Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Nasza grupa koncentruje się na nerwiakowłókniakowatości typu pierwszego i zrozumieniu patologii nowotworów związanych z tą chorobą, nerwiakowłókniaków splotowatych i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych. W tym celu stosujemy kilka technik, w tym genetycznie zmodyfikowany model myszy, P0-GGF-beta-3. Nasze laboratorium i inne badania nad nerwiakowłókniakami splotowatymi i złośliwymi nowotworami nerwów obwodowych stoją przed podobnymi wyzwaniami.

Ograniczony dostęp do próbek nowotworów pochodzących od pacjentów utrudnia naszą pracę. W związku z tym tworzenie i charakteryzowanie genetycznie modyfikowanych modeli myszy ma kluczowe znaczenie dla trwających badań nad mechanizmami choroby i potencjalnego rozwoju metod leczenia. Identyfikacja guzów nerwów obwodowych może być trudna i często jest błędnie diagnozowana jako inne nowotwory.

Aby tego uniknąć, opracowaliśmy szczegółowy protokół wykorzystujący histologię, immunohistochemię i klasyfikację w celu dokładnej identyfikacji i oceny tych guzów. Zwiększa to wiarygodność przyszłych badań naukowych. Nasza praca zapewnia ramy do badania i walidacji genetycznie modyfikowanych guzów pochodzących z modelu myszy, aby upewnić się, że prawidłowo naśladują ludzką chorobę

Wykorzystamy obecne genetycznie zmodyfikowane modele mysie, aby zrozumieć mikrośrodowisko guza i czynniki niezbędne do transformacji guza, co powoduje postęp nerwiakowłókniaków sploty do złośliwych guzów obwodowych. Zacznij od zidentyfikowania dużych widocznych guzów u myszy P0-GGF-beta-3. Po eutanazji myszy należy wyciąć guz w sterylnych warunkach.

Sprawdź, czy guz jest związany z nerwem obwodowym i wytnij guz. Następnie podziel widocznie zauważalne guzy na trzy części. Przeznacz jedną sztukę na histologię i jedną na kultury wczesnopasażowe.

Utrwalić próbkę tkanki do badania histologicznego w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS. Zamroź trzeci element do potencjalnych przyszłych eksperymentów. Umieść próbkę tkanki i pozostałe części ciała zwierzęcia w mieszaninie PBS paraformaldehydu na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Mysz P0-GGF-beta-3 z dużym, rażąco widocznym guzem na prawym boku i pokazano skan MRI tej myszy pokazujący guz połączony z nerwem kulszowym. Guz został zidentyfikowany jako nerwiakowłókniak po badaniu histologicznym. Zidentyfikowano mięsisty MPNST pochodzący ze splotu ramiennego zwierzęcia.

Na początek weź zatopione w parafinie skrawki guza myszy P0-GGF-beta-3 i odparafinowaj je w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki w świeżej objętości rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez kolejne 10 minut. Po zabarwieniu skrawków eozyną, użyj podłoża montażowego na bazie ksylenu do zamontowania szkiełek nakrywkowych, utrzymując szkiełko wilgotne za pomocą rozpuszczalnika na bazie d-limonenu.

Aby zbadać rdzeń kręgowy i korzenie nerwowe pod kątem guzów korzeni nerwowych, inkubuj kolumnę kręgów, związane z nią żebra i tkanki miękkie w 0,3-molowym EDTA i 4% roztworze paraformaldehydu. Następnie przepłukać próbki za pomocą PBS. Spróbuj przebić kolumnę kręgów igłą, aby potwierdzić odwapnienie.

Igła powinna wbić się bez oporu w całkowicie odwapnioną kość. Pokrój odwapniony kręgosłup i związane z nim struktury na bloki, aby zmieściły się w kasecie na tkanki i wykonaj pożądane barwienie. Właściwe znakowanie markerów MPNST zaobserwowano w niezależnie powstających MPNST.

W prawidłowo odwapnionych kręgosłupach wyraźnie widoczne były rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe, trzon kręgów i mięśnie szkieletowe. Nerwiakowłókniaka korzenia nerwu grzbietowego zaobserwowano również u myszy P0-GGF-beta-3. Zbadaj szkiełka guza barwione hematoksyną i eozyną myszy P0-GGF-beta-3 pod mikroskopią jasnego pola, aby zidentyfikować potencjalne guzy osłonki nerwów obwodowych.

