Name: Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania stabilizowanych dwusiarczkiem kompleksów peptydowych transbłonowych do badań strukturalnych białek błonowych. Protokół obejmuje ekspresję w E. coli, oczyszczanie chromatografią afirową i analizę NMR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy jest zapewnione przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Australii (projekt NHMRC grant 1011352 dla M.E.C i M.J.C.; Grant Independent Research Institutes Infrastructure Support Scheme [IRIISS] dla WEHI) oraz rząd stanu Wiktoria (stypendium VESKI Innovation Fellowship dla M.E.C.; Wsparcie dla WEHI przez rząd stanu Wiktoria). M.E.C. jest członkiem Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych im. Królowej Elżbiety II. E.F.X.B dziękuje za wsparcie ze strony Programu Stypendialnego im. Normy Hildy Schuster na Uniwersytecie w Melbourne.

1. Klonowanie i projektowanie konstrukcji
Sklonuj interesujące sekwencje do wektora peptydowego pMM (który może być dostarczony na żądanie) przy użyciu miejsc restrykcyjnych HindIII i BamHI (patrz Rysunek 1). Dwuniciowa wstawka DNA powinna zawierać, w następującej kolejności: miejsce HindIII; pojedynczy kodon metioniny do rozszczepienia CNBr; sekwencja kodująca peptydy zoptymalizowana pod kątem kodonu E. coli; kodon stop; strona BamHI. Wszystkie inne metioniny w peptydzie należy wyeliminować i należy unikać sekwencji dipeptydowej ASP-PRO, ponieważ będzie ona również rozszczepiana w warunkach kwaśnych.
Do każdej sekwencji peptydowej powinna zostać wprowadzona unikalna reszta cysteiny, zgodnie z pożądanym umiejscowieniem wiązania dwusiarczkowego w końcowym kompleksie, a wszystkie inne cysteiny powinny zostać zmutowane do seryny. Plazmid zawiera kasetę oporności na kanamycynę do selekcji.
2. Ekspresja fuzji trpLE-peptide
<ol>
 <li>Filtr uzupełniający i sterylny M9/Kan minimalny wzrost pożywki (0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 3 g/L KH2PO4, 7,5 g/L Na2HPO4·2H2O, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 4 g/L glukozy, 50 mg/L siarczan kanamycyny). Suplement z Centrum Complete A to Zinc w celu dostarczenia witamin z grupy B i metali śladowych: rozpuścić 1 tabletkę w 40 ml H2O mieszając przez 30 min, odwirować w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i sterylnie przefiltrować pomarańczowy supernatant. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni i użyć 4 ml/l w M9. 
 UWAGA: W razie potrzeby do pożywki M9 można dodać 15N-wzbogaconych NH4Cl, 13C wzbogaconych glukozą lub inne prekursory znakowane stabilnymi izotopami na tym etapie.</li>
 <li>Zaszczepić 100 ml kultury starterowej ze świeżo przekształconego szczepu BL21(DE3) E. coli w pożywce M9/Kan. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
 <li>Następnego ranka sprawdź OD600 kultury starterowej - powinna ona mieścić się w zakresie 2 lub większym. Rozcieńczyć 100 ml kultury starterowej na 1 l całkowitej objętości pożywki M9 uzupełnionej Centrum. Podzielić na dwie kolby o pojemności 2 l z przegrodami (po 500 ml kultury w każdej kolbie) i rosnąć w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 140 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,6.</li>
 <li>Ustaw temperaturę wytrząsarki na 18 °C i kontynuuj wytrząsanie przez 1 godzinę, pozwalając kulturom całkowicie ostygnąć przed indukcją.</li>
 <li>Pobrać próbkę przed indukcją do analizy SDS-PAGE (odpowiednik 50 μl z hodowli w OD600 = 1), a następnie dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM, aby wywołać ekspresję fuzji trpLE-peptyd. Kontynuuj wzrost w temperaturze 18 °C/140 obr./min przez noc (16-20 godzin) pod indukcją IPTG.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ciała inkluzyjnego i wiązanie matrycy niklowej
<ol>
 <li>Końcowa wartośćOD 600 kultur ekspresyjnych z dnia na dzień w minimalnej pożywce jest zmienna i powinna wynosić od 2,5 do 5,0. Pobrać próbkę do analizy SDS-PAGE (odpowiednik 50 μl z hodowli o średnicyzewnętrznej 600 = 1) i zbierać komórki przez odwirowywanie przez 20 minut przy 5 000 x g.</li>
 <li>Zawiesić osad komórkowy z 1 l kultury w 50 ml buforze do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Zawiesiny komórkowe mogą być przechowywane w stanie zamrożonym do późniejszego przetworzenia.</li>
 <li>Lizować komórki przez sonikację na lodzie z maksymalną wydajnością przez 1 minutę i odpoczywać na lodzie przez 5 minut. Używamy Misonix Sonicator 3000 (maksymalna moc wyjściowa 600 watów) z wymienną końcówką 1/2 cala o wysokiej intensywności. Powtórz sonikację/chłodzenie przez trzy cykle.</li>
