Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi
13 września 2017
Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.
Ogólnym celem tego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro u ludzi, pochodzącego z monocytów krwi obwodowej lub PBMC, hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi, jest naśladowanie interakcji osteoklastów komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów do kości dotyczące wpływu interakcji komórek nowotworowych i komórek kostnych w mikrośrodowisku kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to w pełni ludzki model przedkliniczny.
Ponadto ta metoda może zapewnić wgląd w przerzuty do kości. Może być również stosowany do badania innych mechanizmów patologicznych związanych z kośćmi, takich jak osteoporoza. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności ze względu na zmienność wśród zdrowych dawców oraz wybór odpowiedniej gęstości komórek PBMC.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ muszą zapoznać się z naszą selekcją PBMC, a etapy wysiewu wymagają pewnego doświadczenia manualnego, zanim będzie można osiągnąć biegłość. Zacznij od rozcieńczenia co najmniej 20 mililitrów krwi pełnej zdrowego dawcy w EDTA w stosunku jeden do jednego w PBS. Po dokładnym wymieszaniu podziel roztwór krwi na 30 mililitrowe porcje w 50-mililitrowych stożkowych probówkach.
Ostrożnie umieść 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dnie każdej probówki. Oddzielić komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości. I wciągnij białą jednojądrową komórkę zawierającą kożuchy do nowej 15-mililitrowej tuby.
Umyj pobrane komórki dwa razy w 20 mililitrach PBS na pranie, a następnie wykonaj lizę czerwonych krwinek za pomocą pięciu mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek przez trzy do pięciu minut na lodzie. Zatrzymaj reakcję za pomocą 20 mililitrów PBS i zbierz białe krwinki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad i uzupełnić alfa M-E-M do liczenia.
Następnie umieść komórki w siedmiu punktach pięć razy 10 do pięciu PBMC na centymetr kwadratowy stężenia w każdym dołku 24-dołkowej płytki do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Po około trzech godzinach usuń supernatant, zanieczyszczenia, nieprzyłączone komórki i niezlizowane erytrocyty z kultur. I dodaj świeże podłoże, uzupełnione MCSF.
Czternaście dni po wysianiu umyj komórki dwa razy PBS i utrwal je w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Barwienie pułapki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki podobne do osteoklastów będą TRAP dodatnie z co najmniej czterema jądrami.
Policz komórki podobne do osteoklastów ręcznie pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. W przypadku różnicowania osteoklastów wywołanego komórkami rakowymi, gdy komórki rakowe osiągają dziewięćdziesiąt procent zbieżności, są one odłączane przez trypsynizację i wysiewane na wstawki porów w punkcie zerowym o długości czterech mikrometrów w stężeniu cztery razy 10 do trzech komórek na centymetr kwadratowy w świeżym alfa MEM. Następnego dnia umieść wkładki z nasionami na niezróżnicowanych, jednodniowych, platerowanych kulturach komórek jednojądrzastych w pełnym alfa M-E-M i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni.
Następnie, 11 dni po rozpoczęciu kohodowli, przenieś inserty na nową płytkę zawierającą odpowiedni odczynnik do pożądanej dalszej analizy. Komórki raka piersi mogą podtrzymywać osteoklastogenezę, ponieważ liczba osteoklastów w studzienkach indukowanych przez komórki rakowe jest podobna do tej uzyskiwanej w studzienkach kontrolnych z dodatnim czynnikiem wzrostu. Liczba osteoklastów obserwowanych we wszystkich kulturach jest jednak zmniejszona, gdy komórki są traktowane lekiem przeciwnowotworowym.
Co ciekawe, powierzchnie dojrzałych osteoklastów pochodzących z czynników wzrostu są większe niż te indukowane przez komórki nowotworowe. Efektu tego nie obserwuje się w kulturach leczonych lekami przeciwnowotworowymi. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę dalszą, taką jak analiza ekspresji genów, Western Blot, analiza immunofluorescencyjna lub ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji rak-komórka/komórka kostna-komórka lub mechanizmy leków przeciwnowotworowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami do kości do badania mikrośrodowiska kostnego w całkowicie ludzkim modelu przedklinicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować monocyty, ulegać różnicowaniu z komórkami rakowymi.
Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi i lekami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje opracowanie in vitro przedklinicznego modelu ludzkiej osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi, aby naśladować interakcję między komórkami nowotworowymi a osteoklastami. Model ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące przerzutów do kości i usprawnić opcje terapeutyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Osteoklastogeneza
- Przerzuty do kości
- Interakcje komórek nowotworowych
Wstęp
- Model wykorzystuje monocyty z krwi obwodowej (PBMCs).
- Ma on na celu odtworzenie oddziaływań między komórkami nowotworowymi a osteoklastami.
- Badania te mają istotne znaczenie dla zrozumienia patologii związanych z kośćmi.
- Zmienność między zdrowymi dawcami może wpływać na wyniki.
Cel badania
- Aby naśladować interakcje między komórkami nowotworowymi a osteoklastami.
- Aby zbadać efekty tych interakcji w mikrośrodowisku kostnym.
- Aby dostarczyć informacji na temat przerzutów do kości i powiązanych z nimi stanów chorobowych.
