Model przerzutów do węzłów chłonnych drenujących do oceny dynamiki limfocytów T ^CD8+ specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia

Protokół ten stanowi użyteczny model reprodukcyjny do badań komórek T CD8 + specyficznych dla antygenu podczas przerzutów do węzłów chłonnych, co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8 + osób postronnych. Staraliśmy się ujawnić ogólnoustrojową i miejscową dynamikę limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów do węzłów chłonnych. Niedawne gromadzone dowody ujawniły, że specyficzne dla nowotworu komórki TD8 + pochodzące z obwodu, zwłaszcza w węzłach chłonnych drenujących guz, ale nie w mikrośrodowisku guza, pośredniczyły w skuteczności terapii blokującej immunologiczne punkty kontrolne.

Niedawno zidentyfikowaliśmy limfocyty T pamięci specyficzne dla guza TCF-1 + TOX w węzłach chłonnych drenujących guz zarówno mysich modeli nowotworowych, jak i pacjentów z ludzkim rakiem wątrobowokomórkowym, które służą jako ogólne odpowiedzi na blokadę immunologicznego punktu kontrolnego. Trudno jest ocenić dokładne punkty czasowe interwencji, ponieważ przerzuty do węzłów chłonnych za pomocą innych technik nie zawsze są wykonalne. Protokół ten zapewnił podejście do precyzyjnego zbadania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu podczas przerzutów do węzłów chłonnych, co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8 + osób postronnych.

Nasz projekt eksperymentalny zapewnia użyteczny model do badania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + podczas przerzutów do węzłów chłonnych i ich interakcji między specyficznymi dla antygenu komórkami T CD8 + a innymi komórkami odpornościowymi lub komórkami zrębu podczas przerzutów do węzłów chłonnych. Postaramy się wyjaśnić, w jaki sposób przerzuty limfy wpływają na przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, a zwłaszcza na właściwości i funkcje komórek TdLN-TTSM. Wyniki te wpłynęłyby na kliniczne możliwości leczenia, czy usunąć lub zachować MLN i rzuciłyby nowe światło na manipulację MLN w celu osiągnięcia maksymalnych korzyści terapeutycznych.

Na początek przygotuj zawiesinę komórek czerniaka B16F10-GP. Przed zasysaniem zawiesiny komórkowej przesuń ściankę rurki, aby przesunąć pęcherzyki do góry. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml odessać 100 l zawiesiny komórek i popchnąć tłok, aby wysunąć górną pęcherzyk.

Następnie przytrzymaj mysz w pozycji leżącej, odsłaniając jej brzuch. Naciśnij palcem lewą tylną kończynę myszy, aby całkowicie odsłonić skórę w lewej okolicy pachwinowej. Ogol lewe podbrzusze myszy i wyczyść je bawełną zawierającą 75% etanolu.

Następnie, utrzymując kąt wkłucia igły na poziomie około 45 stopni z nachyleniem ku górze, wprowadzić igłę w tkankę podskórną okolicy pachwinowej górnej części lewego uda na głębokości od 0,5 do 1 cm. Delikatnie wprowadzić igłę. W tym samym czasie powoli wstrzykuj komórki do tkanki podskórnej.

Obserwuj mały bolus, oznaczający tworzenie się kieszonki płynowej w okolicy podskórnej. Po wstrzyknięciu należy zapiąć rękaw ochronny, wyrzucić go do pudełka na ostre przedmioty i umieścić mysz z powrotem w klatce. Aby przeprowadzić transfer adoptywny, sprawdź myszy z guzem sześć do ośmiu dni po implantacji guza, kiedy guzy są wyczuwalne.

W dniu poprzedzającym transfer należy wstrzyknąć dootrzewnowo 4 mg cyklofosfamidu. W dniu transferu należy odessać 200 l zawiesiny komórek P14 za pomocą strzykawki insulinowej 100-U. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.

Następnie umieść mysz w klatce i naświetlaj ją lampą podczerwoną przez 5 do 10 minut, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Następnie użyj stabilizatora myszy, aby przytrzymać mysz na miejscu. Wyprostuj ogon i przetrzyj go 75% etanolem.

Wprowadzić igłę równolegle do żyły ogonowej i delikatnie odciągnąć tłok. Jeśli krew nie napływa do strzykawki, należy powoli wepchnąć zawiesinę komórkową do żyły. Po zakończeniu wstrzykiwania należy szybko wyciągnąć igłę.

Delikatnie ucisknąć miejsce wstrzyknięcia wacikiem i umieścić mysz z powrotem w nowej, czystej klatce. Uważnie obserwuj mysz przez kilka minut pod kątem jakichkolwiek niepożądanych skutków. Na początek wykonaj badanie palpacyjne guza pierwotnego i określ, czy guz ma średnicę około 5 mm.

Aby wykonać resekcję guza, umieść mysz w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść ją na anatomicznej tablicy pokrytej czystym papierem chłonnym. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach, tak aby jej oś podłużna była równoległa do eksperymentatora. Zdezynfekuj brzuch myszy za pomocą wacika nasączonego jodowidonem.

Następnie za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie w skórze w pobliżu miejsca, w którym znajduje się guz. Włóż zamkniętą końcówkę sterylnych kleszczy do nacięcia, aby wyraźnie odsłonić guz. Usuń guz, upewniając się, że kapsułka pozostaje tak nienaruszona, jak to możliwe.

Ostrożnie i delikatnie usuń tkankę łączną przylegającą do guza za pomocą sterylnych nożyczek. Zacznij od zassania 20 l zawiesiny komórek czerniaka B16F10-GP za pomocą strzykawki insulinowej 100-U. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki.

Następnie u myszy, która przeszła operację resekcji guza, wstrzyknąć zawiesinę komórkową do jednego pachwinowego węzła chłonnego. Włóż igłę od dystalnego końca węzła chłonnego i powoli przesuwaj ją do środka węzła chłonnego. Obserwuj znaczny obrzęk węzła chłonnego, co pokazuje, że płyn jest dokładnie wstrzykiwany.

Wstrzyknąć równą objętość PBS do pachwinowego węzła chłonnego po drugiej stronie. Zszyj nacięcie za pomocą szwu 3-0. Zdezynfekuj skórę otaczającą ranę jodem powidonu.

Następnie umieść mysz w czystej klatce i utrzymuj ciepło za pomocą światła podczerwonego. Trzymaj mysz w bocznej pozycji odleżynowej i monitoruj w sposób ciągły, aż odzyskasz przytomność. Po implantacji komórkami B16F10-GP obserwowano przerzuty do węzłów chłonnych poprzez barwienie hematoksyliną i eozyną.

We wczesnym stadium przerzutowy węzeł chłonny wykazywał częściowe zajęcie przez komórki nowotworowe, przy czym niektóre obszary nadal zawierały nieuszkodzone limfocyty. W późnym stadium przerzutowy węzeł chłonny został wypełniony komórkami nowotworowymi, czemu towarzyszyła angiogeneza guza. Co więcej, częstość występowania limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu we krwi obwodowej wynosiła 2,81% we wczesnym stadium, a w późnym stadium spadła do 1,48%.

Co ciekawe, podczas gdy odsetek limfocytów T CD8 + pozostał stabilny w węzłach chłonnych bez przerzutów, został przejściowo zwiększony w przerzutowym węźle chłonnym we wczesnym stadium, ale gwałtownie zmniejszył się w późnym etapie.