Name: Eksperymentalny model myszy z przerzutami i adoptywną immunoterapią transferową CTL (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj model myszy z przerzutami płucnymi i adoptywną immunoterapię CTL w onkologii. Metoda obejmuje przeszczep komórek nowotworowych i wizualizację atramentem indyjskim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe zapewniły granty z National Institutes of Health (CA133085 dla K.L.) oraz American Cancer Society (RSG-09-209-01-TBG dla K.L.).

1. Eksperymentalny model przerzutów u myszy
<ol>
<li>Dzień przed iniekcjami komórek nowotworowych zasiej jedną kolbę T75, używając do 1 x 107 komórki CMS4-Met w 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy, aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe. Inkubować przez noc w 37°C.</li>
<li>W dniu iniekcji usunąć medium i raz wypłukać komórki solą PBS, następnie zebrać komórki nowotworowe za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA w 37°C przez 5 minut. Reakcję zatrzymano poprzez dodanie 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy. Komórki przeniesiono do probówki stożkowej.</li>
<li>Odwiruj komórki z prędkością 130 obr./min w wirówce Sorvall Legend RT przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usuń nadsącz. Resuspenduj komórki w 10 ml świeżego 1X HBSS w celu przemycia, następnie ponownie odwiruj i resuspenduj w ten sam sposób.</li>
<li>Policz komórki nowotworowe za pomocą komory countingowej (hemocytometru). Rozcieńcz komórki w HBSS tak, aby komórki wymagane do każdego wstrzyknięcia zostały zawieszone w całkowitej objętości 100 μL. </li>
<li>Ogrzać myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni, umieszczając je w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie w celu rozszerzenia żyły ogonowej. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej na blacie. Za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknąć 100 μL komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Należy zastosować technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji. Po wstrzyknięciu należy lekko ucisnąć miejsce iniekcji aż do ustąpienia krwawienia.</li>
<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól guza narastać do pożądanego stadium.</li>
</ol>
2. Immunoterapia z wykorzystaniem adoptywnego transferu cytotoksycznych limfocytów T (CTL)
<ol>
<li>W dniu transferu resuspender poprzez pipetowanie w górę i w dół oczyszczone limfocyty T cytotoksyczne (CTL), przygotowane zgodnie z opisem w tekście. Przenieść wszystkie komórki z jednej płytki do probówki stożkowej o pojemności 15 mL, dbając o to, aby objętość nie przekroczyła 2/3 objętości probówki.</li>
<li>Wprowadzić sterylną pipetę Pasteura do probówki stożkowej i ostrożnie nanieść pod komórki medium do separacji limfocytów (LSM), aż całkowita objętość wyniesie blisko 14 mL.</li>
<li>Należy uważać, aby nie naruszyć warstw. Odwirować przy 200 rpm przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu nie używać hamulca w celu spowolnienia rotora.</li>
<li>Przenieść CTL do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Dodać HBSS do objętości około 10 mL w celu przemycia.</li>
<li>Policzyć komórki. Odwirować przy 130 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Resuspender w HBSS do wymaganej gęstości komórkowej dla iniekcji, utrzymując całkowitą objętość jednej iniekcji na poziomie 10 μL.</li>
<li>Wykorzystać tę samą technikę iniekcji ogonowej, zaprezentowaną wcześniej w tym filmie, aby wstrzyknąć CTL myszom z guzami nowotworowymi.</li>
<li>Umieścić mysz z powrotem w klatce i pozwolić CTL na interakcję z guzem. Myszy są zazwyczaj uśmiercane w celu analizy 14–21 dni po leczeniu CTL.</li>
</ol>
3. Wizualizacja przerzutów do płuc
<ol>
<li>Aby zwizualizować przerzuty do płuc, ułożyć uśpioną mysz na plecach na styropianowej płytce. Przybić kończyny, aby zapewnić swobodny dostęp do tchawicy. Spryskać stronę brzuszną 70% etanolem.</li>
<li>Zaczynając od środka brzucha, przeciąć nożyczkami wzdłuż linii środkowej, przez klatkę piersiową, w górę w stronę ślinianek. Odsłonić tchawicę. Za pomocą pęsety usunąć tkanki otaczające tchawicę.</li>
<li>Przesunąć końcówkę pipety 20 μL pod tchawicę. Trzymając końcówkę jedną ręką, delikatnie unieść tchawicę do góry i odsunąć od ciała.</li>
<li>Obrócić platformę o 180°. Za pomocą strzykawki 50 mL wstrzyknąć tusz indyjski do płuc przez tchawicę. Całkowicie nadmuchać płuca tuszem, aż do momentu wyczucia silnego oporu.</li>
<li>Przeciąć tchawicę nożyczkami. Wsunąć pęsetę pod płuca i wyjąć je z organizmu myszy. Krótko opłukać płuca w zlewce o pojemności 1L z wodą.</li>
<li>W dygestorium przenieść płuca do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 5 mL roztworu Fekete. Po kilku minutach tkanka nowotworowa pojawi się w postaci białych guzków na czarnych płucach. Guzy można teraz policzyć i przechowywać w roztworze Fekete w nieskończoność.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne przerzuty w obrazowanych płucach
<ol>
<li>Tutaj płuca myszy, którym wstrzyknięto linię komórkową raka piersi 4T1, wykazują białe plamki wskazujące na obecność guzów. Myszy, którym wstrzyknięto komórki 4T1 przetransfekowane dominującym negatywnym mutantem K79E białka IRF8, wykazują zwiększony potencjał przerzutowy komórek nowotworowych.</li>
<li>Obrazy te przedstawiają analizę histologiczną skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu CTL. U myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, 6 dni później stwierdzono obecność licznych guzów, zaznaczonych żółtymi strzałkami (A). Z kolei u myszy, którym wstrzyknięto swoiste dla guza limfocyty T, zaobserwowano redukcję liczby guzów (B).</li>
<li>W tym samym eksperymencie zastosowanie tuszu kreślarskiego (India ink) stanowi prostszy sposób pomiaru skuteczności adoptywnego transferu CTL. Tutaj białe guzki nowotworowe na płucach z nowotworem wyraźnie odróżniają je od płuc, które przeszły pomyślnie adoptywny transfer CTL, a liczenie guzków pozwala na stopień ilościowania nieosiągalny w badaniu histologicznym.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
