Binarna transformacja genów oparta na sztucznym wektorze chromosomowym u roślin Arabidopsis: technika generowania roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii

Zacznij od roślin Arabidopsis z niedojrzałymi główkami kwiatowymi. Zanurz główki kwiatowe w zawiesinie komórek Agrobacterium zawierających T-DNA sklonowane za pomocą binarnego sztucznego chromosomu bakteryjnego lub BIBAC, wektora replikującego się zarówno w systemach E. coli, jak i Agrobacterium. Ten wektor binarny T-DNA może dostarczać duże transgeny, takie jak gen odporności na herbicydy i fluorescencyjne markery selekcyjne wraz z promotorem specyficznym dla nasion.

Gdy główki kwiatowe są nadal zanurzone, delikatnie poruszaj roślinami, aby zwiększyć ich kontakt z Agrobacterium. Dzięki swojej wrodzonej zdolności do infekowania roślin, Agrobacterium przenosi transgen do komórki kwiatowej. Gdy transgen wnika do komórki, przemieszcza się do jądra i łączy się z genomem rośliny.

Teraz owiń roślinę folią spożywczą i inkubuj w ciemności, aby zatrzymać wilgoć i poprawić transformację. Usuń folię i hoduj rośliny w warunkach fizjologicznych, aż wydadzą nasiona.

Następnie zbierz nasiona i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wybrać transformanty. Teraz hoduj przekształcone nasiona w odpowiednich warunkach, aż do wykiełkowania. Spryskaj rośliny herbicydem i inkubuj.

Rośliny z wielokrotną insercją transgenu doświadczają wyciszania genów i więdną, podczas gdy rośliny z insercją pojedynczej kopii wyrażają aktywny enzym metabolizujący herbicydy i przeżywają zabieg. Wyodrębnij genomowe DNA z ocalałych transformantów i wykonaj PCR, aby obliczyć skuteczność insercji pojedynczej kopii.

Aby przygotować rośliny Arabidopsis do transformacji, hoduj rośliny Arabidopsis w szklarni lub komorze wzrostu z kontrolowanym klimatem, aż zakwitną. Przypnij pierwsze, aby umożliwić pojawienie się większej liczby dodatkowych. Rośliny są gotowe do zanurzania od czterech do sześciu dni po ścięciu, kiedy rośliny mają wiele niedojrzałych główek kwiatowych i niewiele nawożonych krzemionek.

Aby zanurzyć kwiaty, zanurz kwiatostany na 5 do 10 sekund w zawiesinie Agrobacterium. Używaj delikatnego mieszania. Owiń nadziemne części roślin folią spożywczą, aby utrzymać wysoką wilgotność, i przykryj doniczki pudełkiem, aby rośliny były w ciemności.

Inkubuj rośliny przez dwa dni w szklarni lub komorze wzrostu. Po dwóch dniach wyjmij pudełko i folię spożywczą i wyhoduj rośliny do dojrzałości w szklarni lub komorze wzrostu. Aby zwiększyć efektywność transformacji, te same rośliny można ponownie zanurzyć siedem dni po pierwszym zanurzeniu.

Następnie, gdy przekształcone rośliny osiągną dojrzałość i wyschną, zbierz nasiona. Zbierz i przeanalizuj nasiona roślin przekształconych za pomocą tego samego konstruktu jako pojedynczy zestaw. W przypadku, gdy rośliny są przekształcane za pomocą pochodnej plazmidu BIBAC-RFP-Gateway, zidentyfikuj rośliny transgeniczne, analizując nasiona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Aby wykryć ekspresję DsRed w okrywach nasiennych, zobrazuj nasiona przy wzbudzeniu 560 nanometrów i emisji od 600 do 650 nanometrów. Oddziel nasiona fluorescencyjne od niefluorescencyjnych odpowiedników za pomocą kleszczy.

Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem roślin transgenicznych przekształconych pochodną plazmidu BIBAC-BAR-Gateway, wysiewaj nasiona na tacach wypełnionych ziemią. Zapewnij równomierne rozprowadzenie nasion na tacach, zawieszając nasiona w agarze 0,1% w podłożu 0,5X MS i rozprowadź nasiona za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra.

Stymuluj nasiona do kiełkowania w sposób synchroniczny, inkubując nasiona przez co najmniej dwa dni w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Można to zrobić przed lub po wysianiu nasion. Dwa i trzy tygodnie po wysianiu nasion spryskaj sadzonki 0,5% roztworem glufosynatu amonowego. Użyj 500 mililitrów roztworu glufosynatu amonowego na 1 metr kwadratowy. Przenieś ocalałe sadzonki do doniczek. Przeanalizuj rośliny odporne na glufosynat amonu za pomocą PCR pod kątem obecności interesującego nas konstruktu.