Name: Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Naucz się precyzyjnej metody zbierania hemolimfy z małych stawonogów, takich jak Laodelphax striatellus, wykorzystując mikropipetę i SDS-PAGE do weryfikacji. Technika ta umożliwia badanie interakcji wirus-wektor w arbowirusach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2022YFD1401700) oraz przez Narodową Fundację Nauki Chin (nr 32090013 i nr 32072385).

1. Hodowla owadów
<ol>
	<li>Podnieś SBPH użyte w tym eksperymencie w siewkach ryżu (Oryza sativa cv. Nipponbare). Posadź 20 sadzonek ryżu w inkubatorze (65 mm x 200 mm) i uprawiaj w temperaturze 25 °C w świetle przez 16 godzin, w ciemnym fotoperiodze przez 16 godzin.</li>
</ol>
2. Analiza SBPH dla kolekcji hemolimfy
<ol>
	<li>Włóż SBPH do probówki wirówkowej i umieść je w łaźni lodowej na 10-30 min. 
	UWAGA: Nie umieszczaj SBPH w łaźni lodowej na mniej niż 10 minut, w przeciwnym razie owady mogą się ożywić.</li>
	<li>Umieścić zamrożony SBPH na szkiełku podstawowym (patrz Tabela materiałów) pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów) z brzuchem skierowanym do góry. Dostosuj ostrość na sześciu nogach owada.</li>
	<li>Przygotuj dwie precyzyjne pęsety (patrz tabela materiałów) z bardzo cienkimi końcówkami. Użyj jednej pęsety, aby docisnąć ciało owada, aby utrzymać go na miejscu, a drugą użyj drugiej, aby ostrożnie ściągnąć jedną z nóg owada. 
	UWAGA: W przypadku owadów o twardej skorupie można użyć skalpela okulistycznego do odcięcia jednej z nóg.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij klatkę piersiową owada pęsetą, aby hemolimfa wypłynęła przez ranę. 
	UWAGA: Hemolimfa przedstawia się jako przezroczyste kropelki bez widocznej białej kłaczkówki. Wyrzuć lipid, jeśli jest jakaś biała kłaczkowa, która reprezentuje zanieczyszczenie ciała tłuszczowego.</li>
</ol>
3. Kolekcja hemolimfy za pomocą mikropipet
<ol>
	<li>Przygotuj mikropipetę. Umieścić rurkę kapilarną (patrz tabela materiałów) o objętości 1 μl w bańce pipety (patrz tabela materiałów). Aby uzyskać dokładne pomiary, upewnij się, że linia skali jest widoczna. 
	UWAGA: Konieczny jest mały otwór znajdujący się w górnej części bańki pipety.</li>
	<li>Podczas pobierania hemolimfy należy przytrzymać gruszkę pipety mikropipety i umieścić rurkę kapilarną blisko rany owada. Zbierz hemolimfę wydzielającą się z rany, po prostu dotykając czubka naczynia włosowatego do hemolimfy.</li>
	<li>Lekko zablokuj palcem mały otwór w górnej części bańki pipety, aby zatrzymać proces wchłaniania, gdy płyn wewnątrz rurki kapilarnej osiągnie żądaną linię skali. 
	UWAGA: Pobieraj jedną próbkę 1 μl hemolimfy nieprzerwanie i szybko, aby uniknąć zanieczyszczenia lipidami i zatkania rurki.</li>
	<li>Naciśnij gruszkę pipety, aby rozlać pobraną hemolimfę do 100 μl buforu PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na2HPO4, 1,4 mmol/L KH2PO4, pH 7,2-7,4). 
	UWAGA: Rurkę kapilarną wkłada się do bufora PBS.</li>
	<li>Zmień rurkę kapilarną na nową podczas pobierania kolejnej próbki 1 μl hemolimfy.</li>
</ol>
4. Niebieskie barwienie Coomassie
<ol>
	<li>Pobrać 3 próbki hemolimfy o tej samej objętości (1 μl) od larw 3. stadium zgodnie z protokołami opisanymi w kroku 3 i rozładować pobraną hemolimfę do buforu PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl.</li>
	<li>Dodaj 25 μl 5x buforu ładującego białko (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% w/v SDS, 0,05% w/V błękitu bromofenolowego, 50% w/V glicerolu, 5% w/V β-merkaptoetanolu) do 100 μl rozcieńczonych próbek hemolimfy i podgrzać w celu denaturacji białek.</li>