 <li>Zebrać materiał z nierozpuszczalnymi ciałami inkluzyjnymi (IB) przez wirowanie przez 15 minut przy 20 000 x g i wyrzucić supernatant. Luźna, cienka warstwa jaśniejszych szczątków komórek może być widoczna na wierzchu gęstej pastylki IB; Można go zmyć wodą lub buforem z delikatnym mieszaniem. Kroki 3.3 i 3.4 można powtórzyć w celu poprawy czystości frakcji IB, jeśli jest to pożądane. Próbki osadu i materiału sklarowanego nad osadem należy pobrać do analizy SDS-PAGE w celu potwierdzenia lokalizacji fuzji trpLE-TM do ciał inkluzyjnych.</li>
 <li>Rozpuść granulki IB w roztworze guanidyny (6 M chlorowodorku guanidyny, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), używając 25-50 ml na litr przetworzonej kultury. Ten krok będzie wymagał kilku godzin z mieszaniem i okazjonalnie łagodną sonikacją.</li>
 <li>Oczyścić lizat IB przez odwirowywanie przez 1 godzinę w temperaturze 75 000-100 000 x g i temperaturze 20 °C. Zdekantować supernatant i przefiltrować przez membranę 0,2 μm.</li>
 <li>Połączyć oczyszczony lizat IB w stożkowej probówce o pojemności 50 ml lub w większym naczyniu, które można bezpiecznie zamknąć, z żywicą o powinowactwie do niklu, którą przemyto wodą i zrównoważono z roztworem guanidyny. Użyj 3-4 ml osiadłej żywicy na litr przetworzonej kultury, aby uzyskać fuzje, które wyrażają się w podobnym stopniu, jak trpLE-DAP12TM pokazany tutaj (Rysunek 3, tor 2). Wiązanie wsadowe przez inkubację przez noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
</ol>
4. Sieciowanie oksydacyjne na kolumnie
<ol>
 <li>Załaduj zawiesinę lizatu / żywicy niklowej IB do pustej kolumny przepływowej grawitacyjnej z porowatym podparciem złoża, dodając w sposób ciągły, aż przepłynie przez nią cała objętość. Zebrać i odłożyć na bok przepływ, który może nadal zawierać niezwiązane białko fuzyjne.</li>
 <li>Przepłukać żywicę niklową przepływem grawitacyjnym 5 objętościami roztworu mocznika (8 M mocznika, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) zawierającego 5 mM β-ME.</li>
 <li>Ponownie przemyć żywicę niklową 5 objętościami roztworu mocznika bez β-ME.</li>
 <li>Umyć żywicę niklową po raz trzeci 5 objętościami złoża roztworu mocznika, który został uzupełniony o 20 μM CuSO4 i 2 mM utlenionego glutationu. Po tym przemyciu zamknąć wylot kolumny i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić maksymalne utworzenie wiązania dwusiarczkowego.</li>
</ol>
5. Elucja i kwantyfikacja TFA
UWAGA: Kwas trifluorooctowy (TFA) powoduje poważne oparzenia przy kontakcie ze skórą, a opary są bardzo drażniące. Skoncentrowany TFA powinien być stosowany wyłącznie w zatwierdzonym dygestorium chemicznym z ochroną oczu i rękawicami nielateksowymi. Sprawdź kompatybilność chemiczną wszystkich użytych materiałów; Polipropylen jest kompatybilny ze wszystkimi etapami tego protokołu.
<ol>
 <li>Przepłukać utleniający roztwór mocznika 10 objętościami wody w złożu i wysuszyć łoże kolumny, przykładając przewód próżniowy do wylotu kolumny.</li>
 <li>Zamknij wylot kolumny i dodaj 1,5 objętości złoża czystego (99-100%) TFA. Wymieszaj żywicę niklową małą szpatułką, aby zapewnić równomierne wystawienie na działanie kwasu i inkubuj przez 5 minut. Otwórz wylot kolumny i zbierz eluat kwasu, delikatnie zwiększając ciśnienie za pomocą strzykawki lub przewodu sprężonego powietrza, jeśli to konieczne, aby wypchnąć całą ciecz.</li>
 <li>Powtórz etap elucji kwasowej z kolejnymi 1,5 objętości złoża czystego TFA. Na tym etapie pracuj szybko, aby uniknąć całkowitego rozpuszczenia perełkowej matrycy agarozowej. Wydajność białka można w tym momencie określić zgodnie z równaniem Beera-Lamberta i teoretycznym współczynnikiem ekstynkcji molowej sekwencji trpLE-peptyd. Rozcieńczyć próbkę eluatu TFA (1:20 do 1:50) w trifluoroetanolu (TFE) i zmierzyć absorbancję przy 280 nm, stosując TFA/TFE w tym samym rozcieńczeniu co ślepa próba.</li>
</ol>
6. Trawienie CNBr
UWAGA: Bromek cyjanu (CNBr) jest bardzo toksyczny i powinien być używany tylko w zatwierdzonym dygestoriach chemicznych. Bezwzględnie wymagane są środki ochrony osobistej, w tym okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice nielateksowe. CNBr reaguje na wilgoć i przed otwarciem należy go doprowadzić do temperatury pokojowej. Skontaktuj się z instytucjonalnym biurem ds. bezpieczeństwa, aby uzyskać instrukcje dotyczące neutralizacji/utylizacji roztworów i materiałów zanieczyszczonych CNBr.