Zastosowane metody
- Kultura PBMC z liniami komórkowymi raka piersi.
- Ocena osteoklastogenezy.
- Ocena oddziaływań między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi.
- Analiza zmienności gęstości komórek PBMC.
Główne wyniki
- Model pomyślnie naśladuje interakcje między komórkami nowotworowymi a osteoklastami.
- Uzyskane spostrzeżenia mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych w leczeniu przerzutów do kości.
- Potencjalne zastosowania obejmują również inne choroby związane z układem kostnym.
- Wyzwania obejmują zmienność między dawcami oraz dobór gęstości komórek.
Wnioski
- Ten ludzki model przedkliniczny jest cenny w badaniu przerzutów do kości.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie oddziaływań komórek nowotworowych w mikrośrodowisku kostnym.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model w szerszych zastosowaniach w patologii kości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Ten w pełni ludzki model przedkliniczny umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków osteoklastogennych w przerzutach do kości poprzez odtworzenie interakcji między komórkami nowotworowymi a osteoklastami w systemie istotnym fizjologicznie. Wspiera on walidację celów terapeutycznych oraz opracowywanie testów dla leków przeciwnowotworowych, zapewniając ilościowe odczyty różnicowania i funkcji osteoklastów. Model ten zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących, umożliwiając bezpośrednią obserwację wzajemnych oddziaływań oraz późniejszą analizę obu typów komórek w warunkach podania leku.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących indukowanej przez nowotwór osteoklastogenezy oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych w mikrośrodowisku kostnym.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego i funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie różnicowania osteoklastów z pierwotnych ludzkich monocytów w określonych warunkach kokultury.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez ilościowe określenie powstawania osteoklastów w odpowiedzi na bodźce z komórek nowotworowych w porównaniu z kontrolami z czynnikami wzrostu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez zestandaryzowane różnicowanie osteoklastów z PBMC z wykorzystaniem RANKL i MCSF.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testu poprzez wysiew komórek o stałej gęstości (7,5×10⁵ PBMC/cm²) oraz określony czas różnicowania (14 dni) z ilościowym oznaczaniem osteoklastów na podstawie aktywności TRAP.
- Wartość naukowa: Umożliwienie rzetelnej oceny związków poprzez badanie wpływu leków na osteoklastogenezę w formatach kokultury pośredniej (pożywka kondycjonowana) oraz bezpośredniej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotności chorobowej w przypadku osteoporozy i innych schorzeń kości poprzez adaptację testu osteoklastogenezy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną dzięki zastosowaniu w pełni ludzkich komórek, co zmniejsza ryzyko błędów w translacji międzygatunkowej podczas ekstrapolacji z badań przedklinicznych do klinicznych.
- Wartość naukowa: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez pomiar zmian w liczbie i powierzchni osteoklastów jako biomarkerów farmakodynamicznych skuteczności leku.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w przypadku terapii celowanych w kości oraz modulatorów mikrośrodowiska kostnego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników pochodzących z komórek nowotworowych w aktywacji osteoklastów oraz wyjaśnianie szlaków mechanizmów indukcji osteoklastów niezależnych od RANKL.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzenia analizy poprzez standaryzowaną izolację monocytów, ich różnicowanie oraz kokulturę z liniami komórkowymi raka piersi na wkładkach przepuszczalnych w celu badania sygnalizacji parakrynnej i jukstakrynną.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę osteoklastów za pomocą barwienia TRAP, liczenia komórek wielojądrowych oraz analizy morfometrycznej (powierzchnia) w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając badanie wpływu leków na przerzutowe mikrośrodowisko kostne z wykorzystaniem istotnych klinicznie linii komórkowych raka piersi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do badania modulacji osteoklastów w wielu typach nowotworów i patologiach kostnych poza rakiem piersi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach między osteoklastami a komórkami nowotworowymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom izolacji PBMC, gęstości wysiewu oraz suplementacji cytokinami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnej oceny wpływu leku na formowanie i funkcje osteoklastów, co redukuje ryzyko biologiczne w późnych etapach programów dotyczących przerzutów do kości.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację potencjału osteoklastogennego związków oraz kierowanie dalszymi etapami prac w oparciu o modulację mikrośrodowiska kostnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach izolacji, hodowli i różnicowania pierwotnych ludzkich komórek, w tym w separacji PBMC i adhezji monocytów.
- Zależność od instrumentacji do liczenia komórek, wirowania, mikroskopii (powiększenie 10X do liczenia osteoklastów) oraz inkubacji (37°C, 5% CO₂).
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie pozyskiwania dawców PBMC, optymalizacji gęstości komórek (7.5×10⁵ PBMC/cm²) oraz czasu kokultury (11 dni po wysianiu komórek nowotworowych) w celu zminimalizowania zmienności.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy rozszerzaniu metody na linie komórkowe innych nowotworów niż rak piersi lub alternatywne stymulatory osteoklastogenezy poza RANKL/MCSF.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak zmienność potencjału różnicowania osteoklastów u różnych dawców oraz konieczność biegłości manualnej w wysiewaniu PBMC i przygotowywaniu kokultury.