	<li>Załadować 20 μl ugotowanych próbek do 10% żelu białkowego SDS-PAGE (patrz tabela materiałów) w celu oddzielenia białek.</li>
	<li>Wybarwić żel w roztworze Coomassie Blue (zmieszać 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 z 250 ml izopropanolu, 100 ml lodowatego kwasu octowego i 650 ml ddH2O i odfiltrować wszelkie cząstki za pomocą bibuły filtracyjnej) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie odbarwić żel przez 1 godzinę roztworem odbarwiającym (100 ml kwasu octowego, 400 ml metanolu, 500 ml ddH2O).</li>
</ol>
5. Oznaczanie stężenia białka
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/ml i 0,3125 mg/ml buforem PBS metodą dwukrotnego rozcieńczenia.</li>
	<li>Odessać 5 μl buforu PBS i każde stężenie roztworów BSA w kroku 5.1, dodać 1 ml 1x odczynnika barwnika Bradforda (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Użyj buforu PBS w odczynniku barwnikowym Bradford jako kontroli i zera przy OD = 595 nm. Zmierzyć wartości absorbancji każdego z pozostałych stężeń białka i wykonać krzywą wzorcową.</li>
	<li>Dodać 1 μl hemolimfy z larw, samic lub samców SBPH do 100 μl buforu PBS, a następnie odwirować próbki przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia hemocytów.</li>
	<li>Odessać 90 μl supernatantu do nowej probówki wirówkowej i zmierzyć wartości absorbancji supernatantu zgodnie z instrukcjami w kroku 5.2.</li>
	<li>Obliczyć stężenia białka w próbkach hemolimfy zgodnie z równaniem regresji krzywej standardowej. Uwzględnij w doświadczeniach trzy kontrpróby biologiczne i trzy kontrpróby techniczne.</li>
</ol>
6. Mikroskopijne detekcje
<ol>
	<li>Użyj mikropipet, aby zebrać hemolimfę z 10-15 SBPH na różnych etapach rozwoju. Pobraną hemolimfę dodać do probówki zawierającej 20 μl 4% roztworu paraformaldehydu (patrz tabela materiałów). Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utrwalić hemolimfę.</li>
	<li>Pobrać pipetę z 20 μl utrwalonych hemocytów na środek szkiełka pokrytego silanem (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Wysuszyć kroplę na suszarce do szkiełek. 
	UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia.</li>
	<li>Przykryj próbkę złotym odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) (patrz tabela materiałów) i sprawdź szkiełko pod mikroskopem odwróconym (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja komórek
<ol>
	<li>Za pomocą mikropipety zebrać 1 μl hemolimfy z SBPH i rozpuścić ją w 20 μl buforu PBS.</li>
	<li>Próbki hemolimfy rozcieńczyć pięciokrotnie buforem PBS.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl roztworu hemolimfy do środka komory zliczania komórek (patrz Tabela Materiałów). Przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Policz komórki w pięciu kwadratach na komorze do liczenia komórek (rysunek uzupełniający 1), pod mikroskopem odwróconym (patrz tabela materiałów). Do każdego z doświadczeń należy dołączyć trzy kontrpróby biologiczne oraz trzy kontrpróby techniczne. 
	Komórki/μl = całkowita liczba pięciu środkowych kwadratów × 5 × współczynnik rozcieńczenia × 104</li>
</ol>
8. Analizy statystyczne
<ol>
	<li>Przeprowadzaj analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Utwórz nowy plik, wybierz kolumnę, zaimportuj dane i wygeneruj wykres punktowy z paskiem.</li>
	<li>Oblicz średnią i SD dla każdej grupy danych, korzystając ze statystyk kolumnowych, a następnie użyj jednoczynnikowego narzędzia ANOVA, aby ocenić istotność różnic między grupami. Określić średnią i SD z trzech kontrprób biologicznych za pomocą trzech niezależnych eksperymentów.</li>
</ol>

