Eksperymentalny model myszy z przerzutami i adoptywną immunoterapią transferową CTL

Eksperymentalny model myszy z przerzutami do płuc i immunoterapią CTL do analizy interakcji komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie skuteczności immunoterapii adoptywnej transferowej komórek T specyficznej dla nowotworu in vivo. Osiąga się to najpierw poprzez przeszczepienie komórek nowotworowych poprzez wstrzyknięcie bocznej żyły ogonowej myszom w celu ustalenia przerzutów do płuc. Drugim etapem procedury jest leczenie myszy z nowotworem za pomocą specyficznych dla nowotworu cytotoksycznych limfocytów T CTL.

Ostatnim krokiem jest użycie atramentu indyjskiego jako środka do wizualizacji i ilościowego określenia guzków nowotworowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują CIE różnych metod leczenia poprzez pomiar wielkości guza i ilościowe określenie liczby guzków nowotworowych. Cześć, nazywam się Mary Zimmerman i jestem członkiem laboratorium dr Kevina Lu w Medical College of Georgia.

Cześć, nazywam się Shelene Hu.Jestem studentką drugiego roku i pracuję również w laboratorium Dr.Lou. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak krzywe przeżycia, jest to, że procedura ta jest zarówno jakościowa, jak i ilościowa. Implikacje tych technik mogą rozciągać się na terapię raka, ponieważ naśladują one immunoterapię adoptywną komórek T u pacjentów z rakiem u ludzi.

Więc zacznijmy dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych wysiewaj jedną kolbę T 75 z maksymalnie 10 razy do siódmego. CMS cztery komórki spotkały się w 10 mililitrach pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy. Aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe, należy inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w dniu wstrzyknięcia.

Usuń pożywkę i przepłucz komórki raz PBS, a następnie zbierz komórki nowotworowe za pomocą 0,05% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zatrzymaj reakcję za pomocą 10 mililitrów pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy. Przenieś komórki do stożkowej rurki.

Wiruj komórki z prędkością 1300 obr./min w wirówce val legend RT przez trzy minuty. W temperaturze pokojowej usuń snat, ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach świeżego XHB Ss do umycia. Następnie ponownie odkręć w dół i ponownie wymieszaj w ten sam sposób.

Policz komórki nowotworowe na hemo. Cytometr. Rozcieńczyć komórki w HBSS, tak aby komórki potrzebne do każdego wstrzyknięcia zostały ponownie zawieszone. W łącznej objętości 100 mikrolitrów ogrzej sześcio- do ośmiotygodniowych myszy B SEA w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie.

Aby rozszerzyć żyłę ogonową, umieść mysz w ograniczniku żyły ogonowej na ławce. Użyj mikrostrzykawki, aby wstrzyknąć 100 mikrolitrów komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Użyj techniki septycznej, aby uniknąć infekcji po wstrzyknięciu.

Stosować lekki ucisk w miejscu wstrzyknięcia, aż do ustania krwawienia. Przywróć mysz do klatki i pozwól guzowi urosnąć do pożądanego etapu. W dniu transferu pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić oczyszczone cytotoksyczne limfocyty T lub CTL.

Jak opisano w tekście, przenieś wszystkie komórki z jednej płytki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, nie dopuszczając do tego, aby objętość przekraczała więcej niż dwie trzecie probówki. Włóż sterylną pipetę Pasteura do stożkowej probówki i oddziel limfocyty warstwowo. Medium lub LSM pod komórkami, aż całkowita objętość zbliży się do 14 mililitrów.

Uważaj, aby nie naruszyć warstw. Wirować z prędkością 2000 obr./min przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Nie używaj hamulca do spowalniania wirnika po wirowaniu, przenieś CTL do nowej 15-mililitrowej stożkowej rury.

Dodaj HBSS do objętości około 10 mililitrów. Do prania. Policz komórki, wiruj z prędkością 1300 obr./min przez pięć minut: W temperaturze pokojowej ponownie zawieś HBSS do wymaganej gęstości komórek do wstrzykiwań.

Utrzymanie całkowitej objętości na wstrzyknięcie na poziomie 100 mikrolitrów. Użyj tej samej techniki wstrzykiwania ogona, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Aby wstrzyknąć CTL myszom z nowotworem, należy umieścić mysz z powrotem w klatce i pozwolić CTL na interakcję z guzem.

Myszy są zwykle poświęcane do analizy od 14 do 21 dni po leczeniu CTL. Aby uwidocznić przerzuty do płuc, połóż ofiarowaną mysz na grzbiecie na styropianowej desce. Przypnij nogi, aby zapewnić swobodny dostęp do tchawicy.

Spryskaj stronę brzuszną 70% etanolem, zaczynając od środkowej części brzucha. Użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż linii środkowej przez klatkę piersiową i w górę w kierunku gruczołów ślinowych. Odsłoń tchawicę.

Użyj kleszczy, aby usunąć tkanki otaczające tchawicę. Wsuń końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów pod tchawicę, trzymając końcówkę jedną ręką. Delikatnie unieś tchawicę do góry i odsuń ją od ciała.

Obróć platformę o 180 stopni. Użyj 50-mililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć atrament indyjski do płuc przez tchawicę. Całkowicie napompuj płuca atramentem, aż poczujesz silny opór.

Użyj nożyczek, aby przeciąć tchawicę. Wsuń parę kleszczy pod płuca i wyjmij je z myszy. Krótko przepłukać płuca w litrowej zlewce z wodą w dygestoriach chemicznych.

Przenieść płuca do szklanej instalacji żółciowej zawierającej pięć mililitrów roztworu FTI. Tkanka nowotworowa pojawi się jako białe guzki na czarnych płucach. Po kilku minutach guzy można teraz policzyć i rozpocząć w roztworze FTI w nieskończoność. Tu.

Płuca u myszy przetoczonych rakiem sutka. Linia komórkowa czwarta T jedna pokazuje białe plamy wskazujące na guzy. Myszy transfekowane z dominacją IRF osiem ujemnych odporności na K 79 E wykazują zwiększony potencjał przerzutowy komórek nowotworowych.

Obrazy te przedstawiają analizę histologiczną skuteczności immunoterapii adoptywnej transferowej CTL. Myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, wykazały wiele guzów sześć dni później wskazywanych przez strzałki. Z drugiej strony myszy, którym wstrzyknięto limfocyty T specyficzne dla nowotworu, wykazały zmniejszenie guzów w tym samym eksperymencie.

Obróbka atramentem indyjskim zapewnia prostszy sposób pomiaru skuteczności transferu adoptywnego CTL. W tym przypadku białe guzki guza na płucach zawierających guz wyraźnie odróżniają je od płuc, które pomyślnie przeszły adopcyjny transfer CTL, a zliczenie guzków pozwala na pewien stopień kwantyfikacji, który nie jest możliwy w przypadku histologii. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o rozgrzaniu myszy w celu łatwiejszego i dokładniejszego wstrzyknięcia do żyły ogonowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić skuteczność leczenia za pomocą tej prostej procedury w celu ilościowego określenia wielkości i liczby guzów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.