Name: Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj metodę hodowli monocytów krwi obwodowej z liniami komórkowymi raka piersi w celu badania osteoklastogenezy i interakcji komórek nowotworowych w mikrośrodowisku kostnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Yibin Kang za dostarczenie linii komórkowej SCP2 oraz Cristiano Vernie za pomoc redakcyjną.

Ludzkie osteoklasty zostały odróżnione od PBMC zdrowych dawców, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Protokół badania został zatwierdzony przez lokalną Komisję Etyczną, zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku.
1. Różnicowanie osteoklastów
UWAGA: Zbieraj krew obwodową lub kożuchy od zdrowych ludzkich dawców w EDTA. Nie należy stosować mniej niż 20 ml krwi obwodowej. Płaszcze kożuchowe są preferowane, ponieważ mają większą obfitość komórek jednojądrzastych. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć krew pełną EDTA w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Ponownie zawieś dobrze.</li>
	<li>Nałożyć warstwę na pożywkę do separacji limfocytów (PBS krwi: pożywka do separacji limfocytów, 2:1) w probówkach o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Odpipetować 30 ml krwi rozcieńczonej w PBS do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Delikatnie umieść 15 ml pożywki do separacji limfocytów na dnie probówki o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 757 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (bez hamulców).</li>
	<li>Pobieranie komórek jednojądrzastych:
	<ol>
		<li>Zebrać białą warstwę komórek jednojądrzastych za pomocą pipety o pojemności 5 ml bez mieszania i umieścić ją w nowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć zebrane PBMC w 20 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie PBMC:
	<ol>
		<li>Wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki. Powtórz raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza RBC: 
	UWAGA: Jeśli osad komórkowy jest czerwony, potraktuj komórki roztworem buforowym do lizy czerwonych krwinek (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek.</li>
		<li>Odczekaj 3 - 5 minut, aby zakończyć lizę erytrocytów. Czas różni się w zależności od stopnia zanieczyszczenia erytrocytów.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 20 ml PBS.</li>
		<li>Wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki. 
		UWAGA: Opcjonalnie: Jeśli przeprowadzana jest liza RBC, umyj PBMC zgodnie z poniższym opisem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie PBMC:
	<ol>
		<li>Dodać 20 ml PBS i wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pełnym α-MEM (uzupełnionym 1% glutaminą (początkowe stężenie 100X) i 10% płodową surowicą bydlęcą).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:100 w lodowatym kwasie octowym i użyć 10 μl rozcieńczenia do zliczenia komórek.</li>
		<li>Policz co najmniej dwa razy i oblicz średnią powtórzeń, aby uzyskać całkowitą średnią liczbę zebranych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki płytkowe:
	<ol>
		<li>Komórki płytkowe w stężeniu 750 000 PBMC na cm2.</li>
		<li>Przechowywać posiane komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. 
		UWAGA: Zaprojektuj eksperyment tak, aby obejmował kontrole negatywne, czyli komórki, które są traktowane normalnym kompletnym α-MEM bez MCSF lub RANKL GFs. Pamiętaj, aby wykonać każdy warunek w co najmniej 3 powtórzeniach technicznych. Wykonać co najmniej 3 kontrpróby biologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmień pożywkę uzupełnioną GFs:
	<ol>
		<li>Odczekaj około 3 godziny po wysianiu komórek, a następnie usuń pożywkę pipetą (200 - 1,000 μL), aby usunąć resztki, nieprzyłączone komórki i erytrocyty. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas zmiany podłoża, aby uniknąć oderwania komórek.</li>
		<li>Dodać nowy kompletny α-MEM uzupełniony 20 ng / ml MCSF (500 μl / basenik). 
		UWAGA: Podczas kohodowli z komórkami rakowymi, wysiewaj komórki rakowe dzień po wysiewie PBMC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni (α-MEM uzupełniony o 20 ng/ml MCSF):
	<ol>
		<li>Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
		<li>Dodać nową świeżą pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>6-7 dni po wysianiu komórek dodaj 20 ng / ml RANKL, aby uzupełnić α-MEM + MCSF.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę (pełne α-MEM+MCSF+RANKL) co 2-3 dni:
	<ol>
		<li>Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
		<li>Dodać nową pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl. Zatrzymaj indukcję różnicowania 14 dni po wysianiu komórek.</li>
		<li>Wyrzuć podłoże i przemyj dwukrotnie PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napraw komórki za pomocą paraformaldehydu:
	<ol>
		<li>Pozostaw komórki do wyschnięcia.</li>
		<li>Dodać 4% paraformaldehydu (patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzuć paraformaldehyd i przemyj dwukrotnie 500 μl PBS. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Prosimy o noszenie rękawiczek, maski i okularów.</li>
	<li>Pozostaw komórki do wyschnięcia.</li>
	<li>Barwienie TRAP należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Policz komórki podobne do osteoklastów ręcznie pod mikroskopem przy powiększeniu 10X; NA 0.30. 
