Name: Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę transformacji z użyciem Agrobacterium tumefaciens do inżynierii genetycznej mikroalg Chlorella vulgaris. Protokół umożliwia uzyskanie stabilnych transformantów do badań funkcjonalnych genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Paulowi Hooykaasowi za uprzejme dostarczenie wektora pCAMBIA1302 i Agrobacterium tumefaciens AGL1 z Instytutu Biologii w Lejdzie, Uniwersytetu w Lejdzie, Holandia. Autorzy chcieliby również podziękować Evie Colic za pomoc w uprawie transformantów fluorescencyjnych. Praca ta została sfinansowana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych oraz program Mitacs Accelerate.

Wszystkie media i roztwory muszą być autoklawowane przed użyciem, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie probówki wirówkowe, końcówki do pipet itp. powinny być sterylne lub autoklawowane przed użyciem. Dla ułatwienia informacji, receptury pożywek stosowane w tym protokole są wymienione w tabeli 1.
1. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek A. tumefaciens 
<ol>
	<li>Zaszczepić Agrobacterium (AGL-1) w sterylnej kolbie wytrząsającej o pojemności 25 ml z pożywką LB (uzupełnioną ryfampicyną, 20 mg/L-1) z zamrożonego glicerolu i rosnąć przez noc w temperaturze 28-30 °C i 150 obr./min. 
	UWAGA: Szczep Agrobacterium AGL-1 jest (patrz tabela materiałów) odporny na ryfampicynę, ampicylinę, chloramfenikol i streptomycynę i można go uzyskać od kilku dostawców.</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć kulturę 1 000 000 razy, dodając 0,5 μl kultury na noc do 50 ml autoklawowanej ultraczystej wody i rozprowadzić 10 μl tej rozcieńczonej kultury na płytce LB, a następnie inkubować w temperaturze 28-30 °C przez 1-3 dni.</li>
	<li>Wybierz kolonię i rozpocznij 20 ml nocnej hodowli w LB z ryfampicyną w temperaturze 28-30 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zaszczepić 500 ml pożywki LB (bez antybiotyku) w kolbie z wytrząsarką z 9 ml nocnej kultury i rosnąć w temperaturze 28-30 °C, aż OD600 osiągnie 0,5.</li>
	<li>Podzielić kulturę równomiernie na dziesięć probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i schłodzić na lodzie przez 30 minut. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Odwirować probówki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Następnie usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w każdej probówce w 50 ml lodowatej wody.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml lodowatej wody w każdej probówce.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego 10% (w/v) glicerolu w każdej probówce.</li>
	<li>Połączyć wszystkie probówki w jedną probówkę o pojemności 50 ml i odwirować komórki w temperaturze 4 °C i 4000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl lodowatej glicerolu o stężeniu 10% (w/v). Koncentracja komórek powinna wynosić około 1-3 x 1010 komórek/ml.</li>
	<li>Rozprowadzić komórki w postaci podwielokrotności 50 μl w sterylnych, wstępnie schłodzonych mikroprobówkach. Zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Elektroporacja A. tumefaciens
<ol>
	<li>Dodać 50 μl elektrokompetentnych komórek AGL-1 A. tumefaciens do wstępnie schłodzonej kuwety 0,1 mm i dodać 2 μl plazmidu pCAMBIA1302 lub podobnego plazmidu (stężenie 15 ng/μl) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Elektroporować przy napięciu 2400 V za pomocą elektroporatora (200 Ω, przedłużacz pojemności 250 μFD, pojemność 25 μFD, zanik wykładniczy, patrz tabela materiałów). Stała czasowa powinna wynosić >4,5 ms, aby elektroporacja zakończyła się sukcesem z rozpadem wykładniczym.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 1 ml pożywki LB do kuwety i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieść 1 ml zawieszonych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 28-30 °C przez co najmniej 1 godzinę w celu odzyskania sprawności.</li>
	<li>Umieść komórki na agarze LB zawierającym odpowiedni antybiotyk (tj. 50 mg/l kanamycyny dla pCAMBIA1302 do selekcji prokariotycznej).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 28-30 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Wybierz jedną kolonię, hoduj przez noc w LB z odpowiednią selekcją (50 mg/L kanamycyny dla pCAMBIA1302) i kriokonserwuj szczep zawierający plazmid przy użyciu 50% glicerolu w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. AMT C. vulgaris