Collecting Hemolymph from Small Arthropods

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Hemolimfa jest pożywką układu krążenia u stawonogówów, a arbowirusy mogą atakować inne tkanki stawonogów tylko wtedy, gdy są w stanie przetrwać we wrogim środowisku hemolimfy. Pobranie wysokiej jakości próbki hemolimfy jest pierwszym krokiem w badaniu interakcji wektor-wirus, które zachodzą w hemolimfie. Doniesiono, że hemolimfę owada można uzyskać z kilku miejsc na ciele owada, w tym z rany na przedniej nodze, niewielkiego nacięcia w okolicy głowy lub rany łzowej na brzuchu 26,27,28,29.</sup...

Zarówno wirusy zwierzęce, jak i roślinne mogą być przenoszone przez stawonogi, a wirusy te stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego i powodują ogromne straty ekonomiczne w rolnictwie1,2,3. Co ważne, hemolimfa stawonogów, która pełni funkcję układu krążenia i jest istotnym elementem układu odpornościowego u stawonogów, odgrywa ważną rolę w regulacji transmisji arbowirusowej. Wirusy nabyte przez jelita stawonogów są transportowane do innych tkanek dopiero po udanej ucieczce z niekorzystnego środowiska hemolimfy4,5,6,7. Cykl życiowy wirusów w hemolimfie stawonogów obejmuje przeżycie wirusa w płynnym osoczu, wnikanie do hemocytu i transport do innych tkanek, a w hemolimfie<klasie sup zachodzą różne mechanizmy interakcji wirus-wektor="xref">8,9,10,11,12. Na przykład pionowa transmisja RSV przez SBPH jest zależna od interakcji molekularnej między białkiem witellogeniny SBPH a białkiem kapsydu RSV (wirusa ryżowego pasiastego) 13,14. Niektóre wirusy mogą uciec przed odpowiedzią immunologiczną hemolimfy poprzez wiązanie określonych czynników wektorowych15,16,17,18. Dlatego badanie interakcji wektor-wirus w hemolimfie stawonogów jest ważne dla lepszego zrozumienia transmisji arbowirusa.
Półimimfa niektórych małych owadów, takich jak skoczki roślinne, skoczki liściowe i niektóre komary, jest trudna do zebrania ze względu na ich rozmiar. Aby rozwiązać ten problem, opracowano kilka metod zbierania hemolimfy, w tym wprowadzenie igły strzykawkowej bezpośrednio do ciała owada w celu ekstrakcji mikroobjętości hemolimfy, zbieranie wysięku z miejsca rany za pomocą pęsety z cienką końcówką oraz bezpośrednie wirowanie. Metody te umożliwiły pomiar względnych poziomów ekspresji genów i mian wirusów w obrębie klasy hemolymph<sup="xref">19,20,21. Jednak skuteczna metoda ilościowego określania objętości hemolimfy, która jest niezbędna do liczenia hemocytów, kwantyfikacji białek i analizy aktywności enzymów, nie jest obecnie dostępna dla tych małych owadów.
SBPH (mały brązowy skoczek) to rodzaj małego owada o długości ciała około 2-4 mm. SBPH jest zdolny do przenoszenia różnych wirusów roślinnych, w tym RSV, wirusa szorstkiego karłowatego kukurydzy i wirusa czarnego karła ryżowego22,23,24. Interakcja między SBPH a RSV została dogłębnie zbadana w ciągu ostatniej dekady. Aby ułatwić pracę z SBPH, opracowaliśmy nowatorską i prostą metodę zbierania hemolimfy. Ta metoda, która opiera się na zasadzie sił kapilarnych, wykorzystuje kapilarnę ze znacznikiem skali, aby uzyskać hemolimfę owada w precyzyjny i wymierny sposób. Dzięki temu możemy skutecznie zebrać określoną objętość hemolimfy od małych owadów i bardziej szczegółowo zbadać środowisko hemolimfy małych wektorów.