	UWAGA: Komórki podobne do osteoklastów definiuje się jako komórki polikarionowe TRAP+ z co najmniej 4 jądrami.</li>
</ol>
2. Hodowle komórek nowotworowych
UWAGA: Eksperymenty mogą być przeprowadzane na różnych typach linii komórkowych gruczolakoraka piersi, takich jak SCP217, osteotropowa linia komórkowa wywodząca się z potrójnie ujemnej linii komórkowej ludzkiego raka piersi (MDA-MB-231), oraz linia komórkowa MCF7 z dodatnim receptorem hormonalnym.
<ol>
	<li>Hodować komórki jako monowarstwę w kolbach o długości75 cm 2.
	<ol>
		<li>Wysiej 1 000 000 komórek rakowych w kolbieo średnicy 75 cm2.</li>
		<li>Przechowywać komórki w temperaturze 37 °C w kompletnym pożywce α-MEM uzupełnionej 1% glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą w atmosferze 5%CO2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Odłącz komórki przy zbieganiu około 90%:
	<ol>
		<li>Wyrzuć pożywkę, przemyj PBS i dodaj 2 - 3 ml trypsyny 1X do PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zebrać oderwane komórki z kolby o długości 75cm2 za pomocą pipety o pojemności 10 ml, dodając 8 ml kompletnej pożywki w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.</li>
		<li>Wirować przy 225 x g przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki rakowe:
	<ol>
		<li>Dodać 10 ml PBS.</li>
		<li>Wirować przy 600 x g przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki rakowe za pomocą komory Neubauera.
	<ol>
		<li>Policz komórki rakowe co najmniej dwa razy i oblicz średnią powtórzeń, aby uzyskać całkowitą średnią liczbę zebranych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bezpośrednie kokultury komórek nowotworowych i monocytów ulegających różnicowaniu w kierunku osteoklastów
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki rakowe na wkładkach (średnica porów 0,4 μm):
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki rakowe w stężeniu 4,000 komórek na cm2.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		UWAGA: Wysiej komórki rakowe dzień po wysiewie PBMC do eksperymentu z kokulturą w wstawkach 0,4 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczekaj 24 godziny, aby komórki się przylgnęły.</li>
	<li>Umieścić wysiewaną kulturę insertową na kulturach jednojądrzastych, aby rozpocząć kokulturę (patrz sekcja 1.10 protokołu).</li>
	<li>Zmieniaj nośnik co 2-3 dni za pomocą pełnej pamięci α-MEM.
	<ol>
		<li>Wyrzucić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
		<li>Dodać 500 μl świeżej pożywki. 
		UWAGA: Głównym celem kohodowli jest zrozumienie osteoklastogennej mocy komórek nowotworowych, dlatego GF nie są dodawane do α-MEM. W każdym eksperymencie z kokulturą należy uwzględnić kontrole ujemne (patrz uwaga w kroku 1.10 protokołu) oraz kontrole pozytywne osteoklastów różnicowanych przez RANKL i MCSF (brak komórek rakowych). Komórki rakowe wysiane we wstawkach, które nie są umieszczone nad komórkami jednojądrzastymi, są używane jako negatywna kontrola kokultury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymaj kokulturę i użyj komórek rakowych do dalszej analizy:
	<ol>
		<li>13 dni po wysiewie PBMC i 12 dni po wysianiu komórek rakowych umieść wkładkę na nowej płytce.</li>
		<li>Zatrzymanie hodowli komórek nowotworowych, na podstawie której mają być wykonywane dalsze analizy (patrz Dyskusja).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 14 zatrzymaj różnicowanie osteoklastów i utrwal komórki, jak opisano w kroku 1.15.</li>
	<li>Barwienie metodą TRAP należy wykonać natychmiast lub w ciągu 14 - 30 dni. 