UWAGA: Przygotuj kultury C. vulgaris (UTEX 395, zobacz Tabelę Materiałów) i A. tumefaciens równolegle do wspólnej hodowli. Hodowlę bakterii C. vulgarinależy rozpocząć na 3 dni przed przygotowaniem kultur bakterii A. tumefaciens. Protokół został zmodyfikowany na podstawie tego opublikowanego przez Kumar et al.7.
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę C. vulgaris 
	<ol>
		<li>C. vulgaris jest tradycyjnie przechowywany na skosach lub utrzymywany w kulturach w fazie logarytmicznej w warunkach oświetleniowych. Z kultury w fazie logarytmicznej przy OD600 = 1,0, rozprowadzić 0,5 ml na płytkach agarowych z tris-acetat-fosforanu (TAP, patrz Tabela 1) i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 25 °C z oświetleniem (50 μE/m2s). Da to około 5 x 106 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kulturę A. tumefaciens 
	<ol>
		<li>Wyhodować szczep A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 w kolbie wytrząsającej, zaszczepiając 10 ml pożywki LB uzupełnionej 15 mM glukozy, 20 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l kanamycyny (patrz tabela materiałów) przy użyciu glicerolu. Inkubować przez noc w temperaturze 28-30 °C i 250 obr./min.</li>
		<li>Zaszczepić 1 ml kultury przez noc w 50 ml LB z 15 mM glukozy, 20 mg/l ryfampicyny i 50 mg/l kanamycyny i inkubować w temperaturze 28-30 °C i 250 obr./min, aż OD600 osiągnie 1,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Współuprawa C. vulgaris i A. tumefaciens
	<ol>
		<li>Aby przygotować kulturę A. tumefaciens do wspólnej hodowli, przenieś wyhodowaną kulturę do probówki o pojemności 50 ml i odwiruj przy 4000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety i dwukrotnie przemyć komórki pożywką indukcyjną. 
		UWAGA: Stosowane media indukcyjne to media TAP dostosowane do pH 5,5 i uzupełnione metalami śladowymi F/2 medium i witaminami z acetosyringonem 200 μM (AS, patrz tabela materiałów). Ponownie zawiesić ogniwa w mediach indukcyjnych tak, aby OD600 = 0,5.</li>
		<li>Aby przygotować kulturę C. vulgaris do wspólnej hodowli, dodać 25 ml pożywki indukcyjnej do płytki C. vulgaris zawierającej ~ 5 x 106 komórek. Przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 4000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Wymieszać osad z komórek glonów z 200 μl zawiesiny bakteryjnej (OD600: 0,5) i inkubować je w wytrząsarce obrotowej w temperaturze 21-25 °C przy 150 obr./min przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozprowadzić mieszaną kulturę (200 μl) na płytkach indukcyjnych uzupełnionych 15 mM glukozy i inkubować w temperaturze 21-25 °C w ciemności przez 3 dni.</li>
		<li>Po 3 dniach należy użyć 10 ml pożywki TAP uzupełnionej cefotaksymem o stężeniu 400 mg/l lub 20 mg/l tetracykliny (patrz tabela materiałów) w celu zebrania mikroalg i inkubacji w ciemności w temperaturze 21-25 °C przez 2 dni w celu wyeliminowania A. tumefaciens z hodowli.</li>
		<li>Umieścić 500 μl kultury na selektywnych pożywkach, np. pożywkach TAP uzupełnionych 20-70 mg/l higromycyny B (w przypadku stosowania pCAMBIA1302) i 400 mg/L-1 cefotaksymu lub 20 mg/l tetracykliny. Inkubować w temperaturze 21-25 °C w ciemności przez 2 dni przed umieszczeniem ich w oświetlonej komorze. 
		UWAGA: Odporne kolonie pojawią się 5-7 dni po ekspozycji na światło.</li>
		<li>Pobrać pojedyncze kolonie z płytki transformacyjnej i ponownie rozprowadzić je na płytkach agarowych TAP uzupełnionych 400 mg/l cefotaksymu lub 20 mg/l tetracykliny i 20-70 mg/l higromycyny B.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Colony PCR (cPCR) w celu potwierdzenia integracji genów w transformantach C. vulgaris 
<ol>
	<li>Wyodrębnić genomowe DNA z transformantu C. vulgaris po co najmniej dwukrotnej subkulturze z jednej kolonii przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA roślinnego (zob. tabela materiałów). Używając tego jako matrycy do PCR, zaprojektuj startery dla regionu mgfp5 T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' i M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
	<ol>
