Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą
7 marca 2019
Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.
Głównym wkładem naszej pracy jest to, że zbadaliśmy precyzyjny i dokładny krajobraz patologii beta amyloidu w mózgu osoby z chorobą Alzheimera za pomocą technologii obrazowania spektrometrii mas obrazowania MALDI. Postęp technologiczny osiągnęliśmy dzięki opracowaniu specjalnego protokołu z wstępną obróbką szkiełek tkankowych kwasem mrówkowym. Po badaniu MALDI-IMS generowane są mapy segmentacji i wykonywane są obliczenia w celu odkrycia nowych białek markerowych lub peptydów kolokalizowanych z płytką nazębną i naczynieniem podpajęczynówkowym.
Uzyskanie próbek ludzkiej kory mózgowej do IMS z mózgów, które zostały usunięte, przetworzone i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w ciągu ośmiu godzin po sekcji zwłok. Pobrać próbkę mózgu z kory potylicznej pacjentów z chorobą Alzheimera i osób z grupy kontrolnej w tym samym wieku. Aby wyciąć skrawki tkanki na kriostacie, najpierw umieść przewodzący tlenek indu i cyny lub szkło mikroskopowe z powłoką ITO wewnątrz kriostatu.
Podgrzej próbkę mózgu z autopsji od minus 80 stopni Celsjusza do minus 22 stopni Celsjusza wewnątrz kriostatu. Do każdego eksperymentu należy przymocować nowe jednorazowe ostrze do kriostatu. Zawsze staraj się używać czystej części ostrza.
Umieść zamrożone mózgi z autopsji na scenie wraz z niewielką ilością związku o optymalnej temperaturze cięcia. W przypadku IMS i immunohistochemii należy wyciąć od pięciu do sześciu odcinków z każdej próbki tkanki. Gdy ostrze dopiero zaczyna ciąć tkankę, obróć koło i skieruj się w stronę bloku, aż cała tkanka zostanie odsłonięta.
Jeśli w poprzek sekcji znajduje się mała smuga lub rozdarcie, poczekaj w kriostatu, aż regulacja temperatury automatycznie ją naprawi. Policz kilka sekund przed otwarciem anti-rolla z chusteczką pod spodem. Natychmiast umieść plasterek chusteczki po stronie szkła pokrytej ITO.
Rozmrozić plasterek tkanki, wkładając palec pod szkiełko po stronie niepokrytej ITO. Tkanka przyklei się do szkiełka. Upewnij się, że tkanka jest tak płaska, jak to tylko możliwe, bez zmarszczek.
Aby przepłukać skrawki tkanki, zanurz próbki w 40 do 100 mililitrach 70% etanolu w szklanym słoiku do barwienia na 30 sekund, aby usunąć endogenne lipidy i sole nieorganiczne. Umyć próbki, stosując sekwencję mycia wymienioną w protokole tekstowym. Następnie suszyć próbki w próżni przez 30 minut.
Teraz potraktuj skrawki tkanki parą kwasu mrówkowego, aby uzyskać lepszą jonizację białek beta amyloidu z tkanki mózgowej z autopsji. Aby to zrobić, przygotuj piekarnik w temperaturze 60 stopni Celsjusza i szklane naczynie do inkubacji z pięcioma mililitrami 100% kwasu mrówkowego. Utrzymuj wilgotność powietrza w szklanym naczyniu do inkubacji na poziomie nasycenia.
Umieść szkiełka tkankowe w szklanym naczyniu do inkubacji, unikając zanurzania w kwasie mrówkowym i traktuj przez sześć minut. Wykonaj obraz optyczny próbek za pomocą skanera do filmów, skanera żelowego lub mikroskopu cyfrowego. Wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej.
Wyrównanie obrazu optycznego próbek jest konieczne, gdy cel próbki jest umieszczony wewnątrz urządzenia. Zazwyczaj nie będzie możliwe rozpoznanie sekcji tkankowej znajdującej się pod warstwą matrycy. Aby skorelować obrazy optyczne z próbkami, należy wykonać znaki prowadzące, które są widoczne zarówno na obrazie optycznym, jak i pod warstwą matrycy w optyce kamery.
Najprostszym sposobem jest dostrzeżenie co najmniej trzech śladów płynu korekcyjnego wokół próbki przed wykonaniem obrazu optycznego. Aby spryskać matrycę opryskiwaczem ultradźwiękowym, należy usunąć z eksykatora tkankę, która ma być rozpylona, i umieścić ją w komorze. Upewnij się, że chusteczka nie zakrywa okienka czujnika.
Rozpocznij przygotowanie, naciskając przycisk Start. Zwykle czas przygotowania wynosi około 90 minut. Przygotowanie będzie regulowane automatycznie poprzez monitorowanie grubości warstwy matrycy i wilgotności
.Alternatywnie, aby rozpylić roztwór matrycy na powierzchnię tkanki za pomocą automatycznego rozpylacza, należy użyć systemu pompy rozpuszczalnika ustawionego na 10 psi i 0,15 mililitra na minutę, aby dostarczyć roztwór matrycy. Stały przepływ podgrzanego gazu osłonowego będzie dostarczany razem z natryskiwaniem roztworu matrycy. Wykonuj eksperymenty z obrazowaniem o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą MALDI-IMS.
