Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych
21 listopada 2023
Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.
Migotanie przedsionków jest najczęstszą arytmią, ale złożona patofizjologia wciąż nie jest w pełni poznana. Dzięki naszym badaniom przyczyniamy się do lepszego zrozumienia mechanizmów, które prowadzą do inicjacji i utrzymywania się migotania przedsionków. Przeniesienie badań medycznych z laboratorium do łóżka pacjenta jest dużym wyzwaniem.
Aby rozwiązać ten problem, stworzyliśmy proces translacyjny od modeli komórkowych przez modele mysie do dużych modeli zwierzęcych i świń, co pozwoliło nam zidentyfikować i zweryfikować nowe cele terapeutyczne. Myszy są często wykorzystywane do badania arytmii. Jednak badanie żył płucnych u myszy jest trudne.
Żyły płucne są głównymi czynnikami wywołującymi migotanie przedsionków u pacjentów. Nasz protokół stanowi skuteczną wskazówkę do identyfikacji i mikropreparowania żył płucnych w celu przeprowadzenia dalszych badań. Na początek umieść odwodnione serce i płuca wyizolowane od myszy w naczyniu separacyjnym zawierającym od 40 do 50 mililitrów PBS.
Umieść go pod mikroskopem jasnego pola z 10-krotnym powiększeniem i ustaw oświetlenie. Następnie umieść grzbietową powierzchnię serca na naczyniu preparacyjnym. Za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie oddziel komory od przedsionków po zidentyfikowaniu przejścia między ścianą komory a przedsionkiem.
Umieść oddzielone przedsionki na naczyniu preparacyjnym podstawą serca skierowaną do góry. Ustaw przedsionki tak, aby płaty płuc znajdowały się z tyłu, lewy przedsionek i jego wyrostek znajdowały się po prawej stronie, a prawy przedsionek i jego wyrostek znajdowały się po lewej stronie. Przypnij pozostałą tkankę lewej komory do naczynia preparacyjnego, aby zabezpieczyć preparat.
Delikatnie rozłóż długie płaty, nie wywierając nadmiernej siły, i przypnij je do naczynia rozwarstwiającego. Następnie znajdź aortę z łukiem aorty pośrodku podstawy serca. Usuń tkankę łączną i tłuszczową wokół podstawy serca, zachowując wszystkie zidentyfikowane punkty orientacyjne.
Usuń również łuk aorty, aby oczyścić widok podstawy serca. Wykryj pień płucny bezpośrednio po prawej stronie aorty i prześledź jego drogę w kierunku tyłu, aby zidentyfikować tętnice płucne. Aby potwierdzić ich pozycję, śledź ich korzeń do lewego płata i prawego górnego lub środkowego płata, aby wskazać wnękę płuca.
Określ położenie lewego i prawego głównego oskrzela za aortą. Potwierdź ich położenie, śledząc ich drogę w kierunku wnęki płuca. Następnie zidentyfikuj żyłę główną górną po lewej stronie aorty i prześledź jej drogę do prawego przedsionka w pobliżu wyrostka prawego przedsionka.
Stosując wypreparowanie cienkimi kleszkami, ostrożnie odłącz tętnice płucne od górnej powierzchni przedsionka. Następnie odetnij je we wnęce płuca i odsuń na bok, aby odsłonić wolną ścianę lewego przedsionka i żyły płucne w pełnym widoku. Usuń oskrzela główne z wnęki płuca i wyrzuć tkankę oskrzeli.
Zbadaj wnękę płuca, aby zidentyfikować ujście tętnicy płucnej i oskrzela główne. Aby oddzielić przedsionki i komory, wykonaj nacięcie od przedniej części pozostałej prawej komory i przesuwaj się w górę przez zastawkę trójdzielną do przedniej strony żyły głównej górnej, otwierając prawy przedsionek od strony czołowej. Następnie przetnij tylną wolną ścianę prawego przedsionka przylegającą do przegrody międzyprzedsionkowej, aby utworzyć podział między prawym i lewym przedsionkiem.