		<li>Korzystając z zestawu do mieszania głównej polimerazy DNA o wysokiej wierności Q5 (patrz tabela materiałów), przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), aby zwalidować integrację transgenu. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące warunki: 98 °C przez 3 min; 35 cykli (98 °C przez 10 s, 57 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min); 72 °C przez 5 min. Stosować pCAMBIA1302 jako kontrolę pozytywną i genomowe DNA C. vulgaris typu dzikiego jako kontrolę negatywną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby potwierdzić, że w próbce nie ma pCAMBIA1302 z powodu pozostałego zanieczyszczenia A. tumefaciens, należy użyć PCR kolonii. Dodać niewielką ilość komórek transformacyjnych do 10 μl sterylnej wody i gotować w temperaturze 98 °C przez 15 minut. Użyj tego jako szablonu do PCR.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery dla regionu poza T-DNA na pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAAGAACTTTTC 3' i B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3'). 
		UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące warunki: 94 °C przez 3 min; 30 cykli (94 °C przez 30 s, 48 °C przez 30 s, 68 °C przez 5 min); 68 °C przez 7 min. Użyć gotowanej kolonii A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) jako kontroli pozytywnej i gotowanej kolonii C. vulgaris typu dzikiego jako kontroli ujemnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby potwierdzić, że w próbce nie ma zanieczyszczenia A. tumerfaciens, należy użyć PCR kolonii. Dodać niewielką ilość komórek transformacyjnych do 10 μl sterylnej wody i gotować w temperaturze 98 °C przez 15 minut. Użyj tego jako szablonu do PCR.
	<ol>
		<li>Projektowanie starterów dla genu virE2 zawartego w plazmidzie wirulencji AGL-1 (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' i virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3'). 
		UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące warunki: 94 °C przez 3 min; 30 cykli (94 °C przez 30 s, 53 °C przez 30 s, 68 °C przez 3 min); 68 °C przez 7 min. Użyć gotowanej kolonii A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) jako kontroli pozytywnej i gotowanej kolonii C. vulgaris typu dzikiego jako kontroli ujemnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom próbki PCR na żelu agarozowym DNA wraz z drabinką (drabinka DNA 1 Kbp, patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić rozmiar otrzymanych fragmentów16.</li>
</ol>
5. Pomiar fluorescencji transformantów
<ol>
	<li>Inokulować każdy transformant z kultury podtrzymującej w fazie logarytmicznej lub skosie agaru TAP w 50 ml TAP uzupełnionego cefotaksymem 200 mg/L-1 i higromycyną B 25 mg/L-1 tak, aby początkowy ODwynosił 600 = 0,1. Zaszczepić jedną kulturę C. vulgaris typu dzikiego i tylko 200 mg/L-1 cefotaksymem jako kontrolę negatywną. Inkubować w temperaturze 25 °C przy 150 obr./min przy 150 μmol/m2s światła aktywnego fotosyntetycznie (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Co 24 godziny pobierać próbkę o objętości 300 μl i mierzyć absorbancję i fluorescencję (wzbudzenie 488 nm, emisja 526 nm) w 96-dołkowym czytniku płytek lub spektrometrze UV/Vis i fluorometrze (patrz tabela materiałów). Do jednoczesnych pomiarów należy użyć czarnej płytki z przezroczystym dnem.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja białka surowego, oczyszczanie białek i elektroforeza SDS-PAGE
<ol>
	<li>Zaszczepić transformant (#50) z kultury podtrzymującej w fazie logarytmicznej do 300 ml TAP uzupełnionego cefotaksymem 200 mg/L-1 i 25 mg/L-1 higromycyną B, aby osiągnąć OD680 = 0,1. Zaszczepić jedną kulturę C. vulgaris typu dzikiego i tylko 200 mg/L-1 cefotaksymem jako kontrolę negatywną. Inkubować w temperaturze 25 °C przy 150 obr./min przy 150 μmol/m2s światła aktywnego fotosyntetycznie.</li>
	<li>Ekstrahować surową próbkę białka z transformantu (#50) i szczepów typu dzikiego za pomocą 5 ml buforu do lizy (patrz Tabela 1), a następnie przeprowadzić sonikację przez 4 minuty.</li>
	<li>Oczyść surową próbkę białka żywicą Ni-NTA przez kolumny polipropylenowe o pojemności 5 ml (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Liofilizuj 15 ml oczyszczonych próbek białka i zawieś je ponownie w 1 ml buforze do lizy do analizy SDS-PAGE17.</li>
</ol>

