Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Ogólnym celem tego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro u ludzi, pochodzącego z monocytów krwi obwodowej lub PBMC, hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi, jest naśladowanie interakcji osteoklastów komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów do kości dotyczące wpływu interakcji komórek nowotworowych i komórek kostnych w mikrośrodowisku kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to w pełni ludzki model przedkliniczny.

Ponadto ta metoda może zapewnić wgląd w przerzuty do kości. Może być również stosowany do badania innych mechanizmów patologicznych związanych z kośćmi, takich jak osteoporoza. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności ze względu na zmienność wśród zdrowych dawców oraz wybór odpowiedniej gęstości komórek PBMC.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ muszą zapoznać się z naszą selekcją PBMC, a etapy wysiewu wymagają pewnego doświadczenia manualnego, zanim będzie można osiągnąć biegłość. Zacznij od rozcieńczenia co najmniej 20 mililitrów krwi pełnej zdrowego dawcy w EDTA w stosunku jeden do jednego w PBS. Po dokładnym wymieszaniu podziel roztwór krwi na 30 mililitrowe porcje w 50-mililitrowych stożkowych probówkach.

Ostrożnie umieść 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dnie każdej probówki. Oddzielić komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości. I wciągnij białą jednojądrową komórkę zawierającą kożuchy do nowej 15-mililitrowej tuby.

Umyj pobrane komórki dwa razy w 20 mililitrach PBS na pranie, a następnie wykonaj lizę czerwonych krwinek za pomocą pięciu mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek przez trzy do pięciu minut na lodzie. Zatrzymaj reakcję za pomocą 20 mililitrów PBS i zbierz białe krwinki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad i uzupełnić alfa M-E-M do liczenia.

Następnie umieść komórki w siedmiu punktach pięć razy 10 do pięciu PBMC na centymetr kwadratowy stężenia w każdym dołku 24-dołkowej płytki do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Po około trzech godzinach usuń supernatant, zanieczyszczenia, nieprzyłączone komórki i niezlizowane erytrocyty z kultur. I dodaj świeże podłoże, uzupełnione MCSF.

Czternaście dni po wysianiu umyj komórki dwa razy PBS i utrwal je w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Barwienie pułapki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki podobne do osteoklastów będą TRAP dodatnie z co najmniej czterema jądrami.

Policz komórki podobne do osteoklastów ręcznie pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. W przypadku różnicowania osteoklastów wywołanego komórkami rakowymi, gdy komórki rakowe osiągają dziewięćdziesiąt procent zbieżności, są one odłączane przez trypsynizację i wysiewane na wstawki porów w punkcie zerowym o długości czterech mikrometrów w stężeniu cztery razy 10 do trzech komórek na centymetr kwadratowy w świeżym alfa MEM. Następnego dnia umieść wkładki z nasionami na niezróżnicowanych, jednodniowych, platerowanych kulturach komórek jednojądrzastych w pełnym alfa M-E-M i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni.

Następnie, 11 dni po rozpoczęciu kohodowli, przenieś inserty na nową płytkę zawierającą odpowiedni odczynnik do pożądanej dalszej analizy. Komórki raka piersi mogą podtrzymywać osteoklastogenezę, ponieważ liczba osteoklastów w studzienkach indukowanych przez komórki rakowe jest podobna do tej uzyskiwanej w studzienkach kontrolnych z dodatnim czynnikiem wzrostu. Liczba osteoklastów obserwowanych we wszystkich kulturach jest jednak zmniejszona, gdy komórki są traktowane lekiem przeciwnowotworowym.

Co ciekawe, powierzchnie dojrzałych osteoklastów pochodzących z czynników wzrostu są większe niż te indukowane przez komórki nowotworowe. Efektu tego nie obserwuje się w kulturach leczonych lekami przeciwnowotworowymi. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę dalszą, taką jak analiza ekspresji genów, Western Blot, analiza immunofluorescencyjna lub ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji rak-komórka/komórka kostna-komórka lub mechanizmy leków przeciwnowotworowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami do kości do badania mikrośrodowiska kostnego w całkowicie ludzkim modelu przedklinicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować monocyty, ulegać różnicowaniu z komórkami rakowymi.

Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi i lekami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.