Przetnij tylną ścianę prawej komory obok przegrody międzykomorowej, aby całkowicie odłączyć lewą i prawą komorę. Usuń część podstawowej tkanki płucnej, aby przyciąć rozmiar płatów płuc, pozostawiając od trzech do czterech milimetrów tkanki płucnej. Na początek odizoluj lewy przedsionek i żyły płucne lub PV od serca myszy.
Umieść izolowaną tkankę w formie kriogenicznej z podstawą serca i wierzchołkiem płuca skierowanymi do góry. Rozkręć i rozplątaj PV na wypadek, gdyby były zawiłe. Następnie napełnij formę kriogeniczną związkiem OCT.
Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie ściskaj panele fotowoltaiczne, nie przesuwając ich, aby usunąć resztki powietrza. Zamrozić tkankę w związku OCT na suchym lodzie. W celu barwienia immunologicznego rozmrażaj zamrożone szkiełka PV myszy w systemie barwienia przez 20 minut.
Następnie nałóż kilka kropli 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd na sekcje, aby przymocować tkankę do szkiełek. Po inkubacji przenieś szkiełka na pionowy stojak i zanurz je w pojemniku wypełnionym PBS. Ustaw pojemnik na powolnej wytrząsarce na pięć minut, aby wypłukać szkiełka.
Używając pisaka blokującego ciecz zawierającego ksylol, okrąż każdą sekcję na każdym szkiełku i zreorganizuj szkiełka w systemie barwienia. Za pomocą pipety Pasteura nałóż jedną lub dwie krople roztworu przepuszczalnego na każdą próbkę. Następnie wyczyść roztwór Triton X-100, myjąc szkiełka przez pięć minut w PBS.
Po przestawieniu szkiełek w systemie barwienia dodaj jedną lub dwie krople bufora blokującego do każdej sekcji, zapewniając całkowite pokrycie. Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych składającej się z przeciwciał pierwszorzędowych i buforu blokującego. Wyrzuć resztki bufora blokującego ze szkiełka.
Podaj dwie lub trzy krople mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej sekcji. Po inkubacji umieścić szkiełka w pionowym stojaku i płukać je przez pięć minut w buforze do mycia, zachowując delikatne mieszanie. Następnie przygotuj jeden mililitr mieszanki przeciwciał drugorzędowych składającej się z przeciwciał drugorzędowych i buforu myjącego.
Ponownie umieścić szkiełka w systemie barwienia i za pomocą pipety nanieść dwie lub trzy krople mieszanki przeciwciał wtórnych na każdą sekcję. Następnie wyczyść szkiełka trzy razy po pięć minut w buforze do mycia, potrząsając. Następnie dodaj dwie lub trzy krople roztworu Hoechst 33342 do każdej sekcji ułożonej w systemie barwiącym.
Umieść szkiełka w pionowym ruszcie i płucz je przez pięć minut w buforze do mycia, delikatnie mieszając. Dodaj jedną lub dwie krople fluorescencyjnego medium montażowego do każdego szkiełka i uszczelnij szkiełka nakrywkowe. W 10-krotnym powiększeniu obserwowano obszar otworu żyły płucnej w lewym przedsionku i połączeniu żyły płucnej, żyły pozapłucne i żyły wewnątrzpłucne.
Przy 40-krotnym powiększeniu obserwowano specyficzne sygnały cTnT z typowym prążkowaniem mięśniowym w ujściu żyły płucnej, żyłach pozapłucnych i żyłach wewnątrzpłucnych. CX43 znaleziono we wszystkich trzech regionach płuc i był głównie rzutowany między sąsiednimi kardiomiocytami. Sygnały związane z CX43 obserwowano po stronie polarnej i bocznej kardiomiocytów w rękawach mięśnia sercowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia izolację żył płucnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii oraz ich barwienie immunofluorescencyjne. Celem badania jest pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów migotania przedsionków poprzez szczegółową analizę tkankową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Kardiologia
- Patofizjologia
Wstęp
- Migotanie przedsionków jest najczęstszą arytmią.
- Patofizjologia migotania przedsionków jest złożona i nie do końca poznana.
- Badania mają na celu przeniesienie wyników z modeli komórkowych na modele dużych zwierząt.