Stable Gene Integration in Chlorella vulgaris Using Agrobacterium tumefaciens

<ol><li>Smith, E. F., Townsend, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+tumor+of+bacterial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A plant tumor of bacterial origin.</a> Science. 25 (643), 671-673 (1907).</li>
<li>Chilton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+incorporation+of+plasmid+DNA+into+higher+plant+cells%3A+The+molecular+basis+of+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis.</a> Cell. 11 (2), 263-271 (1977).</li>
<li>De Cleene, M., De Ley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+range+of+crown+gall%5BTitle%5D)+AND+%22The+Botanical+Review%22%5BJournal%5D)">The host range of crown gall.</a> The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).</li>
<li>Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+and+plant+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium and plant genetic engineering.</a> Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).</li>
<li>Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+T-DNA+transfer+from+Agrobacterium+tumefaciens+to+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae.</a> The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).</li>
<li>Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacteriumtumefaciens-mediated+transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).</li>
<li>Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+the+green+alga-Chlamydomonas+reinhardtii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).</li>
<li>de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacteriumtumefaciens-mediated+transformation+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).</li>
<li>Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small%2C+versatile+pPZP+family+of+Agrobacterium+binary+vectors+for+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).</li>
<li>Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+new+generation+of+expression+toolkits+for+engineering+of+green+microalgae%3B+robust+production+of+human+interleukin-2%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2.</a> BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).</li>
<li>Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+production+of+a+functional+SARS-CoV-2+spike+receptor+binding+domain+in+the+green+algae+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii.</a> PLoS One. 16, e0257089(2021).</li>
<li>Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+anti-lipopolysaccharide+factor+isoform+3+in+Chlamydomonas+reinhardtii+showing+high+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity.</a> Marine Drugs. 19 (5), 239(2021).</li>
<li>Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydomonas+reinhardtii-expressed+multimer+of+ToAMP4+inhibits+the+growth+of+bacteria+of+both+Gram-positive+and+Gram-negative%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative.</a> Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).</li>
<li>Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promising+future+of+microalgae%3A+current+status%2C+challenges%2C+and+optimization+of+a+sustainable+and+renewable+industry+for+biofuels%2C+feed%2C+and+other+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products.</a> Microbial Cell Factories. 17, 36(2018).</li>
<li>Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+factors+affecting+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+the+unicellular+green+alga%2C+Chlorella+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+Guide+to+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+and+Detection.+Bulletin+6040%2C+Rev+C%22">A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C</a>. , Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed March (2023).</li>
<li>NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. , New England Biolabs Inc. Accessed March
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol">https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol</a> (2023).</li>
<li>Ward, V. C. A., Rehmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+media+optimization+for+mixotrophic+cultivation+of+Chlorella+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris.</a> Scientific Reports. 9, 19262(2019).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorton%2C+ER+%22Current+Protocols+in+Microbiology.+Chapter+1%3A+Unit+3D.1%22">Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1</a>. , (2012).</li>
<li>Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+of+strawberry+cv.+Camarosa+by+a+dual+plasmid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system.</a> Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).</li>
<li>Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+use+and+abuse%3A+a+threat+to+mitochondria+and+chloroplasts+with+impact+on+research%2C+health%2C+and+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment.</a> Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+DNA+repair+and+Agrobacterium+T-DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458(2021).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Efektywność transformacji wiąże się z kilkoma różnymi parametrami. Wybór szczepów A. tumefaciens stosowanych w AMT ma kluczowe znaczenie. AGL-1 jest jednym z najbardziej inwazyjnych odkrytych szczepów i z tego powodu jest rutynowo stosowany w roślinnym AMT. Uzupełnienie pożywki indukcyjnej glukozą (15-20 mM) jest również ważne dla skuteczności AMT. Biorąc pod uwagę, że C. vulgaris może rosnąć zarówno w warunkach fototroficznych, jak i heterotroficznych, glukoza lub inne źródła węgla są często pomijane w...

