Name: Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Dowiedz się, jak identyfikować i diagnozować złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy. Metoda obejmuje techniki histologiczne i immunohistochemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 i R01 NS109655 dla S.L.C.; R01 NS109655-03S1 do D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 do S.L.C.) oraz Departament Obrony (X81XWH-09-1-0086 i W81XWH-12-1-0164 do S.L.C.).

Pathology Assessment of PN-MPNST Progression in the P0-GGFβ3 Mouse Model

<ol><li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+promoting+the+pathogenesis+of+Schwann+cell+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms.</a> Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).</li>
<li>Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+diagnosis+and+pathogenesis+of+neurofibromatosis+type+1+%28NF1%29-associated+peripheral+nervous+system+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Anatomic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms.</a> Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).</li>
<li>Longo, J. F., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RASopathies%3A+Biology%2C+genetics+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options.</a> Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).</li>
<li>Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).</li>
<li>Rad, E., Tee, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1%3A+Fundamental+insights+into+cell+signalling+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).</li>
<li>Brannan, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+neurofibromatosis+type-1+gene+leads+to+developmental+abnormalities+in+heart+and+various+neural+crest-derived+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues.</a> Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).</li>
<li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+predisposition+in+mice+heterozygous+for+a+targeted+mutation+in+Nf1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1.</a> Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).</li>
<li>Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromas+in+NF1%3A+Schwann+cell+origin+and+role+of+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment.</a> Science. 296 (5569), 920-922 (2002).</li>
<li>Cichowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+tumor+development+in+neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1.</a> Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).</li>
<li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+Nf1+transiently+promotes+self-renewal+but+not+tumorigenesis+by+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells.</a> Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).</li>
<li>Rhodes, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdkn2a+%28Arf%29+loss+drives+NF1-associated+atypical+neurofibroma+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation.</a> Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).</li>
<li>Chaney, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdkn2a+loss+in+a+model+of+neurofibroma+demonstrates+stepwise+tumor+progression+to+atypical+neurofibroma+and+MPNST%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST.</a> Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).</li>
<li>Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+mechanisms+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development.</a> International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620(2021).</li>
<li>Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor%3A+models%2C+biology%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation.</a> Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+inactivation+of+Pten+with+EGFR+overexpression+in+Schwann+cells+models+sporadic+MPNST%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST.</a> Sarcoma. 2012, 620834(2012).</li>
<li>Miettinen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+evaluation+of+atypical+neurofibromatous+tumors+and+their+transformation+into+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+in+patients+with+neurofibromatosis+1-a+consensus+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview.</a> Human Pathology. 67, 1-10 (2017).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+is+recurrently+inactivated+through+EED+or+SUZ12+loss+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+SUZ12+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).</li>
<li>Magallon-Lorenz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+genomic+analysis+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+lines+challenges+current+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis.</a> iScience. 26 (2), 106096(2023).</li>
<li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).</li>
<li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li>
<li>Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+neuregulin-1%2FErbB+signaling+pathway+promotes+the+proliferation+of+neoplastic+Schwann+cells+in+human+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).</li>
<li>Kohli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pan+erbB+inhibitor+PD168393+enhances+lysosomal+dysfunction-induced+apoptotic+death+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).</li>
<li>Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+beta+and+neuregulin-1+alpha+differentially+affect+the+migration+and+invasion+of+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).</li>
<li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).</li>
<li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).</li>
<li>Vogel, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tumor+model+for+neurofibromatosis+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1.</a> Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).</li>
<li>Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReuss%2C+DE+%22WHO+Classification+of+Tumours+of+the+Central+Nervous+System%2C+Revised+4th+Edition%22">WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition</a>. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).</li>
<li>Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+sarcoma+preclinical+modeling%3A+integrating+transgenic+mouse+models+and+patient-derived+models+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research.</a> Cancers. 15 (3), 588(2023).</li>
<li>Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+hematopoietic+progenitor+cell+antigen+CD34+in+vascular+and+spindle+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cutaneous+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors.</a> Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD-34+is+expressed+by+a+distinctive+cell+population+in+peripheral+nerve%2C+nerve+sheath+tumors%2C+and+related+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).</li>
<li>Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+gene+functions+in+tumorigenesis+by+ex+vivo+ablation+of+floxed+alleles+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).</li>
<li>Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+titrating+antibodies+for+immunocytochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).</li>