	UWAGA: Barwienie opcjonalne: Aby potwierdzić, że komórki polikarionowe TRAP+ są osteoklastami, naukowcy mogą wykonać dodatkowe barwienie w celu wykrycia CTR, markera specyficznego dla osteoklastów. Wykrywanie pierścieni F-aktyny to kolejny test barwienia specyficzny dla osteoklastów12,13,14.</li>
</ol>

<ol><li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+and+cancer%3A+the+osteoncology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cases+Miner+Bone+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone and cancer: the osteoncology.</a> Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).</li>
<li>Coleman, R. E., Rubens, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+course+of+bone+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clinical course of bone metastases from breast cancer.</a> Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).</li>
<li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+emergency+in+oncology%3A+bone+metastases+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients.</a> Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of bone metastasis.</a> N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).</li>
<li>Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+cell+metastasis+to+the+bone%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process.</a> Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis+to+the+bone%3A+mechanisms+of+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss.</a> Breast Cancer Res. 12 (6), 215(2010).</li>
<li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+bone+metastases%3A+it%27s+all+about+the+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood.</a> Cell. 154 (5), 957-959 (2013).</li>
<li>Ell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+osteoclast+miRNA+changes+as+regulators+and+biomarkers+of+osteolytic+bonemetastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis.</a> Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+%CE%B14%CE%B21-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+niche+promotes+early-stage+bone+colonization+of+disseminated+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells.</a> Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).</li>
<li>Liverani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF-1+blockade+impairs+breast+cancer+osteoclastogenic+potential+in+co-culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems.</a> Bone. 66, 214-222 (2014).</li>
<li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+everolimus+in+an+in+vitro+model+of+triple+negative+breast+cancer+and+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts.</a> Int J Mol Sci. 1 (11), e1827(2016).</li>
<li>Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF%2C+TNFalpha+and+RANK+ligand+promote+osteoclast+survival+by+signaling+through+mTOR%2FS6+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+DeathDiffer%22%5BJournal%5D)">M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase.</a> Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).</li>
<li>Sugatani, T., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2FAkt2+and+mammalian+target+of+rapamycin%2FBim+play+critical+roles+in+osteoclast+differentiation+and+survival%2C+respectively%2C+whereas+Akt+is+dispensable+for+cell+survival+in+isolated+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors.</a> J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).</li>
<li>Bertoldo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+metastatic+cancer%3A+role+of+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).</li>
<li>Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everolimus+restrains+the+paracrine+pro-osteoclast+activity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (15), 692(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedkliniczne modele in vitro badające mechanizmy przesłuchów między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi są potrzebne do zidentyfikowania mechanizmów przerzutów do kości, które można wykorzystać do tworzenia nowych strategii terapeutycznych. Opracowaliśmy w pełni ludzki model osteoklastogenezy in vitro z ludzkiej krwi obwodowej (ryc. 3). W trakcie optymalizacji metodyki zidentyfikowano i usunięto szereg punktów krytycznych. Pierwsza z nich dotyczyła ilości komórek...

Kość jest częstym miejscem przerzutów dla różnych typów nowotworów pierwotnych, takich jak rak prostaty, płuc i piersi, przy czym u 20 - 25% pacjentów występują przerzuty do kości w trakcie choroby1,2,3. W szczególności 70% pacjentek z rakiem piersi nosi ślady przerzutów do kości w chwili śmierci4. Interakcja guza i komórek zrębu jest niezbędna do progresji raka zarówno w przypadku raka pierwotnego, jak i wtórnego. W mikrośrodowisku kostnym osteolityczne przerzuty do kości spowodowane rakiem piersi zależą od powstania patologicznego błędnego koła zachodzącego między komórkami rakowymi, komórkami kostnymi i mikrośrodowiskiem kości. Komórki rakowe zaburzają równowagę kostną, zwiększając resorpcję kości5,6,7.
