Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest chemiczne udrożnienie (klarowanie) serca myszy z wywołaną arytmią serca w celu wizualizacji całego narządu i nacieku leukocytowego w sercu przy użyciu mikroskopii arkusza światła (Fluorescence Light Sheet Microscopy). Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań całych narządów dotyczące protez i struktur na poziomie rozdzielczości komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona zarówno na kwantyfikację, jak i lokalizację stanu zapalnego w całych narządach.

Przedstawiamy szczegółowy wgląd w protezy neurologiczne. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy pilnie potrzebowaliśmy narzędzia do wizualizacji, aby zidentyfikować komórkowe przyczyny arytmii serca w module deplecji. Po odsłonięciu serca myszy w wieku od 8 do 10 tygodni, należy użyć cewnika 21G i wprowadzić go do prawej komory.

Naciąć aortę, aby umożliwić odpływ krwi, a następnie przeprowadzić perfuzję pięcioma mililitrami PBS z dodatkiem EDTA, stosując powolne i stałe ciśnienie. Po PBS EDTA podać pięć mililitrów 4% paraformaldehydu. Po zakończeniu perfuzji, za pomocą pęsety ząbkowanej, delikatnie uchwycić utrwalone serce i lekko pociągnąć organ do góry, aby przeciąć wszystkie połączenia tkankowe.

Włączając w to dopływające i odpływające tętnice oraz żyły. Następnie przechowywać serce przez cztery godziny w świeżym 4% PFA w celu dalszej fiksacji. Aby odwadnić tkankę, inkubować serce w szeregu rośniejących stężeń etanolu, w czarnych pięciomililitrowych polipropylenowych probówkach reakcyjnych w ciemności, przy stałym powolnym obracaniu na rotatorze do probówek, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.

Następnie przeprowadź klarowanie tkanki poprzez inkubację w 98% dibenzyl ether przy stałej rotacji przez noc. Aby przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem światła (Light Sheet Fluorescence Microscopy), najpierw umieść odwodnione bloki agarozy w standardowym uchwycie na próbki, aby unieruchomić preparat. Następnie przenieś próbkę do uchwytu na próbki.

Następnie przenieś uchwyt próbki do kuwety o odpowiedniej wielkości wypełnionej eterem dibenzylu. Użyj odpowiednich ustawień filtrów wzbudzenia i emisji, aby wykryć interesujące sygnały fluorescencji. Prawidłowe rozmieszczenie i unieruchomienie próbki jest zatem kluczowe dla zminimalizowania efektów cieniowania podczas obrazowania.

Ponadto, niestabilnie zamocowany preparat może powodować artefakty ruchowe, które są trudne do usunięcia podczas postprocessingu. Po pozyskaniu wszystkich obrazów należy uruchomić odpowiednie oprogramowanie do analizy i przetwarzania obrazów 3D i 4D, a następnie wybrać funkcję surpass. Wybierz plik i otwórz, a następnie wskaż folder zawierający dane z pierwszego pozyskanego kanału, aby otworzyć stosy obrazów.

Wybierz opcję edytuj i dodaj kanały, aby dodać odpowiednie dane z pozyskanych kanałów fluorescencyjnych. Następnie kliknij edytuj i wybierz właściwości obrazu, aby skorygować wymiary wokseli w osiach x, y i z. Dostosuj parametry w nowo otwartym oknie.

Aby dostosować sygnały fluorescencyjne, najpierw otwórz menu edycji i wybierz opcję pokaż dostosowanie wyświetlania. W nowym oknie zostaną wyświetlone wszystkie otwarte kanały. Aby zmienić kanał autofluorescencji na skalę szarości, zaznacz kanał autofluorescencji, wybierz biały styl wyświetlania i kliknij OK.

Następnie dostosuj widok, usuwając siatkę. Następnie powiększ obraz i odznacz jeden kanał. Następnie dostosuj wartość poziomu czerni, aby wykluczyć niepożądane sygnały tła, które nie reprezentują struktur próbki, a także intensywność sygnału i kontrast.

Dostosuj kanał przeciwciał w odniesieniu do skorygowanego sygnału kanału autofluorescencji. W ustawieniach trybu kanału wybierz opcję wizualizacji sygnału przeciwciał za pomocą tabeli kolorów mapy ciepła. Następnie wybierz tryb mieszania, aby szczegółowo zwizualizować struktury tkankowe.

Aby wirtualnie rozciąć organ przed eksportem sceny 3D, należy wybrać ikonę płaszczyzny przycinania na liście obiektów. W widoku obrazu pojawi się żółta ramka oraz biały manipulator w kształcie wrzeciona. Za pomocą myszy obracaj wrzeciono za jego cieńszy koniec, aby zmienić orientację płaszczyzny przycinania, a następnie przesuń grubszą, środkową część wrzeciona, aby wybrać pożądaną głębokość przycinania.

Następnie odznacz odpowiednie pola wyboru, aby ukryć ramkę oraz manipulator i utworzyć pożądane zrzuty ekranu. Pozyskanie całego stosu obrazów, składającego się z sygnałów dwóch kanałów fluorescencyjnych, pozwala na wygenerowanie sztucznego renderingu 3D, w którym rozkład leukocytów jest przedstawiony w widoku mapy ciepła. Silnie zapalone obszary serc zwierzęcia traktowanego toksyną błoniczą można rozpoznać po ich czerwonej i białej barwie.

Szczególnie w obszarach układu przewodzącego serca, takich jak pęczek przedsionkowo-komorowy i włókna Purkinjego. W przeciwieństwie do nich, serca zwierząt z grupy kontrolnej traktowanych PBS nie wykazują takiego wzorca stanu zapalnego. Po opanowaniu, technika ta umożliwia cyfrową analizę organu docelowego, od jego pobrania do wspomaganej komputerowo wizualizacji, w ciągu czterech do pięciu dni.

Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie emmenologii do badania wzorców dystrybucji komórkowej w całych organach myszy. Może to pomóc w analizie i leczeniu różnych patofizjologicznych zmian chorobowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować całe organy myszy do mikroskopii arkuszowej z fluorescencją (Fluorescence Light Sheet Microscopy) oraz jak generować i przetwarzać trójwymiarowe stosy danych (3D data stacks).