Agrobacterium tumefaciens, gram-ujemna bakteria przenoszona przez glebę, posiada unikalną zdolność transferu genów między królestwami, dzięki czemu zyskała tytuł "naturalnego inżyniera genetycznego"1. Bakteria ta może przenosić DNA (T-DNA) z plazmidu indukującego nowotwór (plazmid Ti) do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu IV, co powoduje integrację i ekspresję T-DNA w genomie gospodarza1,2,3,4. W środowisku naturalnym proces ten prowadzi do powstawania nowotworów u roślin, powszechnie znanych jako choroba żółciowa korony. Jednak Agrobacterium może również przenosić T-DNA do różnych innych organizmów, w tym drożdży, grzybów, glonów, zarodków jeżowców, a nawet komórek ludzkich w warunkach laboratoryjnych5,6,7,8.
Wykorzystując ten naturalny system, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) umożliwia losową integrację interesujących genów z genomem jądrowym komórki gospodarza poprzez modyfikację regionu T-DNA plazmidu Ti. W tym celu powszechnie stosowanym wektorem ekspresji roślinnej AMT jest pCAMBIA13029. Naukowcy mogą zastosować proste procesy klonowania E. coli przed przeniesieniem pożądanego wektora do A. tumefaciens w celu późniejszego przeniesienia do gospodarza zainteresowania.
Zielone mikroalgi to eukarionty, które mają wiele podobieństw do roślin lądowych, ale są bardzo odporne na modyfikacje genetyczne. Jednak transformacja genetyczna odgrywa kluczową rolę zarówno w podstawowych, jak i biotechnologicznych badaniach nad mikroalgami. W przypadku kilku gatunków mikroalg, w szczególności Chlamydomonas reinhardtii, transformacja genetyczna za pomocą AMT z powodzeniem wprowadziła transgeny, takie jak ludzka interleukina-2 (hIL-2), domena wiążąca receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2 RBD) oraz dwa peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs)10,11,12,13. Wśród nich Chlorella vulgaris, mniej wybredny i szybko rosnący gatunek zielonych alg, ma znaczny potencjał w zakresie zrównoważonej produkcji węglowodanów, białek, nutraceutyków, pigmentów i innych wysokowartościowych związków14. Jednak brak niezawodnych narzędzi do tworzenia transgenicznych szczepów C. vulgaris hamuje jego komercyjny rozwój. Ze względu na ograniczoną liczbę opublikowanych prac wykorzystujących AMT w C. vulgaris15 oraz biorąc pod uwagę znaczne różnice między uprawą roślin a uprawą mikroalg, optymalizacja protokołu AMT staje się niezbędna.
W tym badaniu, badacze umieścili zielone białko fluorescencyjne (mGFP5) poniżej promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (CamV) i dodali znacznik histydyny, aby użyć go jako genu reporterowego do ekspresji białka. Transformanty wyselekcjonowano przy użyciu higromycyny B, a po subkulturze przez ponad dwadzieścia pokoleń przemiana pozostała stabilna. Plazmid pCAMBIA1302 zastosowany w tej pracy może być łatwo przystosowany do zawierania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto przedstawiona metoda i materiały mogą być dostosowane do innych gatunków zielonych alg z aktywnym promotorem CamV35S, ponieważ ten promotor jest używany do selekcji higromycyny.

