Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie in vivo skuteczności immunoterapii polegającej na adoptywnej transferze specyficznych dla guza limfocytów T. Jest to realizowane najpierw poprzez przeszczepienie komórek nowotworowych za pomocą wstrzyknięcia do bocznej żyły ogonowej myszy w celu wywołania przerzutów do płuc. Drugim krokiem procedury jest leczenie myszy z nowotworem za pomocą specyficznych dla guza cytotoksycznych limfocytów T (CTLs).

Ostatnim krokiem jest zastosowanie tuszu indyjskiego w celu wizualizacji i ilościowego określenia guzków nowotworowych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące CIE różnych metod leczenia poprzez pomiar wielkości guza oraz określenie liczby guzków nowotworowych. Witam, nazywam się Mary Zimmerman i jestem członkiem zespołu dr. Kevina Lu w Medical College of Georgia.

Witajcie, nazywam się Shelene Hu. Jestem studentką drugiego roku i pracuję również w laboratorium dr. Lou. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami tradycyjnymi, takimi jak krzywe przeżywalności, jest to, że procedura ta jest zarówno jakościowa, jak i ilościowa. Zastosowanie tych technik może rozszerzyć się na terapię nowotworów, ponieważ naśladuje ona adoptacyjną immunoterapię limfocytami T u pacjentów z nowotworami.

Zacznijmy zatem. Dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych wysiej do jednej kolby T75 do 1×10⁷ komórek CMS4met w 10 mililitrach medium RPMI zawierającego 10% serum. Aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe, inkubuj je przez noc w temperaturze 37°C w dniu wstrzyknięcia.

Usuń pożywkę i raz przepłucz komórki PBS, a następnie zbierz komórki nowotworowe, stosując 0,05% trypsyny EDTA w temperaturze 37°C przez pięć minut. Przerwij reakcję, dodając 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% serum. Przenieś komórki do probówki stożkowej.

Odwirować komórki z prędkością 1300 RPM w wirówce RT firmy val legend przez trzy minuty. W temperaturze pokojowej usunąć supernatant, resuspendować komórki w 10 mililitrach świeżego 1X HB Ss w celu przemycia. Następnie ponownie odwirować i resuspendować w ten sam sposób.

Policz komórki nowotworowe za pomocą hemo.Cytometru. Rozcieńcz komórki w HBSS, aby resuspender ilość komórek wymaganą dla każdego wstrzyknięcia. W całkowitej objętości 100 µL ogrzej myszy B SEA w wieku od sześciu do ośmiu tygodni w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie.

Aby rozszerzyć żyłę ogonową, umieść mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej na stole laboratoryjnym. Za pomocą mikrosstrzykawki wstrzyknij 100 µL komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Stosuj technikę aseptyczną, aby zapobiec infekcji po wstrzyknięciu.

Wywieraj lekki nacisk w miejscu wstrzyknięcia, aż do momentu ustąpienia krwawienia. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól guzowi urosnąć do pożądanego stadium. W dniu transferu, pipetuj roztwór w górę i w dół, aby resuspender przygotowane oczyszczone cytotoksyczne limfocyty T lub CTLs.

Zgodnie z opisem w tekście, przenieś wszystkie komórki z jednej płytki do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml, dbając o to, aby objętość nie przekroczyła dwóch trzecich probówki. Wprowadź sterylną pipetę Pasteura do probówki stożkowej i nanieś warstwowo medium do separacji limfocytów (LSM) nad komórki, aż całkowita objętość zbliży się do 14 ml.

Należy uważać, aby nie naruszyć powstałych warstw. Wirować przy 2000 RPM przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania nie używać hamulca do zatrzymania rotora, a następnie przenieść CTL do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów.

Dodać HBSS do uzyskania objętości około 10 ml w celu przemycia. Odwirować komórki przy 1300 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie resuspendować w HBSS do uzyskania gęstości komórek wymaganej do iniekcji.

Należy zachować całkowitą objętość wtryskiwania wynoszącą 100 µl. Stosujemy tę samą technikę wstrzykiwania do ogona, która została zaprezentowana wcześniej w tym filmie. Aby wstrzyknąć CTL do myszy z nowotworem, należy umieścić mysz z powrotem w klatce i pozwolić CTL na oddziaływanie z guzem.

Myszy są zazwyczaj uśmiercane w celu przeprowadzenia analizy od 14 do 21 dni po leczeniu CTL. Aby zwizualizować przerzuty do płuc, należy położyć uśmierconą mysz na grzbiecie na styropianowej płytce. Przyczepione nogi powinny zapewnić niezakłócony dostęp do tchawicy.

Spryskaj stronę brzuszna 70% ethanolem, zaczynając od środkowej części odwłoka. Za pomocą nożyczek wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej przez klatkę piersiową w górę, w kierunku gruczołów ślinowych. Obnaż tchawicę.

Za pomocą pęsety usunąć tkanki otaczające tchawicę. Przełożyć końcówkę pipety 200 µL pod tchawicę, trzymając końcówkę jedną ręką. Delikatnie unieść tchawicę do góry i oddalić ją od ciała.

Obróć platformę o 180 stopni. Używając strzykawki o pojemności 50 ml, wstrzyknij tusz indyjski do płuc poprzez tchawicę. Całkowicie wypełnij płuca tuszem, aż poczujesz silny opór.

Przeciąć tchawicę za pomocą nożyczek. Przesunąć pęsetę pod płuca i wyjąć je z organizmu myszy. Krótko opłukać płuca w zlewce o pojemności jednego litra z wodą, pracując w dygestorium.

Przenieś płuca do szklanego naczynia zawierającego pięć mililitrów roztworu FTI. Tkanka nowotworowa pojawi się w postaci białych guzków na czarnych płucach. Po kilku minutach można przystąpić do zliczania guzów, a następnie przechowywać je w roztworze FTI w nieokreślonym czasie.

Płuca myszy z przetransfekcjonowanym rakiem piersi. Linia komórkowa 4T1 wykazuje białe plamki wskazujące na obecność guzów. Myszy przetransfekcjonowane dominującym negatywnym mutantem IRF8 K79E wykazują zwiększony potencjał przerzutowy komórek nowotworowych.

Na obrazach przedstawiono analizę histologiczną skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu limfocytów CTL. U myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, sześć dni później zaobserwowano wiele guzów, wskazanych strzałkami. Z kolei u myszy, którym wstrzyknięto specyficzne dla nowotworu limfocyty T, w tym samym eksperymencie odnotowano redukcję guzów.

Zastosowanie tuszu indyjskiego stanowi prostszy sposób pomiaru skuteczności adoptywnego transferu limfocytów CTL. W tym przypadku białe guzki nowotworowe na płucach z obciążeniem nowotworowym wyraźnie odróżniają je od płuc, w których pomyślnie przeprowadzono adoptywny transfer CTL, a liczenie guzków pozwala na stopień kwantyfikacji nieosiągalny przy użyciu histologii. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ogrzaniu myszy, aby ułatwić i zwiększyć precyzję iniekcji do żyły ogonowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat oceny skuteczności leczenia za pomocą tej prostej procedury służącej do ilościowego określenia wielkości i liczby nowotworów. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.