Name: Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj czułą na polaryzację mikroskopię dwufotonową do badania orientacji fibryl amyloidowych w sferulitach. Ta technika umożliwia głębszą penetrację próbki i niższą fototoksyczność w porównaniu do metod jednofotonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekt Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) finansowany przez Narodowe Centrum Nauki.

Characterizing Spherulites with Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy

<ol><li>Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetazzi%2C+RA+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).</li>
<li>Kress, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+orientational+behavior+of+MHC+class+I+protein+and+lipid+probes+in+cell+membranes+by+fluorescence+polarization-resolved+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging.</a> Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).</li>
<li>Duboisset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioflavine-T+and+Congo+Red+reveal+the+polymorphism+of+insulin+amyloid+fibrils+when+probed+by+polarization-resolved+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).</li>
<li>De Luca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ensemble+polymorphism+and+single+aggregate+structural+heterogeneity+in+insulin+amyloid+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excited+polarization-dependent+autofluorescence+of+amyloids+as+a+label-free+method+of+fibril+organization+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).</li>
<li>Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+in+superstructures+-+local+ordering+revealed+by+polarization+analysis+of+two-photon+excited+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence.</a> Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).</li>
<li>Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+orientation+in+molecular+ensembles+by+polarization+sensitive+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+two-photon+imaging+of+amyloid+plaques+in+deep+brain+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).</li>
<li>Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids-fluorophores+interactions+probed+by+combined+nonlinear+polarized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).</li>
<li>Mojzisova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-sensitive+two-photon+microscopy+study+of+the+organization+of+liquid-crystalline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA.</a> Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).</li>
<li>Olesiak-Banska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+crystal+phases+of+DNA%3A+Evaluation+of+DNA+organization+by+two-photon+fluorescence+microscopy+and+polarization+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis.</a> Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).</li>
<li>Olesiak-Banska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+multifunctional+probes+in+a+liquid+crystalline+DNA+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix.</a> Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).</li>
<li>Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-photon+excited+autofluorescence+of+lysozyme+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).</li>
<li>Brasselet, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrasselet%2C+S+%22Fluorescent+Methods+to+Study+Biological+Membranes%22">Fluorescent Methods to Study Biological Membranes</a>. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).</li>
<li>Krebs, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+spherulites+by+amyloid+fibrils+of+bovine+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).</li>
<li>Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+birefringence+on+polarization+resolved+nonlinear+microscopy+and+collagen+SHG+structural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging.</a> Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).</li>
<li>Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+distortion+effects+in+polarimetric+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Ferrand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultimate+use+of+two-photon+fluorescence+microscopy+to+map+orientational+behavior+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores.</a> Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).</li>
<li>Chipman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization+index+and+the+average+degree+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Depolarization index and the average degree of polarization.</a> Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).</li>
<li>de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+reference+standards+for+two-photon+absorption+in+the+680%26%23x2013%3B1050+nm+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680&#x2013;1050 nm wavelength range.</a> Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).</li>
<li>Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+in+cartilage+under+strain+probed+by+polarization+sensitive+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy.</a> Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611(2019).</li>
<li>Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+model+of+the+molecular+orientational+distribution+probed+by+polarization-resolved+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+A%22%5BJournal%5D)">Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation.</a> Physical Review A. 85 (4), 043829(2012).</li>
<li>Loksztejn, A., Dzwolak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+Bifurcation+in+aggregating+insulin%3A+an+induced+circular+dichroism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study.</a> Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Mikroskopia dwufotonowa z czułością polaryzacyjną jest cennym narzędziem do badania lokalnego uporządkowania fibryli wewnątrz superstruktur amyloidowych, wymagającym jedynie niewielkich modyfikacji standardowego układu wielofotonowego. Ponieważ opiera się ona na nieliniowych zjawiskach optycznych, można w niej osiągnąć zredukowaną fotoselekcję kątową oraz zwiększoną rozdzielczość osiową w porównaniu z metodami mikroskopii fluorescencyjnej z wzbudzeniem jednofotonowym. Ponadto prowadzi ona do mniejszego rozproszenia świat...