W przypadku pomiaru spektrometrii mas należy zdefiniować obszary tkanek za pomocą oprogramowania sterującego MALDI i oprogramowania do analizy danych. Pozyskiwanie widm w dodatnim trybie liniowym o zakresie stosunku masy do ładunku od 2 000 do 20 000 i rozdzielczości przestrzennej 20 i 100 mikronów. Aby uzyskać wzorzec kalibracyjny, rozpuść wzorzec kalibracji peptydów i wzorzec kalibracji białka w stosunku od jednego do czterech roztworem CHCA i TA30, a następnie rozcieńcz go 10 razy.
Umieść jeden mikrolitr wzorca kalibracyjnego na szkiełku w czterech różnych miejscach. Korzystając z oprogramowania do histologii molekularnej, nałóż na siebie wiele obrazów sygnałów, aby znaleźć korelację przestrzenną różnych sygnałów, takich jak różne peptydy beta amyloidu kolokalizujące się w blaszkach starczych i ścianach tętnic. Fenotypy amyloidowej angiopatii mózgowej lub CAA pacjenta numer trzy były najbardziej widoczne w tym badaniu.
MALDI-IMS tkanki mózgowej tego pacjenta wyraźnie uwidocznił, że amyloid beta 1-42 i amyloid beta 1-43 były preferencyjnie odkładane w postaci blaszek starczych w miąższu mózgu. Natomiast krótsze beta-amyloidy, takie jak amyloid beta 1-36 do 1-41, były preferencyjnie odkładane na obszarach naczyniowych opon mózgowo-rdzeniowych. W kontroli niepatologicznej nie stwierdzono istotnych sygnałów.
Rozkłady amyloidu beta 1-40 i amyloidu beta 1-42 zostały następnie zweryfikowane za pomocą immunohistochemii przy użyciu sąsiednich zamrożonych odcinków tkanek. Przeciwciało anty-amyloidowe beta 1-40 znakowane CAA i ujawnione amyloid beta 1-40 jest preferencyjnie zdeponowane w naczyniach krwionośnych opon mózgowo-rdzeniowych, co stanowi wyraźny kontrast z dystrybucją amyloidu beta 1-42 w miąższu mózgu w postaci blaszek starczych. Pokazano tutaj mapę segmentacji uzyskaną za pomocą dwuczęściowej analizy k-średnich zastosowanej do tego samego przekroju od pacjenta numer trzy.
Ta metoda grupowania z powodzeniem zidentyfikowała struktury przypominające blaszki miażdżycowe w miąższu i struktury naczyniowe w przestrzeni podpajęczynówkowej. Interesujące jest znalezienie małego okrągłego obszaru w miąższu, który jest wykrywany tuż wokół małej tętniczki w miąższu, a także w przestrzeni podpajęczynówkowej. Potwierdzają to obrazy pojedynczych jonów tych pojedynczych peptydów beta amyloidu.
Istnieje limit jednoczesnego śledzenia szerokiego zakresu beta-amyloidu, nawet w przypadku stosowania specyficznych przeciwciał. Tutaj pokazujemy rozmieszczenie beta-amyloidu w ludzkich mózgach za pomocą najnowocześniejszej metody obrazowania spektrometrii mas MALDI. Wierzymy, że ten wkład stanowi przełom w badaniach nad chorobą Alzheimera, ponieważ ten raport oferuje charakterystykę pełnego zestawu białek beta amyloidu w ludzkich mózgach poddanych autopsji.
Najbardziej imponującym odkryciem jest to, że tylko jedna zmiana aminokwasu na końcu C białka beta amyloidu powoduje drastyczną zmianę w ich dystrybucji. Etapy przygotowania tkanek mają kluczowe znaczenie dla uzyskania skutecznej jonizacji zagregowanych białek w ludzkiej tkance mózgowej. Jednorodna kokrystalizacja analitu z matrycami ma kluczowe znaczenie dla obrazowania o wysokiej czułości i bez artefaktów.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół detekcji i wizualizacji białka amyloid β w tkankach mózgu w chorobie Alzheimera oraz w mózgowej angiopatii amyloidowej z wykorzystaniem techniki MALDI-IMS (obrazowania masowego z desorpcją/jonizacją wspomaganą laserowo). Celem protokołu jest poprawa rozdzielczości przestrzennej oraz identyfikacji patologii amyloidowej w próbkach tkanki mózgowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie biologiczne
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wstęp
- Patologia amyloidu β jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera.
- W badaniu wykorzystano technikę MALDI-IMS do szczegółowego mapowania białek amyloidu β.
- Wstępna obróbka kwasem mrówkowym poprawia jonizację białek docelowych.