 <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="Schemat modelu mysiego przerzutów nowotworowych; transplantacja komórek nowotworowych, transfer CTL, analiza przerzutów do płuc." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Schemat doświadczalny dla modelu mysiego do badania przerzutów nowotworowych oraz immunoterapii z adaptacyjnym transferem limfocytów CTL. Czerwone kropki oznaczają komórki nowotworowe, a zielone kropki oznaczają limfocyty CTL.
 <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="Porównanie wzrostu guza w płucach myszy; wyniki eksperymentalne; badania nad rakiem; linie komórkowe 4T1." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zaburzenie funkcji IRF8 zwiększyło potencjał przerzutowy komórek nowotworowych. Linia komórkowa raka piersi myszy 4T1 została stabilnie przetransfekowana wektorem (4T1.Vector) lub wektorem wykazującym ekspresję dominującego negatywnego mutanta IRF8 K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Komórki nowotworowe wstrzyknięto dożylnie (i.v.) do bocznych żył ogonowych myszy. Płuca z guzami wypełniono tuszem indyjskim w celu wizualizacji guzków nowotworowych. Guzki nowotworowe są łatwo widoczne jako białe punkty na czarnym tle tkanki płucnej.
 <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="Porównanie histologiczne, tkanka płucna, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej, barwienie H&amp;E." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza histologiczna skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adopcyjnego transferu limfocytów CTL. Mysią linię komórkową mięsaka CMS4-Met wstrzyknięto dożylnie do bocznych żył ogonowych myszy. Trzy dni później myszom z nowotworem wstrzyknięto sól fizjologiczną (A) lub specyficzne dla nowotworu limfocyty T (B). Płuca przeanalizowano sześć dni po leczeniu CTL za pomocą konwencjonalnego H&E&amp;E barwienie histologiczne. Guzki nowotworowe wskazano strzałkami.
 <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="Porównanie wzrostu guza w grupie kontrolnej i grupie CTL, wyniki eksperymentu, analiza zmiany wielkości guza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Wizualizacja guzków nowotworowych za pomocą inflacji tuszem indyjskim. Mysia linia komórkowa mięsaków CMS4-Met została wstrzyknięta dożylnie do bocznych żył ogonowych myszy. Trzy dni później myszy z nowotworem otrzymały wstrzyknięcie soli fizjologicznej (kontrola) lub specyficznych dla nowotworu limfocytów T (+CTL). Płuca poddano analizie czternaście dni po zastosowaniu CTL. Białe plamki, będące guzkami nowotworowymi, umożliwiają łatwą kwantyfikację skuteczności leczenia CTL.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
<li>Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fas%2FFas+ligand+pathway+is+important+for+optimal+tumor+regression+in+a+mouse+model+of+CTL+adoptive+immunotherapy+of+experimental+CMS4+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases.</a> J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).</li>
<li>Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+Adoptive+Immunotherapy+Concurrently+Mediates+Tumor+Regression+and+Tumor+Escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape.</a> J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).</li>
<li>Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+IFN-gammaR+in+association+with+loss+of+Fas+function+is+linked+to+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression.</a> International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).</li>
<li>Pages, F., Berger, A., Camus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+T+cells%2C+early+metastasis%2C+and+survival+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).</li>
<li>Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type%2C+density%2C+and+location+of+immune+cells+within+human+colorectal+tumors+predict+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome.</a> Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).</li>
<li>Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+CD95+expression+predisposes+for+recurrence+in+curatively+resected+colon+carcinoma%3A+clinical+evidence+for+immunoselection+and+CD95L+mediated+control+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease.</a> Gut. 54 (5), 661-665 (2005).</li>
<li>Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intratumoral+immune+reaction+and+human+colorectal+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence.</a> Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+therapy+following+non-myeloablative+but+lymphodepleting+chemotherapy+for+the+treatment+of+patients+with+refractory+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).</li>
<li>Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T-cell+activation+by+depleting+cystine+and+cysteine.+Cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research.</a> 70 (1), 68-77 (2010).</li>
<li>Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+escape+mechanism+governed+by+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+colorectal+cancer+and+liver+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+surgery%22%5BJournal%5D)">Mouse models of colorectal cancer and liver metastases.</a> Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lymphotoxin+beta+receptor+with+tumor-specific+T+lymphocytes+for+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression.</a> Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+Regulatory+Factor+8+Mediates+Apoptosis+in+Nonhemopoietic+Tumor+Cells+via+Regulation+of+Fas+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression.</a> J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+IFN+regulatory+factor+8+by+DNA+methylation+is+a+molecular+determinant+of+apoptotic+resistance+and+metastatic+phenotype+in+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells.</a> Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
</ol>

