Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Nasze badania koncentrują się na arbowirusach, owadach i interakcjach roślin. Pobieranie próbek hemolimfy od małych stawonogów stanowi wyzwanie techniczne dla badań nad chorobami przenoszonymi przez owady. Niniejszy protokół pokazuje naszą precyzyjną i wymierną technikę przeciwdziałania temu problemowi.

Ostatnie osiągnięcia badawcze w zakresie przenoszenia arbowirusów wykazały, że wirusy mogą manipulować kilkoma ważnymi czynnikami wektorowymi, aby przebić się przez barierę gospodarza. Protokół ten jest prostą, opłacalną i cenną techniką, która pozwala na precyzyjne określenie ilościowe hemolimfy. Metoda ta oferuje również cenną technologię do badania interakcji między wirusami a wektorami.

Nasze nadchodzące badania będą koncentrować się na zrozumieniu mechanizmów molekularnych różnych transmisji przez owady wektorowe. Badamy i ulepszamy nowe techniki operacyjne. Do tego badania użyj małych brązowych skoczków roślinnych lub SBPH, hodowanych w sadzonkach ryżu.

Gdy kultury będą gotowe, umieść wyhodowane SBPH w probówce wirówkowej i umieść je w łaźni lodowej na 10 do 30 minut. Następnie umieść zamrożony SBPH na szklanym szkiełku pod mikroskopem stereoskopowym z brzuchem skierowanym do góry i dostosuj ostrość na jego sześciu nogach. Przygotuj dwie precyzyjne pęsety z bardzo cienkimi końcówkami.

Za pomocą jednej pęsety dociśnij ciało owada, aby utrzymać je na miejscu, i ostrożnie ściągnij jedną nogę drugą pęsetą. Następnie delikatnie przyciśnij klatkę piersiową owada, pozwalając hemolimfie przepłynąć przez ranę. Aby pobrać hemolimfę, przygotuj mikropipetę, umieszczając jednomikrolitrową rurkę kapilarną w bańce pipety.

Umieść rurkę kapilarną blisko rany owada, trzymając za gruszkę pipety do mikropipet. Przyłóż końcówkę kapilary do wydzielającej się hemolimfy i zbierz ją. Gdy rurka kapilarna osiągnie żądaną linię skali, lekko zablokuj palcem mały otwór w bańce pipety, aby zatrzymać proces wchłaniania.

Następnie zebraną hemolimfę rozładować do 100 mikrolitrów buforu PBS. Dokładność pobierania hemolimfy została potwierdzona za pomocą SDS-PAGE, która wykazała podobną zawartość białka we wszystkich trzech próbkach hemolimfy pobranych osobno. W przypadku larw całkowite stężenie białka wynosiło około 3,7 miligrama na mililitr.

U dorosłych samic i mężczyzn SBPH stężenia białka wynosiły odpowiednio około 3,5 i 3,6 miligrama na mililitr, nie wykazując istotnej różnicy między trzema próbkami. Larwa hemolimfy wykazywała hemocyty o wielkości od 2 do 20 nanometrów. Ponadto stężenie komórek było porównywalne w trzech pobranych próbkach hemolimfy.