<li>Brossier, N. M., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+shed+new+light+on+the+pathogenesis+of+neurofibromatosis+type+I-related+neoplasms+of+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system.</a> Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione tu metody histologiczne i biochemiczne stanowią ramy do diagnozowania i charakteryzowania modeli GEM nerwiakowłókniaka i patogenezy MPNST. Z biegiem lat stwierdziliśmy, że te metodologie są bardzo przydatne do oceny patologii guzów osłonek nerwów obwodowych powstających w modelach GEM 21,25,26. Jednakże, chociaż przedstawione tutaj protokoły są przydatne do określenia, jak dokładnie guzy w modelach GEM podsumowują patologię swoich ludzkich odpowiedników, istnieją pewne ograniczenia tych strategii, które należy docenić. Po pierwsze, myszy P 0-GGFβ3 wykazują prawie całkowitą penetrację fenotypu guza, co sprawia, że stosunkowo łatwo jest uzyskać dużą liczbę myszy z nerwiakowłókniakami i MPNSTs 21,25,26, które można wykorzystać do badań genomicznych i badań przesiewowych shRNA w skali genomu. Wysoka penetracja fenotypu w tym modelu sprawia również, że myszy P 0-GGFβ3 są bardzo przydatne w badaniach przedklinicznych. Należy jednak pamiętać, że nie będzie tak w przypadku wszystkich modeli raka GEM. Dlatego podkreśliliśmy znaczenie określenia frakcji zwierząt, u których można przewidzieć, że rozwiną się nowotwory. Podczas pracy z modelem zwierzęcym, w którym rzadziej rozwijają się nowotwory, stwierdziliśmy, że korzystne jest stosowanie metod obrazowania, takich jak rezonans magnetyczny lub pozytonowa tomografia emisyjna, w celu ostatecznej identyfikacji zwierząt będących nosicielami nowotworów, które można wprowadzić do badań przedklinicznych lub innych badań. Takie podejście może być jednak zbyt kosztowne, jeśli wymagane jest wielokrotne skanowanie. Dlatego też podkreśliliśmy również znaczenie ustalenia średniego czasu przeżycia interesującego modelu GEM:26 zrozumienie, kiedy można się spodziewać, że u zwierzęcia rozwinie się guz, zmniejsza liczbę skanów, które są wymagane do identyfikacji zwierząt o pożądanym fenotypie i związanych z tym kosztów.
Ważne jest również, aby zdać sobie sprawę, że duży guz u myszy jest nadal raczej niewielką ilością tkanki. W tym protokole zalecamy proces, w którym tkanka nowotworowa jest dzielona na trzy części, z porcjami poświęconymi histologii/immunohistochemii, ustanawianiu kultur komórkowych wczesnego pasażu i izolacji interesujących biomolekuł (białek, RNA, DNA). Jednak rozmiar guza będzie się różnił, a jeśli guz jest dość mały, może to wykluczyć posiadanie wystarczającej ilości tkanki do podziału w ten sposób. W takim przypadku badacz musi określić, czy priorytetem jest diagnoza nowotworu, czy inne wykorzystanie tkanki nowotworowej32. W tych okolicznościach nasze nastawienie jest takie, że musimy mieć właściwą diagnozę, aby zrozumieć, z czym pracujemy, zanim rozpoczniemy inne eksperymenty. Odkryliśmy, że diagnozę guza można zwykle łatwo ustalić przy użyciu mniej niż jednej trzeciej nowotworu. Kiedy mamy do czynienia z małymi guzami, zamiast tego zazwyczaj usuwamy niewielki fragment tkanki nowotworowej, owijamy go w tkankę histologiczną i umieszczamy w kasecie na tkanki, aby upewnić się, że tkanka nie zostanie utracona podczas przetwarzania. Wadą tego podejścia jest to, że może ono spowodować, że badacz zaniży ocenę nowotworu, jeśli pożądana jest klasyfikacja WHO; Dzieje się tak, ponieważ regiony o niższym i wyższym stopniu złośliwości często współistnieją w nowotworach, a jeśli zostanie pobrana bardzo mała próbka, uzyskany stopień będzie zależał od tego, skąd pobrano próbkę guza.
Opisane przez nas protokoły ustalania tożsamości guza osłonki nerwów obwodowych opierają się w dużej mierze na immunohistochemii. Chociaż od czasu do czasu istnieją alternatywne podejścia, które można zastosować w przypadku niektórych typów komórek (np. wykonywanie barwienia Unna w celu identyfikacji komórek tucznych), nie jest to jednolicie prawdziwe dla większości typów komórek obecnych w nerwiakowłókniakach i MPNST. W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby ustalić, czy procedury immunohistochemiczne, które będą stosowane, zostały odpowiednio zoptymalizowane. Z naszego doświadczenia wynika, że kilka problemów może zagrozić immunohistochemii diagnostycznej. Niezwykle ważne jest, aby badacz wykonał serię rozcieńczeń z pierwszorzędowym przeciwciałem, którego wcześniej nie używał; Ponadto w przypadku stosowania nowej partii przeciwciała, które zostało wcześniej zoptymalizowane, należy przeprowadzić serię rozcieńczeń33. Należy również zadbać o to, aby mieć pod ręką świeże partie odczynników. Z naszego doświadczenia wynika, że z wiekiem nadtlenek wodoru i DAB są szczególnie podatne na nieprawidłowe działanie, co może prowadzić badacza do niewłaściwej decyzji, że ich plamy są negatywne.
Profile immunohistochemiczne, które opisujemy dla nerwiakowłókniaków sploty, MPNST i różnych typów nowotworów, które są brane pod uwagę w diagnostyce różnicowej MPNST, to te, z którymi najczęściej się spotykaliśmy 21,25,26,34. Ponieważ jednak rozbieżne różnicowanie nie jest rzadkością w MPNST i innych nowotworach złośliwych, badacz może napotkać profile barwienia, które różnią się nieco od tego, co tutaj opisujemy. Te niuanse są powodem, dla którego zdecydowanie zalecamy, aby w skład zespołu charakteryzującego nowy model nowotworzenia GEM wchodził doświadczony patolog ludzki lub weterynaryjny. W tym protokole zastosowaliśmy klasyfikację WHO do GEM i ludzkich MPNST. Preferujemy ten system oceniania, ponieważ kryteria oceniania są stosunkowo dobrze zdefiniowane i można je łatwo porównać między ludzkimi i mysimi MPNST 2,28. Zwracamy jednak uwagę, że kryteria klasyfikacji WHO nie są jednolicie akceptowane przez patologów. Dzieje się tak, ponieważ nie jest jasne, czy trzy stopnie WHO, które są stosowane do MPNST, są predyktorem wyników klinicznych u pacjentów. Z tego powodu wielu patologów woli klasyfikować MPNST po prostu jako nowotwory złośliwe o niskim lub wysokim stopniu złośliwości. Stosując to podejście, około 85% MPNST uważa się za nowotwory złośliwe o wysokim stopniu złośliwości, charakteryzujące się energiczną aktywnością mitotyczną, wyraźną atypią komórkową i hiperchromazją, której może towarzyszyć martwica guza. MPNST o niskim stopniu złośliwości wykazują mniejszą komórkowość, hiperchromazję i aktywność mitotyczną.
Odkryliśmy, że przeszczep allogeniczny komórek MPNST wczesnego pasażu jest prostym sposobem weryfikacji rakotwórczości tych kultur. Należy jednak wziąć pod uwagę pewne kwestie, gdy komórki nie tworzą przeszczepu allogenicznego32. Z naszego doświadczenia wynika, że podczas gdy przytłaczająca większość komórek MPNST we wczesnym pasażu tworzy przeszczep allogeniczny, od czasu do czasu spotykamy się z kulturami wczesnego pasażu, które tego nie robią. Pomimo tego niepowodzenia, macierzowa porównawcza hybrydyzacja genomowa (aCGH) i sekwencjonowanie całego egzomu wykazały, że te kultury wczesnego pasażu miały wiele nieprawidłowości genomowych zgodnych z tym, że są komórkami nowotworowymi25,26. Znaleźliśmy również kultury wczesnopasażowe, które nie są zdrowe, zwykle dlatego, że kulturom pozwolono zlać się przed zebraniem ich do szczepienia. Komórki uszkodzone przez nieostrożne obchodzenie się (np. zbyt długa inkubacja z nieenzymatycznym roztworem dysocjacyjnym komórek pipetowanym w górę iw dół nadmierną liczbę razy) również osiągają słabe wyniki po przeszczepie. Zwracamy również uwagę, że wskazane przez nas czasy zakładania przeszczepów są szacunkowe oparte na naszym doświadczeniu. Od czasu do czasu spotykamy się z kulturami wczesnopasażowymi, które z powodzeniem zakładają przeszczepy allogeniczne, ale zajmuje to więcej czasu.
Przedstawione powyżej podejścia zapewniają kompleksowe sposoby scharakteryzowania kluczowych aspektów nowo opracowanego modelu GEM neoplazji obwodowego układu nerwowego i prawidłowego diagnozowania wszelkich nerwiakowłókniaków i MPNST, które rozwijają się u tych zwierząt. Przedstawione przez nas metody ustalania kultur MPNST z wczesnym pasażem i wykorzystywania tych kultur do przeszczepu allogenicznego również dostarczają wyraźnych dowodów na rakotwórczość nowotworów zidentyfikowanych w modelach GEM. Podkreślamy, że nie dokonujemy selekcji poszczególnych klonów przy zakładaniu kultur wczesnego pasażu. Chociaż zdajemy sobie sprawę, że pewna selekcja jest nieunikniona podczas umieszczania komórek nowotworowych w hodowlach, te wstępne odkrycia sugerują, że mutacje zidentyfikowane w kulturach GEM MPNST we wczesnym pasażu pozostają bardzo podobne do tych obecnych w guzie macierzystym. Jednak stosując aCGH, odkryliśmy również, że kontynuowanie przenoszenia tych wczesnych kultur pasażowych dla bardziej wydłużonych pasaży powoduje zmiany genomowe, które zaczynają odbiegać od tego, co widać we wcześniejszych pasażach tych komórek nowotworowych.