Myszy zakupiono z Narodowego Instytutu Raka (National Cancer Institute, Friderick, MD) i przetrzymywano w obiekcie dla zwierząt Medical College of Georgia. Eksperymenty oraz opieka i dobrostan zwierząt były zgodne z przepisami federalnymi oraz protokołem zatwierdzonym przez komisję IACUC Medical College of Georgia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">Roztwory:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Roztwór tuszu indyjskiego (17):&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Wlać 150 ml wody destylowanej do kolby o pojemności 250 ml.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 4 krople wodorotlenku amonu do wody destylowanej.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 30 ml roztworu zapasowego tuszu indyjskiego (np. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) do mieszaniny amoniaku i wody.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dopełnić wodą destylowaną do objętości 200 ml. Roztwór jest gotowy do wstrzyknięcia.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Roztwór Fekete'a (17):&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Roztwór Fekete'a służy do odbarwiania płuc z guzem, w których zastosowano nadmuchanie tuszem indyjskim, aby odróżnić białe guzki nowotworowe od czarnego tła tkanek prawidłowych.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Dodać 350 ml 95% EtOH do szklanej butelki o pojemności 1L.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 150 ml wody destylowanej&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 50 ml formaldehydu&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 25 ml kwasu octowego lodowatego&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów ctl

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Eksperymentalny model przerzutów u myszy jest prostym, a jednocześnie istotnym fizjologicznie modelem przerzutowania. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane dożylnie (i.v.) do ogonowych żył myszy, gdzie kolonizują płuca, odzwierciedlając tym samym ostatnie etapy spontanicznego przerzutowania komórek nowotworowych: przeżycie w krwiobiegu, ekstrawazację oraz kolonizację w odległych narządach. Z punktu widzenia terapeutycznego, eksperymentalny model przerzutów jest najprostszym i idealnym modelem, ponieważ celem terapii jest często końcowy etap przerzutowania: utrwalony guz przerzutowy w odległym narządzie. W tym modelu komórki nowotworowe wstrzykuje się dożylnie do ogonowych żył myszy i pozwala im na kolonizację oraz wzrost w płucach. Następnie do myszy z przerzutami wstrzykuje się dożylnie swoiste dla nowotworu limfocyty CTL. Liczbę i wielkość przerzutów w płucach można kontrolować poprzez liczbę wstrzykiwanych komórek nowotworowych oraz czas wzrostu guza. Dzięki temu można modelować różne stadia przerzutowania, od przerzutów minimalnych po rozległe. Przerzuty w płucach analizuje się poprzez wypełnienie ich tuszem, co umożliwia łatwiejszą obserwację wizualną i kwantyfikację.