Upewnij się, że mikroskopijne nerwiakowłókniaki i MPNST są związane z nerwem obwodowym. Zidentyfikuj bloki zawierające potencjalne guzy osłonki nerwów obwodowych do specjalnych barwników w celu potwierdzenia lub obalenia diagnozy. Odróżnienie potencjalnych PNST od MPNST na podstawie cech histologicznych.

Ludzkie i mysie PN P0-GGF-beta-3 mają wydłużone, faliste jądra z luźno upakowanymi komórkami oddzielonymi mixoidalnym materiałem zewnątrzkomórkowym. Obecność mitozy i guza hiperkomórkowego wskazuje na MPNST lub nowotwór o wysokim stopniu złośliwości. Następnie zbadaj wybarwione immunologicznie skrawki za pomocą mikroskopii jasnego pola.

Szukaj jednolitej lub niejednolitej immunoreaktywności dla markerów S100 beta, Nestin i SOX10, wskazujących na różnicowanie Schwanni'a w MPNST. Zbadaj skrawki pod kątem wyraźnej hiperkomórkowości, energicznej aktywności mitotycznej i atypii cytologicznej dla MPNST czwartego stopnia. Nerwiakowłókniaki składają się z nowotworowych komórek Schwanna i innych elementów nienowotworowych, na co wskazuje barwienie S100 beta subpopulacji komórek.

Nowotworowe komórki Schwanna są również immunoreaktywne dla pośredniego filamentu Nestin i czynnika transkrypcyjnego SOX10. Barwienie Luna wykonane na nerwiakowłókniaku splotowatym P0-GGF-beta-3 podkreśliło obecność komórek tucznych zwykle nieobecnych w MPNST. W przeciwieństwie do tego, immunoreaktywność Ki67 praktycznie nie istnieje w nerwiakowłókniakach splotowatych Znakowanie jądrowe Ki67 jest zwykle obecne w bardzo dużej frakcji komórek nowotworowych, jak widać w mikroskopijnym MPNST powstającym w zwoju nerwu trójdzielnym myszy P0-GGF-beta-3.

Na początek umieść sterylne szkiełka nakrywkowe w studzienkach sześciodołkowych naczyń do hodowli tkankowych i wlej odpowiednią objętość roztworu poli-l-lizyny i lamininy do studzienek, aby przykryć szkiełko nakrywkowe. Następnie zamknij płytkę folią, aby ograniczyć parowanie i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylnym PBS.

Dodać dwa mililitry zawiesiny komórkowej i pożywki wzrostowej do płytki 10 000 komórek do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Po umyciu szkiełek nakrywkowych PBS, utrwal komórki 4% roztworem paraformaldehydu i PBS przez 18 minut. Spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS przez pięć minut przed barwieniem immunologicznym.

Inkubować wybarwione immunologicznie i umyte szkiełka nakrywkowe w jednym do pięciu mikrogramów barwnika Hoechst przez 10 minut. Następnie myj szkiełka nakrywkowe PBS przez dodatkowe pięć minut. Zamontuj szkiełka przy użyciu równych proporcji mieszaniny PBS i glicerolu i uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Traktuj komórki nieenzymatycznym roztworem dysocjacji komórek przez 30 sekund do jednej minuty. Następnie dodaj pięć mililitrów DMEM na każdy mililitr nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru.

Odwirować komórki w temperaturze pięciu G przez pięć minut. Zawiesić komórki w stężeniu od jednego do dwóch razy 10 szóstych komórek na 100 mikrolitrów DMEM. Ułożyć zwierzę na brzuchu i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem.

Wstrzyknąć jeden do dwóch razy 10 do szóstych komórek podskórnie w prawą flankę. Umieść mysz samą w klatce bez ściółki i pozwól jej dojść do siebie. Aby zapobiec hipotermii, umieść część klatki na poduszce grzewczej.

Pokazano obrazy małej i dużej mocy komórek MPNST P0-GGF-beta-3 we wczesnym pasażu. Okazało się, że komórki są rakotwórcze, tworząc kolonie w miękkim agarze i przeszczepy u myszy z niedoborem odporności.