Cel badania
- Opracowanie ukierunkowanego protokołu w celu lepszej wizualizacji amyloidu β w tkance mózgowej.
- Identyfikacja białek markerowych lub peptydów związanych z blaszkami amyloidowymi.
- Zrozumienie przestrzennego rozmieszczenia białek amyloidowych w patologii choroby Alzheimera.
Zastosowane metody
- W charakterze platformy obrazowania dla spektrometrii mas wykorzystano MALDI-IMS.
- Pozyskano preparaty kory mózgowej ludzi od pacjentów z chorobą Alzheimera oraz od grupy kontrolnej.
- Próbki poddano specyficznym etapom wstępnego przygotowania, w tym ekspozycji na opary kwasu mrówkowego.
- W celu analizy rozkładu przestrzennego amyloidy β zastosowano mapy segmentacji i metody klastrowania.
Główne wyniki
- Badanie ujawniło zróżnicowane wzorce odkładania się różnych peptydów amyloid β.
- Amyloid β 1-42 i 1-43 znajdowały się głównie w blaszkach starczych w obrębie miąższu mózgu.
- Kluczowym odkryciem było preferencyjne odkładanie się krótszych peptydów amyloid β w pobliżu naczyń krwionośnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia udoskonalone podejście metodologiczne do badania patologii amyloidu w chorobie Alzheimera.
- Uzyskane informacje poszerzają naszą wiedzę na temat dynamiki przestrzennej rozkładu amyloidu β w tkankach mózgu.
- Wyniki te mają znaczenie dla przyszłych badań ukierunkowanych na mechanizmy związane z amyloidem w chorobach neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
MALDI-IMS umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie przestrzenne izoform amyloidu β w tkance mózgu człowieka, dostarczając wglądu w mechanizmy patologii choroby Alzheimera oraz cerebralnej amyloidowej angiopatii. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez ujawnienie zróżnicowanych wzorców odkładania się peptydów amyloidu β, co pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych i odkrywanie biomarkerów. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, wiążąc rozkład cząsteczek z fenotypami neuropatologicznymi bez konieczności stosowania specyficznych sond.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację amyloidy β 1-42 i 1-43 w blaszkach starczych oraz krótszych izoform w złogach naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczne ograniczanie ryzyka dzięki bezpośredniej obserwacji wiązania z celem w istotnych dla choroby tkankach ludzkich.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację gatunków amyloidy β o odmiennej lokalizacji patologicznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez wstępne traktowanie kwasem mrówkowym oraz segmentację MALDI-IMS.
- Wartość operacyjna: Rozwiązanie kwestii standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zautomatyzowanemu nanoszeniu matrycy oraz kontroli rozdzielczości przestrzennej.
- Gotowość do screeningu: Podkreślenie skalowalności i możliwości ponownego wykorzystania platformy do ilościowego profilowania amyloidy β w przekrojach tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówiono znaczenie dla patogenezy choroby poprzez mapowanie izoform amyloidu β w naczyniach opon mózgowych oraz w miąższu mózgowym w chorobie Alzheimera (AD) i angiopatii amyloidowej mózgu (CAA).
- Wartość operacyjna: Opisano ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem korelacji przestrzennej sygnałów peptydowych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Skupiono się na predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez walidację specyficznych dla izoform złogów za pomocą immunohistochemii.
Integracja potoku i przepływu pracy
MALDI-IMS integruje kontinuum odkryć, od walidacji celu po prace przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków i dopasowanie biomarkerów w tkance ludzkiego mózgu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie przestrzenne peptydów amyloid β w tkankach chorych i kontrolnych.
- Przesiew: Opisuje gotowość testu dzięki powtarzalnemu przygotowaniu tkanek, aplikacji matrycy oraz obrazowaniu z rozdzielczością przestrzenną 20 µm.
- Analityka: Wyróżnia pomiary ilościowe izoform amyloid β oraz analizę kolokalizacji z wykorzystaniem oprogramowania do histologii molekularnej.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację wzorców depozycji naczyniowych i parenchymalnych za pomocą sąsiadującej immunohistochemii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje MALDI-IMS jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w celu multipleksowego mapowania białek w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w patologii amyloidu β.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów przygotowania tkanek oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wglądowi w cele specyficzne dla izoform.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o rozwoju oparte na różnicowym odkładaniu amyloidu β w miąższu w porównaniu z naczyniami krwionośnymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie spektrometrii mas, histologii i neuropatologii.
- Zapotrzebowanie na instrumentarium i infrastrukturę analityczną, w tym system MALDI, kriotom, rozpylacz ultradźwiękowy oraz oprogramowanie do histologii molekularnej.
- Wymogi dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania tkanek, traktowania oparami kwasu mrówkowego oraz protokołów analizy danych.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w szczególności w przypadku tkanek z autopsji ludzkich w porównaniu z modelami transgenicznymi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność optymalizacji aplikacji matrycy oraz możliwość nakładania się sygnałów w złożonych środowiskach tkankowych.