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Eksperymentalny model przerzutów u myszy jest prostym, a jednocześnie istotnym fizjologicznie modelem przerzutowania. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane dożylnie (i.v.) do...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie skuteczności immunoterapii in vivo z wykorzystaniem adoptywnego transferu limfocytów T swoistych dla nowotworu. W pierwszym etapie komórki nowotworowe są przeszczepiane myszom poprzez wstrzyknięcie do bocznej żyły ogonowej w celu wywołania przerzutów do płuc. Drugim krokiem procedury jest leczenie myszy z nowotworem za pomocą swoistych dla nowotworu cytotoksycznych limfocytów T CTLs.Ostatnim krokiem jest wykorzystanie tuszu indyjskiego w celu wizualizacji i kwantyfikacji guzków nowotworowych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące CIE różnych metod leczenia poprzez pomiar wielkości guza oraz określenie liczby guzków nowotworowych. Cześć, nazywam się Mary Zimmerman i jestem członkiem laboratorium dr. Kevina Lu w Medical College of Georgia.Witajcie, nazywam się Shelene Hu. Jestem studentką drugiego roku i pracuję również w laboratorium dr. Lou. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak krzywe przeżywalności, jest to, że procedura ta ma charakter zarówno jakościowy, jak i ilościowy. Zastosowanie tych technik może rozciągać się na terapię nowotworów, ponieważ naśladują one adoptywną immunoterapię limfocytami T u pacjentów z chorobami nowotworowymi.Zacznijmy zatem. Dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych zasiać do kolby T75 do 1 × 10⁷ komórek CMS4 w 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% serum. Aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe, inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C w dniu wstrzyknięcia.Usunąć medium i wypłukać komórki raz za pomocą PBS, następnie zebrać komórki nowotworowe, stosując 0,05% trypsyny EDTA w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Przerwać reakcję, dodając 10 ml medium RPMI zawierającego 10% serum. Przenieść komórki do probówki stożkowej.Odwiruj komórki przy 1300 RPM w wirówce RT val legend przez trzy minuty. W temperaturze pokojowej usuń nadsącz, resuspenduj komórki w 10 mililitrach świeżego 1 XHB Ss w celu przemycia. Następnie ponownie odwiruj i resuspenduj w ten sam sposób.Policz komórki nowotworowe za pomocą hemo.Cytometru. Rozcieńcz komórki w HBSS tak, aby resuspendować liczbę komórek wymaganą do każdego wstrzyknięcia. W całkowitej objętości 100 microliters ogrzej myszy B SEA w wieku od sześciu do ośmiu tygodni w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie.Aby rozszerzyć żyłę ogonową, umieść mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej na blacie. Użyj mikrosstrzykawki, aby wstrzyknąć 100 µL komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Stosuj technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji po iniekcji.Wywieraj lekki nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aż do ustąpienia krwawienia. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól guźowi urosnąć do pożądanego stadium. W dniu transferu pipetuj roztwór w górę i w dół, aby resuspendować przygotowane oczyszczone cytotoksyczne limfocyty T lub CTL.Zgodnie z opisem w tekście, przenieś wszystkie komórki z jednej płytki do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml, dbając o to, aby objętość nie przekroczyła dwóch trzecich probówki. Wprowadź sterylną pipetę Pasteura do probówki stożkowatej i nanieś warstwę medium do separacji limfocytów (LSM) pod komórki, aż całkowita objętość zbliży się do 14 ml.Należy uważać, aby nie zaburzyć warstw. Wirować z prędkością 2000 RPM przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu nie używać hamulca w celu zatrzymania rotora, a następnie przenieść CTLs do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów.Dodać HBSS do objętości około 10 mililitrów w celu przemycia. Odwirować komórki przy 1300 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie resuspender w HBSS do wymaganej gęstości komórkowej niezbędnej do iniekcji.Utrzymaj całkowitą objętość na wtrysk na poziomie 100 microliters. Zastosuj tę samą technikę wtryskiwania do ogona, którą zaprezentowano wcześniej w tym filmie. Aby wstrzyknąć CTL do myszy z nowotworem, umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól CTL oddziaływać z guzem.Myszy są zazwyczaj uśmiercane w celu przeprowadzenia analizy od 14 do 21 dni po leczeniu CTL. Aby zwizualizować przerzuty do płuc, należy położyć uśmierconą mysz na plecach na styropianowej płytce. Przyprzypnij kończyny, aby zapewnić niezakłócony dostęp do tchawicy.Spryskaj stronę brzuszna 70% etanolem, zaczynając od środka odwłoka. Za pomocą nożyczek przetnij wzdłuż linii środkowej klatkę piersiową, kierując się ku gruczołom ślinowym. Odsłoń tchawicę.Za pomocą pęsety usuń tkanki otaczające tchawicę. Przełóż końcówkę pipety 200 µL pod tchawicę, trzymając końcówkę jedną ręką. Delikatnie unieś tchawicę do góry i odsuń ją od ciała.Obróć platformę o 180 stopni. Używając strzykawki o pojemności 50 ml, wstrzyknij tusz indyjski do płuc poprzez tchawicę. Całkowicie wypełnij płuca tuszem, aż poczujesz silny opór.Użyj nożyczek, aby przeciąć tchawicę. Wsuń pęsetę pod płuca i wyjmij je z organizmu myszy. Krótko opłucz płuca w zlewce z jednym litrem wody w dygestorium.Przenieś płuca do szklanej kolby zawierającej pięć mililitrów roztworu FTI. Tkanka nowotworowa pojawi się w postaci białych guzków na czarnych płucach. Po kilku minutach można policzyć guzy, a następnie przechowywać je w roztworze FTI bezterminowo.Płuca myszy z transfekcją raka gruczołowego piersi. Linia komórkowa 4T1 wykazuje białe punkty wskazujące na obecność guzów. Mysze z transfekcją dominującego negatywnego wariantu IRF8 K79E wykazują zwiększony potencjał przerzutowy komórek nowotworowych.Zdjęcia te przedstawiają analizę histologiczną skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu CTL. U myszy z nowotworami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, sześć dni później zaobserwowano liczne guzy wskazane strzałkami. Z kolei u myszy, którym wstrzyknięto specyficzne dla nowotworu limfocyty T, w tym samym eksperymencie odnotowano redukcję guzów.Zastosowanie tuszu indyjskiego stanowi prostszą metodę pomiaru skuteczności adoptywnego transferu limfocytów CTL. W tym przypadku białe guzki nowotworowe na płucach z przerzutami wyraźnie odróżniają je od płuc, w których adoptywny transfer CTL przebiegł pomyślnie, a liczenie guzków pozwala na stopień kwantyfikacji nieosiągalny w badaniu histologicznym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ogrzaniu myszy, co ułatwia i zwiększa precyzję iniekcji dożylnych do ogona.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ocenić skuteczność leczenia za pomocą tej prostej procedury służącej do ilościowego określania wielkości i liczby guzów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