W ciągu ostatnich trzech dekad liczne laboratoria próbowały stworzyć mysie modele ludzkich nowotworów, wprowadzając mutacje związane z ludzkim rakiem do genomu myszy lub poprzez nadekspresję produktu genetycznego, który ulega nadekspresji w ludzkich nowotworach. Powstałe w ten sposób modele myszy modyfikowanych genetycznie (GEM) można wykorzystać do różnych celów, takich jak ustalenie, że nowo wprowadzona modyfikacja genomu inicjuje nowotworzenie nowotworu, identyfikacja innych zachodzących później zmian genetycznych lub epigenetycznych, które przyczyniają się do progresji nowotworu, oraz zdefiniowanie kluczowych szlaków sygnałowych, które napędzają inicjację i progresję guza. W przeciwieństwie do ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów, które opierają się na wykorzystaniu myszy z niedoborem odporności, modele raka GEM mają w pełni funkcjonalny układ odpornościowy, a więc dokładniej modelują odpowiedzi na potencjalne środki terapeutyczne. Jednak przy użyciu modeli raka GEM do takich celów ważne jest, aby badacze potwierdzili, że obserwacje poczynione z nowotworami GEM są istotne dla ich ludzkich odpowiedników. Walidacja ta powinna obejmować dokładną ocenę patologii nowotworów GEM oraz ustalenie, czy cechy patologiczne nowotworów GEM odzwierciedlają patologię odpowiedniego typu nowotworu ludzkiego.
Zespół podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1) jest najczęstszą chorobą genetyczną atakującą ludzki układ nerwowy, występującą u około 1 na każde 3 000-3 500 żywych urodzeń1,2,3. U osób dotkniętych NF1 rozwijają się liczne łagodne guzy osłonki nerwów obwodowych znane jako nerwiakowłókniaki w skórze (nerwiakowłókniaki skórne) oraz w dużych nerwach i splotach nerwowych (nerwiakowłókniaki splotowate). Podczas gdy zarówno nerwiakowłókniaki skórne, jak i splotowate pogarszają jakość życia pacjenta, powodując upośledzenie fizyczne, behawioralne i/lub społeczne, nerwiakowłókniaki splotowate (PN) są szczególnie niebezpieczne4,5. Dzieje się tak, ponieważ PN często przekształcają się w złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST), które są agresywnymi nowotworami wrzecionowatokomórkowymi o wyjątkowo niskim wskaźniku przeżycia1,2. W dużej mierze ten niski wskaźnik przeżycia wynika z tego, że schematy radio- i chemioterapeutyczne, które są obecnie stosowane w leczeniu MPNST, są nieskuteczne. Jednak opracowanie nowych, skuteczniejszych terapii było wyzwaniem. Dzieje się tak dlatego, że pomimo tego, jak często MPNST występują u pacjentów z NF1, nadal są to rzadkie nowotwory. W rezultacie bardzo trudno jest uzyskać dużą liczbę ludzkich nowotworów do badań; wyzwaniem jest również rekrutacja wystarczającej liczby pacjentów z MPNST do badań klinicznych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono kilka modeli GEM, których celem jest uzyskanie dalszych informacji na temat nieprawidłowości napędzających patogenezę nerwiakowłókniaka i progresję PN-MPNST oraz ułatwienie badań przedklinicznych z potencjalnymi środkami terapeutycznymi.
NF1 pacjenci mają mutacje inaktywujące w jednej kopii genu NF1. Patogeneza nerwiakowłókniaka jest wywoływana, gdy mutacja inaktywująca w pozostałym funkcjonalnym genie NF1 występuje w komórce w linii komórkowej Schwanna. Co zaskakujące, gdy myszy zostały wygenerowane z mutacjami Nf1 inaktywującymi linię zarodkową, nie rozwinęły się u nich nerwiakowłókniaki6,7. Późniejsze wykazanie, że myszy z komórkami Schwanna Nf1-null i haploinsuficjencją Nf1 we wszystkich innych typach komórek (Krox20-Cre;U myszy Nf1flox/- rozwinęły się nerwiakowłókniaki splotowate, co sugerowało, że zmniejszona dawka genu Nf1 w dodatkowych typach komórek była wymagana do patogenezy nerwiakowłókniaka8. Nawet wtedy nerwiakowłókniaki splotowate w Krox20-Cre; Myszy Nf1flox/- nie rozwinęły się, aby stać się MPNST, a więc tylko częściowo naśladowały biologię swoich ludzkich odpowiedników. Patogeneza MPNST występowała, gdy mutacje Nf1 były powiązane z mutacjami w dodatkowych genach supresorowych nowotworów, takich jak Trp539 lub Cdkn2a10, ale MPNST w tych modelach GEM rozwinęły się de novo lub z atypowych nowotworów nerwiakowłókniakowatych o niepewnym potencjale biologicznym (ANNUBPs)11,12, a nie z wcześniej istniejących łagodnych nerwiakowłókniaków splotowatych (patrz13,14 za doskonałe recenzje tych modeli, jak również innych modeli wprowadzających dodatkowe mutacje powodujące utratę funkcji w genach związanych z MPNST, takich jak Suz12 i Pten15).
