Name: Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj mikrodysekcję i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów migotania przedsionków i identyfikację nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK; 81X3600221 do H.V., 81X2600255 do S.C.), Chińską Radę Stypendialną (CSC201808130158 do R.X.), Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 do PT) oraz Corona Foundation (S199/10079/2019 do SC).

Revealing Murine Pulmonary Veins Myocardial Architecture

<ol><li>Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+atrial+fibrillation%3A+An+increasing+epidemic+and+public+health+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge.</a> International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).</li>
<li>Wijesurendra, R. S., Casadei, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of atrial fibrillation.</a> Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).</li>
<li>Haïssaguerre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+initiation+of+atrial+fibrillation+by+ectopic+beats+originating+in+the+pulmonary+veins%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins.</a> The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).</li>
<li>Mueller-Hoecker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+rodents+and+humans%3A+a+light+microscopic+and+ultrastructural+study+on+cardiomyocytes+in+pulmonary+veins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins.</a> International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).</li>
<li>Kramer, A. W., Marks, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+cardiac+muscle+in+the+pulmonary+veins+of+Rodenita%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita.</a> Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).</li>
<li>Nathan, H., Eliakim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junction+between+the+left+atrium+and+the+pulmonary+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The junction between the left atrium and the pulmonary veins.</a> Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).</li>
<li>Nathan, H., Gloobe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+atrio-venous+junctions+and+extensions+%28sleeves%29+over+the+pulmonary+and+caval+veins%3A+Anatomical+observations+in+various+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals.</a> Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).</li>
<li>Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+currents%2C+action+potentials%2C+and+noradrenergic+responses+in+rat+pulmonary+vein+and+left+atrial+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes.</a> Physiological Reports. 8 (9), 14432(2020).</li>
<li>Thiagalingam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vein+contraction%3A+Characterization+of+dynamic+changes+in+pulmonary+vein+morphology+using+multiphase+multislice+computed+tomography+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning.</a> Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).</li>
<li>Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+excitation+from+the+atrium+into+thoracic+veins+in+human+beings+and+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs.</a> The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).</li>
<li>Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ultrastructure+at+mammalian+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).</li>
<li>Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+and+the+structure+of+the+nexus+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle.</a> Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).</li>
<li>Kawamura, K., Konishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+the+cell+junction+of+heart+muscle+with+special+reference+to+its+functional+significance+in+excitation+conduction+and+to+the+concept+of+%26%2334%3Bdisease+of+intercalated+disc%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of &#34;disease of intercalated disc&#34.</a> Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).</li>
<li>Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+connexin43%2C+the+major+cardiac+gap+junction+protein%2C+in+the+developing+and+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart.</a> Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).</li>
<li>Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure+and+connexin+expression+of+canine+pulmonary+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins.</a> Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+connexin+43%2C+ion+channels+and+Ca2%2B-handling+proteins+in+rat+pulmonary+vein+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).</li>
<li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunofluorescence+staining%2C+confocal+imaging+and+3D+reconstruction+of+the+sinoatrial+and+atrioventricular+node+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).</li>
<li>Tomsits, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medetomidine%2Fmidazolam%2Ffentanyl+narcosis+alters+cardiac+autonomic+tone+leading+to+conduction+disorders+and+arrhythmias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice.</a> Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).</li>
<li>Xia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+resident+cardiac+macrophages+from+the+murine+sinoatrial+and+atrioventricular+node%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).</li>
<li>Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+activity+arising+in+cardiac+muscle+sleeves+of+the+pulmonary+vein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein.</a> Biomolecules. 12 (1), 23(2021).</li>
<li>Chen, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of atrial fibrillation.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).</li>
<li>Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+lateralization+contributes+to+male+susceptibility+to+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Dzięki temu protokołowi udostępniamy metodę rozróżniania i izolowania PV serca myszy oraz wykonywania na nich barwienia immunofluorescencyjnego. Po pobraniu narządów serce i płuca odwodniono w wysterylizowanym roztworze sacharozy, a następnie oddzielono komory od przedsionka i płatów płuc pod mikroskopowym nadzorem. Następnie przygotowano podstawę serca w celu uwidocznienia PV, a następnie wycięto je z płuc na wnęce. Późniejsze barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono przy użyciu kriotechniki poprzez zatopienie tka...

