Analiza struktur amyloidowych w skrawku tkanki przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Weź wycinek tkanki z agregatami amyloidu reprezentującymi nieprawidłowe złogi białka.

Tkanka jest barwiona barwnikiem fluorescencyjnym heptamer-formyl tiofenem octowym lub hFTAA, który wiąże się specyficznie ze strukturami beta-arkuszowymi włókien amyloidowych.

Zobrazuj szkiełko za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w jednostkę do obrazowania czasu życia fluorescencji, która mierzy czas życia fluorescencji cząsteczek barwnika.

Zoptymalizuj ustawienia mikroskopu pod kątem efektywnego wzbudzania cząsteczek barwnika.

Gdy światło lasera oświetla tkankę, hFTAA wzbudza się i fluoryzuje.

Silniejsze wiązanie barwnikiem w strukturach zwartych skutkuje dłuższą żywotnością, podczas gdy słabsze wiązanie barwnikiem w mniej zwartych strukturach prowadzi do krótszych żywotów.

Później oprogramowanie generuje obraz agregacji oznaczony kolorami.

Kolory, takie jak czerwony i żółty, pojawiają się na obrzeżach, wskazując na krótsze czasy życia fluorescencji, które odzwierciedlają mniej zwarte, niestabilne struktury amyloidowe.

Podczas gdy kolory takie jak niebieski i zielony w rdzeniu reprezentują dłuższe czasy życia fluorescencji, odzwierciedlając bardziej zwarte i stabilne struktury amyloidowe.

W dniu barwienia zanurz skrawki w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu, dH_2O i PBS na 10 minut za każdym razem, a następnie pozwól skrawkom tkanki wyschnąć w warunkach otoczenia. Podczas wyschnięcia tkanki przygotuj roztwór roboczy HFTAA, rozcieńczając zapas od 1 do 10 000 w PBS. Gdy tkanka wyschnie, dodaj kropelki roztworu roboczego HFTAA do każdej sekcji tkanki, aby ją przykryć. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Spłucz roztwór barwiący 500 mikrolitrami PBS, a następnie zanurz szkiełko w kąpieli PBS na 10 minut. Po pozostawieniu sekcji do wyschnięcia w warunkach otoczenia, zamontuj ją za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Poczekaj, aż podłoże montażowe osiądzie przez noc.

Detekcja amyloidu może być wykonywana bezpośrednio po zamontowaniu lub nawet bez montażu. Jeśli jednak celem eksperymentu jest zebranie wysokiej jakości informacji spektralnych, preferowana jest inkubacja przez noc.

Przełącz mikroskop w tryb FLIM, ustaw otwór na 20, długość fali wzbudzenia na 490 nanometrów, a intensywność lasera na 0,5%. Używaj laserów impulsowych o częstotliwości 40 megaherców. W oprogramowaniu FLIM ustaw zliczanie fotonów powyżej 550 nanometrów. W oknie Parametry wyświetlania postępuj zgodnie ze zliczaniem fotonów, aż maksymalna liczba fotonów wyniesie około 4 000 zliczeń. Zapisz plik i wyeksportuj go jako obraz SPC.