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE żel białkowy</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Separacja i detekcja białek</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td></td><td>Solarbio P1110</td><td>Do utrwalania komórek lub tkanek&nbsp;</td></tr><tr><td>Odczynnik barwnikowy Bradford</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>Wykrywanie stężenia białka</td></tr><tr><td>Kapilara</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Do zbierania hemolimfy</td></tr><tr><td>Komora do liczenia komórek</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Liczenie hemocytów</td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>szklane Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Do trzymania owadów</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane pokryte silanem</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Do przechowywania próbek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Barwienie jąder</td></tr><tr><td>Szkło pokrywy mikroskopu</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Do obserwacji mikroskopowej</td></tr><tr><td>Żarówka do pipet</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Do zbierania hemolimfy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Prism 8.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>/</td><td>Analizy statystyczne</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Do preparacji owadów</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Do preparacji owadów</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Obserwacja hemocytów</td></tr></tbody></table>

precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Stawonogi są znane z przenoszenia różnych wirusów o znaczeniu medycznym i rolniczym poprzez swoją hemolimfę, co jest niezbędne do przenoszenia wirusów. Kolekcja Hemolymph to podstawowa technologia do badania interakcji wirus-wektor. W tym miejscu opisujemy nowatorską i prostą metodę ilościowego zbierania hemolimfy od małych stawonogów przy użyciu Laodelphax striatellus (mały brązowy skoczek roślinny, SBPH) jako modelu badawczego, ponieważ ten stawonogów jest głównym wektorem wirusa pasków ryżowych (RSV). W tym protokole proces rozpoczyna się od delikatnego uszczypnięcia jednej nogi zamrożonego stawonoga pęsetą z cienką końcówką i wyciśnięcia hemolimfy z rany. Następnie prosta mikropipeta składająca się z kapilary i gruszki pipety służy do zbierania transudywnej hemolimfy z rany zgodnie z zasadą sił kapilarnych. Na koniec zebraną hemolimfę można rozpuścić w określonym buforze do dalszych badań. Ta nowa metoda zbierania hemolimfy od małych stawonogów jest użytecznym i skutecznym narzędziem do dalszych badań nad arbowirusami i interakcjami wektor-wirus.

Model mikropipety i pobieranie hemolimfy 
Opracowaliśmy prostą mikropipetę, której działanie opiera się na siłach kapilarnych rurki kapilarnej. Mikropipeta składa się z rurki kapilarnej oraz gruszki do pipetowania (Rysunek 1A). Rurki kapilarne są dostępne w różnych rozmiarach objętości od 1 µL do 20 µL, a objętość rurki kapilarnej jest dobierana zgodnie z wymaganiami. Nie zaleca się stosowania rurek kapilarnych o mniejszych objętościach, ponieważ bardzo wąskie otwory rure...