<ol>
 <li>Rozcieńczyć eluat kwasu do 80% końcowego stężenia TFA, dodając kroplami wodę, delikatnie mieszając. Jeśli utworzy się osad, dodaj z powrotem niewielką objętość (0,5 do 1 ml) czystego TFA, aż roztwór się klaruje, a następnie ponownie skoryguj do 80% wodą. Pobrać 5 μl próbki do wstępnego trawienia do analizy SDS-PAGE, zamrażając w ciekłym azocie i natychmiast liofilizując próbkę.</li>
 <li>Dodaj kryształy CNBr do około 0,2 g/ml, uważając, aby bezpiecznie zważyć toksyczną substancję chemiczną w zamkniętych, wstępnie zważonych probówkach lub używając wagi wewnątrz okapu oparów chemicznych. Delikatnie mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przepłukać i uszczelnić naczynie reakcyjne w gazie obojętnym (strumień azotu lub argonu) i inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
 <li>Pobrać 5 μl próbki po strawieniu do analizy SDS-PAGE, a następnie natychmiast zamrozić i poddać liofilizacji. Przenieść reakcję trawienia do kasety lub rurki do dializy z regenerowanej celulozy (octan celulozy rozpuści się w stężonym kwasie) o masie cząsteczkowej odcięcia 3,5 kDa lub mniejszej, w zależności od wielkości oczekiwanego kompleksu peptydowego. Dializować przez noc do 4 l wody w dygestoriach chemicznych w celu zmniejszenia stężenia TFA i rozkładu nieprzereagowanego CNBr. Pozostawić miejsce w kasecie lub rurce do dializy na znaczne zwiększenie objętości (nawet dwu- lub trzykrotnie) podczas dializy w nocy.</li>
 <li>Usunąć dializowany roztwór reakcyjny z zawieszonym osadem z kasety dializacyjnej lub rurki do dializy (większość białka wytrąca się po zmniejszeniu stężenia TFA) i przenieść zawiesinę do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Zamrażać i liofilizować w celu usunięcia wody i śladów CNBr/TFA. Ten krok prawdopodobnie zajmie kilka dni. 
 ostrożność: Zarówno dializowana reakcja trawienia, jak i woda dializowana powinny być nadal traktowane jako toksyczne i traktowane/usuwane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności.</li>
 <li>Próbki kultur z etapów pre-indukcji i zbioru, supernatant i osad inkluzyjny, eluat TFA i materiał trawiony CNBr mogą być analizowane za pomocą SDS-PAGE. Przygotować próbki przez podgrzanie do temperatury 95 °C w buforze do próbek Invitrogen NuPAGE LDS. Próbki eluatu i trawienia tłuszczów trans powinny być przygotowywane zarówno w warunkach redukujących, jak i nieredukujących, aby ułatwić identyfikację produktu i ocenę sieciowania oksydacyjnego.</li>
 <li>Oddziel próbki na 12% prefabrykowanym żelu akrylowym NuPAGE bis-tris za pomocą buforu roboczego MES-SDS w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości najmniejszych produktów trawiennych.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie HPLC z odwróconymi fazami usieciowanych dwusiarczkowo-usieciowanych kompleksów peptydowych
<ol>
 <li>Rozpuść do 100 mg liofilizowanych produktów trawiennych w 2-3 ml czystego kwasu mrówkowego i załaduj na wagę preparatywną (21,2 x 150 mm) kolumnę Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT w rozpuszczalniku A (zwykle 10-20% acetonitrylu lub 5-10% izopropanolu w wodzie z 0,1% TFA).</li>
 <li>Eluować produkty trawienia w gradiencie rozpuszczalnika B (acetonitryl lub izopropanol z 0,1% TFA) przez co najmniej 5 objętości kolumn. Zobacz DYSKUSJĘ, aby uzyskać sugestie dotyczące wyboru optymalnych warunków gradientu dla różnych sekwencji peptydowych.</li>
 <li>Pobrać 50-100 μl próbek z każdej frakcji HPLC do analizy SDS-PAGE i natychmiast zamrozić i poddać liofilizacji. Usuwanie rozpuszczalników HPLC jest szybkie i powinno zakończyć się w ciągu 1-2 godzin.</li>
 <li>Przygotować liofilizowane próbki HPLC do SDS-PAGE przez podgrzanie do 95 °C w buforze do próbek Invitrogen NuPAGE LDS bez środka redukującego. Schłodzić i podzielić każdą próbkę równomiernie na 2 probówki mikrowirówkowe, dodając 100 mM DTT do jednej z nich i krótko podgrzewając.</li>
 <li>Oddzielić zredukowane i niezredukowane próbki HPLC na 12% prefabrykowanym żelu akrylowym NuPAGE bis-tris z buforem roboczym MES-SDS, jak powyżej. Małe, hydrofobowe peptydy często nie wchłaniają dobrze barwnika Coomassie i mogą nie działać przy oczekiwanej masie cząsteczkowej. Jednakże porównanie próbek zredukowanych i niezredukowanych powinno ułatwić identyfikację produktów peptydów usieciowanych i ocenę czystości.</li>