Te mysie modele były nieocenione dla ustalenia roli, jaką geny takie jak NF1, TP53 i CDKN2A odgrywają w patogenezie nowotworów obwodowego układu nerwowego związanych z NF1 oraz dla badań przedklinicznych testujących potencjalne środki terapeutyczne. Jednak nadal mamy niepełne zrozumienie procesu, w którym nerwiakowłókniaki splotowate przekształcają się w atypowe nowotwory nerwiakowłókniakowate o niepewnym potencjale biologicznym (ANNUBPs16), a następnie MPNST. Ostatnio poczyniono pewne postępy w zrozumieniu tego procesu dzięki niedawnemu raportowi, że myszy z delecjami w Nf1 i Arf rozwijają ANNUBPs, które stają się MPNSTs11. Jednak mysie modele oparte na mutacji Nf1, które w pełni podsumowują proces progresji nerwiakowłókniaka splotowatego-MPNST obserwowany u ludzi, jeszcze nie istnieją. Ponadto nie jest jasne, czy istnieje wiele odrębnych ścieżek, które prowadzą do rozwoju MPNST. Biorąc to pod uwagę, możliwe jest, że opisane powyżej GEM modelują tylko podzbiór kilku różnych szlaków, które prowadzą do progresji nerwiakowłókniaka-MPNST i patogenezy MPNST. Podkreśla to fakt, że MPNST również występują sporadycznie i że niektóre sporadyczne MPNST najwyraźniej nie mają mutacji NF117,18.
Chociaż ten ostatni punkt został zakwestionowany przez niedawną sugestię Magollon-Lorenz et al., że przynajmniej niektóre sporadyczne MPNST pozbawione mutacji NF1 to czerniaki lub inny typ mięsaka19, ostatnio informowaliśmy o sporadycznym MPNST i linii komórkowej pochodzącej z tego guza (komórki 2XSB), która była NF1 wild-type20. Podczas charakterystyki guza macierzystego i linii komórkowej 2XSB systematycznie wykluczaliśmy alternatywne możliwości diagnostyczne, w tym czerniaka i wiele innych typów mięsaków, które są rutynowo brane pod uwagę w diagnostyce różnicowej sporadycznego złośliwego guza osłonki nerwu obwodowego20. Ponadto zauważamy, że Magollon-Lorenz i in. przyznali, że ich odkrycia w trzech sporadycznych liniach komórkowych MPNST, które badali, nie mogą być uogólnione, aby wskazać, że wszystkie guzy zidentyfikowane jako sporadyczne MPNST nie są MPNST.
Aby skonstruować model GEM, w którym neurofibroma i patogeneza MPNST niekoniecznie były zależne od specyficznych mutacji genu supresorowego nowotworu, wygenerowaliśmy transgeniczne myszy, u których nadekspresja silnego mitogenu neureguliny-1 z komórek Schwanna (NRG1) była napędzana przez promotor białka mieliny specyficznego dla komórek Schwanna (P0) (myszy P0-GGFβ3)21. Wcześniej wykazaliśmy, że ludzkie nerwiakowłókniaki, MPNST i linie komórkowe MPNST wyrażają kilka izoform NRG1 wraz z kinazami tyrozynowymi receptora erbB (erbB2, erbB3 i erbB4), które pośredniczą w sygnalizacji NRG1 i że te receptory erbB są konstytutywnie aktywowane22. Wykazaliśmy również, że farmakologiczne inhibitory kinaz erbB silnie hamują proliferację MPNST22, survival23 i migration24. Zgodnie z naszymi obserwacjami na ludziach, myszy P 0-GGFβ3 rozwijają nerwiakowłókniaki splotowate25, które stają się MPNST z dużą częstotliwością21,25. Wykazaliśmy, że MPNST P 0-GGFβ3, podobnie jak ich ludzkie odpowiedniki, często rozwijają mutacje Trp53 i Cdkn2a, a także wiele innych nieprawidłowości genomowych, które potencjalnie przyczyniają się do nowotworzenia25. MPNST powstające u myszy P 0-GGFβ3 nie mają inaktywujących mutacji Nf1. Jednak za pomocą komplementacji genetycznej wykazaliśmy, że NRG1 promuje nowotworzenie u myszy P 0-GGFβ3 głównie poprzez te same kaskady sygnałowe, które są zmieniane przez Nf1 loss26; wniosek ten opiera się na naszym ustaleniu, że zastąpienie nadekspresji NRG1 utratą Nf1 w obecności haploinsuficjencji Trp53 (P 0-GGFβ3;Myszy Trp53 +/-) produkują zwierzęta, u których MPNST rozwijają się de novo, jak widać w cis-Nf1 +/-; Trp53+/- myszy<klasa sup="xref">27.
Aby uzyskać te i inne informacje pokazujące, że myszy P 0-GGFβ3 dokładnie modelują procesy patogenezy nerwiakowłókniaka i progresji nerwiakowłókniaka-MPNST obserwowanej u ludzi z NF1, opracowaliśmy specjalistyczne metodologie przetwarzania tkanek od tych zwierząt, dokładnego diagnozowania ich guzów, oceny MPNST powstających u tych myszy, ustalenia i scharakteryzowania wczesnych pasaży P0-GGFβ3 i P0-GGFβ3;Trp53 +/- hodowle MPNST i krytyczne porównanie patologii P 0-GGFβ3 PN i MPNST oraz P0-GGFβ3; Trp53 +/- MPNST do swoich ludzkich odpowiedników. Wiele z tych metodologii można uogólnić na inne modele GEM nowotworu układu nerwowego. Ponadto kilka z tych metodologii ma szersze zastosowanie do modeli GEM, w których nowotwory powstają w innych miejscach narządów. W związku z tym poniżej przedstawiamy szczegółowy opis tych metodyk.

