Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Protokół ten wytwarza kowalencyjnie stabilizowane kompleksy peptydów transbłonowych do badań strukturalnych mających na celu zrozumienie, w jaki sposób białka błonowe oddziałują ze sobą poprzez swoje domeny osadzone w lipidach. Po pierwsze, należy wyrazić znakowane hist białko fuzyjne zawierające sekwencję transbłonową będącą przedmiotem zainteresowania u E. coli. Następnie wyekstrahuj białko z frakcji inkluzji za pomocą gwinei i detergentu przy użyciu matrycy powinowactwa do niklu.

Skoncentrować znakowane hist białko fuzyjne i siarczek di, usieciować je do postaci średnicowej, myjąc kolumnę w roztworze zawierającym środki utleniające. Następnie wymyj usieciowane białko fuzyjne w kwasie trifluorowooctowym i potraktuj bromkiem cyjanu w celu uwolnienia partnera fuzyjnego, przystąp do wyizolowania usieciowanego produktu peptydowego z mieszaniny trawiennej za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Ostatecznie tożsamość i czystość produktów są weryfikowane za pomocą strony SDS i analiz spektrometrii mas.