Name: Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii świetlnej do ilościowej wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w sercu myszy z piorunującym zapaleniem mięśnia sercowego. Ta technika umożliwia analizę całych narządów z rozdzielczością komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Gunzera były wspierane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (grant nr 0315590 A-D) oraz przez Niemiecką Fundację Badawczą (grant nr. GU769/4-1, GU769/4-2). Ponadto dziękujemy IMCES za wsparcie techniczne oraz Sebastianowi Kubatowi za pomoc w modelowaniu kreskówek 3D.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi UE i zostały zatwierdzone przez odpowiednie władze lokalne w Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Niemcy). Zwierzęta były wykorzystywane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).
1. Indukcja zapalenia mięśnia sercowego przez toksynę błonicy (DTX)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór DTX do indukcji zapalenia mięśnia sercowego, rozcieńczając roztwór podstawowy DTX solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do roztworu roboczego o stężeniu 1 μg/ml.</li>
	<li>Nanieść 100 μl tego roztworu dotchawiczo (i.t.) na 8 do 10 tygodniowych myszy CD11c.DTR (ok. 5 ng/g masy ciała (bw)), jak wykazano przez Hasenberga i wsp. dla i.t. aplikacji zawiesiny zarodników grzybów20. 
	UWAGA: Dootrzewnowe podanie toksyny może spowodować podobną indukcję śmiertelnego zapalenia mięśnia sercowego. Podejście to musiałoby jednak najpierw zostać zweryfikowane.
	<ol>
		<li>W przypadku stosowania dojelitowego należy znieczulić zwierzęta przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg m.c. ketaminy i 10 mg/kg m.c. ksylazyny.</li>
		<li>Po osiągnięciu głębokiej narkozy (próba uszczypnięcia palca u nogi) zaintubować zwierzęta za pomocą cewnika dożylnego 22 G przez jamę ustną. Sprawdź prawidłowe ustawienie tubusu soczewki, wentylując zwierzęta za pomocą respiratora dla małych zwierząt z szybkością 250 oddechów na minutę i objętością wdechu 250 μl na oddech, co również wykazano przez Hasenberga i wsp.20. 
		UWAGA: Przy prawidłowym ustawieniu częstość oddechów zwierząt zmieni się zgodnie z zastosowanymi ustawieniami wentylacji.</li>
		<li>Odłączyć system wentylacji i wkraść 100 μl roztworu DTX lub taką samą ilość PBS jako kontrolę przez cewnik do płuc i kontynuować wentylację zwierząt przez 1 dodatkową minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu i monitoruj ogólny stan zdrowia i zmianę masy ciała przez 4 dni. 
	UWAGA: W zależności od tła genetycznego, szczepu myszy lub początkowej masy, nasilenie i początek zapalenia mięśnia sercowego mogą się różnić i należy je najpierw określić.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do mikroskopii z użyciem lekkiego arkusza
<ol>
	<li>4 dni po zastosowaniu toksyny znieczulij myszy, przepłukując komorę indukcyjną odparowaną 2% mieszaniną izofluranu i tlenu. Wstrzyknąć 15 μg bezpośrednio znakowanego przeciwciała anty-CD45 (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) w 50 μl PBS dożylnie (i.v.) przy użyciu zadoczodołowej drogi aplikacji, która zapewnia bardzo szybkie i bardzo dokładne podanie odpowiedniej ilości przeciwciała. 
	UWAGA: Pożądana głębokość narkozy została osiągnięta, gdy myszy leżą i nie reagują na testy szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji należy złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy i perfuzję serc in situ za pomocą 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
	<ol>
		<li>Odsłonić serce i wstrzyknąć roztwór perfuzyjny do prawej komory za pomocą cewnika 21 G. Perfuzja z powolnym, stałym ciśnieniem i upewnienie się, że krew może zostać odprowadzona po rozcięciu aorty. 
		UWAGA: Ta perfuzja przezsercowa może powodować drobne artefakty preparacji, które mogą zakłócić ostateczną wizualizację 3D narządu. Dlatego zaawansowani eksperymentatorzy na zwierzętach mogli przeprowadzić perfuzję przez żyłę główną dolną, wycinając aortę brzuszną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu utrwalenia chemicznego należy przetoczyć perfuzję serca przez to samo wgłębienie za pomocą 5 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Utrzymuj cewnik na miejscu i po prostu podłącz nową strzykawkę wypełnioną PFA. Przenikaj z powolnym i stałym ciśnieniem. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny; Unikać kontaktu ze skórą, oczami i innymi błonami śluzowymi.