W normalnych i patologicznych warunkach, osteoklasty są komórkami odpowiedzialnymi za resorpcję kości, podczas gdy osteoblasty, deponując nową matrycę, są odpowiedzialne za tworzenie nowej kości8. Aktywność osteoklastów jest regulowana przez osteoblasty poprzez ekspresję RANKL, który wiąże się ze swoim receptorem RANK na powierzchni przedosteoklastowej, indukując fuzję przedosteoklastową, proces niezbędny do różnicowania się w dojrzałe osteoklasty. Indukcja osteoklastogenezy zwiększa resorpcję kości. Duża liczba badań in vivo znacznie poprawiła naszą wiedzę na temat powstawania przerzutów do kości9,10,11. Komórki raka piersi z guza pierwotnego i w mikrośrodowisku kości zaburzają homeostazę kości, sprzyjając osteoklastogenezie i resorpcji kości8. W tym scenariuszu kluczowe znaczenie mają wszystkie interakcje molekularne zachodzące między komórkami nowotworowymi a osteoklastami. Jak już wspomniano, mechanizm powstawania przerzutów do kości został wyjaśniony w modelach in vivo myszy. Jednak oprócz konieczności zatwierdzania przez Komitet Etyki wszystkich doświadczeń in vivo na zwierzętach, istnieje kilka innych wad przeprowadzania doświadczeń in vivo, w tym wysokie koszty i czasochłonne metody. Kilku autorów połączyło przedkliniczne modele osteoklastogenezy in vivo i in vitro przy użyciu mysiej linii preosteoklastów o nazwie RAW246.79,10,11. Wady tego modelu wynikają z faktu, że komórki są już zaangażowane w stanie się preosteoklastami i nie są pochodzenia ludzkiego. Z tych powodów badania translacyjne mogą przynieść ogromne korzyści z dostępności w pełni ludzkich modeli przedklinicznych in vitro do badania interakcji między komórkami raka kości.
Zoptymalizowaliśmy metodę osteoklastogenezy in vitro, zaczynając od próbek ludzkiej krwi obwodowej12,13. Osteoklasty pochodzą z monocytów, które są obecne, choć w niewielkim stopniu, w próbkach krwi obwodowej. Komórki jednojądrzaste są najpierw oddzielane od erytrocytów i granulocytów obecnych we krwi pełnej za pomocą gradientu gęstości Ficollu; Są one następnie selekcjonowane ze względu na ich zdolność do przylegania do podłoża z tworzywa sztucznego, w przeciwieństwie do limfocytów. Po wysianiu komórki są hodowane przez 14 dni. MCSF i RANKL to GF wymagane przez monocyty do różnicowania się najpierw w makrofagi, a następnie w osteoklasty14,15. MCSF jest potrzebny przez cały czas trwania testu, podczas gdy RANKL służy do indukowania procesu różnicowania w późnych stadiach osteoklastogenezy. We wczesnej fazie różnicowania MCSF pomaga monocytom namnażać się i przetrwać14,15. Podczas drugiej części osteoklastogenezy komórki łączą się ze sobą i dojrzewają jako osteoklasty, wykazując charakterystyczny rozkład aktyny F w pierścieniach i wyrażając specyficzne markery, takie jak kwasowa fosfataza odporna na winian (TRAP) i receptor kalcytoniny (CTR)14,15. Nasza metoda polega na dodawaniu MCSF do hodowli monocytów przez pierwsze 7 dni eksperymentu oraz kombinacji MCSF i RANKL od 7 do 14 dni. Pod koniec eksperymentu osteoklastogeneza jest analizowana poprzez liczenie zróżnicowanych komórek, jak opisano poniżej.
Hodowle monocytów indukowane do różnicowania przez GF stanowią podstawę naszego modelu przedklinicznego. Zoptymalizowaliśmy system kohodowli bez GF, aby lepiej zrozumieć osteoklastogenną moc komórek raka piersi. Najpierw opracowaliśmy model pośrednich kokultur, dodając pożywkę (80% α -Minimal Essential Medium (α-MEM) i 20% kondycjonowaną pożywkę pobraną z hodowli komórek raka piersi, które w około 90% zrażały się z komórkami przechodzącymi różnicowanie12. Kondycjonowaną pożywkę (nie pobraną w warunkach deprywacji surowicy) pobrano po 24 godzinach i zmieszano ze świeżą pożywką w proporcji 1:4. Kondycjonowane podłoże indukowało istotne różnicowanie osteoklastów w stosunku do kontroli ujemnej. Ponieważ jednak informacje na temat wzajemnych oddziaływań między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi są tracone podczas stosowania pośrednich kultur, ulepszyliśmy nasz system, przeprowadzając bezpośrednie kokultury. Umieściliśmy komórki rakowe we wstawkach 0,4 μM i umieściliśmy je w studzienkach, w których poszczepiono komórki jednojądrzaste. Korzystając z tej metody, komórki dzielą to samo podłoże i wymieniają wydzielane białka. W ten sposób stworzyliśmy w pełni ludzki przedkliniczny model osteoklastogenezy indukowanej przez komórki nowotworowe13.