 <li>Przeanalizuj kandydujące frakcje zawierające peptydy za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą desorpcją laserową i jonizacją czasu przelotu (MALDI-TOF) (patrz DYSKUSJA) w celu zidentyfikowania interesujących gatunków i potwierdzenia ich oczekiwanej masy.</li>
 <li>Połączyć, zamrozić i liofilizować frakcje HPLC zawierające czysty, usieciowany kompleks peptydowy TM i pobrać suchą masę produktu końcowego w celu określenia wydajności. Frakcje o wysokiej zawartości izopropanolu nie mogą pozostać zamrożone. Jeśli frakcje peptydowe wyschną do filmu, a nie do puszystego liofilizowanego produktu, należy ponownie całkowicie rozpuścić film w małej objętości czystego heksafluoroizopropanolu (HFIP), zamrozić i ponownie liofilizować. Produkt poddany działaniu HFIP powinien być małym, białym stożkiem, który można łatwo wychylić i zważyć.</li>
</ol>

<ol><li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+into+the+blind+spot%3A+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li>
<li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li>
<li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface%3A+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li>
<li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li>
<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li>
<li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li>
<li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li>
<li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment%2C+CB2%28180-233%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li>
<li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li>
<li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li>
<li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li>
<li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li>
<li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer%27s+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li>
<li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li>
<li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ekspresja fuzji trpLE-TM. Z naszego doświadczenia wynika, że fuzje trpLE-TM są słabo eksprymowane w bogatej pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C, a opisane tutaj warunki hodowli okazały się skuteczne dla wielu różnych sekwencji zawierających od jednej do czterech domen TM z wydajnością w zakresie od 50 do 150 mg/L czystej, nienaruszonej fuzji. Fuzje kodujące trzy- lub czteroczęściowe fragmenty GPCR TM (odpowiednio ludzkie CCR5 TM1-TM3 i TM4-TM7) lub rdzeń katalityczny fragmentu ludzkiej peptydazy sygnałowej p...

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, którą opracowaliśmy do produkcji stabilizowanych dwusiarczkowymi kompleksów peptydów transbłonowych (TM) do badań strukturalnych przy użyciu roztworu NMR. Procedura wykorzystuje solidną ekspresję zapewnianą przez system fuzji ΔtrpLE1413 (patrz poniżej) i umożliwia generowanie kompleksów peptydowych TM o określonym składzie przy użyciu zaawansowanych technik znakowania stabilnymi izotopami dla nowoczesnych wielowymiarowych eksperymentów NMR. Zastosowaliśmy te techniki do określenia kilku struktur NMR, które ujawniły ważne nowe informacje na temat tego, w jaki sposób immunoreceptory aktywujące limfocyty są składane z wielu podjednostek białek błonowych poprzez interakcje między ich domenami TM (ostatnio przeglądane w 1). Techniki te mają zastosowanie do wielu innych błonowych systemów białkowych, a także do szerokiego zakresu dalszych metod analitycznych oprócz NMR roztworu. Podczas gdy podany tutaj przykład wykorzystuje natywne reszty cysteiny do stworzenia kompleksu, który naśladuje naturalnie wiązane białko dwusiarczkowe, projekt równie dobrze nadaje się do tworzenia zmodyfikowanych wiązań dwusiarczkowych w celu stabilizacji kompleksów, które normalnie są utrzymywane razem przez słabsze, niekowalencyjne oddziaływania, takie jak homo- i heterodimeryczne kompleksy TM białek z rodziny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)2-4 lub heterodimeryczne kompleksy integryny αβ5,6.