	<ol>
		<li>Delikatnie chwyć serce ząbkowanymi kleszczami, pociągnij je lekko do góry i przetnij wszystkie połączenia tkankowe, w tym tętnice i żyły przychodzące i wychodzące. Przechowuj narząd przez dodatkowe 4 godziny w 4% PFA w celu dalszego utrwalenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby odwodnić narząd, inkubuj serce w rosnącej serii etanolu w 50%, 70% i dwukrotnie w 100%, każdy przez 12 godzin, w temperaturze 4 °C w ciemności. W tym przypadku należy użyć czarnych polipropylenowych probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml, co pozwala im stale obracać się w rotatorze probówek przy niskiej prędkości obrotowej, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Pełne przygotowanie próbki przez chemiczne oczyszczanie. Aby serca były przezroczyste, inkubuj je w 98% eterze dibenzylowym (DBE), stale obracając się przez noc. 
	UWAGA: DBE działa drażniąco na oczy, skórę i układ oddechowy.</li>
</ol>
3. Mikroskopia arkuszowa
<ol>
	<li>Przeprowadzić LSFM za pomocą mikroskopu arkuszowego (patrz tabela materiałów). Umieść próbkę na standardowym uchwycie mikroskopu w kuwecie wypełnionej DBE, która jest odpowiednia dla próbek o wymiarach do 30 mm x 30 mm x 15 mm.</li>
	<li>Przytrzymaj próbkę mocno na miejscu podczas akwizycji obrazu za pomocą odwodnionych i oczyszczonych bloków agarozy.
	<ol>
		<li>Aby przygotować bloki agarozy, wlej 2% stopionej agarozy do formy (15 mm x 15 mm x 5 mm). Pozwól agarozie ostygnąć, aż stężeje.</li>
		<li>Odwodnić go w rosnącej serii etanolu (50%, 70% i dwukrotnie w 100%). Inkubuj bloki agarozy przez noc w 98% DBE. Przechowuj agarozę w DBE do czasu jej użycia. 
		UWAGA: Ponieważ agaroza składa się głównie z wody, czas inkubacji dla każdego etapu odwadniania może być wydłużony, w zależności od wielkości bloku. 
		UWAGA: DBE działa drażniąco na oczy, skórę i układ oddechowy.</li>
		<li>W razie potrzeby przytnij przygotowany blok agarozy do pożądanego kształtu za pomocą ostrego skalpela. Zazwyczaj wycina się formy w kształcie pryzmatu lub klina, aby umieścić je na krawędziach adaptera próbki. 
		UWAGA: Ponieważ bloki agarozy są elastyczne, próbka pozostaje na miejscu, gdy jest popychana z niewielką siłą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj interesujące sygnały fluorescencyjne (w tym przypadku autofluorescencję i barwienie przeciwciałami anty-CD45) za pomocą odpowiednich ustawień filtra wzbudzenia i emisji.
	<ol>
		<li>Do wykrywania sygnału autofluorescencji pochodzącego z tkanki łącznej należy użyć filtra pasmowoprzepustowego 525/50 nm o długości fali wzbudzenia 488 nm (OPSL: 50 mW); Barwienie CD45 przeciwciałem sprzężonym z AF647 wykrywa się przy długości fali 668 nm (filtr pasmowoprzepustowy: 680/30 nm) i przy długości fali wzbudzenia 647 nm (laser diodowy: 50 mW).</li>
		<li>Wybierz 4 μm jako odległość między dwiema poszczególnymi płaszczyznami z.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie końcowe obrazu
UWAGA: Pozyskane dane obrazu cyfrowego były dalej przetwarzane za pomocą naukowego oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów 3D/4D (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Otwieranie i wstępne dostosowywanie plików danych.
	<ol>
		<li>Po uruchomieniu oprogramowania analitycznego wybierz przycisk "Surpass" w lewym górnym rogu. Aby otworzyć stosy obrazów, wybierz "Plik", "Otwórz" i wybierz folder zawierający dane z pierwszego pozyskanego kanału. Wybierz "Edytuj" i "Dodaj kanały", aby dodać kolejne pozyskane kanały. 
