Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Protokół ten wytwarza kowalencyjnie stabilizowane kompleksy peptydów transbłonowych do badań strukturalnych mających na celu zrozumienie, w jaki sposób białka błonowe oddziałują ze sobą poprzez swoje domeny osadzone w lipidach. Po pierwsze, należy wyrazić znakowane hist białko fuzyjne zawierające sekwencję transbłonową będącą przedmiotem zainteresowania u E. coli. Następnie wyekstrahuj białko z frakcji inkluzji za pomocą gwinei i detergentu przy użyciu matrycy powinowactwa do niklu.

Skoncentrować znakowane hist białko fuzyjne i siarczek di, usieciować je do postaci średnicowej, myjąc kolumnę w roztworze zawierającym środki utleniające. Następnie wymyj usieciowane białko fuzyjne w kwasie trifluorowooctowym i potraktuj bromkiem cyjanu w celu uwolnienia partnera fuzyjnego, przystąp do wyizolowania usieciowanego produktu peptydowego z mieszaniny trawiennej za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Ostatecznie tożsamość i czystość produktów są weryfikowane za pomocą strony SDS i analiz spektrometrii mas.

Główną zaletą tej techniki jest to, że czyste kompleksy socjometryczne są wytwarzane do badań strukturalnych przy użyciu technik takich jak roztwór lub NMR w ciele stałym. Nawet jeśli wiadomo, że dwie domeny transbłonowe oddziałują na siebie, rozpuszczalność peptydów i tworzenie kompleksów są często sprzeczne w warunkach eksperymentalnych. Zaczynając od dobrze zdefiniowanego kowalencyjnie stabilizowanego kompleksu, można znacznie poszerzyć zakres warunków eksperymentalnych, które można przetestować w celu zebrania wysokiej jakości danych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z trudnościami w radzeniu sobie z tymi niezwykle hydrofobowymi fragmentami białkowymi. Niniejszy protokół oraz porady zawarte w dołączonym manuskrypcie mają na celu zapewnienie prostego rozwiązania niektórych z najczęstszych wyzwań w procesie przewidywania i oczyszczania. Podniebienie, jednolitrowa kultura bakterii wyrażająca fuzję peptydów flaków i ponowne zawieszenie w 50 mililitrach buforu do lizy.

Następnie wykonaj trzy cykle sonikacji z maksymalną wydajnością przez jedną minutę i schładzaj na lodzie przez pięć minut. Zebrać nierozpuszczalny materiał korpusu inkluzji przez odwirowanie w stężeniu 20 000 G przez 15 minut dekantować i odstawić supernatant. Etapy sonikacji i wirowania można powtórzyć, jeżeli wymagana jest poprawa czystości frakcji IB.

Zarezerwować próbki osadu i materiału supernatantu do analizy strony SDS w celu potwierdzenia podróży. Lokalizacja fuzji TM do ciał inkluzyjnych rozpuszcza teraz granulki ciała inkluzji w roztworze Guine'a przy użyciu od 25 do 50 mililitrów na litr kultury. Przetworzone mieszać delikatnie w temperaturze pokojowej przez kilka godzin z okazjonalnym zasysaniem.

Następnie oczyścić lizat ciała inkluzyjnego przez odwirowanie w temperaturze od 75 000 do 100 000 razy G przez jedną godzinę. W temperaturze pokojowej przefiltruj supernat przez membranę 0,2 mikrona w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Połączyć oczyszczony lizat ciała inkluzyjnego z żywicą o powinowactwie do niklu, która została zrównoważona z roztworem gwinei w celu związania partii.

Zawiesinę delikatnie wymieszać przez noc w temperaturze pokojowej. Załaduj zawiesinę żywicy niklowej z lizatem ciała inkluzyjnego do pustej kolumny przepływowej grawitacyjnej z porowatym podparciem złoża, aż przepłynie cała objętość. Zebrać i odłożyć na bok przepływ, przez który może nadal zawierać niezwiązane białko fuzyjne.

Następnie umyj żywicę niklową grawitacyjnie. Przepływać z pięcioma objętościami złoża roztworu mocznika zawierającego pięciomilimolowy wiązkę merkaptoetanolu. Wykonaj drugie pranie bez wiązki merkaptoetanolu dla trzeciego prania.

Stosować roztwór mocznika uzupełniony siarczanem miedzi i utlenionym glutationem. Następnie zamknij wylot kolumny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić maksymalne utworzenie wiązania di siarczkowego. Umyć utleniający roztwór mocznika 10 objętościami wody.

Następnie zastosuj linię podciśnieniową, aby wysuszyć łoże kolumny i zamknij wylot kolumny. Teraz w kapturze bezpieczeństwa chemicznego dodaj 1,5 objętości złoża czystego TFA, wymieszaj żywicę niklową małą szpatułką, aby zapewnić równomierne wystawienie na działanie kwasu i inkubuj przez pięć minut. W razie potrzeby zebrać eluat kwasowy pod ciśnieniem za pomocą sprężonego przewodu powietrznego, aby wypchnąć całą ciecz.

Powtórz etap rozcieńczania kwasem z kolejnymi 1,5 objętościami złoża czystego TFA Aby zmierzyć wydajność białka, rozcieńczyć TFA EIT w etanolu trifluoroetanolu i zmierzyć chłonność przy 280 nanometrach w stosunku do A-T-F-A-T-E. Rozcieńczyć kwasowe elu do 80% końcowego stężenia TFA kroplami. Dodanie wody podczas delikatnego mieszania.