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Nasze badania koncentrują się na arbowirusach, owadach i interakcjach roślin. Pobieranie próbek hemolimfy od małych stawonogów stanowi wyzwanie techniczne dla badań nad chorobami przenoszonymi przez owady. Niniejszy protokół pokazuje naszą precyzyjną i wymierną technikę przeciwdziałania temu problemowi.Ostatnie osiągnięcia badawcze w zakresie przenoszenia arbowirusów wykazały, że wirusy mogą manipulować kilkoma ważnymi czynnikami wektorowymi, aby przebić się przez barierę gospodarza. Protokół ten jest prostą, opłacalną i cenną techniką, która pozwala na precyzyjne określenie ilościowe hemolimfy. Metoda ta oferuje również cenną technologię do badania interakcji między wirusami a wektorami.Nasze nadchodzące badania będą koncentrować się na zrozumieniu mechanizmów molekularnych różnych transmisji przez owady wektorowe. Badamy i ulepszamy nowe techniki operacyjne. Do tego badania użyj małych brązowych skoczków roślinnych lub SBPH, hodowanych w sadzonkach ryżu.Gdy kultury będą gotowe, umieść wyhodowane SBPH w probówce wirówkowej i umieść je w łaźni lodowej na 10 do 30 minut. Następnie umieść zamrożony SBPH na szklanym szkiełku pod mikroskopem stereoskopowym z brzuchem skierowanym do góry i dostosuj ostrość na jego sześciu nogach. Przygotuj dwie precyzyjne pęsety z bardzo cienkimi końcówkami.Za pomocą jednej pęsety dociśnij ciało owada, aby utrzymać je na miejscu, i ostrożnie ściągnij jedną nogę drugą pęsetą. Następnie delikatnie przyciśnij klatkę piersiową owada, pozwalając hemolimfie przepłynąć przez ranę. Aby pobrać hemolimfę, przygotuj mikropipetę, umieszczając jednomikrolitrową rurkę kapilarną w bańce pipety.Umieść rurkę kapilarną blisko rany owada, trzymając za gruszkę pipety do mikropipet. Przyłóż końcówkę kapilary do wydzielającej się hemolimfy i zbierz ją. Gdy rurka kapilarna osiągnie żądaną linię skali, lekko zablokuj palcem mały otwór w bańce pipety, aby zatrzymać proces wchłaniania.Następnie zebraną hemolimfę rozładować do 100 mikrolitrów buforu PBS. Dokładność pobierania hemolimfy została potwierdzona za pomocą SDS-PAGE, która wykazała podobną zawartość białka we wszystkich trzech próbkach hemolimfy pobranych osobno. W przypadku larw całkowite stężenie białka wynosiło około 3,7 miligrama na mililitr.U dorosłych samic i mężczyzn SBPH stężenia białka wynosiły odpowiednio około 3,5 i 3,6 miligrama na mililitr, nie wykazując istotnej różnicy między trzema próbkami. Larwa hemolimfy wykazywała hemocyty o wielkości od 2 do 20 nanometrów. Ponadto stężenie komórek było porównywalne w trzech pobranych próbkach hemolimfy.

a-precise-quantifiable-method-for-collecting-hemolymph-from-small

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Amerykański krab podkowy, Limulus polyphemus, jest prawdopodobnie najdogodniejszym źródłem dużych ilości krwi wśród wszystkich bezkręgowców. Krew ma prosty skład, z tylko jednym typem komórek w krążeniu ogólnym – amebocytem ziarnistym – oraz tylko trzema dominującymi białkami w osoczu: hemocyjaniną, białkami reaktywnymi C oraz α2-makroglobuliną. Krew pobierana jest z serca, a komórki krwi i osocze rozdziela się poprzez wirowanie.

Pobieranie krwi z amerykańskiego kraba podkowiastego, Limulus polyphemus

Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.

Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Hemocyty owadów pełnią wiele istotnych funkcji, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, na wszystkich etapach rozwoju owada. Nasza obecna wiedza na temat typów i funkcji hemocytów pochodzi z badań nad genetycznymi modelami owadów. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę izolacji, kwantyfikacji i wizualizacji hemocytów z dzikich gąsienic.

Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Ten film demonstruje test zaburzeń hemocytów, oceniając ponowne przyleganie hemocytów do kieszeni krwiotwórczych larw Drosophila. Zakłócenia mechaniczne uwalniają rezydujące hemocyty, podnosząc liczbę krążących hemocytów. Po wyzdrowieniu potwierdza się ponowne przyleganie rezydentnych hemocytów, co ilustruje odwracalność.

Test zaburzeń hemocytów w celu oceny readhezji hemocytów do kieszonek krwiotwórczych

Krwinki Drosophila, czyli hemocyty, krążą między miejscami rezydentnymi a krążeniem.  U larwy hemocyty rezydentne (siedzące) lokalizują się w mikrośrodowiskach indukcyjnych, kieszeniach krwiotwórczych, podczas gdy krążące hemocyty poruszają się swobodnie w hemolimfie. Celem tego protokołu jest standaryzowana izolacja i kwantyfikacja tych dwóch, behawioralnie odrębnych, ale wymiennych populacji hemocytów.

Oznaczanie populacji krwinek larwy Drosophila melanogaster

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Naucz się precyzyjnej metody zbierania hemolimfy z małych stawonogów, takich jak Laodelphax striatellus, wykorzystując mikropipetę i SDS-PAGE do weryfikacji. Technika ta umożliwia badanie interakcji wirus-wektor w arbowirusach.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Przeglądaj więcej filmów