastosuj bodźce elektryczne w celu wywołania skurczów, a następnie wystawij komórkę na ciągły impuls świetlny o różnym natężeniu światła.

Zapisz co najmniej 15 skurczów po zahamowaniu wywołanym światłem. GtACR1 ulega ekspresji w hodowanych kardiomiocytach królików. Fotoaktywacja GtACR1 przy natężeniu światła wynoszącym cztery miliwaty na milimetr do kwadratu przez 300 milisekund powoduje duże prądy skierowane do wewnątrz przy minus 74 miliwoltach przy zmierzonym prądzie szczytowym 245 pikoamperów.

W tym reprezentatywnym eksperymencie potencjały czynnościowe były wyzwalane albo elektrycznie za pomocą wstrzyknięć prądu 1,5 razy powyżej progu, albo optycznie za pomocą 10-milisekundowych impulsów świetlnych. Kardiomiocyty o stymulacji optycznej wykazywały wolniejszy początek potencjału czynnościowego. Elektrycznie wyzwalane potencjały czynnościowe były hamowane w świetle ciągłym.

Wstrzyknięcia o wyższym prądzie i 1,5-krotne przekroczenie progu podczas długotrwałej aplikacji światła również nie wywołują potencjałów czynnościowych. Kardiomiocyt wygenerował siłę skurczu wynoszącą 232 mikroniutony na milimetr do kwadratu po stymulacji elektrycznej i 261 mikroniutonów na milimetr do kwadratu po stymulacji optycznej. Przedłużone impulsy zielonego światła hamowały skurcze, a nawracające skurcze po zahamowaniu generowały mniejszą siłę skurczu, zgodnie z rozkurczową utratą wapnia z kardiomiocytów królika.

Zalecamy przećwiczenie technik przed przeprowadzeniem eksperymentu, zwłaszcza że ustawienie mikrosond w ciemności może być trudne. jest bardzo ważne podczas analizy kurczliwości kardiomiocytów, ponieważ może wpływać na wytwarzanie siły i relaksację. Różne obciążenia następcze mogą być również stosowane do analizy skurczów izotonicznych i auksotonicznych.

Techniki te pozwalają na scharakteryzowanie biofizycznych efektów aktywacji nowo opracowanych aktywatorów optogenetycznych w kardiomiocytach, co ma kluczowe znaczenie dla wyboru najbardziej odpowiedniego narzędzia optogenetycznego dla każdego eksperymentu. Należy pamiętać, że transdukcja adenowirusa i wszystkie etapy następujące po transdukcji powinny być wykonywane w warunkach II poziomu bezpieczeństwa biologicznego.