<table><tbody><tr><td>100 mm Płytki do hodowli tkankowych</td><td>Corning Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'- Diaminobensydyna (DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-400</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Wtórny (kozi anty-mysz)</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Wtórny (kozi przeciw myszy)</td><td>Invitrogen</td><td>A21043 lub A11004</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Wtórny (kozioł anty-króliczy)</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejFisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Caldesmon</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>E89, ab32330</td><td></td></tr><tr><td>CD117</td><td>Cell Marque</td><td>117R-18-ASR</td><td></td></tr><tr><td>CD163</td><td>Leica</td><td>NCL-L-CD163</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab29364</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab81289</td><td></td></tr><tr><td>CD86</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab53004</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz izolacji komórek</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe w kole</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>Hybryda Citrisolve (rozpuszczalnik na bazie d-limonenu)</td><td>Decon Laboratories</td><td>5989-27-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas krytyczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratyna</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>C-11, ab7753</td><td></td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Agilent Dako&nbsp;</td><td>klon D33 (M0760)</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobensizdyna (DAB) Rozwiązanie</td><td>wektorowe Laboratoria</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 dowodów)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>Forksolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Fisherbrand</td><td>245-677</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Brightline-Hauser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>327-500</td><td></td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Wako Chemicals</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Zestaw polimerów HRP (peroksydaza), mysz na myszy</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-2400</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Zestaw polimerów HRP (peroksydaza), Horse Anti-Rabbit</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Inkubator CO2 Heracell 240i</td> Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25 Isopropanol Fisher Scientific A415 Ki-67 Sygnalizacja komórkowa&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>12202</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły Azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MART1</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>M2-9E3, ab187369</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>Człowiek: MAD5236 (10C2), Człowiek: MAB353 (Szczur-401)</td><td></td></tr> <tr><td>Neuregulina 1 beta</td><td>W domu</td><td>Wykonane przez SLC (dostępne również jako 396-HB-050 / CF od R& D Systems)</td><td></td></tr><tr><td>Neurofibromin</td><td>Santa Cruz Biotechnologia&nbsp;</td><td>sc-67</td><td></td></tr><tr><td>SKINIENIE GŁOWY. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Walmart</td><td>Marka</td><td></td>o doskonałej wartości</tr><tr><td>P0-GGF&beta; 3 myszy</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Leica</td><td>Paraplast 39601006</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Permount (ksylenowe podłoże montażowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler Toldedo</td><td>Seven Excellence, 8603</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Dulbecco's)</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PMEL</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>EP4863(2), ab137078</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Przenośna maszyna do izoflurencji</td><td>VetEquip Systemy</td><td></td><td></td>anestezjologii inhalacyjnej</tr><tr><td>PVA-DABCO (wodne podłoże montażowe)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>10981100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do gotowania ryżu</td><td>Buk Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S100B</td><td>Agilent Dako&nbsp;</td><td>Z0311&nbsp; (obecnie GA504)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMA Ventana Systemy Medyczne&nbsp;</td><td>klon 1A4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu (dwuwodny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Sox10</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab212843</td><td></td></tr><tr><td>Stalowa forma</td><td></td><td></td><td></td>histologiczna</tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>TCF4/TCFL2&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa&nbsp;</td><td>(CH48H11) #2569</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta</td><td></td><td></td><td></td>na tkanki</tr><tr><td>Toluidyna Blue</td><td>ACROS Organics</td><td>348600050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-051-31</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models