Ekstremalnie hydrofobowe sekwencje peptydowe, takie jak te pochodzące z dwuwarstwowych części białek TM obejmujących dwie warstwy lipidowe, są niezwykle trudnym tematem do badań biochemicznych i biofizycznych. Oprócz tego, że są bardzo trudne do manipulowania przy użyciu standardowych technik chemicznych białek i peptydów, często są dość toksyczne dla komórek i dlatego trudno je wyprodukować rekombinacyjnie. My7,8 i inni9-11 odnieśliśmy znaczący sukces w ekspresji tak trudnych sekwencji peptydowych u bakterii, jak fuzje karboksylowo-końcowe w ramce ze zmodyfikowaną wersją sekwencji ΔtrpLE1413 pochodzącej z operonu 12 E. coli trp. Polipeptyd trpLE o masie ~13 kDa kodowany przez tę sekwencję może być wytwarzany na wysokich poziomach pod promotorem T7 i jest całkowicie zlokalizowany w ciałach inkluzyjnych, w których unika się problemów związanych z toksycznością i / lub niestabilnością. Modyfikacja sekwencji poprzez dodanie aminokońcowego znacznika 9-histydyny13 i eliminacja wewnętrznych reszt metioniny i cysteiny z sekwencji14 trpLE pozwoliła na oczyszczenie fuzji trpLE-peptyd za pomocą chromatografii powinowactwa metal-jon i trawienie przy użyciu bromku cyjanu (CNBr) w celu uwolnienia pożądanej sekwencji peptydowej. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten system do ekspresji kilkunastu różnych sekwencji jako fuzji trpLE reprezentujących fragmenty białek błonowych, które zawierają aż cztery domeny TM (7,8 i niepublikowane wyniki; patrz również sekcja DYSKUSJA).
Kluczową innowacją w tym protokole jest identyfikacja warunków, w których nieustrukturyzowane i bardzo słabo rozpuszczalne fuzje trpLE-TM mogą być efektywnie sieciowane dwusiarczkowo w kontekście usprawnionego przepływu pracy. Kilka aspektów wysokowydajnej ekspresji, obsługi i oczyszczania produktów peptydowych zostało również dokładnie zoptymalizowanych, a przedstawione tutaj zalecenia są równie istotne dla produkcji produktów peptydowych TM bez usieciowania dwusiarczkowego (monomerycznego).

<table><tbody><tr><td>Bromek cyjanu</td><td>ALDRICH</td><td>P.No-C91492, CAS-506-68-3</td><td>< SILNA>SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE. Bardzo toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Kontakt z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy. Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, może powodować długotrwałe niekorzystne skutki w środowisku wodnym.</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P.CODE-1000984387, numer CAS 76-05-1</td><td><SILNA>SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE., Powoduje poważne oparzenia. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe. Działa szkodliwie na organizmy wodne, może powodować długotrwałe niekorzystne skutki w środowisku wodnym.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; tanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P.No M7154, numer CAS 60-24-2</td><td>< SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA>NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE< MOCNE>. Działa toksycznie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa drażniąco na skórę. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, może powodować długotrwałe niekorzystne skutki w środowisku wodnym.</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Numer produktu 52512, nr CAS 920-66-1</td><td><SILNA>SUBSTANCJA NIEBEZPIECZNA. TOWARY NIEBEZPIECZNE< MOCNE>. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i po połknięciu. Powoduje oparzenia.</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Merck KGaA</td><td>K41186564</td><td>łatwopalna ciecz i pary. Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu.</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>UNIVAR, AJAX FINECHEM</td><td>Numer produktu, 817, nr CAS 57-13-6</td><td>Po podgrzaniu rozkłada się na dwutlenek węgla i amoniak; po spaleniu wydziela niewielkie ilości tlenków azotu. Może powodować zaczerwienienie i podrażnienie skóry i oczu.</td></tr><tr><td>CHLOROWODOREK GUANIDYNY</td><td>Amresco</td><td>P.No-M110, Numer CAS: 50-01-1</td><td>Działa szkodliwie po połknięciu, Powoduje poważne podrażnienie oczu, Działa drażniąco na skórę, Toksyczność ostra doustnie, Działa drażniąco na skórę, Działa drażniąco na oczy.