		UWAGA: W zależności od rozmiaru danych i systemu komputerowego proces ten może potrwać kilka minut. Prezentowany protokół demonstruje wszystkie kroki dla 2 kanałów akwizycji (autofluorescencja i AF647).</li>
		<li>Popraw wymiary wokseli x, y i z, klikając "Edytuj" i wybierając "Właściwości obrazu". Gdy otworzy się nowe okno, dostosuj parametry. 
		UWAGA: Ten krok zależy od zastosowanego systemu mikroskopowego i konkretnego formatu danych. Prawidłowe wartości x-y-z mają kluczowe znaczenie dla późniejszych rozmiarów i odległych pomiarów. W większości przypadków parametry te są przechowywane jako metadane w plikach mikrograficznych. Jeśli jednak format pliku nie może być poprawnie zinterpretowany przez oprogramowanie analityczne, ważne jest, aby ręcznie wprowadzić rozmiar w pikselach. Rozmiar piksela w wymiarach x i y zależy od rozmiaru piksela aparatu, potencjalnie zastosowanego łączenia do kategorii oraz powiększenia obiektywu i obiektywu. Rozmiar piksela w z jest równoważny samodzielnie zdefiniowanemu rozmiarowi kroku z (np. 4 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacje kanałów
	<ol>
		<li>Najpierw przekształć sygnał autofluorescencji na skalę szarości, otwierając "Regulację wyświetlacza" ("Edycja" i "Pokaż korektę wyświetlania"). Nowe okno wyświetli listę wszystkich otwartych kanałów i ustawień wyświetlania dla wszystkich z nich; Aby zmienić jego domyślny kolor, wybierz kanał autofluorescencji i wybierz "biały" styl wyświetlania. Kliknij "ok", aby zastosować.</li>
		<li>Aby dostosować poziom czerni, wróć do "Regulacja wyświetlania" i dostosuj wartość poziomu czerni, aby wykluczyć niechciane sygnały tła, które nie reprezentują przykładowych struktur.
		<ol>
			<li>Aby to zrobić, użyj lewego górnego trójkąta na pasku kanału i przeciągnij go od lewej do prawej. 
			UWAGA: Zmiany zostaną natychmiast zwizualizowane. Upewnij się, że tłumisz tylko sygnały, które nie pochodzą z próbki. Minimalne wartości w tle nigdy nie powinny wynosić "0", aby uniknąć czarnych jak smoła pikseli, ponieważ sygnały szumu mogą być potrzebne do dodatkowych obliczeń. Upewnij się, że wszystkie zmiany poziomu czerni są wykonywane po uzyskaniu obrazu. W przeciwnym razie cenne informacje o próbce mogą zostać utracone. Regulacja poziomu czerni służy jedynie celom reprezentacyjnym. Aby użyć tych samych ustawień wyświetlania dla różnych próbek, dokładne wartości można wprowadzić w polu numerycznym "min" pod listą kanałów. Jest to bardzo pomocne w analizach ilościowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dokonaj regulacji intensywności, używając prawego górnego trójkąta, aby dostosować intensywność odpowiedniego kanału lub wprowadzając dokładne wartości w polu numerycznym "max" poniżej listy kanałów.</li>
		<li>Wykonaj regulację kontrastu, przeciągając dolny trójkąt na środku paska kanału, aby zwiększyć lub zmniejszyć wartość gamma lub wprowadzając dokładne wartości.</li>
		<li>Dostosuj kanał AF647 zgodnie z kanałem autofluorescencji. Dla porównania, należy ustawić wizualizację sygnału AF647 na tabelę wyszukiwania kolorów mapy cieplnej. Zrób to, wybierając tryb kanału "odpalanie" w sposób podobny do tego opisanego w kroku 4.2.1. 
		UWAGA: Ponieważ ogólne natężenie sygnału jest znacznie niższe w porównaniu z kanałem autofluorescencji, poziomy czerni są zwykle dostosowywane do znacznie niższych wartości. Jeśli chodzi o kanał autofluorescencji, jasność tego kanału jest zwykle zwiększona.</li>
		<li>Wybierz "tryb mieszania", aby szczegółowo zobrazować struktury tkankowe. Analizuj wszystkie próbki z jednej serii o tych samych wartościach parametrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirtualne przycinanie
	<ol>
		<li>Aby praktycznie rozciąć organy przed eksportem sceny 3D, zastosuj płaszczyznę przycinania do renderowanego obiektu 3D.