Pacjenci z autosomalnym dominującym zespołem podatności na nowotwory typu 1 (NF1) często rozwijają nerwiakowłókniaki splotowate (PN), które następnie przekształcają się w wysoce agresywne złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST). Zrozumienie procesu, w którym PN przekształca się w MPNST, byłoby ułatwione dzięki dostępności genetycznie modyfikowanych modeli myszy (GEM), które dokładnie replikują progresję PN-MPNST obserwowaną u ludzi z NF1. Niestety, modele GEM z ablacją Nf1 nie oddają w pełni tego procesu. To skłoniło nas do opracowania myszy P 0-GGFβ3, modelu GEM, w którym nadekspresja mitogenu neureguliny-1 z komórek Schwanna (NRG1) w komórkach Schwanna powoduje rozwój PN, które z dużą częstotliwością przekształcają się w MPNST. Jednak, aby ustalić, czy nowotworzenie i progresja nowotworowa u myszy P 0-GGFβ3 dokładnie modelują procesy obserwowane u pacjentów z NF1, musieliśmy najpierw udowodnić, że patologia guzów osłonki nerwów obwodowych P0-GGFβ3 podsumowuje patologię ich ludzkich odpowiedników.
Tutaj opisujemy specjalistyczne metodologie używane do dokładnego diagnozowania i oceniania nowotworów obwodowego układu nerwowego w modelach GEM, używając P 0-GGFβ3 i P0-GGFβ3; Na przykład myszy Trp53 +/-. Opisujemy metody histologiczne, immunohistochemiczne i histochemiczne stosowane do diagnozowania PN i MPNST, jak odróżnić te nowotwory od innych typów nowotworów, które naśladują ich patologię, oraz jak ocenić te nowotwory. Omawiamy tworzenie kultur wczesnopasażowych z MPNST GEM, jak scharakteryzować te kultury za pomocą immunocytochemii oraz jak zweryfikować ich rakotwórczość poprzez ustanowienie alloprzeszczepów. Łącznie techniki te charakteryzują patologię PN i MPNST, które pojawiają się w modelach GEM i krytycznie porównują patologię tych mysich guzów z ich ludzkimi odpowiednikami.