</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>SIGMA</td><td>Numer produktu- T8532 Nr CAS: 9002-93-1</td><td>Triton X-100 to niejonowy detergent, w 100% składnik aktywny, który jest często stosowany w zastosowaniach biochemicznych do rozpuszczania białek. Triton X-100 nie ma właściwości przeciwdrobnoustrojowych i jest uważany za stosunkowo łagodny, niedenaturujący</td></tr><tr><td>detergent His-Select Żel powinowactwa do niklu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Num- P6611</td><td>IS-Select Nickel Affinity Gel to produkt do chromatografii powinowactwa do jonów metali (IMAC). Żel HIS-Select Nickel Affinity to opatentowany chelat czworonożny na agarozie z perełkami naładowany niklem, który jest przeznaczony do specyficznego wiązania białek zawierających histydynę.</td></tr><tr><td>(-)-Glutation, utleniony</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Numer katalogowy 150568</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dźwiękowiec Misonix S-3000</td><td>QSONICA</td><td>S-3000 (wycofany)</td><td>Maksymalna moc wyjściowa 600 watów. Sonda z wymienną końcówką 1/2 cala przyjmuje końcówki 1/2 cala o wysokiej intensywności i dużej objętości oraz szereg końcówek o wysokiej intensywności i małej objętości. Najbliższe modele dostępne obecnie w ofercie tej firmy to Q500 i Q700.</td></tr><tr><td>RP-HPLC: System chromatografii DuoFlow firmy BioLogic, wersja oprogramowania 5.3</td> Numer katalogu <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>760-0047, nr konfiguracji: AU500571, numer seryjny: 484BR3705</td><td>Peptydy wiążą się z kolumnami HPLC z odwróconą fazą w wysokiej wodnej fazie ruchomej i są eluowane z kolumn RP HPLC z wysoką organiczną fazą ruchomą. W RP HPLC peptydy są rozdzielane na podstawie ich hydrofobowego charakteru. Peptydy można rozdzielić, prowadząc liniowy gradient rozpuszczalnika organicznego.</td></tr><tr><td>Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analityczna kolumna HPLC, 21,2 x 150 mm, 5 &mu; m wielkość cząstek</td><td>Agilent</td><td>Nr produktu: 895150-909</td><td>Kolumna HPLC z odwróconymi fazami</td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0341BOX</td><td>Wstępnie obsadzone żele do elektroforezy białek</td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G2, 3,5K</td><td>MWCO Thermo Scientific</td><td>Nr produktu: 87724</td><td>Dializa próbki</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Fizyczne interakcje między zatopionymi w lipidach domenami alfa-helisowymi białek błonowych odgrywają kluczową rolę w fałdowaniu i składaniu kompleksów białek błonowych oraz w dynamicznych procesach, takich jak sygnalizacja transbłonowa (TM) i regulacja poziomów białek na powierzchni komórki. Zrozumienie cech strukturalnych napędzających asocjację poszczególnych sekwencji wymaga zaawansowanych analiz biofizycznych i biochemicznych kompleksów peptydowych TM. Jednak ekstremalna hydrofobowość domen TM sprawia, że bardzo trudno jest nimi manipulować przy użyciu standardowych technik chemicznych peptydów, a produkcja odpowiedniego materiału do badań często okazuje się zbyt trudna. Zidentyfikowanie warunków, w których peptydy mogą przyjmować stabilne konformacje spiralne i spontanicznie tworzyć kompleksy, zwiększa poziom trudności. W tym miejscu przedstawiamy procedurę wytwarzania homo- lub hetero-dimerycznych kompleksów peptydowych TM z materiałów, które ulegają ekspresji w E. coli, umożliwiając w ten sposób stosunkowo niedrogie włączenie stabilnych znaczników izotopowych do magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub aminokwasów nienaturalnych do innych zastosowań. Kluczową innowacją w tej metodzie jest to, że kompleksy TM są wytwarzane i oczyszczane jako kowalencyjnie powiązane (usieciowane dwusiarczkowo-krzyżowe) zespoły, które mogą tworzyć stabilne, stechiometryczne i jednorodne struktury po rozpuszczeniu w detergentach, lipidach lub innych materiałach błono-mimetycznych. Przedstawiamy również starannie zoptymalizowane procedury ekspresji i oczyszczania, które są równie przydatne, niezależnie od tego, czy wytwarza się pojedyncze domeny TM, czy usieciowane kompleksy, a także udzielamy porad dotyczących dostosowania tych metod do nowych sekwencji TM.

Poziom ekspresji osiągany dla fuzji trpLE jest zmienny i w dużym stopniu zależy od sekwencji aminokwasowej przyłączonego peptydu. Rycina 3 przedstawia analizę SDS-PAGE próbek pobranych przed indukcją (ścieżka 1) oraz w momencie zbioru (ścieżka 2) z hodowli, która dostarczyła około 120 mg czystej, nienaruszonej fuzji trpLE-DAP12TM z 1 litra hodowli i 4 ml matrycy niklowej. Cała fuzja trpLE-DAP12TM zlokalizowana była w osadzie ciałek inkluzyjnych (ścieżka 4), a nie w supernatancie (ścieżka 3).
<p clas...