		<ol>
			<li>Kliknij ikonę "Płaszczyzna tnąca" (nożyczki) na liście obiektów. Wewnątrz widoku obrazu pojawi się żółta ramka i manipulator (białe wrzeciono). Obróć wrzeciono na cieńszym końcu za pomocą myszy, zmieniając w ten sposób orientację płaszczyzny przycinania, i przesuń grubszą środkową część wrzeciona, aby wybrać żądaną głębokość przycinania.</li>
			<li>Ukryj ramkę i manipulator, odznaczając odpowiednie pola wyboru pod listą obiektów i utwórz żądane migawki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229473459_Uber_Sichtbarmachung_und_Grossenbestimmung_ultramikoskopischer_Teilchen_mit_besonderer_Anwendung_auf_Goldrubinglaser">Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser.</a> Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%281%2C2%2C3%29%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3).</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+building+units+and+properties+of+a+fluorescence+single+plane+illumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705(2007).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3D+reconstruction+of+large+microscopical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens.</a> J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+bacterial-animal+symbioses+with+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy.</a> Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 2207(2013).</li>
<li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Clarifying+Tissue+Clearing">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Maruyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide+field+intravital+imaging+by+two-photon-excitation+digital-scanned+light-sheet+microscopy+%282p-DSLM%29+with+a+high-pulse+energy+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser.</a> Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).</li>
<li>Mann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11c.DTR+mice+develop+a+fatal+fulminant+myocarditis+after+local+or+systemic+treatment+with+diphtheria+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin.</a> Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+depletion+of+CD11c%2B+dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8%2B+T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).</li>
<li>Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11c+integrin+gene+promoter+activity+during+myeloid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation.</a> Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).</li>
<li>Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11chigh+dendritic+cell+ablation+impairs+lymphopenia-driven+proliferation+of+naive+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).</li>
<li>Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+maximize+the+memory+CD8+T+cell+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection.</a> Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).</li>
<li>Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+phagocytosis+and+NET-formation+by+neutrophils+in+infected+lungs+using+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+axial+resolution+in+fluorescence+microscopy+by+standing-wave+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation.</a> Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).</li>
<li>Göppert-Mayer, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228051231_Uber_Elementarakte_mit_zwei_Quantensprungen">Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen.</a> Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Männ, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11c.DTR+mice+develop+a+fatal+fulminant+myocarditis+after+local+or+systemic+treatment+with+diphtheria+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin.</a> Eur. J. Immunol. , in press (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+of+tissue+measured+with+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Refractive index of tissue measured with confocal microscopy.</a> J Biomed Opt. 10 (4), 44014(2005).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+tooth+model+system.+An+aid+in+the+study+of+root+canal+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy.</a> Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).</li>
<li>Karreman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+targeting+of+single+tumor+cells+in+vivo+by+multimodal+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy.</a> J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

We współczesnych naukach przyrodniczych mikroskopowa wizualizacja procesów biologicznych odgrywa coraz większą rolę. W tym kontekście, w ciągu ostatnich dwóch stuleci dokonano wielu zmian, które pomagają odpowiedzieć na pytania, na które do tej pory nie można było odpowiedzieć. Po pierwsze, istnieje wyraźna tendencja do zasadniczego zwiększania rozdzielczości mikroskopów świetlnych. Z mikroskopią oświetlenia strukturalnego (SIM)21,22, mikroskopią wymuszonej emisj...

Podczas ewolucji mikroskopii świetlnej pojawiło się wiele wyspecjalizowanych form, wszystkie z nich zostały opracowane w celu zminimalizowania ograniczeń w procesie wizualizacji dla poszczególnych próbek. Jedną z takich metod jest mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM). Po raz pierwszy opracowany w 1903 roku przez Siedentopfa i Zsigmondy'ego1 i znajdujący swoje pierwsze podstawowe zastosowania biologiczne na początku lat 90. 2, LSFM stał się najpotężniejszym jak dotąd narzędziem mikroskopowym do wizualizacji dużych okazów, takich jak nienaruszone narządy myszy, z rozdzielczością sygnału fluorescencji aż do poziomu komórkowego. Ze względu na te korzyści, w połączeniu z jego potencjałem do obrazowania żywych komórek, Nature Methods nazwało LSFM "Metodą Roku 20143".