<table><tbody><tr><td>1 Kb Plus drabinka DNA</td><td>FroggaBio</td><td>DM015</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Fisher Scientific</td><td>D26665G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>Szczep: AGL-1; Prezent od prof. Paula Hooykaasa</td><td>Genotyp: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA</td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>89151-400</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>AK Scientific</td><td>J90010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorella vulgaris</td><td>University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Szczep:</td><td>UTEX 395</td><td>Wildtype</td></tr><tr><td>szczep CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8661-25G</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>CX2185-1</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9234-500G</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td>Jednostka główna wyposażona w moduł PC.</td></tr><tr><td>GeneJET Zestaw do oczyszczania genomu roślinnego</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0791</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>VWR</td><td>CABDH3093-2,2P</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>BioBasic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6068103</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>K-250-25</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>JT Baker</td><td>BAKR2540-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>VWR</td><td>BDH7971-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA&middot; 2H2O</td><td>JT Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>JT Baker</td><td>BAKR3764-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>BDH7257-7</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>CA80058-650</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3&nbsp; </td><td>VWR</td><td>BDH4574-500G</td><td></td></tr><tr><td>NEBExpress Ni Resin</td><td>NewEngland BioLabs</td><td>NEB #S1427</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>VWR</td><td>BDH9208-500G</td><td></td></tr><tr><td>pCAMBIA1302</td><td>Leiden University</td><td>Prezent od prof. Paula Hooykaasa</td><td>pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, promotor CaMV 35S/mgpf5-6xhis/NOS terminator)</td></tr><tr><td>Kolumny polipropylenowe (5 ml)</td><td>QIAGEN</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Niebarwione wzorce białkowe, rekombinowane ze znacznikami Strep, 1 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Millipore Sigma</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Taśma LED SunBlaster 48 cali&nbsp;</td><td></td> Spektrometr UV/Vis <td>SunBlaster</td> 210000000906 <td></td></tr><tr><td>Synergy 4 Microplate&nbsp;</td><td>BioTEK</td><td>S4MLFPTA</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>CAAAJ61714-14</td><td></td></tr><tr><td>TGX Zestaw do usuwania plam z akrylamidu FastCast, 12%</td><td>Bio-Rad</td><td>1610185</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>TCI America</td><td>T0181-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BioBasic</td><td>TG217(G211)</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B12 (cyjanokobalamina)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>89151-436</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>JT Baker</td><td>4382-01</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem agrobacterium tumefaciens, chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) służy jako szeroko stosowane narzędzie do manipulowania genomami roślin. Jednak A. tumefaciens wykazuje zdolność do transferu genów do różnych gatunków. Wiele gatunków mikroalg nie ma dobrze ugruntowanych metod niezawodnej integracji genów będących przedmiotem zainteresowania z ich genomem jądrowym. Aby wykorzystać potencjalne korzyści płynące z biotechnologii mikroglonów, kluczowe znaczenie mają proste i skuteczne narzędzia do manipulacji genomem. W niniejszym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół AMT dla przemysłowych gatunków mikroalg Chlorella vulgaris, wykorzystujący białko zielonej fluorescencji reporterowej (mGFP5) i marker oporności na antybiotyki dla higromycyny B. Mutanty są wybierane poprzez posiew na pożywce tris-acetate-fosforanu (TAP) zawierającej higromycynę B i cefotaksym. Ekspresja mGFP5 jest określana ilościowo za pomocą fluorescencji po ponad dziesięciu pokoleniach subhodowli, co wskazuje na stabilną transformację kasety T-DNA. Protokół ten pozwala na niezawodne wygenerowanie wielu transgenicznych kolonii C. vulgaris w czasie krótszym niż dwa tygodnie, przy użyciu dostępnego na rynku wektora ekspresji roślinnej pCAMBIA1302.

Aby pokazać udaną transformację za pomocą powyższej metody, C. vulgaris był hodowany z AGL-1 zawierającym plazmid pCAMBIA1302 lub bez plazmidu (typu dzikiego i posiażdżonego na agarze TAP uzupełnionym higromycyną B i cefotaksymem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Skrajna lewa płytka pokazuje przekształcone kolonie zdolne do wzrostu na płytkach higromycyny B / cefotaksymu, a środkowa płytka pokazuje, że AGL-1 typu dzikiego nie może rosnąć na płytkach higromycyny B / cefotaksymu. Skrajna prawa tabliczka pokazuje, ...