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Protokół ten wytwarza kowalencyjnie stabilizowane kompleksy peptydów transbłonowych do badań strukturalnych mających na celu zrozumienie, w jaki sposób białka błonowe oddziałują ze sobą poprzez swoje domeny osadzone w lipidach. Po pierwsze, należy wyrazić znakowane hist białko fuzyjne zawierające sekwencję transbłonową będącą przedmiotem zainteresowania u E. coli. Następnie wyekstrahuj białko z frakcji inkluzji za pomocą gwinei i detergentu przy użyciu matrycy powinowactwa do niklu.Skoncentrować znakowane hist białko fuzyjne i siarczek di, usieciować je do postaci średnicowej, myjąc kolumnę w roztworze zawierającym środki utleniające. Następnie wymyj usieciowane białko fuzyjne w kwasie trifluorowooctowym i potraktuj bromkiem cyjanu w celu uwolnienia partnera fuzyjnego, przystąp do wyizolowania usieciowanego produktu peptydowego z mieszaniny trawiennej za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Ostatecznie tożsamość i czystość produktów są weryfikowane za pomocą strony SDS i analiz spektrometrii mas.Główną zaletą tej techniki jest to, że czyste kompleksy socjometryczne są wytwarzane do badań strukturalnych przy użyciu technik takich jak roztwór lub NMR w ciele stałym. Nawet jeśli wiadomo, że dwie domeny transbłonowe oddziałują na siebie, rozpuszczalność peptydów i tworzenie kompleksów są często sprzeczne w warunkach eksperymentalnych. Zaczynając od dobrze zdefiniowanego kowalencyjnie stabilizowanego kompleksu, można znacznie poszerzyć zakres warunków eksperymentalnych, które można przetestować w celu zebrania wysokiej jakości danych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z trudnościami w radzeniu sobie z tymi niezwykle hydrofobowymi fragmentami białkowymi. Niniejszy protokół oraz porady zawarte w dołączonym manuskrypcie mają na celu zapewnienie prostego rozwiązania niektórych z najczęstszych wyzwań w procesie przewidywania i oczyszczania. Podniebienie, jednolitrowa kultura bakterii wyrażająca fuzję peptydów flaków i ponowne zawieszenie w 50 mililitrach buforu do lizy.Następnie wykonaj trzy cykle sonikacji z maksymalną wydajnością przez jedną minutę i schładzaj na lodzie przez pięć minut. Zebrać nierozpuszczalny materiał korpusu inkluzji przez odwirowanie w stężeniu 20 000 G przez 15 minut dekantować i odstawić supernatant. Etapy sonikacji i wirowania można powtórzyć, jeżeli wymagana jest poprawa czystości frakcji IB.Zarezerwować próbki osadu i materiału supernatantu do analizy strony SDS w celu potwierdzenia podróży. Lokalizacja fuzji TM do ciał inkluzyjnych rozpuszcza teraz granulki ciała inkluzji w roztworze Guine'a przy użyciu od 25 do 50 mililitrów na litr kultury. Przetworzone mieszać delikatnie w temperaturze pokojowej przez kilka godzin z okazjonalnym zasysaniem.Następnie oczyścić lizat ciała inkluzyjnego przez odwirowanie w temperaturze od 75 000 do 100 000 razy G przez jedną godzinę. W temperaturze pokojowej przefiltruj supernat przez membranę 0,2 mikrona w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Połączyć oczyszczony lizat ciała inkluzyjnego z żywicą o powinowactwie do niklu, która została zrównoważona z roztworem gwinei w celu związania partii.Zawiesinę delikatnie wymieszać przez noc w temperaturze pokojowej. Załaduj zawiesinę żywicy niklowej z lizatem ciała inkluzyjnego do pustej kolumny przepływowej grawitacyjnej z porowatym podparciem złoża, aż przepłynie cała objętość. Zebrać i odłożyć na bok przepływ, przez który może nadal zawierać niezwiązane białko fuzyjne.Następnie umyj żywicę niklową grawitacyjnie. Przepływać z pięcioma objętościami złoża roztworu mocznika zawierającego pięciomilimolowy wiązkę merkaptoetanolu. Wykonaj drugie pranie bez wiązki merkaptoetanolu dla trzeciego prania.Stosować roztwór mocznika uzupełniony siarczanem miedzi i utlenionym glutationem. Następnie zamknij wylot kolumny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić maksymalne utworzenie wiązania di siarczkowego. Umyć utleniający roztwór mocznika 10 objętościami wody.Następnie zastosuj linię podciśnieniową, aby wysuszyć łoże kolumny i zamknij wylot kolumny. Teraz w kapturze bezpieczeństwa chemicznego dodaj 1,5 objętości złoża czystego TFA, wymieszaj żywicę niklową małą szpatułką, aby zapewnić równomierne wystawienie na działanie kwasu i inkubuj przez pięć minut. W razie potrzeby zebrać eluat kwasowy pod ciśnieniem za pomocą sprężonego przewodu powietrznego, aby wypchnąć całą ciecz.Powtórz etap rozcieńczania kwasem z kolejnymi 1,5 objętościami złoża czystego TFA Aby zmierzyć wydajność białka, rozcieńczyć TFA EIT w etanolu trifluoroetanolu i zmierzyć chłonność przy 280 nanometrach w stosunku do A-T-F-A-T-E. Rozcieńczyć kwasowe elu do 80% końcowego stężenia TFA kroplami. Dodanie wody podczas delikatnego mieszania.Jeśli wytrącisz formy, dodaj z powrotem niewielką ilość TFA, aż roztwór się klaruje. Następnie skoryguj do 80% wodą. Zarezerwuj