experimental-metastasis-ctl-adoptive-transfer-immunotherapy-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Eksperymentalny model przerzutów i immunoterapia z przeniesieniem CTL myszy

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Zdolność klonów przerzutowych do kolonizacji odległych miejsc zależy od ich zdolności do proliferacji i/lub zdolności do przetrwania w mikrośrodowisku gospodarza bez znaczącej proliferacji. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który umożliwia ilościową wizualizację obu typów kolonizacji wątroby przez klony z przerzutami.

Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Tutaj opisujemy model mysiego ksenoprzeszczepu, który funkcjonalnie przypomina rezerwuar Ommaya u pacjentów. Opracowaliśmy mysi Ommaya w celu zbadania nowych metod leczenia powszechnie śmiertelnej choroby opon mózgowo-rdzeniowych.

Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania terapii ukierunkowanej na chorobę opon mózgowo-rdzeniowych

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Przedstawiony tutaj eksperymentalny projekt dostarcza użytecznego modelu reprodukcyjnego do badań specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ podczas przerzutów do węzłów chłonnych (LN), co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8+ osób postronnych.

Model przerzutów do węzłów chłonnych drenujących do oceny dynamiki limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Poznaj model myszy z przerzutami płucnymi i adoptywną immunoterapię CTL w onkologii. Metoda obejmuje przeszczep komórek nowotworowych i wizualizację atramentem indyjskim.

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Przeglądaj więcej filmów