Migotanie przedsionków (AF) jest najczęstszą trwałą arytmią1. Częstość występowania migotania przedsionków wzrasta jeszcze bardziej, a oczekiwana liczba pacjentów w Europie w 2060 r. wyniesie ~17,9 miliona pacjentów1. Migotanie przedsionków jest klinicznie bardzo ważne, ponieważ jest istotnym czynnikiem ryzyka rozwoju zawału mięśnia sercowego, niewydolności serca lub udaru mózgu, powodując ogromne obciążenie indywidualne, społeczne i społeczno-ekonomiczne1. Mimo że migotanie przedsionków jest znane od dziesięcioleci, patofizjologia migotania przedsionków wciąż nie jest w pełni poznana2.
Już pod koniec lat dziewięćdziesiątych, badania wykazały ogromny wpływ żył płucnych (PV) na inicjowanie i utrzymywanie migotania przedsionków, ponieważ są one głównym źródłem wyzwalających migotanie przedsionków ektopowych3. Wykazano, że PV różnią się strukturalnie od innych naczyń krwionośnych. Podczas gdy typowe naczynia krwionośne zawierają komórki mięśni gładkich, osłonka pożywki PV zawiera również kardiomiocyty4. U gryzoni ta muskulatura serca jest wszechobecna w całych PV, w tym w częściach wewnątrz- i zewnątrzpłucnych, a także w okolicy otworu5. U ludzi PV zawierają również kardiomiocyty, które można zaobserwować w przedłużeniach mięśnia sercowego lewego przedsionka (LA) - tak zwane rękawy mięśnia sercowego (MS)6,7.
MS mają morfologiczne podobieństwa do mięśnia sercowego przedsionkowego8. Kształt i wielkość kardiomiocytów przedsionkowych i PV nie różnią się znacząco między sobą i wykazują porównywalne właściwości elektrofizjologiczne8. Zapisy elektrofizjologiczne w PV dowiodły aktywności elektrycznej SM, a obrazowanie angiograficzne ujawniło skurcze zsynchronizowane z biciem serca9,10.
Połączenia szczelinowe to tworzące pory kompleksy białkowe złożone z sześciu podjednostek koneksyny, które umożliwiają przepływ jonów i małych cząsteczek11. W apozycjach międzykomórkowych istnieją połączenia szczelinowe, które łączą ze sobą sąsiednie kardiomiocyty i umożliwiają międzykomórkowe sprzężenie elektryczne między kardiomiocytami12,13. Kilka izoform koneksyny ulega ekspresji w sercu, przy czym koneksyna 43 (Cx43) jest najpowszechniejszą izoformą wyrażaną we wszystkich regionach serca14. Wcześniejsze badania dostarczają dowodów na ekspresję Cx43 w kardiomiocytach klasy PVs<sup="xref">15,16.
Nadal trudno jest zbadać MS w nienaruszonych PV ze względu na ich delikatną strukturę, zwłaszcza w małych modelach zwierzęcych. Tutaj pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować PV wraz z LA i płatami płuc u myszy za pomocą mikrodysekcji pod kontrolą mikroskopii. Dodatkowo demonstrujemy barwienie immunofluorescencyjne (IF) PV w celu wizualizacji kardiomiocytów i ich wzajemnych połączeń w PV.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka adhezyjne</td><td>Epredia</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>AF568-przeciwciało drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A11036</td><td>Gospodarz: Koza, Reaktywność: Agaroza królicza</td></tr><tr><td></td><td>Biozym LE</td><td>840104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-przeciwciało wtórne</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4408S</td><td>Gospodarz: Koza, Reaktywność: mysz</td></tr><tr><td>Anti-Connexin 43 / GJA1 przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Przeciwciało poliklonalne, Klon: GJA1, Gospodarz: Królik&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cTNT</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-12960</td><td>Przeciwciało monoklonalne, Klon: 13-11, Gospodarz: Mysz</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Szczotka</td><td>Lukas&nbsp;</td><td>5486</td><td>rozmiar 6</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Epredia</td><td></td><td>24 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Cryotome Cryo Star NX70</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td>Ustawienia: Temperatura próbki: -18 &deg; C, Temperatura ostrza: -25 &deg; C</td></tr><tr><td>DFC365FX aparat</td><td>fotograficzny Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny DM6 B</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami Dubecco (DPBS) 1x stężenie.</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dumont #5FS Kleszcze</td><td>FST</td> <td>91150-20</td> potrzebne <td>2 sztuki</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny nośnik montażowy</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Barwienie przeciwstawne jąder komórkowych</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Oprogramowanie do analizy i przetwarzania</td><td>FIJI</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania dla Leica DM6 B</td></tr><tr><td>Ostrza mikrotomu S35</td><td>Feather</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S26-M</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Pierce</td><td>28908</td><td>pipety</td></tr><tr><td>Pasteura bez metanolu</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>średnica 100 mm</td></tr><tr><td>Rocker 3D digital</td><td>IKA Sch&uuml; ttler</td><td>00040010000</td><td></td></tr><tr><td>Słoiki do barwienia szkiełek</td><td>EasyDip</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Formy do próbek</td><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>4557</td><td>25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>System barwienia StainTray M920</td><td>StainTray</td><td>631-1923</td><td>System barwienia na 20 szkiełek</td></tr><tr><td>Sterican Needle</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td>G 27 - służy do iniekcji (krok 2) i przypinania (krok 3 i 4) w protokole</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>F.S.T.</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen Liquid Blocker</td><td>Super PAP Pen</td><td>N71310-N</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>TRIS-RO</td><td>składnik do 1x Tris-Buffered Saline (TBS)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Żyły płucne (PVs) są głównym źródłem ektopowych uderzeń w arytmii przedsionkowej i odgrywają kluczową rolę w rozwoju i progresji migotania przedsionków (AF). PV zawierają rękawy mięśnia sercowego (MS) złożone z kardiomiocytów. Stwardnienie rozsiane bierze udział w inicjacji i utrzymaniu migotania przedsionków, ponieważ zachowują podobieństwa do pracującego mięśnia sercowego, w tym zdolność do generowania ektopowych impulsów elektrycznych. Gryzonie są szeroko stosowane i mogą stanowić doskonałe modele zwierzęce do badania mięśnia sercowego żyły płucnej, ponieważ kardiomiocyty są szeroko obecne na całej ścianie naczynia. Jednak precyzyjna mikrodysekcja i przygotowanie mysich PV jest trudne ze względu na mały rozmiar narządu i skomplikowaną anatomię.
Demonstrujemy protokół mikrodysekcji pod kontrolą mikroskopii do izolowania mysiego lewego przedsionka (LA) razem z PVs. Barwienie immunofluorescencyjne za pomocą sercowych przeciwciał Troponin-T (cTNT) i connexin 43 (Cx43) jest wykonywane w celu wizualizacji LA i PV na całej długości. Obrazowanie przy powiększeniu 10x i 40x zapewnia kompleksowy obraz struktury PV, a także szczegółowy wgląd w architekturę mięśnia sercowego, szczególnie podkreślając obecność koneksyny 43 w SM.