pięciomikrolitrową próbkę wstępnego trawienia do analizy strony SDS i natychmiast zamroź ją w ciekłym azocie.Następnie zważyć kryształy bromku cyjanu dla około 0,2 grama na mililitr próbki. Dbając o bezpieczne zważenie toksycznej substancji chemicznej. Dodać bromek cyjanu do próbki w kapturze bezpieczeństwa i delikatnie mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.Teraz przepłukać naczynie reakcyjne w uszczelce z gazem obojętnym i inkubować przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zarezerwuj pięciomikrolitrową próbkę po strawieniu do analizy strony SDS, natychmiast zamrażając ją w ciekłym azocie i liofilizuj razem z próbką wstępnego trawienia. Następnie przenieś reakcję trawienia do kasety do dializy z regenerowanej celulozy, co pozwala na znaczne zwiększenie objętości.Próbkę należy dializować przez noc w czterech litrach wody w chemicznym okapie dla kobiet. Następnego ranka usunąć dializowany roztwór reakcyjny z zawieszonym osadem białkowym z kasety dializacyjnej i przenieść zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie zamrozić i liofilizować próbkę przez kilka dni, aby usunąć wodę i wszelkie ślady cyjanu, bromku i TFA, rozpuść do 100 miligramów liofilizowanych produktów trawienia w trzech mililitrach czystego mieszania kwasu mrówkowego, aż roztwór całkowicie się oczyści.Załadować próbkę do kolumny zoax SB 300 C3 w skali preparatywnej w strumieniu rozpuszczalnika A za pomocą pięciomililitrowej pętli próbki. Następnie eluować produkty trawienia w gradiencie rozpuszczalnika B, w co najmniej pięciu objętościach kolumn. Przeanalizuj frakcje HPLC za pomocą strony SDS i spektrometrii mas MALDI TOF, aby zidentyfikować interesujące gatunki i potwierdzić ich oczekiwaną masę liofilizacji.Frakcje HPLC zawierające usieciowany produkt peptydowy. Jeśli produkt wyschnie do postaci filmu, a nie proszku, można go ponownie rozpuścić w niewielkiej objętości HFIP zamrożonego w płynie i liofilizowanego. Ponownie, rezultatem będzie puszysty biały stożek, który można łatwo wychylić i zważyć Sekwencja DNA kodująca transbłonowe i flagujące regiony transbłonowej cząsteczki sygnalizacyjnej receptora immunologicznego.DAP 12 został sklonowany do wektora peptydowego PMM przy użyciu trzech miejsc restrykcyjnych w języku hindi i BAM H jeden. Powstały w ten sposób bakteryjny konstrukt ekspresyjny wytwarza oznakowane białko fuzyjne z unikalnymi wewnętrznymi resztami metioniny i cystyny do rozszczepienia bromku cyjanogenu i sieciowania oksydacyjnego. Poziom ekspresji osiągnięty dla fuzji flaków różni się w zależności od sekwencji aminokwasowej przyłączonego peptydu.Preparat ten dał około 120 miligramów czystego, nienaruszonego białka fuzyjnego z jednego litra kultury i czterech mililitrów matrycy niklowej. Po lizie komórek białko fuzyjne zostało zlokalizowane w osadzie inkluzji ciała. Około 70% fuzji oczyszczonych z niklu flaków DAP 12 TM było usieciowanych dwusiarczkiem do formy DME.Chociaż produkty peptydowe DAP 12 TM nie są łatwe do zidentyfikowania w całkowitych próbkach trawienia bromku CYANOGEN, porównanie nienaruszonych pasm fuzji i fragmentów tripu w zredukowanej próbce trawienia wskazuje, że trawienie fuzji było w około 60% kompletne w tej typowej separacji produktów trawienia. Na kolumnie C3 w skali preparatywnej przy użyciu HPLC z odwróconą fazą, związane produkty naliczane w dwustopniowym gradieniu rozpuszczalnika B. Produkt peptydowy usieciowany siarczkiem diss można zidentyfikować w analizie strony SDS głównych frakcji HPLC w warunkach nieredukujących i redukujących. Analiza spektrometrii mas Maldi tof potwierdza tożsamość peptydu deme w piku czwartym z głównym produktem o wartości 6729,2 daltonów.Nie zapominaj, że praca z cyjanogenem, bromkiem, rozpuszczalnikami organicznymi i stężonymi kwasami może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tych procedur należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny, a bromek cyjanu nigdy nie powinien być dotykany poza zatwierdzonym kapturem bezpieczeństwa chemicznego. Technika ta dostarczyła kluczowego materiału badawczego dla trzech różnych struktur roztworu i mr transbłonowych kompleksów peptydowych, demonstrując, w jaki sposób wielopodjednostkowe receptory immunologiczne gromadzą się w wyniku interakcji białkowych w błonie limfocytów.Wierzymy, że zastosowanie tej techniki okaże się równie cenne dla innych systemów białek błonowych.

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Produkcja zstabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi kompleksów peptydów transbłonowych do badań strukturalnych

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Poznaj metodę wytwarzania stabilizowanych dwusiarczkiem kompleksów peptydowych transbłonowych do badań strukturalnych białek błonowych. Protokół obejmuje ekspresję w E. coli, oczyszczanie chromatografią afirową i analizę NMR.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Przeglądaj więcej filmów