Opracowaliśmy metodologię oceny, czy nowotwory układu nerwowego u genetycznie modyfikowanych myszy dokładnie odwzorowują patologię ich ludzkich odpowiedników. Tutaj stosujemy te techniki histologiczne, zdefiniowane kryteria patologiczne i metodologie hodowli do nerwiakowłókniaków i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych powstających w mysim modelu P 0-GGFβ3.

Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Patients with the autosomal dominant tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) commonly develop plexiform neurofibromas (PNs) that ...

Nasza grupa koncentruje się na nerwiakowłókniakowatości typu pierwszego i zrozumieniu patologii nowotworów związanych z tą chorobą, nerwiakowłókniaków splotowatych i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych. W tym celu stosujemy kilka technik, w tym genetycznie zmodyfikowany model myszy, P0-GGF-beta-3. Nasze laboratorium i inne badania nad nerwiakowłókniakami splotowatymi i złośliwymi nowotworami nerwów obwodowych stoją przed podobnymi wyzwaniami.Ograniczony dostęp do próbek nowotworów pochodzących od pacjentów utrudnia naszą pracę. W związku z tym tworzenie i charakteryzowanie genetycznie modyfikowanych modeli myszy ma kluczowe znaczenie dla trwających badań nad mechanizmami choroby i potencjalnego rozwoju metod leczenia. Identyfikacja guzów nerwów obwodowych może być trudna i często jest błędnie diagnozowana jako inne nowotwory.Aby tego uniknąć, opracowaliśmy szczegółowy protokół wykorzystujący histologię, immunohistochemię i klasyfikację w celu dokładnej identyfikacji i oceny tych guzów. Zwiększa to wiarygodność przyszłych badań naukowych. Nasza praca zapewnia ramy do badania i walidacji genetycznie modyfikowanych guzów pochodzących z modelu myszy, aby upewnić się, że prawidłowo naśladują ludzką chorobę.Wykorzystamy obecne genetycznie zmodyfikowane modele mysie, aby zrozumieć mikrośrodowisko guza i czynniki niezbędne do transformacji guza, co powoduje postęp nerwiakowłókniaków sploty do złośliwych guzów obwodowych. Zacznij od zidentyfikowania dużych widocznych guzów u myszy P0-GGF-beta-3. Po eutanazji myszy należy wyciąć guz w sterylnych warunkach.Sprawdź, czy guz jest związany z nerwem obwodowym i wytnij guz. Następnie podziel widocznie zauważalne guzy na trzy części. Przeznacz jedną sztukę na histologię i jedną na kultury wczesnopasażowe.Utrwalić próbkę tkanki do badania histologicznego w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS. Zamroź trzeci element do potencjalnych przyszłych eksperymentów. Umieść próbkę tkanki i pozostałe części ciała zwierzęcia w mieszaninie PBS paraformaldehydu na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Mysz P0-GGF-beta-3 z dużym, rażąco widocznym guzem na prawym boku i pokazano skan MRI tej myszy pokazujący guz połączony z nerwem kulszowym. Guz został zidentyfikowany jako nerwiakowłókniak po badaniu histologicznym. Zidentyfikowano mięsisty MPNST pochodzący ze splotu ramiennego zwierzęcia.Na początek weź zatopione w parafinie skrawki guza myszy P0-GGF-beta-3 i odparafinowaj je w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki w świeżej objętości rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez kolejne 10 minut. Po zabarwieniu skrawków eozyną, użyj podłoża montażowego na bazie ksylenu do zamontowania szkiełek nakrywkowych, utrzymując szkiełko wilgotne za pomocą rozpuszczalnika na bazie d-limonenu.Aby zbadać rdzeń kręgowy i korzenie nerwowe pod kątem guzów korzeni nerwowych, inkubuj kolumnę kręgów, związane z nią żebra i tkanki miękkie w 0,3-molowym EDTA i 4% roztworze paraformaldehydu. Następnie przepłukać próbki za pomocą PBS. Spróbuj przebić kolumnę kręgów igłą, aby potwierdzić odwapnienie.Igła powinna wbić się bez oporu w całkowicie odwapnioną kość. Pokrój odwapniony kręgosłup i związane z nim struktury na bloki, aby zmieściły się w kasecie na tkanki i wykonaj pożądane barwienie. Właściwe znakowanie markerów MPNST zaobserwowano w niezależnie powstających MPNST.W prawidłowo odwapnionych kręgosłupach wyraźnie widoczne były rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe, trzon kręgów i mięśnie szkieletowe. Nerwiakowłókniaka korzenia nerwu grzbietowego zaobserwowano również u myszy P0-GGF-beta-3. Zbadaj szkiełka guza barwione hematoksyną i eozyną myszy P0-GGF-beta-3 pod mikroskopią jasnego pola, aby zidentyfikować potencjalne guzy osłonki nerwów obwodowych.Upewnij się, że mikroskopijne nerwiakowłókniaki i MPNST są związane z nerwem obwodowym. Zidentyfikuj bloki zawierające