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, mimo że nastąpił znaczący rozwój licznych technik mikroskopii fluorescencyjnej do bioobrazowania białek i ich agregatów1, tylko kilka z nich zostało wykorzystanych do rozwiązania ich lokalnego uporządkowania w próbce2,3. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji4 została wykorzystana do zbadania wewnętrznej niejednorodności strukturalnej nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Co więcej, ilościowe określenie lokalnego uporządkowania wewnątrz złożonych i gęsto upakowanych biostruktur, takich jak sferulity, można rozwiązać przy użyciu metod wrażliwych na polaryzację3. Jednak standardowe techniki fluorescencji z powierzchowną penetracją tkanek są ograniczone, ponieważ użycie długości fal UV-VIS do wzbudzenia fluoroforów in vivo prowadzi do wysokiego rozpraszania światła w tkankach5. Ponadto takie obrazowanie często wymaga zaprojektowania i powiązania określonych sond fluorescencyjnych z docelową biomolekułą, co zwiększa koszt i ilość pracy potrzebnej do wykonania obrazowania.
Ostatnio, aby rozwiązać te problemy, nasz zespół dostosował czułą na polaryzację mikroskopię fluorescencji wzbudzonej dwoma fotonami (ps-2PFM) do bezznacznikowego obrazowania struktur biologicznych6,7. Ps-2PFM pozwala na pomiar zależności intensywności fluorescencji dwufotonowej od kierunku polaryzacji liniowej wiązki wzbudzenia oraz analizę polaryzacji emitowanej fluorescencji8. Implementacja tej techniki wymaga uzupełnienia standardowej ścieżki wzbudzenia ustawienia mikroskopu wielofotonowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) o płytkę półfalową do sterowania płaszczyzną polaryzacji światła. Następnie z sygnałów zebranych przez dwie fotodiody lawinowe, zbierając w ten sposób dwie, wzajemnie prostopadłe składowe polaryzacji polaryzacji fluorescencji wzbudzonej tworzy się wykresy biegunowe, obrazujące zależność intensywności wzbudzonej fluorescencji dwufotonowej od polaryzacji wzbudzonej przez dwa fotony.
Ostatnim krokiem jest proces analizy danych, uwzględniający wpływ elementów optycznych, takich jak zwierciadła dichroiczne czy obiektyw o dużej aperturze numerycznej, na polaryzację. Ze względu na naturę procesu dwufotonowego, metoda ta zapewnia zarówno zredukowaną kątową selekcję zdjęć, jak i zwiększoną rozdzielczość osiową, ponieważ wzbudzenie fluoroforów dwufotonowych poza płaszczyzną ogniskową jest probabilistycznie ograniczone. Udowodniono również, że podobne metody mogą być z powodzeniem wdrożone do obrazowania in vivo sond bliskiej podczerwieni (NIR) do obrazowania tkanek głębokich9. Ps-2PFM został wcześniej zastosowany do obrazowania fluoroforów w błonach komórkowych10 i DNA11,12, a także niestandardowych markerów fluorescencyjnych systemów biologicznych, takich jak nanocząstki złota13. Jednak we wszystkich tych przykładach informacje o organizacji biomolekuł zostały uzyskane pośrednio i wymagały predefiniowanej wzajemnej orientacji między fluoroforem a biomolekułą.
W jednym z naszych ostatnich artykułów wykazaliśmy, że ps-2PFM może być z powodzeniem stosowany do określania lokalnej polaryzacji autofluorescencji nadbudówek amyloidu i fluorescencji tioflawiny T, barwnika specyficznego dla amyloidu, związanego z włókienkami amyloidu w sferulitach6. Co więcej, w innym wykazaliśmy możliwość wykorzystania ps-2PFM do wykrywania orientacji włókienek amyloidowych wewnątrz sferulitów amyloidowych w reżimie wielkości submikronowej, co zostało potwierdzone przez korelację z obrazowaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)7. Osiągnięcie tego wyniku było możliwe dzięki: i) autofluorescencji wewnętrznej sferulitów-amyloidów, wzbudzonych jednym lub dwoma fotonami, wykazują autofluorescencję wewnętrzną z maksimami emisyjnymi zlokalizowanymi w zakresie od 450 do 500 nm i dwufotonowymi przekrojami czynnymi absorpcji porównywalnymi ze standardowymi barwnikami fluorescencyjnymi<klasa SUP="xref">14, ii) modele matematyczne wprowadzone wcześniej w celu opisania, w jaki sposób ps-2PEF barwników znakujących błony biologiczne i struktury DNA można zastosować do fluorescencji wykazywanej przez sferulity i barwniki z nimi związane8,11,15. Dlatego przed przystąpieniem do analizy zalecamy zapoznanie się z wymaganą teorią opisaną zarówno w tekście głównym, jak i w informacjach pomocniczych naszego pierwszego artykułu na ten temat6. W tym miejscu przedstawiamy protokół zastosowania techniki ps-2PFM do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu sferulitów insuliny bydlęcej.