Jeśli wytrącisz formy, dodaj z powrotem niewielką ilość TFA, aż roztwór się klaruje. Następnie skoryguj do 80% wodą. Zarezerwuj pięciomikrolitrową próbkę wstępnego trawienia do analizy strony SDS i natychmiast zamroź ją w ciekłym azocie.

Następnie zważyć kryształy bromku cyjanu dla około 0,2 grama na mililitr próbki. Dbając o bezpieczne zważenie toksycznej substancji chemicznej. Dodać bromek cyjanu do próbki w kapturze bezpieczeństwa i delikatnie mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.

Teraz przepłukać naczynie reakcyjne w uszczelce z gazem obojętnym i inkubować przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zarezerwuj pięciomikrolitrową próbkę po strawieniu do analizy strony SDS, natychmiast zamrażając ją w ciekłym azocie i liofilizuj razem z próbką wstępnego trawienia. Następnie przenieś reakcję trawienia do kasety do dializy z regenerowanej celulozy, co pozwala na znaczne zwiększenie objętości.

Próbkę należy dializować przez noc w czterech litrach wody w chemicznym okapie dla kobiet. Następnego ranka usunąć dializowany roztwór reakcyjny z zawieszonym osadem białkowym z kasety dializacyjnej i przenieść zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie zamrozić i liofilizować próbkę przez kilka dni, aby usunąć wodę i wszelkie ślady cyjanu, bromku i TFA, rozpuść do 100 miligramów liofilizowanych produktów trawienia w trzech mililitrach czystego mieszania kwasu mrówkowego, aż roztwór całkowicie się oczyści.

Załadować próbkę do kolumny zoax SB 300 C3 w skali preparatywnej w strumieniu rozpuszczalnika A za pomocą pięciomililitrowej pętli próbki. Następnie eluować produkty trawienia w gradiencie rozpuszczalnika B, w co najmniej pięciu objętościach kolumn. Przeanalizuj frakcje HPLC za pomocą strony SDS i spektrometrii mas MALDI TOF, aby zidentyfikować interesujące gatunki i potwierdzić ich oczekiwaną masę liofilizacji.

Frakcje HPLC zawierające usieciowany produkt peptydowy. Jeśli produkt wyschnie do postaci filmu, a nie proszku, można go ponownie rozpuścić w niewielkiej objętości HFIP zamrożonego w płynie i liofilizowanego. Ponownie, rezultatem będzie puszysty biały stożek, który można łatwo wychylić i zważyć Sekwencja DNA kodująca transbłonowe i flagujące regiony transbłonowej cząsteczki sygnalizacyjnej receptora immunologicznego.

DAP 12 został sklonowany do wektora peptydowego PMM przy użyciu trzech miejsc restrykcyjnych w języku hindi i BAM H jeden. Powstały w ten sposób bakteryjny konstrukt ekspresyjny wytwarza oznakowane białko fuzyjne z unikalnymi wewnętrznymi resztami metioniny i cystyny do rozszczepienia bromku cyjanogenu i sieciowania oksydacyjnego. Poziom ekspresji osiągnięty dla fuzji flaków różni się w zależności od sekwencji aminokwasowej przyłączonego peptydu.

Preparat ten dał około 120 miligramów czystego, nienaruszonego białka fuzyjnego z jednego litra kultury i czterech mililitrów matrycy niklowej. Po lizie komórek białko fuzyjne zostało zlokalizowane w osadzie inkluzji ciała. Około 70% fuzji oczyszczonych z niklu flaków DAP 12 TM było usieciowanych dwusiarczkiem do formy DME.

Chociaż produkty peptydowe DAP 12 TM nie są łatwe do zidentyfikowania w całkowitych próbkach trawienia bromku CYANOGEN, porównanie nienaruszonych pasm fuzji i fragmentów tripu w zredukowanej próbce trawienia wskazuje, że trawienie fuzji było w około 60% kompletne w tej typowej separacji produktów trawienia. Na kolumnie C3 w skali preparatywnej przy użyciu HPLC z odwróconą fazą, związane produkty naliczane w dwustopniowym gradieniu rozpuszczalnika B. Produkt peptydowy usieciowany siarczkiem diss można zidentyfikować w analizie strony SDS głównych frakcji HPLC w warunkach nieredukujących i redukujących. Analiza spektrometrii mas Maldi tof potwierdza tożsamość peptydu deme w piku czwartym z głównym produktem o wartości 6729,2 daltonów.

Nie zapominaj, że praca z cyjanogenem, bromkiem, rozpuszczalnikami organicznymi i stężonymi kwasami może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tych procedur należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny, a bromek cyjanu nigdy nie powinien być dotykany poza zatwierdzonym kapturem bezpieczeństwa chemicznego. Technika ta dostarczyła kluczowego materiału badawczego dla trzech różnych struktur roztworu i mr transbłonowych kompleksów peptydowych, demonstrując, w jaki sposób wielopodjednostkowe receptory immunologiczne gromadzą się w wyniku interakcji białkowych w błonie limfocytów.

Wierzymy, że zastosowanie tej techniki okaże się równie cenne dla innych systemów białek błonowych.