Jak sama nazwa wskazuje, oświetlenie próbki w LSFM jest prowadzone przez arkusze świetlne, które są zorientowane prostopadle do osi celu używanego do zbierania światła emisyjnego i późniejszego tworzenia obrazu. Arkusz świetlny jest zwykle generowany albo przez skupienie szerokich, skolimowanych wiązek laserowych za pomocą cylindrycznej soczewki, albo przez szybki ruch boczny wąskich, skupionych wiązek laserowych w jednej płaszczyźnie poziomej lub pionowej4,5. W ten sposób oświetlana jest tylko płaszczyzna ogniskowa optyki obrazowania, zwykle o grubości 1-4 μm. W związku z tym, w przypadku próbki fluorescencyjnej umieszczonej w płaszczyźnie oświetlenia, zarówno generowanie światła rozproszonego, jak i efekty fotowybielania z obszarów powyżej lub poniżej płaszczyzny ogniskowej są eliminowane lub znacznie tłumione6,7. Ponieważ wszystkie nieostre płaszczyzny nie są oświetlone, efekty fotowybielania są pomijane w tych obszarach. W przeciwieństwie do standardowej mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej, ścieżki światła oświetlanego i emitowanego są od siebie oddzielone, dzięki czemu ostateczna jakość obrazu nie zależy od idealnego skupienia wiązki światła wzbudzającego przez obiektywy. W zależności od podstawowego pytania, możliwe jest zatem użycie obiektywów o ogromnym polu widzenia (FOV), tak aby można było zobrazować jak największy obszar oświetlonej płaszczyzny bez żadnych części składowych poruszających się w kierunku xy.
W nowoczesnych systemach LSFM, obraz fluorescencyjny generowanej sekcji optycznej jest rejestrowany na bardzo czułym urządzeniu ze sprzężonym ładunkiem (CCD) lub kamerach CMOS (Complementary metal-oxide semiconductor), które są w stanie uzyskać całe pole widzenia (FOV) w mikrosekundach. W związku z tym, przesuwając próbkę przez arkusz świetlny i uzyskując obrazy w zdefiniowanych krokach z, możliwe jest uzyskanie pełnych informacji 3D o próbce w rozsądnym czasie8,9, dzięki czemu ta technika ma zastosowanie do badań na żywych komórkach10,11,12.
Mimo to, mimo że LSFM oferuje szybką, czułą i przyjazną dla fluorescencji metodę, transmisja światła przez próbkę jest nadal poważnym problemem, zwłaszcza gdy celem analizy 3D są duże próbki biologiczne. Transmisja światła jest krytycznie modyfikowana przez fizyczne aspekty absorpcji i rozpraszanie światła na granicy faz struktur o różnych współczynnikach załamania światła13. Dlatego podczas obrazowania próbek o wielkości kilku milimetrów, LSFM jest najczęściej łączony z protokołami oczyszczania, aby próbki były optycznie przezroczyste. Techniki te opierają się na idei usuwania wody z odpowiedniej tkanki biologicznej i wymiany jej na media zanurzeniowe na bazie wody lub (organicznych) rozpuszczalników, które są dobierane tak, aby ściśle odpowiadały współczynnikom załamania światła poszczególnych składników tkanki docelowej. W rezultacie, boczne rozpraszanie światła jest zminimalizowane, a wszystkie długości fal światła mogą znacznie wydajniej przechodzić przez tissue13. W wielu przypadkach próbki biologiczne potraktowane w ten sposób wydają się makroskopowo krystalicznie czyste, co umożliwia przeprowadzanie LSFM, nawet na całych narządach myszy, przy użyciu obiektywów o dużym dużym powiększeniu.