<table><tbody><tr><td>Przygotowanie próbki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 24 x 24 mm</td><td>Chemland</td><td>04-298.202.04</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt DPX do histologii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6522</td><td>Uchwyt do szkiełek</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, polipropylen</td><td>Chemland</td><td>02-63102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Służy do inkubacji sferulitu</td></tr><tr><td>HLP 5UV System oczyszczania wody</td><td>Hydrolab</td><td></td><td>Źródło wody djonizowanej używanej do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Kwas solny (&ge; 37%, APHA &le; 10),</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-M</td><td></td></tr><tr><td>Insulina w proszku z trzustki bydlęcej (&ge; 25 jednostek/mg (HPLC))</td>Metanol <td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>(klasa HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270474</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe z wklęsłym, 76 x 26 x 1 mm</td><td>Chemland</td><td>04-296.202.09</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60</td><td>Olympus</td><td></td><td>Polaryzacyjny mikroskop optyczny używany na rysunku 2</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca gwint PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm2</td><td>Chemland</td><td>VIT131097</td><td></td></tr><tr><td>Microscope ps-2PFM setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FELH0800 - &Oslash; Filtr długoprzepustowy 25,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FESH0700 - &Oslash; Filtr krótkoprzepustowy 25,0 mm</td><td>Thorlabs</td> IDQ100 fotodiody <td></td><td></td></tr><tr><td>lawinowe zliczające fotony&nbsp;</td><td>Krótkoprzepustowy filtr emisyjny ID Quantique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton 720 nm&nbsp;</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mounted Achromatyczna półfalowa płytka, 690-1200 nm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piezoelektryczny stolik 3D</td><td>Piezosystem Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S130C - Smukły czujnik mocy fotodiody, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabView 2018</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Wersja 18.0.1f2</td></tr><tr><td>Biblioteka</td><td></td><td></td> Matplotlib <td>Wersja 3.3.2</td></tr><tr><td>Biblioteka</td><td></td><td></td> NumPy <td>Wersja 1.19.2</td></tr><tr><td>Biblioteka</td><td></td><td></td> SciPy <td>Wersja 1.5.2</td></tr><tr><td>Spyder Python 3 IDE</td><td></td><td></td><td>Wersja 4.1.5</td></tr></tbody></table>

czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization

W porównaniu do swojego jednofotonowego odpowiednika, wzbudzenie dwufotonowe jest korzystne dla eksperymentów bioobrazowania ze względu na niższą fototoksyczność, głębszą penetrację tkanek, efektywne działanie w gęsto upakowanych systemach i zredukowaną kątową fotoselekcję fluoroforów. Tak więc wprowadzenie analizy polaryzacji w dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej (2PFM) zapewnia bardziej precyzyjne określenie organizacji molekularnej w próbce w porównaniu ze standardowymi metodami obrazowania opartymi na liniowych procesach optycznych. W niniejszej pracy skupiamy się na wrażliwym na polaryzację 2PFM (ps-2PFM) i jego zastosowaniu w określaniu uporządkowania molekularnego w złożonych biostrukturach - sferulitach amyloidowych. Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera czy Parkinsona, są często diagnozowane poprzez wykrywanie agregatów białkowych amyloidów powstałych w wyniku upośledzonego procesu nieprawidłowego fałdowania białek. Zbadanie ich struktury prowadzi do lepszego zrozumienia ich ścieżki powstawania, a co za tym idzie, do opracowania bardziej czułych metod diagnostycznych. W pracy przedstawiono ps-2PFM przystosowany do wyznaczania miejscowej kolejności włókienek wewnątrz sferulitów insuliny bydlęcej i sferycznych agregatów białek amyloidogennych. Co więcej, udowadniamy, że proponowana technika może rozwiązać trójwymiarową organizację włókienek wewnątrz sferulitu.

Przedstawiony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania nadstruktur amyloidu do badań za pomocą ps-2PFM, budowy układu mikroskopowego oraz pomiarów odpowiedniej próbki. Przed jednak wykonaniem końcowego zestawu pomiarów niezbędne jest prawidłowe wyrównanie detektorów APD za pomocą izotropowego wzorca, co powinno skutkować zarejestrowaniem symetrycznego sygnału o podobnym kształcie i intensywności na obu detektorach (Rysunek 4C). Nawet minimalne różnice między intensyw...

Ten artykuł opisuje, jak można zastosować mikroskopię dwufotonową wrażliwą na polaryzację, aby scharakteryzować lokalną organizację w obrębie bezznacznikowych nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Opisano w nim również, jak przygotować i zmierzyć próbkę, skompletować wymaganą konfigurację i przeanalizować dane w celu uzyskania informacji o lokalnej organizacji włókienek amyloidowych.

Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

Compared to its one-photon counterpart, two-photon excitation is beneficial for bioimaging experiments because of its lower phototoxicity, deeper tissue ...

Naszym celem jest opracowanie nowych markerów optycznych i technik detekcji agregatów białkowych zwanych amyloidami. Są one zaangażowane w szereg chorób, takich jak choroba Alzheimera i cukrzyca typu drugiego. Tak więc, aby wyleczyć te choroby, musimy dysponować technikami wizualizacji amyloidów.Wykazaliśmy, że mikroskopia dwufotonowa może być wykorzystana do wykrycia orientacji włókienek amyloidowych wewnątrz nadbudówek amyloidowych. Można to osiągnąć nie tylko za pomocą barwników specyficznych dla amyloidu, ale także poprzez wykorzystanie autofluorescencji amyloidów. Ponieważ nasza technika działa na nieliniowe zjawiska optyczne, może osiągnąć zmniejszoną fotoselekcję kątową, zwiększyć rozdzielczość osiową, mniejsze rozpraszanie światła, niższą fototoksyczność i głębszą penetrację próbki w porównaniu z techniką mikroskopii fluorescencji jednofotonowej.Wrażliwa na polaryzację dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna jest obiecującym narzędziem do obrazowania wewnętrznej struktury różnych złożonych struktur biologicznych, nie tylko agregatów białkowych, ale także pęcherzyków DNA i błon lipidowych.

polarization-sensitive-two-photon-microscopy-for-label-free-amyloid

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje technikę barwienia amyloidów w skrawkach tkanek za pomocą luminescencyjnie sprzężonego barwnika oligotiofenowego - heptamer-formyl tiofenu octowego lub hFTAA - do obrazowania fluorescencyjnego. Amyloidy są bogatymi w β arkusze nieprawidłowymi agregatami białkowymi. Ich wykrywanie w próbkach tkanek jest pomocne w diagnostyce i leczeniu chorób związanych z amyloidem czy proteinopatii.

Barwienie złogów amyloidu hFTAA: technika wizualizacji włókienek amyloidowych przy użyciu barwnika na bazie oligotiofenu do obrazowania fluorescencyjnego w skrawkach tkanek

Źródło: Nyström, S., et al., Obrazowanie tkanek amyloidowych wybarwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia analizę struktur amyloidowych za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM), przy użyciu barwnika hFTAA w celu ujawnienia zwartych rdzeni jako niebieskich/zielonych i niestabilnych peryferii jako czerwonych/żółtych na obrazach...

Analiza struktur amyloidowych w skrawku tkanki przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

W tym artykule przedstawiamy protokół wykrywania oligodendrocytów obciążonych mikrotubulami w modelu tubulinopatii za pomocą prostego, innowacyjnego podejścia do mikroskopii drugiej harmonicznej.

Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Kursy czasowe aktywności glikozylazy DNA 8-oksoguaniny są dwufazowe, wykazując gwałtowne tworzenie produktu i liniową fazę stanu ustalonego. Wykorzystując techniki przepływu gaszącego, można zmierzyć szybkość rozerwania i stanu ustalonego, które odpowiadają odpowiednio wycięciu 8-oksoguaniny i uwolnieniu glikozylazy z DNA produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

W tym artykule przedstawiono procedurę ilościowego określania parametrów transportu masowego substancji chemicznych w różnych materiałach.  Proces ten polega na zastosowaniu modelu dyfuzji opartego na analizie odwrotnej do profili emisji par zarejestrowanych za pomocą spektrometrii mas w czasie rzeczywistym w wysokiej próżni.

Podejście oparte na analizie odwrotnej do charakterystyki transportu chemicznego w farbach

Synteza, aktywacja i charakterystyka celowo zaprojektowanych metaloorganicznych materiałów szkieletowych jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy bloki budulcowe są niekompatybilne lub niechciane polimorfy są termodynamicznie faworyzowane nad pożądanymi formami. Opisujemy, w jaki sposób zastosowania wspomaganej rozpuszczalnikiem wymiany łączników, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego proszku w kapilarnach i aktywacji poprzez suszenie nadkrytycznym CO2 mogą rozwiązać niektóre z tych wyzwań.

Synteza i charakterystyka funkcjonalizowanych struktur metaloorganicznych

Poznaj czułą na polaryzację mikroskopię dwufotonową do badania orientacji fibryl amyloidowych w sferulitach. Ta technika umożliwia głębszą penetrację próbki i niższą fototoksyczność w porównaniu do metod jednofotonowych.

Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

Przeglądaj więcej filmów