Przeprowadziliśmy mikrodyssekcję, barwienie i obrazowanie żył płucnych (PV) u 10 myszy w wieku od 12 do 16 tygodni. Zgodnie z protokołem, w przypadku wszystkich myszy doświadczalnych pomyślnie wykonaliśmy mikrodyssekcję PV wraz z lewym przedsionkiem (LA), uzyskując przekroje z kompleksowym widokiem PV u ośmiu osobników. Zdjęcia ogólne wykonano przy powiększeniu 10x w celu zidentyfikowania obszaru ujścia żyły płucnej (PVO) na połączeniu LA-PV, pozapłucnych fragmentów żył płucnych (PVex) (PV znajdujących się pom...

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

Migotanie przedsionków jest najczęstszą arytmią, ale złożona patofizjologia wciąż nie jest w pełni poznana. Dzięki naszym badaniom przyczyniamy się do lepszego zrozumienia mechanizmów, które prowadzą do inicjacji i utrzymywania się migotania przedsionków. Przeniesienie badań medycznych z laboratorium do łóżka pacjenta jest dużym wyzwaniem.Aby rozwiązać ten problem, stworzyliśmy proces translacyjny od modeli komórkowych przez modele mysie do dużych modeli zwierzęcych i świń, co pozwoliło nam zidentyfikować i zweryfikować nowe cele terapeutyczne. Myszy są często wykorzystywane do badania arytmii. Jednak badanie żył płucnych u myszy jest trudne.Żyły płucne są głównymi czynnikami wywołującymi migotanie przedsionków u pacjentów. Nasz protokół stanowi skuteczną wskazówkę do identyfikacji i mikropreparowania żył płucnych w celu przeprowadzenia dalszych badań. Na początek umieść odwodnione serce i płuca wyizolowane od myszy w naczyniu separacyjnym zawierającym od 40 do 50 mililitrów PBS.Umieść go pod mikroskopem jasnego pola z 10-krotnym powiększeniem i ustaw oświetlenie. Następnie umieść grzbietową powierzchnię serca na naczyniu preparacyjnym. Za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie oddziel komory od przedsionków po zidentyfikowaniu przejścia między ścianą komory a przedsionkiem.Umieść oddzielone przedsionki na naczyniu preparacyjnym podstawą serca skierowaną do góry. Ustaw przedsionki tak, aby płaty płuc znajdowały się z tyłu, lewy przedsionek i jego wyrostek znajdowały się po prawej stronie, a prawy przedsionek i jego wyrostek znajdowały się po lewej stronie. Przypnij pozostałą tkankę lewej komory do naczynia preparacyjnego, aby zabezpieczyć preparat.Delikatnie rozłóż długie płaty, nie wywierając nadmiernej siły, i przypnij je do naczynia rozwarstwiającego. Następnie znajdź aortę z łukiem aorty pośrodku podstawy serca. Usuń tkankę łączną i tłuszczową wokół podstawy serca, zachowując wszystkie zidentyfikowane punkty orientacyjne.Usuń również łuk aorty, aby oczyścić widok podstawy serca. Wykryj pień płucny bezpośrednio po prawej stronie aorty i prześledź jego drogę w kierunku tyłu, aby zidentyfikować tętnice płucne. Aby potwierdzić ich pozycję, śledź ich korzeń do lewego płata i prawego górnego lub środkowego płata, aby wskazać wnękę płuca.Określ położenie lewego i prawego głównego oskrzela za aortą. Potwierdź ich położenie, śledząc ich drogę w kierunku wnęki płuca. Następnie zidentyfikuj żyłę główną górną po lewej stronie aorty i prześledź jej drogę do prawego przedsionka w pobliżu wyrostka prawego przedsionka.Stosując wypreparowanie cienkimi kleszkami, ostrożnie odłącz tętnice płucne od górnej powierzchni przedsionka. Następnie odetnij je we wnęce płuca i odsuń na bok, aby odsłonić wolną ścianę lewego przedsionka i żyły płucne w pełnym widoku. Usuń oskrzela główne z wnęki płuca i wyrzuć tkankę oskrzeli.Zbadaj wnękę płuca, aby zidentyfikować ujście tętnicy płucnej i oskrzela główne. Aby oddzielić przedsionki i komory, wykonaj nacięcie od przedniej części pozostałej prawej komory i przesuwaj się w górę przez zastawkę trójdzielną do przedniej strony żyły głównej górnej, otwierając prawy przedsionek od strony czołowej. Następnie przetnij tylną wolną ścianę prawego przedsionka przylegającą do przegrody międzyprzedsionkowej, aby utworzyć podział między prawym i lewym przedsionkiem.Przetnij tylną ścianę prawej komory obok przegrody międzykomorowej, aby całkowicie odłączyć lewą i prawą komorę. Usuń część podstawowej tkanki płucnej, aby przyciąć rozmiar płatów płuc, pozostawiając od trzech do czterech milimetrów tkanki płucnej. Na początek odizoluj lewy przedsionek i żyły płucne lub PV od serca myszy.Umieść izolowaną tkankę w formie kriogenicznej z podstawą serca i wierzchołkiem płuca skierowanymi do góry. Rozkręć i rozplątaj PV na wypadek, gdyby były zawiłe. Następnie napełnij formę kriogeniczną związkiem OCT.Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie ściskaj panele fotowoltaiczne, nie przesuwając ich, aby usunąć resztki powietrza. Zamrozić tkankę w związku OCT na suchym lodzie. W celu barwienia immunologicznego rozmrażaj zamrożone szkiełka PV myszy w systemie barwienia przez 20 minut.Następnie nałóż kilka kropli 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd na sekcje, aby przymocować tkankę do szkiełek. Po inkubacji przenieś szkiełka na pionowy stojak i zanurz je w pojemniku wypełnionym PBS. Ustaw pojemnik na powolnej wytrząsarce na pięć minut, aby wypłukać szkiełka.Używając pisaka blokującego ciecz zawierającego ksylol, okrąż każdą sekcję na każdym szkiełku i zreorganizuj szkiełka w systemie barwienia. Za pomocą pipety Pasteura nałóż jedną lub dwie krople roztworu przepuszczalnego na każdą próbkę. Następnie wyczyść roztwór Triton X-100, myjąc szkiełka przez pięć minut w PBS.Po przestawieniu szkiełek w systemie barwienia dodaj jedną lub dwie krople bufora blokującego do każdej sekcji, zapewniając całkowite pokrycie. Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych składającej się z przeciwciał pierwszorzędowych i buforu blokującego. Wyrzuć resztki bufora blokującego ze szkiełka.Podaj dwie lub trzy krople mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej sekcji. Po inkubacji umieścić szkiełka w pionowym stojaku i płukać je przez pięć minut w buforze do mycia, zachowując delikatne mieszanie. Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki przeciwciał drugorzędowych składającej się z przeciwciał drugorzędowych i buforu myjącego.Ponownie umieścić szkiełka w systemie barwienia i za pomocą pipety nanieść dwie lub trzy krople mieszanki przeciwciał wtórnych na każdą sekcję. Następnie wyczyść szkiełka trzy razy po pięć minut w buforze do mycia, potrząsając. Następnie dodaj dwie lub trzy krople roztworu Hoechst 33342 do każdej sekcji ułożonej w systemie barwiącym.Umieść szkiełka w pionowym ruszcie i płucz je przez pięć minut w buforze do mycia, delikatnie mieszając. Dodaj jedną lub dwie krople fluorescencyjnego medium montażowego do każdego szkiełka i uszczelnij szkiełka nakrywkowe. W 10-krotnym powiększeniu obserwowano obszar otworu żyły płucnej w lewym przedsionku i połączeniu żyły płucnej, żyły pozapłucne i żyły wewnątrzpłucne.Przy 40-krotnym powiększeniu obserwowano specyficzne sygnały cTnT z typowym prążkowaniem mięśniowym w ujściu żyły płucnej, żyłach pozapłucnych i żyłach wewnątrzpłucnych. CX43 znaleziono we wszystkich trzech regionach płuc i był głównie rzutowany między sąsiednimi kardiomiocytami. Sygnały związane z CX43 obserwowano po stronie polarnej i bocznej kardiomiocytów w rękawach mięśnia sercowego.

microdissection-immunofluorescence-staining-myocardial-sleeves-murine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u...

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Źródło: Brown, A. O., i Orihuela, C. J. Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w mikrozmianach serca i późniejsza remodelacja serca. J. Vis. Exp. (2015)Film demonstruje immunobarwienie chemicznie utrwalonych przekrojów tkanki sercowej myszy, aby zobrazować bakterie patogenne zlokalizowane w mikrozmianach wywołanych infekcją. Proces obejmuje mycie tkanek, przepuszczanie błon, blokowanie miejsc niespecyficznych, znakowanie przeciwciał, przeciwbarwienie jądrowe oraz mikroskopię konfokalną w celu...

Immunobarwienie mikrozmian wypełnionych bakteriami w przekroju tkanki sercowej myszy do obrazowania

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Udostępniamy krok po kroku protokół barwienia immunofluorescencyjnego całego węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) u mysich serc.

Barwienie immunofluorescencyjne w całości mount, obrazowanie konfokalne i rekonstrukcja 3D węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego u myszy

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj mikrodysekcję i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów migotania przedsionków i identyfikację nowych celów terapeutycznych.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Przeglądaj więcej filmów