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania do obrazowania dużych próbek w mikroskopie z arkuszami świetlnymi (zobacz tabelę materiałów), który ustaliliśmy w celu zbadania nacieku komórkowego serca w mysim modelu zapalenia mięśnia sercowego15. Myszy CD11c.DTR wykazują ekspresję receptora toksyny błoniczej naczelnych (DTR) pod kontrolą promotora CD11c16. W związku z tym komórki tych myszy, które wyrażają CD11c wraz z DTR, są wrażliwe na egzotoksynę błonicy Corynebacterium (toksyna błonicy, DTX); ogólnoustrojowe leczenie tych zwierząt DTX powoduje wyczerpanie wszystkich komórek CD11c+. CD11c jest integryną i jako receptor powierzchniowy komórki dla wielu różnych rozpuszczalnych czynników, bierze udział w procesach aktywacji i dojrzewania, głównie w komórkach linii monocytowej17. W związku z tym mysi model CD11c.DTR był intensywnie wykorzystywany do badania roli komórek dendrytycznych i podzbiorów makrofagów w kontekście wielu różnych pytań immunologicznych. Z biegiem czasu doniesiono, że myszy CD11c.DTR leczone ogólnoustrojowo DTX mogą powodować niepożądane skutki uboczne i mogą wykazywać znacznie podwyższone wskaźniki śmiertelności18,19. Niedawno udało nam się zidentyfikować podstawową przyczynę zgonu15, opisując rozwój piorunującego zapalenia mięśnia sercowego po dotchawczym zastosowaniu DTX u tych zwierząt. Prowokacja toksyną spowodowała zniszczenie komórek, w tym w centralnych częściach systemu przekazywania bodźców w sercu. Towarzyszył temu masywny naciek leukocytów CD45+, co ostatecznie doprowadziło do śmiertelnych zaburzeń rytmu serca. W tym przypadku ważny był nie tylko wygląd populacji leukocytów, ale także jej rozmieszczenie przestrzenne wewnątrz serca. To eksperymentalne pytanie jest wyzwaniem dla nowoczesnego obrazowania mikroskopowego, które rozwiązaliśmy za pomocą mikroskopii świetlnej, która jest wspierana przez barwienie przeciwciał dożyciowych i protokół optycznego usuwania na bazie rozpuszczalnika organicznego.

<table><tbody><tr><td>Toksyna błonicza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Biochrom</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>ketamina [50 mg/mL]</td><td>Inresa</td><td>PZN 4089014</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna [2 %]</td>Strzykawka <td>Ceva</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td>REF 9161502</td><td>Braun Omincan F&nbsp;</td></tr><tr><td>Cewnik żylny zamieszkany&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 381923</td> Półmaska oddechowa dla małych zwierząt <td>BD Insyte Autoguard</td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0044</td><td>Przeciwciało MiniVent</td></tr><tr><td>anit-CD45 (AF647)</td><td>BioLegend</td><td>103124</td><td></td></tr><tr><td>dwuwodny sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td> Cewnik <td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>(21 G)</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 387455</td><td>BD valu-set</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Rurka PE Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>(5 ml)</td><td>Carl Roth</td><td>EKY9.1</td><td>Etanol Rotilabo</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>eter dibenzylowy</td><td>Rotator rurkowy Sigma-Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>MACSmix</td></tr><tr><td>agarozy (o niskim zżelowaniu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Forma A4018</td><td></td></tr><tr><td>(15 x 15 x 5 mm)</td><td>Tissue Tek</td><td>4566</td><td>Cryomold&nbsp;</td></tr><tr><td>system mikroskopów arkuszowych LaVision</td><td>Biotec</td><td></td><td>Ultramikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>korpus mikroskopu</td><td>Olympus</td><td></td><td>MVX10&nbsp;</td></tr><tr><td>obiektyw</td><td>Olympus</td><td></td><td>0.5&nbsp; NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS 5,5MP</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm OPSL (50mW) laser</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>647 nm&nbsp; laser diodowy (50mW)</td><td>Koherentne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu 3D</td><td>Bitplane</td><td></td><td>IMARIS Ver. 8.3</td></tr><tr><td>transgeniczny szczep myszy</td><td>Steffen Jung i wsp.</td><td></td><td>CD11c.DTR</td></tr><tr><td>wt szczep myszy</td><td>Envigo</td><td></td><td>Balb/c Ola Hsd J</td></tr><tr><td>Moduł laserowy</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MVPLAPO 2XC Soczewka obiektywowa</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Mikroskopia fluorescencyjna (LSFM), w połączeniu z protokołami oczyszczania chemicznego, stała się złotym standardem do analizy fluorescencyjnie znakowanych struktur w dużych próbkach biologicznych i jest ograniczona do rozdzielczości komórkowej. Tymczasem ciągłe udoskonalanie podstawowych protokołów i zwiększona dostępność specjalistycznych systemów komercyjnych umożliwiają nam badanie mikrostruktury całych narządów myszy, a nawet pozwalają na scharakteryzowanie zachowania komórek w różnych podejściach do obrazowania żywych komórek. W tym miejscu opisujemy protokół przestrzennej wizualizacji całego montażu i kwantyfikacji populacji leukocytów CD45 + w sercach myszy z zapaleniem skóry. W metodzie wykorzystano transgeniczny szczep myszy (CD11c.DTR), który, jak wykazano niedawno, służy jako solidny, indukowalny model do badania rozwoju piorunującego śmiertelnego zapalenia mięśnia sercowego, charakteryzującego się letalnymi zaburzeniami rytmu serca. Protokół ten obejmuje indukcję zapalenia mięśnia sercowego, barwienie komórek za pośrednictwem przeciwciał dożyciowych, przygotowanie narządów i LSFM z późniejszym komputerowym przetwarzaniem obrazu. Chociaż protokół jest przedstawiany jako metoda wysoce dostosowana do naszego konkretnego zagadnienia naukowego, reprezentuje plan łatwo regulowanego systemu, który może również celować w zupełnie inne struktury fluorescencyjne w innych narządach, a nawet u innych gatunków.