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

Zakres badań koncentrował się na opracowaniu i optymalizacji protokołu przemiany chlorelli vulgaris. Naszym celem jest stworzenie stabilnych transgenicznych szczepów chlorelli vulgaris, przy użyciu agrobacterium tumefaciens i specyficznego plazmidu pCAMBIA 13 02, który pozwolił na wprowadzenie genu będącego przedmiotem zainteresowania i potencjału do zastosowań biotechnologicznych. Inżynieria metaboliczna i biologia syntetyczna, mikroskopia i obrazowanie, koszt CRISPR, edycja dziewięciu genów, bioinformatyka, modelowanie obliczeniowe, teledetekcja i obrazowanie satelitarne, nanotechnologiczne przetwarzanie dwutechnologiczne i przetwarzanie końcowe.Badanie to wprowadza zoptymalizowany protokół transformacji pożywki tophaceous microbacterium dla mikroalg, chlorella vulgaris. Za pomocą określonego plazmidu i markera. Stanowi on podstawę do udoskonalenia biotechnologii mikroalg, pokonując wcześniejsze ograniczenia w zakresie niezawodnych narzędzi do przekształcania C. vulgaris.Zacznij od rozcieńczenia 0,5 mikrolitra nocnych kultur kultur Agrobacterium tumefaciens 50 mililitrami autoklawowanej ultraczystej wody. Rozprowadź 10 mikrolitrów tej rozcieńczonej kultury na bulionie lizogenicznym lub płytce LB. Inkubuj płytkę w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni.Teraz zaszczep pojedynczą kolonię w 20 mililitrach pożywki LB uzupełnionej ryfampicyną. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia zaszczepić 500 mililitrów zwykłej pożywki LB w kolbie wytrząsarskiej z dziewięcioma mililitrami kultury przez noc.Umieść kultury na shakerze w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza. Po inkubacji i podzieleniu kultur na probówki, odwirować schłodzone probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4 000 G przez 15 minut. Za pomocą pipety usunąć supernatant.I ponownie zanurz każdą granulkę w 50 mililitrach lodowatej wody. Po odcentrowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 25 mililitrach lodowatej wody w każdej probówce, odwirować jak poprzednio. Następnie ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze lodowatego 10% glicerolu.Teraz połącz zawartość wszystkich probówek w jedną 50-mililitrową probówkę przed odwirowaniem. Na koniec, po wyrzuceniu supernatentu, ponownie zawieś granulat w 400 mikrolitrach lodowatego glicerolu. Zacznij od dodania 50 mikrolitrów elektrokompetentnych komórek agrobacterium tumefaciens do wstępnie schłodzonej kuwety o średnicy 0,1 milimetra.Dodać dwa mikrolitry pCAMBIA 13 02 do kuwety. Teraz użyj elektroporatora o napięciu 2 400 woltów, aby naelektryzować ogniwa. natychmiast dodaj jeden mililitr pożywki LB do kuwety i pipetuj roztwór w górę iw dół, aby delikatnie wymieszać.Następnie przenieś zawieszone komórki do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie inkubuj ją w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby dojść do siebie. Teraz połóż komórki na agarze LB uzupełnionym antybiotykiem. Inkubuj płytki w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.Na koniec zaszczep pojedynczą kolonię w bulionie LB. Pozwól kulturze rosnąć przez noc. Następnie kriokonserwuj szczep zawierający plazmid 50% roztworem glicerolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.Zacznij od odpipetowania 0,5 mililitra kultury chlorelli vulgaris w fazie logarytmicznej. Rozprowadź kulturę na płytce z fosforanem tris acetatu lub płytką agarową TAP. Uprawiaj kulturę przez pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie zaszczepić 10 mililitrów uzupełnionego bulionu LB pętlą pełną elektroporowanych kultur agrobacterium tumefaciens w kolbie do wytrząsania. Inkubować kolbę w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez noc. Następnego dnia zaszczepij jeden mililitr nocnej kultury w 50 mililitrach uzupełnionego LB. Inkubować kolbę w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza i prędkości obrotowej 250 obr./min.Aby wspólnie hodować kultury glonów i bakterii, najpierw przenieś kulturę agrobacterium do 50-mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 4 000 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odpipetować supernatant w celu jego odrzucenia i dwukrotnie przemyć komórki za pomocą pożywki indukcyjnej.Następnie dodaj 25 mililitrów pożywki indukcyjnej na płytkę hodowlaną chlorelli vulgaris. Przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj przy 4 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu połączyć osad z komórek glonów z 200 mikrolitrami zawiesiny bakteryjnej.Wstrząśnij połączoną kulturą w inkubatorze obrotowym w temperaturze od 21 do 25 stopni Celsjusza. Ustaw na 150 obr./min na jedną godzinę. Rozprowadzić 200 mikrolitrów mieszanej kultury na płytkach indukcyjnych, uzupełnionych 15 milimolami glukozy i inkubować płytki w ciemności w temperaturze od 21 do 25 stopni Celsjusza przez trzy dni.Po trzech dniach zbierz mikroalgi do kolby, używając 10 mililitrów pożywki TAP uzupełnionej 20 miligramami na litr tetracykliny. Inkubować kolbę w ciemności przez dwa dni, utrzymując temperaturę od 21 do 25 stopni Celsjusza, umieścić 500 mikrolitrów kultury na selektywnej pożywce uzupełnionej 20 miligramami na litr tetracykliny. Inkubuj płytki w temperaturze od 21 do 25 stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni przed przeniesieniem ich do oświetlonej komory.Wybierz pojedyncze kolonie z płytki transformacyjnej i rozprowadź je na płytkach agarowych TAP. Aby wykonać PCR kolonii, zacznij od dodania niewielkiej objętości transformujących komórek glonów do 10 mikrolitrów sterylnej wody. Gotuj roztwór w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 15 minut.Podobnie przetworzyć inną matrycę PCR w celu potwierdzenia braku agrobacterium w próbce. Uruchom próbki PCR na żelu agarozowym DNA z drabinką, aby zweryfikować rozmiar powstałych fragmentów. Przekształcone kolonie były w stanie rosnąć na płytkach zawierających higromycynę z cefotaksymem.Kolonie typu dzikiego nie rosły na talerzach. Uzyskano kolonie odporne do 70 miligramów na litr cefotaksymu. W próbkach glonów nie stwierdzono amplikonu Colony PCR pCAMBIA 13 02.Jednak MGFP5G w amplikonie wykryto we wszystkich trzech próbkach glonów. Hodowle glonów, które wielokrotnie były subkulturami cefotaksymu, wykazują brak białka wirulencji e2, co wskazuje na brak plazmidu. Zaobserwowano istotną różnicę we wzroście glonów transformantów i szczepów typu dzikiego.Pomimo niższego wzrostu, transformant miał wyższy poziom fluorescencji, gdy był znormalizowany pod kątem gęstości komórek.

