Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Zakres badań koncentrował się na opracowaniu i optymalizacji protokołu przemiany chlorelli vulgaris. Naszym celem jest stworzenie stabilnych transgenicznych szczepów chlorelli vulgaris, przy użyciu agrobacterium tumefaciens i specyficznego plazmidu pCAMBIA 13 02, który pozwolił na wprowadzenie genu będącego przedmiotem zainteresowania i potencjału do zastosowań biotechnologicznych. Inżynieria metaboliczna i biologia syntetyczna, mikroskopia i obrazowanie, koszt CRISPR, edycja dziewięciu genów, bioinformatyka, modelowanie obliczeniowe, teledetekcja i obrazowanie satelitarne, nanotechnologiczne przetwarzanie dwutechnologiczne i przetwarzanie końcowe.

Badanie to wprowadza zoptymalizowany protokół transformacji pożywki tophaceous microbacterium dla mikroalg, chlorella vulgaris. Za pomocą określonego plazmidu i markera. Stanowi on podstawę do udoskonalenia biotechnologii mikroalg, pokonując wcześniejsze ograniczenia w zakresie niezawodnych narzędzi do przekształcania C. vulgaris.

Zacznij od rozcieńczenia 0,5 mikrolitra nocnych kultur kultur Agrobacterium tumefaciens 50 mililitrami autoklawowanej ultraczystej wody. Rozprowadź 10 mikrolitrów tej rozcieńczonej kultury na bulionie lizogenicznym lub płytce LB. Inkubuj płytkę w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni.

Teraz zaszczep pojedynczą kolonię w 20 mililitrach pożywki LB uzupełnionej ryfampicyną. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia zaszczepić 500 mililitrów zwykłej pożywki LB w kolbie wytrząsarskiej z dziewięcioma mililitrami kultury przez noc

Umieść kultury na shakerze w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza. Po inkubacji i podzieleniu kultur na probówki, odwirować schłodzone probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4 000 G przez 15 minut. Za pomocą pipety usunąć supernatant.

I ponownie zanurz każdą granulkę w 50 mililitrach lodowatej wody. Po odcentrowaniu i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 25 mililitrach lodowatej wody w każdej probówce, odwirować jak poprzednio. Następnie ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze lodowatego 10% glicerolu.

Teraz połącz zawartość wszystkich probówek w jedną 50-mililitrową probówkę przed odwirowaniem. Na koniec, po wyrzuceniu supernatentu, ponownie zawieś granulat w 400 mikrolitrach lodowatego glicerolu. Zacznij od dodania 50 mikrolitrów elektrokompetentnych komórek agrobacterium tumefaciens do wstępnie schłodzonej kuwety o średnicy 0,1 milimetra.

Dodać dwa mikrolitry pCAMBIA 13 02 do kuwety. Teraz użyj elektroporatora o napięciu 2 400 woltów, aby naelektryzować ogniwa. natychmiast dodaj jeden mililitr pożywki LB do kuwety i pipetuj roztwór w górę iw dół, aby delikatnie wymieszać.

Następnie przenieś zawieszone komórki do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie inkubuj ją w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby dojść do siebie. Teraz połóż komórki na agarze LB uzupełnionym antybiotykiem. Inkubuj płytki w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Na koniec zaszczep pojedynczą kolonię w bulionie LB. Pozwól kulturze rosnąć przez noc. Następnie kriokonserwuj szczep zawierający plazmid 50% roztworem glicerolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Zacznij od odpipetowania 0,5 mililitra kultury chlorelli vulgaris w fazie logarytmicznej. Rozprowadź kulturę na płytce z fosforanem tris acetatu lub płytką agarową TAP. Uprawiaj kulturę przez pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie zaszczepić 10 mililitrów uzupełnionego bulionu LB pętlą pełną elektroporowanych kultur agrobacterium tumefaciens w kolbie do wytrząsania. Inkubować kolbę w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez noc. Następnego dnia zaszczepij jeden mililitr nocnej kultury w 50 mililitrach uzupełnionego LB. Inkubować kolbę w temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza i prędkości obrotowej 250 obr./min.

Aby wspólnie hodować kultury glonów i bakterii, najpierw przenieś kulturę agrobacterium do 50-mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 4 000 G przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odpipetować supernatant w celu jego odrzucenia i dwukrotnie przemyć komórki za pomocą pożywki indukcyjnej.

Następnie dodaj 25 mililitrów pożywki indukcyjnej na płytkę hodowlaną chlorelli vulgaris. Przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj przy 4 000 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu połączyć osad z komórek glonów z 200 mikrolitrami zawiesiny bakteryjnej.

Wstrząśnij połączoną kulturą w inkubatorze obrotowym w temperaturze od 21 do 25 stopni Celsjusza. Ustaw na 150 obr./min na jedną godzinę. Rozprowadzić 200 mikrolitrów mieszanej kultury na płytkach indukcyjnych, uzupełnionych 15 milimolami glukozy i inkubować płytki w ciemności w temperaturze od 21 do 25 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Po trzech dniach zbierz mikroalgi do kolby, używając 10 mililitrów pożywki TAP uzupełnionej 20 miligramami na litr tetracykliny. Inkubować kolbę w ciemności przez dwa dni, utrzymując temperaturę od 21 do 25 stopni Celsjusza, umieścić 500 mikrolitrów kultury na selektywnej pożywce uzupełnionej 20 miligramami na litr tetracykliny. Inkubuj płytki w temperaturze od 21 do 25 stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni przed przeniesieniem ich do oświetlonej komory.

Wybierz pojedyncze kolonie z płytki transformacyjnej i rozprowadź je na płytkach agarowych TAP. Aby wykonać PCR kolonii, zacznij od dodania niewielkiej objętości transformujących komórek glonów do 10 mikrolitrów sterylnej wody. Gotuj roztwór w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Podobnie przetworzyć inną matrycę PCR w celu potwierdzenia braku agrobacterium w próbce. Uruchom próbki PCR na żelu agarozowym DNA z drabinką, aby zweryfikować rozmiar powstałych fragmentów. Przekształcone kolonie były w stanie rosnąć na płytkach zawierających higromycynę z cefotaksymem.

Kolonie typu dzikiego nie rosły na talerzach. Uzyskano kolonie odporne do 70 miligramów na litr cefotaksymu. W próbkach glonów nie stwierdzono amplikonu Colony PCR pCAMBIA 13 02.

Jednak MGFP5G w amplikonie wykryto we wszystkich trzech próbkach glonów. Hodowle glonów, które wielokrotnie były subkulturami cefotaksymu, wykazują brak białka wirulencji e2, co wskazuje na brak plazmidu. Zaobserwowano istotną różnicę we wzroście glonów transformantów i szczepów typu dzikiego.

Pomimo niższego wzrostu, transformant miał wyższy poziom fluorescencji, gdy był znormalizowany pod kątem gęstości komórek.