Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Migotanie przedsionków jest najczęstszą arytmią, ale złożona patofizjologia wciąż nie jest w pełni poznana. Dzięki naszym badaniom przyczyniamy się do lepszego zrozumienia mechanizmów, które prowadzą do inicjacji i utrzymywania się migotania przedsionków. Przeniesienie badań medycznych z laboratorium do łóżka pacjenta jest dużym wyzwaniem.

Aby rozwiązać ten problem, stworzyliśmy proces translacyjny od modeli komórkowych przez modele mysie do dużych modeli zwierzęcych i świń, co pozwoliło nam zidentyfikować i zweryfikować nowe cele terapeutyczne. Myszy są często wykorzystywane do badania arytmii. Jednak badanie żył płucnych u myszy jest trudne.

Żyły płucne są głównymi czynnikami wywołującymi migotanie przedsionków u pacjentów. Nasz protokół stanowi skuteczną wskazówkę do identyfikacji i mikropreparowania żył płucnych w celu przeprowadzenia dalszych badań. Na początek umieść odwodnione serce i płuca wyizolowane od myszy w naczyniu separacyjnym zawierającym od 40 do 50 mililitrów PBS.

Umieść go pod mikroskopem jasnego pola z 10-krotnym powiększeniem i ustaw oświetlenie. Następnie umieść grzbietową powierzchnię serca na naczyniu preparacyjnym. Za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie oddziel komory od przedsionków po zidentyfikowaniu przejścia między ścianą komory a przedsionkiem.

Umieść oddzielone przedsionki na naczyniu preparacyjnym podstawą serca skierowaną do góry. Ustaw przedsionki tak, aby płaty płuc znajdowały się z tyłu, lewy przedsionek i jego wyrostek znajdowały się po prawej stronie, a prawy przedsionek i jego wyrostek znajdowały się po lewej stronie. Przypnij pozostałą tkankę lewej komory do naczynia preparacyjnego, aby zabezpieczyć preparat.

Delikatnie rozłóż długie płaty, nie wywierając nadmiernej siły, i przypnij je do naczynia rozwarstwiającego. Następnie znajdź aortę z łukiem aorty pośrodku podstawy serca. Usuń tkankę łączną i tłuszczową wokół podstawy serca, zachowując wszystkie zidentyfikowane punkty orientacyjne.

Usuń również łuk aorty, aby oczyścić widok podstawy serca. Wykryj pień płucny bezpośrednio po prawej stronie aorty i prześledź jego drogę w kierunku tyłu, aby zidentyfikować tętnice płucne. Aby potwierdzić ich pozycję, śledź ich korzeń do lewego płata i prawego górnego lub środkowego płata, aby wskazać wnękę płuca.

Określ położenie lewego i prawego głównego oskrzela za aortą. Potwierdź ich położenie, śledząc ich drogę w kierunku wnęki płuca. Następnie zidentyfikuj żyłę główną górną po lewej stronie aorty i prześledź jej drogę do prawego przedsionka w pobliżu wyrostka prawego przedsionka.

Stosując wypreparowanie cienkimi kleszkami, ostrożnie odłącz tętnice płucne od górnej powierzchni przedsionka. Następnie odetnij je we wnęce płuca i odsuń na bok, aby odsłonić wolną ścianę lewego przedsionka i żyły płucne w pełnym widoku. Usuń oskrzela główne z wnęki płuca i wyrzuć tkankę oskrzeli.

Zbadaj wnękę płuca, aby zidentyfikować ujście tętnicy płucnej i oskrzela główne. Aby oddzielić przedsionki i komory, wykonaj nacięcie od przedniej części pozostałej prawej komory i przesuwaj się w górę przez zastawkę trójdzielną do przedniej strony żyły głównej górnej, otwierając prawy przedsionek od strony czołowej. Następnie przetnij tylną wolną ścianę prawego przedsionka przylegającą do przegrody międzyprzedsionkowej, aby utworzyć podział między prawym i lewym przedsionkiem.

Przetnij tylną ścianę prawej komory obok przegrody międzykomorowej, aby całkowicie odłączyć lewą i prawą komorę. Usuń część podstawowej tkanki płucnej, aby przyciąć rozmiar płatów płuc, pozostawiając od trzech do czterech milimetrów tkanki płucnej. Na początek odizoluj lewy przedsionek i żyły płucne lub PV od serca myszy.

Umieść izolowaną tkankę w formie kriogenicznej z podstawą serca i wierzchołkiem płuca skierowanymi do góry. Rozkręć i rozplątaj PV na wypadek, gdyby były zawiłe. Następnie napełnij formę kriogeniczną związkiem OCT.

Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie ściskaj panele fotowoltaiczne, nie przesuwając ich, aby usunąć resztki powietrza. Zamrozić tkankę w związku OCT na suchym lodzie. W celu barwienia immunologicznego rozmrażaj zamrożone szkiełka PV myszy w systemie barwienia przez 20 minut.

Następnie nałóż kilka kropli 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd na sekcje, aby przymocować tkankę do szkiełek. Po inkubacji przenieś szkiełka na pionowy stojak i zanurz je w pojemniku wypełnionym PBS. Ustaw pojemnik na powolnej wytrząsarce na pięć minut, aby wypłukać szkiełka.

Używając pisaka blokującego ciecz zawierającego ksylol, okrąż każdą sekcję na każdym szkiełku i zreorganizuj szkiełka w systemie barwienia. Za pomocą pipety Pasteura nałóż jedną lub dwie krople roztworu przepuszczalnego na każdą próbkę. Następnie wyczyść roztwór Triton X-100, myjąc szkiełka przez pięć minut w PBS.

Po przestawieniu szkiełek w systemie barwienia dodaj jedną lub dwie krople bufora blokującego do każdej sekcji, zapewniając całkowite pokrycie. Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych składającej się z przeciwciał pierwszorzędowych i buforu blokującego. Wyrzuć resztki bufora blokującego ze szkiełka.

Podaj dwie lub trzy krople mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej sekcji. Po inkubacji umieścić szkiełka w pionowym stojaku i płukać je przez pięć minut w buforze do mycia, zachowując delikatne mieszanie. Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki przeciwciał drugorzędowych składającej się z przeciwciał drugorzędowych i buforu myjącego.

Ponownie umieścić szkiełka w systemie barwienia i za pomocą pipety nanieść dwie lub trzy krople mieszanki przeciwciał wtórnych na każdą sekcję. Następnie wyczyść szkiełka trzy razy po pięć minut w buforze do mycia, potrząsając. Następnie dodaj dwie lub trzy krople roztworu Hoechst 33342 do każdej sekcji ułożonej w systemie barwiącym.

Umieść szkiełka w pionowym ruszcie i płucz je przez pięć minut w buforze do mycia, delikatnie mieszając. Dodaj jedną lub dwie krople fluorescencyjnego medium montażowego do każdego szkiełka i uszczelnij szkiełka nakrywkowe. W 10-krotnym powiększeniu obserwowano obszar otworu żyły płucnej w lewym przedsionku i połączeniu żyły płucnej, żyły pozapłucne i żyły wewnątrzpłucne.

Przy 40-krotnym powiększeniu obserwowano specyficzne sygnały cTnT z typowym prążkowaniem mięśniowym w ujściu żyły płucnej, żyłach pozapłucnych i żyłach wewnątrzpłucnych. CX43 znaleziono we wszystkich trzech regionach płuc i był głównie rzutowany między sąsiednimi kardiomiocytami. Sygnały związane z CX43 obserwowano po stronie polarnej i bocznej kardiomiocytów w rękawach mięśnia sercowego.