Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi
September 13th, 2017
Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.
Ogólnym celem tego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro u ludzi, pochodzącego z monocytów krwi obwodowej lub PBMC, hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi, jest naśladowanie interakcji osteoklastów komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów do kości dotyczące wpływu interakcji komórek nowotworowych i komórek kostnych w mikrośrodowisku kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to w pełni ludzki model przedkliniczny.
Ponadto ta metoda może zapewnić wgląd w przerzuty do kości. Może być również stosowany do badania innych mechanizmów patologicznych związanych z kośćmi, takich jak osteoporoza. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności ze względu na zmienność wśród zdrowych dawców oraz wybór odpowiedniej gęstości komórek PBMC.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ muszą zapoznać się z naszą selekcją PBMC, a etapy wysiewu wymagają pewnego doświadczenia manualnego, zanim będzie można osiągnąć biegłość. Zacznij od rozcieńczenia co najmniej 20 mililitrów krwi pełnej zdrowego dawcy w EDTA w stosunku jeden do jednego w PBS. Po dokładnym wymieszaniu podziel roztwór krwi na 30 mililitrowe porcje w 50-mililitrowych stożkowych probówkach.
Ostrożnie umieść 15 mililitrów pożywki do separacji limfocytów na dnie każdej probówki. Oddzielić komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości. I wciągnij białą jednojądrową komórkę zawierającą kożuchy do nowej 15-mililitrowej tuby.
Umyj pobrane komórki dwa razy w 20 mililitrach PBS na pranie, a następnie wykonaj lizę czerwonych krwinek za pomocą pięciu mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek przez trzy do pięciu minut na lodzie. Zatrzymaj reakcję za pomocą 20 mililitrów PBS i zbierz białe krwinki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad i uzupełnić alfa M-E-M do liczenia.
Następnie umieść komórki w siedmiu punktach pięć razy 10 do pięciu PBMC na centymetr kwadratowy stężenia w każdym dołku 24-dołkowej płytki do ich inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Po około trzech godzinach usuń supernatant, zanieczyszczenia, nieprzyłączone komórki i niezlizowane erytrocyty z kultur. I dodaj świeże podłoże, uzupełnione MCSF.
Czternaście dni po wysianiu umyj komórki dwa razy PBS i utrwal je w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Barwienie pułapki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki podobne do osteoklastów będą TRAP dodatnie z co najmniej czterema jądrami.
Policz komórki podobne do osteoklastów ręcznie pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. W przypadku różnicowania osteoklastów wywołanego komórkami rakowymi, gdy komórki rakowe osiągają dziewięćdziesiąt procent zbieżności, są one odłączane przez trypsynizację i wysiewane na wstawki porów w punkcie zerowym o długości czterech mikrometrów w stężeniu cztery razy 10 do trzech komórek na centymetr kwadratowy w świeżym alfa MEM. Następnego dnia umieść wkładki z nasionami na niezróżnicowanych, jednodniowych, platerowanych kulturach komórek jednojądrzastych w pełnym alfa M-E-M i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni.
Następnie, 11 dni po rozpoczęciu kohodowli, przenieś inserty na nową płytkę zawierającą odpowiedni odczynnik do pożądanej dalszej analizy. Komórki raka piersi mogą podtrzymywać osteoklastogenezę, ponieważ liczba osteoklastów w studzienkach indukowanych przez komórki rakowe jest podobna do tej uzyskiwanej w studzienkach kontrolnych z dodatnim czynnikiem wzrostu. Liczba osteoklastów obserwowanych we wszystkich kulturach jest jednak zmniejszona, gdy komórki są traktowane lekiem przeciwnowotworowym.
Co ciekawe, powierzchnie dojrzałych osteoklastów pochodzących z czynników wzrostu są większe niż te indukowane przez komórki nowotworowe. Efektu tego nie obserwuje się w kulturach leczonych lekami przeciwnowotworowymi. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu siedmiu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkową analizę dalszą, taką jak analiza ekspresji genów, Western Blot, analiza immunofluorescencyjna lub ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji rak-komórka/komórka kostna-komórka lub mechanizmy leków przeciwnowotworowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami do kości do badania mikrośrodowiska kostnego w całkowicie ludzkim modelu przedklinicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować monocyty, ulegać różnicowaniu z komórkami rakowymi.
Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi i lekami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje rozwój in vitro ludzkiego preklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórek raka piersi, aby naśladować interakcję komórek rakowych i osteoklastów. Ten model może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przerzutów do kości i poprawić opcje terapeutyczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Osteoklastoogeneza
- Przerzuty do kości
- Interakcje komórek rakowych
Tło
- Model wykorzystuje monocyty krwi obwodowej (PBMC).
- Celem jest naśladowanie interakcji między komórkami rakowymi a osteoklastami.
- Badania te są ważne dla zrozumienia patologii związanych z kośćmi.
- Różnorodność wśród zdrowych donorów może wpływać na wyniki.
Cel badania
- Naśladować interakcje komórek rakowych i osteoklastów.
- Zbadać efekty tych interakcji w środowisku kości.
- Dostarczyć wglądu w przerzuty do kości i powiązane stany.
Stosowane metody
- Hodowla PBMC z liniami komórek raka piersi.
- Ocena osteoklastogenezy.
- Oceny interakcji komórek rakowych i komórek kości.
- Analiza zmienności gęstości komórek PBMC.
Główne wyniki
- Model z powodzeniem naśladuje interakcje komórek rakowych i osteoklastów.
- Uzyskane wglądy mogą pomóc w opracowywaniu strategii terapeutycznych dla przerzutów do kości.
- Potencjalne zastosowania obejmują inne choroby związane z kośćmi.
- Wyzwania obejmują zmienność donorów i wybór odpowiedniej gęstości komórek PBMC.
Konkluzje
- Ten ludzki prekliniczny model jest wartościowy do badania przerzutów do kości.
- Zwiększa zrozumienie interakcji komórek rakowych w mikrośrodowisku kości.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do szerszych zastosowań w patologii kości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