- Myszy są często wykorzystywane do badania arytmii, jednak analiza żył płucnych jest trudna.
Cel badania
- Poprawa zrozumienia mechanizmów inicjacji i utrzymywania migotania przedsionków.
- Ustanowienie translacyjnego procesu identyfikacji celów terapeutycznych.
- Usprawnienie metodologii badawczych w studiach nad arytmią.
Zastosowane metody
- Izolacja żył płucnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii.
- Barwienie immunofluorescencyjne na troponinę T serca oraz koneksynę 43.
- Przygotowanie próbek tkanek z lewego przedsionka i płuc.
- Wykorzystanie różnych modeli zwierzęcych do kompleksowej analizy.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja i barwienie żył płucnych.
- Identyfikacja kluczowych białek związanych z migotaniem przedsionków.
- Wgląd w zmiany strukturalne w żyłach płucnych.
- Walidacja metod dla przyszłych badań nad arytmią.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania żył płucnych u myszy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia migotania przedsionków.
- Ustanowienie ścieżki translacyjnej usprawnia identyfikację celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne żył płucnych myszy umożliwiają wysokorozdzielczą analizę rękawów mięśniowych, które stanowią krytyczny substrat w patogenezie migotania przedsionków. Niniejszy protokół wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów w programach badawczych koncentrujących się na arytmiach, łącząc wyniki na poziomie komórkowym z translacyjnymi modelami zwierzęcymi. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania leków oraz w punktach zwrotnych fazy przedklinicznej dla portfolio kardiologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie podłoży arytmogennych w istotnych dla choroby modelach mysich.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wizualizację markerów kardiomiocytów oraz białek złączy szczelinowych.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do potencjalnych celów terapeutycznych zaangażowanych w migotanie przedsionków.
- Zapewnia kontekst strukturalny i molekularny niezbędny do priorytetyzacji hipotez terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowaną metodę przygotowania tkanek do późniejszych ilościowych analiz obrazowych.
- Standaryzuje protokoły immunofluorescencji w celu powtarzalnego wykrywania białek serca.
- Umożliwia skalowalną analizę lokalizacji białek i architektury mięśnia sercowego w procesach przesiewowych.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na strukturę tkanki serca.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników uzyskanych na modelach mysich ze strategiami translacyjnymi dotyczącymi biomarkerów w badaniach nad arytmią.
- Zapewnia ciągłość przejścia od modeli komórkowych do walidacji na dużych zwierzętach w ramach procesu translacyjnego.
- Pozwala na dostosowanie ryzyka w rozwoju celów terapeutycznych w oparciu o odczyty strukturalne i molekularne.
- Zwiększa wartość prognostyczną dla podejmowania decyzji przedklinicznych w programach kardiologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w ciąg procesu odkrywczego – od wczesnych badań mechanistycznych po walidację przedkliniczną – wspierając zarówno identyfikację celów terapeutycznych, jak i badania translacyjne w dziedzinie arytmii.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących struktury mankietu mięśnia sercowego i ekspresji białek w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki immunofluorescencji do analiz porównawczych.
- Analityka: Dostarcza wysokorozdzielcze obrazy oraz dane dotyczące lokalizacji białek w celu przeprowadzenia porównań między różnymi stanami.
- Badania translacyjne: Łączy modele mysie i modele dużych zwierząt w celu zapewnienia ciągłości badań nad biomarkerami i celami terapeutycznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia ustandaryzowany przepływ pracy, który można dostosować do różnych programów badań sercowo-naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych arytmii.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zstandaryzowanych, powtarzalnych i skalowalnych protokołów analizy tkanek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów w obszarze odkrywania leków sercowo-naczyniowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrosekcji, immunofluorescencji oraz pracy z tkanką serca.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej infrastruktury mikroskopowej i obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja protokołu w celu zapewnienia powtarzalności wyników między zespołami.
- Może wymagać adaptacji do różnych modeli zwierzęcych lub rozmiarów tkanek.
- Ograniczone przez złożoność anatomiczną i niewielki rozmiar żył płucnych myszy.