potencjalne guzy osłonki nerwów obwodowych do specjalnych barwników w celu potwierdzenia lub obalenia diagnozy. Odróżnienie potencjalnych PNST od MPNST na podstawie cech histologicznych.Ludzkie i mysie PN P0-GGF-beta-3 mają wydłużone, faliste jądra z luźno upakowanymi komórkami oddzielonymi mixoidalnym materiałem zewnątrzkomórkowym. Obecność mitozy i guza hiperkomórkowego wskazuje na MPNST lub nowotwór o wysokim stopniu złośliwości. Następnie zbadaj wybarwione immunologicznie skrawki za pomocą mikroskopii jasnego pola.Szukaj jednolitej lub niejednolitej immunoreaktywności dla markerów S100 beta, Nestin i SOX10, wskazujących na różnicowanie Schwanni'a w MPNST. Zbadaj skrawki pod kątem wyraźnej hiperkomórkowości, energicznej aktywności mitotycznej i atypii cytologicznej dla MPNST czwartego stopnia. Nerwiakowłókniaki składają się z nowotworowych komórek Schwanna i innych elementów nienowotworowych, na co wskazuje barwienie S100 beta subpopulacji komórek.Nowotworowe komórki Schwanna są również immunoreaktywne dla pośredniego filamentu Nestin i czynnika transkrypcyjnego SOX10. Barwienie Luna wykonane na nerwiakowłókniaku splotowatym P0-GGF-beta-3 podkreśliło obecność komórek tucznych zwykle nieobecnych w MPNST. W przeciwieństwie do tego, immunoreaktywność Ki67 praktycznie nie istnieje w nerwiakowłókniakach splotowatych Znakowanie jądrowe Ki67 jest zwykle obecne w bardzo dużej frakcji komórek nowotworowych, jak widać w mikroskopijnym MPNST powstającym w zwoju nerwu trójdzielnym myszy P0-GGF-beta-3.Na początek umieść sterylne szkiełka nakrywkowe w studzienkach sześciodołkowych naczyń do hodowli tkankowych i wlej odpowiednią objętość roztworu poli-l-lizyny i lamininy do studzienek, aby przykryć szkiełko nakrywkowe. Następnie zamknij płytkę folią, aby ograniczyć parowanie i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylnym PBS.Dodać dwa mililitry zawiesiny komórkowej i pożywki wzrostowej do płytki 10 000 komórek do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Po umyciu szkiełek nakrywkowych PBS, utrwal komórki 4% roztworem paraformaldehydu i PBS przez 18 minut. Spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy PBS przez pięć minut przed barwieniem immunologicznym.Inkubować wybarwione immunologicznie i umyte szkiełka nakrywkowe w jednym do pięciu mikrogramów barwnika Hoechst przez 10 minut. Następnie myj szkiełka nakrywkowe PBS przez dodatkowe pięć minut. Zamontuj szkiełka przy użyciu równych proporcji mieszaniny PBS i glicerolu i uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Traktuj komórki nieenzymatycznym roztworem dysocjacji komórek przez 30 sekund do jednej minuty. Następnie dodaj pięć mililitrów DMEM na każdy mililitr nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru.Odwirować komórki w temperaturze pięciu G przez pięć minut. Zawiesić komórki w stężeniu od jednego do dwóch razy 10 szóstych komórek na 100 mikrolitrów DMEM. Ułożyć zwierzę na brzuchu i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem.Wstrzyknąć jeden do dwóch razy 10 do szóstych komórek podskórnie w prawą flankę. Umieść mysz samą w klatce bez ściółki i pozwól jej dojść do siebie. Aby zapobiec hipotermii, umieść część klatki na poduszce grzewczej.Pokazano obrazy małej i dużej mocy komórek MPNST P0-GGF-beta-3 we wczesnym pasażu. Okazało się, że komórki są rakotwórcze, tworząc kolonie w miękkim agarze i przeszczepy u myszy z niedoborem odporności.

identifying-diagnosing-grading-malignant-peripheral-nerve-sheath

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Ten artykuł opisuje wykorzystanie ultradźwięków o wysokiej rozdzielczości u genetycznie modyfikowanych myszy z rakiem trzustki. Podstawowym celem jest dostarczenie szczegółowej instrukcji wykrywania i oceny endogennych nowotworów trzustki.

Wykorzystanie ultradźwięków o wysokiej rozdzielczości do monitorowania początku i wzrostu guza w genetycznie modyfikowanych modelach raka trzustki

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Celem tego artykułu metodycznego jest zademonstrowanie solidnej i powtarzalnej metodologii wzbogacania, generowania i rozszerzania pierwotnych linii komórek nowotworowych z chirurgicznie wyciętego międzybłoniaka opłucnej.

Generowanie i rozszerzanie pierwotnych, złośliwych linii guza międzybłoniaka opłucnej

Dowiedz się, jak identyfikować i diagnozować złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy. Metoda obejmuje techniki histologiczne i immunohistochemiczne.

Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Przeglądaj więcej filmów