Ten system jest niezwykle wszechstronny i może być używany do różnych celów badawczych, np. w badaniach farmakologicznych badających rolę leków w przerzutach do kości. Nasz model umożliwia badanie skuteczności i mechanizmów działania terapii ukierunkowanych na kości i/lub leków przeciwnowotworowych w mikrośrodowisku kości w obecności komórek nowotworowych13. Zaprojektowanie eksperymentów z odpowiednimi kontrolami, tj. komórkami nowotworowymi i osteoklastami hodowanymi indywidualnie, ułatwia zrozumienie wpływu kokultury na aktywność leku. Podejście to staje się jeszcze bardziej interesujące, gdy badany lek celuje zarówno w komórki nowotworowe, jak i osteoklasty, np. everolimus16. Model ten może być również wykorzystany do identyfikacji nowych szlaków interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi.

<table><tbody><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life-technologies</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Technologie życia</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Należy przestrzegać wskazówek dotyczących przechowywania</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>Należy przestrzegać wskazówek dotyczących przechowywania</td></tr><tr><td>Fosfataza kwasowa, Zestaw leukocytów (TRAP) Sigma</td><td>Aldrich</td><td>387 A</td> Pożywka do separacji limfocytów <td></td></tr><tr><td></td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący czerwone krwinki</td><td>SIgma</td><td>11814389001 ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>Chzt. ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4% roztwór wodny, klasa EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-267</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3470-Clear</td><td>Te wkładki są przeznaczone do płytek 24-dołkowych; 6,5 mm, 0,4 &mu; M; wielkość porów</td></tr></tbody></table>

opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nowotworowymi a komórkami kostnymi w mikrośrodowisku kości jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu powstawania przerzutów do kości. Opracowaliśmy w pełni ludzki model przedkliniczny in vitro kohodowli komórek i monocytów raka piersi ulegających różnicowaniu w kierunku osteoklastów. Zoptymalizowaliśmy model osteoklastogenezy, zaczynając od próbki krwi obwodowej pobranej od zdrowych dawców. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) najpierw oddzielono przez wirowanie w gradimencie gęstości, wysiewano w dużej gęstości i indukowano do różnicowania przez dodanie dwóch czynników wzrostu (GF): aktywatora receptora liganda czynnika jądrowego κB (RANKL) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF). Komórki pozostawiono w hodowli na 14 dni, a następnie utrwalono i przeanalizowano za pomocą dalszej analizy. W osteolitycznych przerzutach do kości jednym ze skutków wniknięcia komórek nowotworowych do kości jest indukcja osteoklastogenezy. W związku z tym rzuciliśmy wyzwanie naszemu modelowi z kokulturami komórek raka piersi, aby zbadać zdolność różnicowania komórek rakowych w odniesieniu do GF. Prostym sposobem badania interakcji komórki rakowej z osteoklastami jest przeprowadzenie pośrednich kokultur opartych na użyciu kondycjonowanej pożywki pobranej z kultur komórek raka piersi i zmieszanej ze świeżą pożywką. Mieszanina ta jest następnie używana do indukowania różnicowania osteoklastów. Zoptymalizowaliśmy również metodę bezpośredniej kohodowli, w której komórki nowotworowe i monocyty ulegające różnicowaniu dzielą pożywkę i wymieniają wydzielane czynniki. Jest to znacząca poprawa w porównaniu z pierwotną metodą pośredniej hodowli, ponieważ naukowcy mogą obserwować wzajemne interakcje dwóch typów komórek i przeprowadzać dalsze analizy zarówno komórek nowotworowych, jak i osteoklastów. Metoda ta umożliwia badanie wpływu leków na mikrośrodowisko kości z przerzutami oraz na wysiewanie linii komórkowych innych niż te pochodzące z raka piersi. Model może być również wykorzystywany do badania innych chorób, takich jak osteoporoza czy inne choroby kości.

Zoptymalizowano metodę pozwalającą na łatwe odróżnienie osteoklastów od monocytów krwi obwodowej człowieka. Hodowlę monocytów inkubowano z komórkami nowotworowymi, co potwierdziło (zgodnie z opisami w literaturze18), że komórki nowotworowe są w stanie podtrzymywać osteoklastogenezę w przerzutach do kości. Osteoklasty zróżnicowane z komórek nowotworowych i czynników wzrostu (GFs) przedstawiono na Rysunku 1. Komórką przypominającą osteok...