agrobacterium-tumefaciens-mediated-genetic-engineering-green

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje transformację genetyczną jednokomórkowej morskiej algi Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji. Ten organizm eukariotyczny stanowi efektywną platformę modelową dla roślin wyższych, posiadając znacznie zredukowaną złożoność genomową i komórkową oraz będąc łatwo podatnym na hodowlę komórkową i biologię chemiczną.

Transformacja genomiczna piko-eukarionta Ostreococcus tauri

W tym filmie demonstrujemy generację transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję stabilnego transgenu poprzez transformację binarnego sztucznego genu bakteryjnego opartego na chromosomach za pośrednictwem Agrobacterium.

Binarna transformacja genów oparta na sztucznym wektorze chromosomowym u roślin Arabidopsis: technika generowania roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii

W tym filmie pokazujemy genetyczną transformację genomu ryżu za pomocą wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta ułatwia przenoszenie obcego plazmidu DNA za pomocą białek wirulencji Agrobacterium.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą metody zanurzania kwiatów może być z powodzeniem wykorzystana do stworzenia stabilnych linii transgenicznych modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Przedstawiamy protokół zmodyfikowany w stosunku do tego dla Arabidopsis thaliana, biorąc pod uwagę różne nawyki wzrostu i cechy fizjologiczne ekstremofitu.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Tutaj prezentujemy protokół budowy fotobioreaktorów z bąbelkowymi kolumnami na skalę laboratoryjną i wykorzystania ich do hodowli mikroalg. Dostarcza również metody określania tempa wzrostu kultury i neutralnej zawartości lipidów.

Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.

Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Poznaj metodę transformacji z użyciem Agrobacterium tumefaciens do inżynierii genetycznej mikroalg Chlorella vulgaris. Protokół umożliwia uzyskanie stabilnych transformantów do badań funkcjonalnych genów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Przeglądaj więcej filmów