Przedstawiona metoda LSFM analizuje rozmieszczenie i liczbę leukocytów w sercach myszy po indukcji ciężkiego zapalenia mięśnia sercowego. Rycina 1A wyjaśnia protokół wstępnego przygotowania transgenicznych myszy CD11c.DTR do indukcji zapalenia mięśnia sercowego. Krok ten stanowi niezbędny wyzwalacz rekrutacji leukocytów do mięśnia sercowego. Po pomyślnym podaniu DTX u zwierząt w ciągu 2-4 dni rozwijają się ciężkie objawy choroby, takie jak ogólne osłabienie, anoreksja i u...

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest chemiczne udrożnienie (klarowanie) serca myszy z wywołaną arytmią serca w celu wizualizacji całego narządu i nacieku leukocytowego w sercu przy użyciu mikroskopii arkusza światła (Fluorescence Light Sheet Microscopy). Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań całych narządów dotyczące protez i struktur na poziomie rozdzielczości komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona zarówno na kwantyfikację, jak i lokalizację stanu zapalnego w całych narządach.Przedstawiamy szczegółowy wgląd w protezy neurologiczne. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy pilnie potrzebowaliśmy narzędzia do wizualizacji, aby zidentyfikować komórkowe przyczyny arytmii serca w module deplecji. Po odsłonięciu serca myszy w wieku od 8 do 10 tygodni, należy użyć cewnika 21G i wprowadzić go do prawej komory.Naciąć aortę, aby umożliwić odpływ krwi, a następnie przeprowadzić perfuzję pięcioma mililitrami PBS z dodatkiem EDTA, stosując powolne i stałe ciśnienie. Po PBS EDTA podać pięć mililitrów 4% paraformaldehydu. Po zakończeniu perfuzji, za pomocą pęsety ząbkowanej, delikatnie uchwycić utrwalone serce i lekko pociągnąć organ do góry, aby przeciąć wszystkie połączenia tkankowe.Włączając w to dopływające i odpływające tętnice oraz żyły. Następnie przechowywać serce przez cztery godziny w świeżym 4% PFA w celu dalszej fiksacji. Aby odwadnić tkankę, inkubować serce w szeregu rośniejących stężeń etanolu, w czarnych pięciomililitrowych polipropylenowych probówkach reakcyjnych w ciemności, przy stałym powolnym obracaniu na rotatorze do probówek, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.Następnie przeprowadź klarowanie tkanki poprzez inkubację w 98% dibenzyl ether przy stałej rotacji przez noc. Aby przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem światła (Light Sheet Fluorescence Microscopy), najpierw umieść odwodnione bloki agarozy w standardowym uchwycie na próbki, aby unieruchomić preparat. Następnie przenieś próbkę do uchwytu na próbki.Następnie przenieś uchwyt próbki do kuwety o odpowiedniej wielkości wypełnionej eterem dibenzylu. Użyj odpowiednich ustawień filtrów wzbudzenia i emisji, aby wykryć interesujące sygnały fluorescencji. Prawidłowe rozmieszczenie i unieruchomienie próbki jest zatem kluczowe dla zminimalizowania efektów cieniowania podczas obrazowania.Ponadto, niestabilnie zamocowany preparat może powodować artefakty ruchowe, które są trudne do usunięcia podczas postprocessingu. Po pozyskaniu wszystkich obrazów należy uruchomić odpowiednie oprogramowanie do analizy i przetwarzania obrazów 3D i 4D, a następnie wybrać funkcję surpass. Wybierz plik i otwórz, a następnie wskaż folder zawierający dane z pierwszego pozyskanego kanału, aby otworzyć stosy obrazów.Wybierz opcję edytuj i dodaj kanały, aby dodać odpowiednie dane z pozyskanych kanałów fluorescencyjnych. Następnie kliknij edytuj i wybierz właściwości obrazu, aby skorygować wymiary wokseli w osiach x, y i z. Dostosuj parametry w nowo otwartym oknie.Aby dostosować sygnały fluorescencyjne, najpierw otwórz menu edycji i wybierz opcję pokaż dostosowanie wyświetlania. W nowym oknie zostaną wyświetlone wszystkie otwarte kanały. Aby zmienić kanał autofluorescencji na skalę szarości, zaznacz kanał