Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Ogólnym celem tego protokołu jest chemiczne oczyszczenie serca myszy z indukowaną arytmią serca dla całego narządu wizualizacja nacieku leukocytarnego serca za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań całych narządów dotyczących protez i struktur na poziomie rozdzielczości komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona zarówno kwantyfikację, jak i lokalizację stanu zapalnego w całych narządach.

Podanie szczegółowych wnętrz protezy neurologicznej. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy pilnie potrzebowaliśmy narzędzia do wizualizacji w celu zidentyfikowania komórkowych wyjaśnień arytmii serca w module wyczerpania. Po ekspozycji serca od 8 do 10 tygodniowej myszy użyj cewnika o rozmiarze 21 i przeniknij do prawej komory.

Naciąć aortę, aby umożliwić drenaż krwi, a następnie wykonać perfuzję z pięcioma mililitrami PBS plus EDTA, przy powolnym, stałym ciśnieniu. Postępuj zgodnie z PBS EDTA z pięcioma mililitrami 4% paraformaldehydu. Pod koniec perfuzji użyj ząbkowanych kleszczy, aby delikatnie chwycić nieruchome serce i pociągnij narząd lekko do góry, aby przeciąć wszystkie połączenia tkankowe.

W tym tętnice i żyły przychodzące i wychodzące. Następnie przechowuj serce przez cztery godziny w świeżym 4% PFA w celu dalszego utrwalenia. Aby odwodnić tkankę, inkubuj serce w rosnącej serii etanolu, w czarnych pięciomililitrowych polipropylenowych probówkach reakcyjnych w ciemności, ze stałym powolnym obrotem na rotatorze rurowym, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.

Następnie oczyść tkankę za pomocą inkubacji 98% eteru dibenzylowego ze stałą rotacją przez noc. Aby przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną z użyciem lekkiego arkusza, najpierw umieść odwodnione bloki agarozy w standardowym uchwycie próbki, aby utrzymać próbkę na miejscu. Następnie przenieś próbkę do uchwytu na próbkę.

Następnie przenieś uchwyt próbki do odpowiedniej wielkości kuwety wypełnionej eterem dibenzylowym. Użyj odpowiednich ustawień filtra wzbudzenia i emisji, aby wykryć interesujące sygnały fluorescencyjne. Dlatego prawidłowe pozycjonowanie i utrwalanie próbki ma zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania efektów zacienienia podczas obrazowania.

Co więcej, luźna próbka może powodować ruchome artefakty, które są trudne do oświetlenia podczas obróbki końcowej. Po wymaganiu wszystkich obrazów otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy przetwarzania obrazów 3D i 4D i wybierz opcję przewyższaj. Wybierz plik i otwórz, a następnie wybierz folder zawierający dane z pierwszego pobranego kanału, aby otworzyć stosy obrazów.

Wybierz opcję edycji i dodaj kanały, aby dodać odpowiednie pozyskane dane kanału fluorescencyjnego. Następnie kliknij edytuj i wybierz właściwości obrazu, aby skorygować wymiary woksela x, y i z. Dostosowanie parametrów w nowo otwartym oknie.

Aby wyregulować sygnały fluorescencyjne, najpierw otwórz menu edycji i wybierz opcję pokaż regulację wyświetlania. Nowe okno bardzo wyświetla wszystkie otwarte kanały. Aby zmienić kanał autofluorescencji na skalę szarości, wybierz kanał autofluorescencji, wybierz biały styl wyświetlania i kliknij przycisk OK.

Następnie dostosuj widok, usuwając siatkę. Następnie powiększ i odznacz jeden kanał. Następnie dostosuj wartość poziomu czerni, aby wykluczyć wszelkie niepożądane sygnały tła, które nie reprezentują struktur próbki, intensywności sygnału i kontrastu.

Dostosuj kanał stojący przeciwciała w stosunku do zmienionego sygnału kanału autofluorescencji. Ustawiając tryb kanału, odpal, aby ustawić wizualizację sygnału przeciwciała na tabelę wyszukiwania kolorów mapy cieplnej. Następnie wybierz tryb mieszania, aby szczegółowo zobrazować struktury tkanek.

Aby wirtualnie rozciąć organy, przed eksportem sceny 3D wybierz ikonę płaszczyzny tnącej na liście obiektów. W widoku obrazu pojawi się żółta ramka i biały manipulator wrzeciona. Użyj myszy, aby obrócić wrzeciono na cieńszym końcu, aby zmienić orientację płaszczyzny przycinania i przesuń grubszą środkową część wrzeciona, aby wybrać żądaną głębokość przycinania.

Następnie odznacz odpowiednie pola wyboru, aby ukryć ramkę i manipulator oraz utworzyć żądane migawki. Akwizycja całego stosu obrazów, składającego się z dwóch sygnałów kanału fluorescencyjnego, wywołuje sztuczne renderowanie 3D, w którym rozkład leukocytów jest wyświetlany w widoku mapy cieplnej. Silnie zapalne obszary serca u zwierzęcia leczonego toksyną błonicy można rozpoznać po ich czerwonawym, białawym wyglądzie.

Szczególnie w obszarach układu przewodzącego serca, takich jak pęczek komorowy przedsionków i włókna Purkinjego. W przeciwieństwie do tego, serca zwierząt z grupy kontrolowanej leczonych PBS nie wykazują tego wzorca zapalenia. Po opanowaniu, technika ta pozwala na cyfrową analizę docelowego narządu, od jego pobrania do wspomaganej komputerowo reprezentacji, w ciągu czterech do pięciu dni.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie emmenologii do zbadania wzorców rozmieszczenia komórek w całych narządach myszy. Może to starzeć się w analizie i leczeniu różnych protez chorób patofizjologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować całe narządy myszy do mikroskopii fluorescencyjnej oraz jak generować i przetwarzać stosy danych 3D.