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Ogólnym celem tego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro u ludzi, pochodzącego z monocytów krwi obwodowej lub PBMC, hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi, jest naśladowanie interakcji osteoklastów komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów do kości dotyczące wpływu interakcji komórek nowotworowych i komórek kostnych w mikrośrodowisku kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to w pełni ludzki model przedkliniczny.Ponadto ta metoda może zapewnić wgląd w przerzuty do kości. Może być również stosowany do badania innych mechanizmów patologicznych związanych z kośćmi, takich jak osteoporoza. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności ze względu na zmienność wśród zdrowych dawców oraz wybór odpowiedniej gęstości komórek PBMC.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ muszą zapoznać się z naszą selekcją PBMC, a etapy wysiewu wymagają pewnego doświadczenia manualnego, zanim będzie można osiągnąć biegłość. Zacznij od rozcieńczenia co najmniej 20 mililitrów krwi pełnej zdrowego dawcy w EDTA w stosunku jeden do jednego w PBS. Po dokładnym wymieszaniu podziel roztwór krwi na 30 mililitrowe porcje w 50-mililitrowych stożkowych probówkach.Ostrożnie umieść 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dnie każdej probówki. Oddzielić komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości. I wciągnij białą jednojądrową komórkę zawierającą kożuchy do nowej 15-mililitrowej tuby.Umyj pobrane komórki dwa razy w 20 mililitrach PBS na pranie, a następnie wykonaj lizę czerwonych krwinek za pomocą pięciu mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek przez trzy do pięciu minut na lodzie. Zatrzymaj reakcję za pomocą 20 mililitrów PBS i zbierz białe krwinki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad i uzupełnić alfa M-E-M do liczenia.Następnie umieść komórki w siedmiu punktach pięć razy 10 do pięciu PBMC na centymetr kwadratowy stężenia w każdym dołku 24-dołkowej płytki do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Po około trzech godzinach usuń supernatant, zanieczyszczenia, nieprzyłączone komórki i niezlizowane erytrocyty z kultur. I dodaj świeże podłoże, uzupełnione MCSF.Czternaście dni po wysianiu umyj komórki dwa razy PBS i utrwal je w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Barwienie pułapki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki podobne do osteoklastów będą TRAP dodatnie z co najmniej czterema jądrami.Policz komórki podobne do osteoklastów ręcznie pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. W przypadku różnicowania osteoklastów wywołanego komórkami rakowymi, gdy komórki rakowe osiągają dziewięćdziesiąt procent zbieżności, są one odłączane przez trypsynizację i wysiewane na wstawki porów w punkcie zerowym o długości czterech mikrometrów w stężeniu cztery razy 10 do trzech komórek na centymetr kwadratowy w świeżym alfa MEM. Następnego dnia umieść wkładki z nasionami na niezróżnicowanych, jednodniowych, platerowanych kulturach komórek jednojądrzastych w pełnym alfa M-E-M i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni.Następnie, 11 dni po rozpoczęciu kohodowli, przenieś inserty na nową płytkę zawierającą odpowiedni odczynnik do pożądanej dalszej analizy. Komórki raka piersi mogą podtrzymywać osteoklastogenezę, ponieważ liczba osteoklastów w studzienkach indukowanych przez komórki rakowe jest podobna do tej uzyskiwanej w studzienkach kontrolnych z dodatnim czynnikiem wzrostu. Liczba osteoklastów obserwowanych we wszystkich kulturach jest jednak zmniejszona, gdy komórki są traktowane lekiem przeciwnowotworowym.Co ciekawe, powierzchnie dojrzałych osteoklastów pochodzących z czynników wzrostu są większe niż te indukowane przez komórki nowotworowe. Efektu tego nie obserwuje się w kulturach leczonych lekami przeciwnowotworowymi. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę dalszą, taką jak analiza ekspresji genów, Western Blot, analiza immunofluorescencyjna lub ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji rak-komórka/komórka kostna-komórka lub mechanizmy leków przeciwnowotworowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami do kości do badania mikrośrodowiska kostnego w całkowicie ludzkim modelu przedklinicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować monocyty, ulegać różnicowaniu z komórkami rakowymi.Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi i lekami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Obecny raport podsumowuje protokół, który może być wykorzystany do modelowania wpływu niszy mikrośrodowiska szpiku kostnego na komórki białaczkowe, kładąc nacisk na wzbogacenie najbardziej chemoodpornej subpopulacji.

Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę hodowli monocytów krwi obwodowej z liniami komórkowymi raka piersi w celu badania osteoklastogenezy i interakcji komórek nowotworowych w mikrośrodowisku kostnym.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Przeglądaj więcej filmów