autofluorescencji, wybierz biały styl wyświetlania i kliknij OK.Następnie dostosuj widok, usuwając siatkę. Następnie powiększ obraz i odznacz jeden kanał. Następnie dostosuj wartość poziomu czerni, aby wykluczyć niepożądane sygnały tła, które nie reprezentują struktur próbki, a także intensywność sygnału i kontrast.Dostosuj kanał przeciwciał w odniesieniu do skorygowanego sygnału kanału autofluorescencji. W ustawieniach trybu kanału wybierz opcję wizualizacji sygnału przeciwciał za pomocą tabeli kolorów mapy ciepła. Następnie wybierz tryb mieszania, aby szczegółowo zwizualizować struktury tkankowe.Aby wirtualnie rozciąć organ przed eksportem sceny 3D, należy wybrać ikonę płaszczyzny przycinania na liście obiektów. W widoku obrazu pojawi się żółta ramka oraz biały manipulator w kształcie wrzeciona. Za pomocą myszy obracaj wrzeciono za jego cieńszy koniec, aby zmienić orientację płaszczyzny przycinania, a następnie przesuń grubszą, środkową część wrzeciona, aby wybrać pożądaną głębokość przycinania.Następnie odznacz odpowiednie pola wyboru, aby ukryć ramkę oraz manipulator i utworzyć pożądane zrzuty ekranu. Pozyskanie całego stosu obrazów, składającego się z sygnałów dwóch kanałów fluorescencyjnych, pozwala na wygenerowanie sztucznego renderingu 3D, w którym rozkład leukocytów jest przedstawiony w widoku mapy ciepła. Silnie zapalone obszary serc zwierzęcia traktowanego toksyną błoniczą można rozpoznać po ich czerwonej i białej barwie.Szczególnie w obszarach układu przewodzącego serca, takich jak pęczek przedsionkowo-komorowy i włókna Purkinjego. W przeciwieństwie do nich, serca zwierząt z grupy kontrolnej traktowanych PBS nie wykazują takiego wzorca stanu zapalnego. Po opanowaniu, technika ta umożliwia cyfrową analizę organu docelowego, od jego pobrania do wspomaganej komputerowo wizualizacji, w ciągu czterech do pięciu dni.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie emmenologii do badania wzorców dystrybucji komórkowej w całych organach myszy. Może to pomóc w analizie i leczeniu różnych patofizjologicznych zmian chorobowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować całe organy myszy do mikroskopii arkuszowej z fluorescencją (Fluorescence Light Sheet Microscopy) oraz jak generować i przetwarzać trójwymiarowe stosy danych (3D data stacks).

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Brown, A. O. i in. Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w mikrozmianach serca i późniejsza remodelacja serca. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje mikroskopową wizualizację mikrozmian bakteryjnych w tkance serca myszy. Serce myszy zakażonej Streptococcus pneumoniae jest pobierane, myte i zabiegane przed przetworzeniem w celu uzyskania przekrojów koronalnych. Te fragmenty są barwione hematoksyliną i eozyną oraz badane pod mikroskopem, aby zobaczyć bakterie zamieszkujące mikrozmiany.

Mikroskopowa wizualizacja mikrozmian bakteryjnych w tkance serca myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Obecny protokół opisuje mikroskopię fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych oraz zautomatyzowane metody wspomagane oprogramowaniem, aby wizualizować i precyzyjnie określać ilościowo proliferujące i uśpione pasożyty Trypanosoma cruzi oraz limfocyty T w nienaruszonych, oczyszczonych organach i tkankach. Techniki te zapewniają wiarygodny sposób oceny wyników leczenia i oferują nowe informacje na temat interakcji pasożyt-gospodarz.

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Poznaj metodę mikroskopii świetlnej do ilościowej wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w sercu myszy z piorunującym zapaleniem mięśnia sercowego. Ta technika umożliwia analizę całych narządów z rozdzielczością komórkową.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów