Name: Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj protokół trójwymiarowego biodrukowania kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC w hydrogelowych rusztowaniach. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i wzrost neurytów w ciągu siedmiu dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Alexowi Volkerlingowi, Martinowi Engelowi i Rachel Bleach za pomoc w opracowaniu protokołu i opinie na temat manuskryptu.

3D Bioprinted Cocultures of iPSC-Derived Neurons and Astrocytes

<ol><li>Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+burden+metrics+the+innovations+of+leading+pharmaceutical+companies%3A+a+global+and+regional+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Globalization+and+Health%22%5BJournal%5D)">Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study.</a> Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).</li>
<li>Potkin, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+treatment-resistant+schizophrenia%3A+paths+to+antipsychotic+resistance+and+a+roadmap+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Schizophrenia%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research.</a> npj Schizophrenia. 6, 1(2020).</li>
<li>Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZahra%2C+W+%22Bioeconomy+for+Sustainable+Development%22">Bioeconomy for Sustainable Development</a>. , Springer, Singapore. (2019).</li>
<li>Perucca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacological+treatment+of+epilepsy%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Epileptologica%22%5BJournal%5D)">The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives.</a> Acta Epileptologica. 3 (1), 22(2021).</li>
<li>Nikolakopoulou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+translational+engineered+in+vitro+models+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system.</a> Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).</li>
<li>Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+models+of+neurodegeneration%3A+implementation+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).</li>
<li>Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+brain+extracellular+matrix+in+vitro%3A+A+review+of+current+methodologies+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Israel+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges.</a> Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).</li>
<li>Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+perineuronal+nets+and+the+perinodal+extracellular+matrix+in+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).</li>
<li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+extracellular+matrix+accelerates+the+formation+of+neural+networks+and+communities+in+a+neuron-glia+co-culture+on+a+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array.</a> Scientific Reports. 9, 4159(2019).</li>
<li>Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+maintain+the+expression+of+neural+stem+cell-associated+glycoepitopes+and+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix.</a> Cells. 11 (5), 760(2022).</li>
<li>Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+to+study+extracellular+matrix+development+during+neural+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration.</a> Cells. 8 (3), 242(2019).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+hyaluronic+acid-based+cell-laden+scaffold+for+brain+microenvironment+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Design+and+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation.</a> Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).</li>
<li>Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+3D+hydrogels+for+personalized+in+vitro+human+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165(2018).</li>
<li>Ma, J., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+mechanism+of+three-dimensional+hydrogel+system+in+regulating+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).</li>
<li>Belfiore, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+3D+cell+culture+models+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876(2021).</li>
<li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).</li>
<li>Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+high+throughput+drug+discovery+in+3D+cell+cultures+through+a+novel+bioprinting+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow.</a> SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).</li>
<li>Takamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+age+on+global+and+regional+brain+stiffness+in+young+and+middle-aged+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).</li>
<li>Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328(2020).</li>
<li>de Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+variability+examined%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Organoid variability examined.</a> Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).</li>
<li>Hernández, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+variabilities+of+human+iPSC-derived+cerebral+organoids+are+a+major+issue+for+the+modelling+of+phenotypes+observed+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Review+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease.</a> Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPS+cells+into+sensory+neurons+exhibits+developmental+stage-specific+cryopreservation+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960(2021).</li>
<li>Nishiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+and+efficient+method+for+cryopreservation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+stem+and+progenitor+cells+by+a+programmed+freezer+with+a+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field.</a> Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).</li>
<li>Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+recovery%3A+Freezing+and+thawing+optimization+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells.</a> Cells. 11 (5), 799(2022).</li>
<li>Harbom, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+rho+kinase+inhibition+on+morphological+and+electrophysiological+maturity+in+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons.</a> Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).</li>
<li>Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+neurite+outgrowth+using+nano-structured+scaffolds+coupled+with+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin.</a> Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).</li>
<li>Tarus, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+hyaluronic+acid+hydrogels+to+promote+neurite+outgrowth+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).</li>
<li>Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiative+Cell+Census+Network+%28BICCN%29.+A+multimodal+cell+census+and+atlas+of+the+mammalian+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).</li>
<li>Dauchy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+transcriptional+regulation+of+ABC+transporters+and+cytochromes+P450+in+hCMEC%2FD3+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
<li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain%3A+A+review+of+150+years+of+cell+counting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+stem+cell-derived+central+nervous+system+cells+enables+astrocyte+growth%2C+vasculogenesis+and+enhances+neural+differentiation%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+deterministic+forward+programming+of+human+pluripotent+stem+cells+into+neurons%2C+skeletal+myocytes%2C+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
</ol>

CW, NC i JB są pracownikami Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, Londyn, Wielka Brytania. YH jest pracownikiem Merck Sharp & Dohme LLC, spółki zależnej Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
Rysunek pierwszy został utworzony przy użyciu Biorender.com.

Zapotrzebowanie na dokładne modele OUN nigdy nie było większe, a ograniczenia dwuwymiarowych (2D) tradycyjnych modeli hodowli komórkowych doprowadziły w ostatnich latach do generacji złożonych modeli OUN19. Jednak wiele złożonych modeli 3D, które reprezentują interakcje między typami komórek nerwowych a ECM, ma ograniczenia, które uniemożliwiałyby zastosowanie tych modeli w procesach przemysłowych 6,20,21. W tym protokole opracowujemy model kokultury 3D ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC, który ma na celu rozwiązanie niektórych z tych ograniczeń przy użyciu technologii biodruku 3D w celu stworzenia bioaktywnego rusztowania hydrożelowego w formatach 96-dołkowych i 384-dołkowych.
Metodologia opracowywania tych modeli została uproszczona dzięki oprogramowaniu do projektowania map płyt, automatycznie generowanym protokołom drukowania i sterowanemu procesowi drukowania z biodrukarki. Jednak ze względu na wrażliwy charakter wrażliwych typów komórek pochodzących z iPSC stosowanych w tym protokole, należy zachować ostrożność podczas następujących krytycznych etapów rozmrażania i hodowli. Po pierwsze, włączenie inhibitora ROCK (ROCKi) ma kilka zalet w całym procesie biodrukowania i podczas wczesnej hodowli. Rozmrażanie komórek jest punktem krytycznym, w którym neurony mogą doświadczyć reakcji na stres, a niewłaściwe protokoły rozmrażania mogą zmniejszyć szanse na przeżycie22. Zazwyczaj zaleca się rozmrażanie komórek, dodawanie pożywki i podnoszenie ich do temperatury inkubatora tak efektywnie, jak to możliwe23. Jednak podczas procesu biodrukowania opisanego w tym protokole konieczne jest, aby neurony i astrocyty zostały ponownie zawieszone w roztworze aktywatora, a nie w pożywce, a komórki nie zostaną podniesione powyżej temperatury pokojowej do końca cyklu drukowania (do 30 minut po rozmrożeniu). W związku z tym dodanie ROCKi do pożywki natychmiast po rozmrożeniu i włączenie go podczas dwóch etapów wirowania (kroki 2.1-2.7 i 1.3.15-1.3.20) jest niezbędne do zahamowania szlaków stresu komórkowego, co skutkowałoby niższymi poziomami żywotności24. Ponadto wykazano, że ROCKi sprzyja wzrostowi neurytów i poprawia dojrzewanie neuronów25. W związku z tym suplementacja ROCKi jest kontynuowana przez 48 godzin po bioprintingu. Konieczne jest jednak usunięcie suplementacji ROCKi po 48 godzinach, aby zapewnić całkowite zmycie podczas kolejnych zmian pożywki przed użyciem komórek do testu.
Kolejnym krokiem, który wymaga krytycznej uwagi, jest dodawanie i zmiana nośnika po druku (kroki 2.8-2.13). Rusztowanie hydrożelowe z nadrukiem biologicznym ma równoważną sztywność biomechaniczną wynoszącą zaledwie 1,1 kPa, co odpowiada istocie szarej. Jak opisano w kroku 2.10, bardzo ważne jest, aby delikatnie pipetować bok studzienki podczas dodawania i aspiracji pożywki, aby zapobiec zakłóceniom. Ma to szczególne znaczenie w przypadku płytek 384-dołkowych, w których poziom żelu zajmuje większą część całkowitej objętości studzienki. Metoda ta powinna być również stosowana w studzienkach kontrolnych 2D, aby zapobiec podnoszeniu się krawędzi komórek i ścinaniu wyrostków neurytów. Autorzy chcieliby również podkreślić znaczenie sterylnej techniki w biodrukarce, która powinna być traktowana z taką samą ostrożnością, jak w przypadku komory bezpieczeństwa biologicznego używanej do hodowli komórek pochodzących z iPSC. Obejmuje to sterylne filtrowanie 70% EtOH i dH2O stosowane w procedurach zielonego oświetlenia i drukowania, utrzymywanie pokrywek na wkładach i płytach podczas wsuwania i wysuwania rąk z biodrukarki oraz odkażanie powierzchni wewnątrz biodrukarki za pomocą chusteczek z 70% etanolu przed i po drukowaniu.
Rusztowanie hydrożelowe z nadrukiem biodrukowanym, uformowane z roztworów biotuszu i aktywatora, wybrane do opracowania tego modelu, jest wybierane z szeregu roztworów biotuszy i aktywatorów opracowanych przez Inventia Life Science do użytku w biodrukarce RASTRUM. Laminina i kwas hialuronowy zostały zidentyfikowane jako cząsteczki mające znaczenie dla dojrzewania neuronów pochodzących z iPSC ze względu na ich rolę w prowadzeniu aksonów, tworzeniu synaps i tworzeniu sieci okołoneuronalnej26,27. Ponadto wybrano sztywność biomechaniczną wynoszącą 1,1 kPa, ponieważ wykazano, że hydrożele o mniejszej gęstości umożliwiają lepszy wzrost neurytów z neuronów12. Jeśli do protokołu zostaną wprowadzone modyfikacje przy użyciu neuronów i astrocytów, które zostały zróżnicowane wewnętrznie lub od innego komercyjnego dostawcy, zaleca się wykonanie testu selekcyjnego macierzy w celu określenia najbardziej wspierającego rusztowania hydrożelowego15. Co więcej, może być również konieczna optymalizacja gęstości komórek, jeśli zostaną wprowadzone zmiany w źródłach komórek, aby zapewnić optymalną żywotność i zapobiec przepełnieniu hydrożelu. W przypadku wszelkich modyfikacji i rozwiązywania problemów związanych z funkcją biodrukarki autorzy zalecają skontaktowanie się z producentami i odniesienie się do protokołów producenta.
OUN zawiera szeroki zakres podtypów neuronów i komórek glejowych, z których wszystkie istnieją w różnych niszach mózgu i pełnią określone role przyczyniające się do funkcjonowania neuronów28. W kontekście tego szerokiego zakresu model ten reprezentuje tylko dwa najliczniejsze typy komórek (astrocyty i pobudzające neurony glutaminergiczne). Ważne typy komórek, takie jak mikroglej, oligodendrocyty i komórki śródbłonka tworzące barierę krew-mózg, są pomijane w tym systemie. Włączenie mikrogleju może mieć znaczenie w skupieniu się na interakcjach neuroimmunologicznych, a oligodendrocyty mogą być interesujące w chorobach, które wpływają na centralną mielinizację. Oprócz swojej roli w patologii, komórki, takie jak komórki śródbłonka tworzące barierę krew-mózg, wydzielają enzymy metabolizujące leki, co może wpłynąć na wykorzystanie tego modelu do testów farmakokinetycznych29. Kolejnym ograniczeniem modelu może być stosunek astrocytów do neuronów; Stosunek astrocytów do neuronów różni się znacznie w zależności od regionu mózgu, z sugerowanymi wartościami od 1:1 do 1:3 30,31. Ten model ma przybliżony stosunek astrocytów 1:1,5 do neuronów; W związku z tym model ten może nie mieć znaczenia dla modelowania obszarów mózgu, w których astrocyty są liczniejsze, takich jak obszaryistoty białej 30.
W ostatnich latach opublikowano inne protokoły opracowywania biodrukowanych modeli kokultury 3D. W publikacji Sullivan i in., 2021, przedstawiono biodrukowany model neuronowy 3D przy użyciu nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC, który wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i poprawę funkcji neuronów w porównaniu z kulturami2D 32. Jednak w tym protokole neuronalne komórki progenitorowe zostały wykorzystane jako źródło komórek i były utrzymywane w hodowli przez 4 tygodnie. W tym protokole wykorzystano dostępne na rynku neurony glutaminergiczne i astrocyty pochodzące z iPSC. Pozwala to na stworzenie sieci 3D współhodowanych komórek w ciągu zaledwie 7 dni; Jak wykazano w analizie wzrostu neurytów, wzrost neurytów rozpoczyna się w ciągu 24 godzin i trwa w sposób liniowy przez cały okres 156 godzin, w którym monitorowano wzrost komórek. Szybkie tworzenie tych sieci można częściowo przypisać wykorzystaniu neuronów glutaminergiczne, które wykorzystują zoptymalizowaną ekspresję genu NGN2 indukowaną doksycykliną, która wykazuje ekspresję dojrzałych markerów podtypu neuronalnego w ciągu 7 dni, nawet w hodowli2D 33. Skrócenie tego okresu wzrostu przy użyciu tej techniki jest ważne dla wdrażania modeli w przemyśle biofarmaceutycznym, ponieważ opracowanie testu wymaga szybkiej realizacji i opracowania modeli komórkowych15.
Podsumowując, model ten wykazuje potencjał dla modelu 3D neuronów i astrocytów, który jest szybko i wygodnie ustalany do celów przesiewowych. Przyszłe zastosowania tego typu modelu mogą dotyczyć prac nad odkrywaniem leków na różne choroby OUN, z możliwością rozszerzenia na różne choroby przy użyciu linii iPSC pacjenta lub choroby z edytowanymi genami. Co więcej, zastosowanie neuronów glutaminergicznego pochodzących z iPSC o ekspresji NGN2 indukowanej doksycykliną pozwala komórkom osiągnąć dojrzałość w krótszym czasie, co można wykorzystać do opracowania modeli starzejącego się mózgu do badań nad neurodegeneracją. System ten można również rozszerzyć poprzez wykorzystanie dodatkowych typów komórek w kokulturze, w tym mikrogleju i oligodendrocytów.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated from:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD R&#38;D Innovation Centre Ltd 
2Merck &#38; Co., Inc.
to:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD Research Laboratories, London, UK 
2Merck &#38; Co., Inc., Rahway, NJ, USA

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

Badania nad chorobami ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w przemyśle poszukiwania nowych leków dynamicznie się rozwijają1. Jednak wiele powszechnych chorób OUN, takich jak epilepsja, schizofrenia i choroba Alzheimera, wciąż nie posiada metod leczenia prowadzących do całkowitego wyleczenia2,3,4. Brak skutecznych terapii w obrębie chorób OUN można przypisać, przynajmniej częściowo, brakowi dokładnych modeli mózgu in vitro5. Doprowadziło to do powstania luki translacyjnej między obecnymi modelami in vitro a danymi in vivo i w konsekwencji do zahamowania postępów w wysiłkach badawczych.
Wobec tej luki translacyjnej w ostatnich latach odnotowano znaczny wzrost rozwoju nowych trójwymiarowych (3D) modeli komórkowych, w tym organoidów neuronalnych, neurosferoidów oraz modeli opartych na rusztowaniach6. Struktura 3D tych modeli pomaga w odtworzeniu mikrośrodowiska neuronalnego, w tym naprężeń biomechanicznych, kontaktów międzykomórkowych oraz macierzy pozakomórkowej (ECM) mózgu7. Macierz ECM mózgu jest dynamicznym elementem neurofizjologii, który wypełnia przestrzeń między typami komórek neuronalnych, w tym neuronami, astrocytami, oligodendrocytami i jednostką neuronaczyniową7. Wykazano, że odtworzenie ECM mózgu wpływa na morfologię i aktywność elektryczną neuronów, a wiele złożonych modeli 3D mózgu wykazało odkładanie białek ECM przez typy komórek neuronalnych8,9,10,1. Modele oparte na rusztowaniach składają się z dojrzałych kokultur neuronalnych zawieszonych w porowatej syntetycznej lub biologicznej macierzy hydrożelowej, która reprezentuje ECM mózgu12. W przeciwieństwie do systemów organoidów i sferoidów, modele 3D oparte na rusztowaniach umożliwiają dostosowanie składu obecnych białek ECM oraz oferują dodatkową zaletę w postaci możliwości regulacji sztywności hydrożelu w celu naśladowania naprężeń biomechanicznych13,14.
Chociaż zdecydowana większość trójwymiarowych modeli neuronalnych wykazuje lepsze odtworzenie mikrośrodowiska mózgu, nie wszystkie modele są odpowiednie do zastosowań w odkrywaniu leków15. Aby model 3D mógł zostać wdrożony w procesach przemysłowych, system musi spełniać wymagania dotyczące przepustowości dla aplikacji przesiewowych oraz charakteryzować się stosunkowo krótkim czasem opracowania16. Biodruk 3D jest nową technologią, która oferuje potencjał tworzenia opartych na rusztowaniach modeli neuronalnych 3D z krótkim czasem opracowania, zwiększoną przepustowością i wyższym poziomem precyzyjnej kontroli, przy jednoczesnym wyeliminowaniu zmienności spowodowanej błędem ludzkim17. Niniejszy protokół przedstawia model kokultury 3D pochodzących z ludzkich iPSC neuronów glutaminergicznych i astrocytów w rusztowaniu hydrożelowym. To rusztowanie hydrożelowe zawiera fizjologicznie reprezentatywne peptydy bioaktywne (RGD, IKVAV, YIGSR) oraz białka ECM o biomimetycznej sztywności biomechanicznej. Te pełnowymiarowe białka ECM obejmują pełnowymiarową lamininę-21 i kwas hialuronowy, obficie występujące w ludzkiej korze, z sztywnością 1,1 kPa, zgodną z pomiarami in vivo18. Model ten został zaprojektowany z myślą o praktyczności w odkrywaniu leków i jest&#160;tworzony za pomocą biodrukarki 3D w formacie płytek 96- lub 384-dołkowych, odpowiednim dla analiz przesiewowych z wykorzystaniem technik obrazowania z barwnikami komórkowymi i przeciwciałami, a także testów wzrostu neurytów. Komórki wykazują ekspresję markerów typów komórek neuronalnych oraz wzrost wypustek neurytów i astrocytów w ciągu 7 dni hodowli. Tym samym, niniejszy protokół przedstawi metodologię opracowania wysokoprzepustowego modelu kokultury neuronalnej 3D do zastosowań w odkrywaniu leków.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Ilustracyjny przegląd metodologii stosowanej do biodruku 3D kokultur. Neurony i astrocyty pochodzące z ludzkich iPSC są łączone z roztworami aktywatora i bioatramentu zawierającymi bioaktywne peptydy, a następnie biodrukowane na rusztowaniach hydrożelowych w formatach 96- lub 384-dołkowych przy użyciu technologii biodruku kroplowego (drop-on-demand). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>płytka 384-dołkowa</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>PerkinElmer</td><td>6055300</td><td></td></tr><tr><td>Aktywator płynu F299</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Aktywator płynu F3</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x) minus Vit A</td><td>Thermofisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do biotuszu F261</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do biotuszu F32</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A Hyklalat</td><td></td></tr><tr><td>doksycykliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5207</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG H& L Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150115</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG H& L Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Abcam</td><td>ab228551</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rekombinowane białko BDNF</td><td>Thermofisher</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane NT3</td><td>Thermofisher</td><td>PHC7036</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyty iCell</td><td>Analizator dźwięku Fujifilm CDI</td><td>1434</td><td></td></tr><tr><td>INCell 6500HS</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td>system obrazowania o wysokiej zawartości</td></tr><tr><td>Incucyte S3</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ioGlutamatergiczne neurony (duża fiolka)</td><td>Bit.bio</td><td>e001</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (1 mg / ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy zestaw (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Mysia tubulina anty-BIII NL637 sprzężona</td><td>R& Systemy D</td><td>SC024</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live (Hoechst 33342)</td><td>Thermofisher</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermofisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PEI 50% w H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181978</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Borate Buffer 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28341</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Królik antyjonotropowy receptor glutamamatre 2 (GluR2)</td><td>Abcam</td><td>ab206293</td><td></td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) Bioprinter</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>Bioprinter</td></tr><tr><td>Wkłady do biodrukarki RASTRUM(TM)</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>Wkłady do biodrukarki</td></tr><tr><td>RASTRUM(TM) Płytka celownicza</td><td>Inventia Life Science</td><td>N/A</td><td>Płytka celownicza</td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho (ROCK)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Owca anty-GFAP NL493 sprzężona</td><td>R& D systems</td><td>SC024</td><td></td></tr><tr><td>Sygnały Artysta Obrazu&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Platforma do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Platforma mikroskopu odwróconego&nbsp;</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z ipsc do zastosowań przesiewowych

Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

Aby model komórkowy był użyteczny do badań przesiewowych leków, system musi spełniać wymagania dotyczące przepustowości i jednorodności, a także mieć efektywny czas rozwoju. Jednak wiele opublikowanych modeli 3D nie spełnia tych kryteriów. Ogranicza to zatem ich przydatność we wczesnych zastosowaniach związanych z odkrywaniem leków. Biodruk trójwymiarowy (3D) to nowatorska technologia, którą można zastosować do opracowywania modeli 3D w celu przyspieszenia czasu opracowywania, zwiększenia standaryzacji i zwiększenia przepustowości. Tutaj przedstawiamy protokół opracowywania biodrukowanych w 3D modeli kokultury neuronów glutaminergicznego i astrocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kokultury te są osadzone w hydrożelowej matrycy bioaktywnych peptydów, białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) o pełnej długości i o fizjologicznej sztywności 1,1 kPa. Model można szybko wprowadzić w formaty 96-dołkowe i 384-dołkowe, a średnia żywotność po wydrukowaniu wynosi 72%. Wykazano, że stosunek astrocytów do neuronów w tym modelu wynosi 1:1,5, co mieści się w fizjologicznym zakresie dla ludzkiego mózgu. Te biodrukowane w 3D populacje komórek wykazują również ekspresję markerów dojrzałych komórek nerwowych oraz wzrost projekcji neurytów i astrocytów w ciągu 7 dni od hodowli. W rezultacie model ten nadaje się do analizy przy użyciu barwników komórkowych i technik barwienia immunologicznego wraz z testami wzrostu neurytów. Możliwość tworzenia tych fizjologicznie reprezentatywnych modeli na dużą skalę sprawia, że idealnie nadają się one do stosowania w średnio- i wysokoprzepustowych testach przesiewowych dla celów neurobiologicznych.

Analiza wzrostu neurytów 
W niniejszym protokole pochodne iPSC neurony glutaminergiczne i astrocyty zostały wydrukowane biopotencjalnie w kokulturze w matrycy hydrożelowej przy użyciu biodrukarki 3D. W ciągu pierwszych 7 dni po drukowaniu komórki obrazowano co 12 h za pomocą mikroskopu do żywych komórek. Po biodruku komórki powinny mieć zaokrągloną morfologię i być rozproszone w całej matrycy hydrożelowej, stopniowo zmieniając się w mniejsze skupiska komórkowe z niewielkimi wypustkami w ciągu pierwszych kilku dni hodowli (patrz Supplementary&#160;Video 1 w celu zobaczenia reprezentatywnego wzrostu zdrowych komórek). Do 4. dnia zdrowe komórki migrują przez żel, tworząc większe skupiska połączone wypustkami neurytów. Do 7. dnia prawie nie powinno pozostać pojedynczych komórek, łączące się wiązki neurytów i projekcje astrocytarne powinny wydawać się wzmocnione, a ze skupisk powinny być widoczne liczne mniejsze wypustki neurytów (Rycina 2A). Wykorzystując serię obrazów w jasnym polu żywych komórek wykonanych w ciągu 7-dniowego okresu wzrostu, przeprowadzono analizę wyrastania neurytów, zgodnie z opisem w sekcji 3. Analiza ta wykazała, że wyrastanie neurytów zwiększa się w sposób niemal liniowy (wartość R2 = 0,84) między 12 h a 156 h (Rycina 2B). W tym okresie wyrastania neurytów wielkość skupisk ciał komórkowych również wzrasta (patrz Supplementary&#160;Video 1), co świadczy o migracji komórek w obrębie hydrożelu.
Żywotność komórek i stosunek populacji 
W niniejszym protokole do biodrukowania modeli komórkowych zastosowano stężenie 20 milionów komórek/mL, składające się z 15 milionów neuronów/mL i 5 milionów astrocytów/mL. Wykorzystując barwienie żywych komórek kalceiną-AM (komórki żywe), etydinium homodimerem-1 (komórki martwe) oraz barwnikiem jądrowym, liczbę komórek przeżywających w okresie 7 dni można obliczyć zgodnie z sekcją 4 (Rysunek 3A). Wyniki żywotności komórek dla reprezentatywnych kultur przedstawiono dla dnia 4., w którym 72% ± 1% (średnia ± SEM) wszystkich komórek są żywe i wykazują barwienie kalceiną-AM, podczas gdy 29% ± 2% (średnia ± SEM) wszystkich komórek są martwe i wykazują barwienie etydinium homodimerem-1 (Rysunek 3B). Reprezentatywne obrazy barwienia komórek kalceiną-AM i etydinium homodimerem-1 znajdują się na Rysunku uzupełniającym 1. Należy zauważyć, że wartości przeżywalności komórek dla kultur 3D nie mogą być bezpośrednio porównywane z kulturami 2D, ponieważ martwe komórki zostają zatrzymane w hydrożelu i nie są usuwane podczas procesów dokarmiania komórek.
Zastosowanie barwienia immunofluorescencyjnego dla &#914;tubulinę $\beta$-III oraz GFAP, zgodnie z opisem w sekcji 5 oraz w Rysunek 4można przeprowadzić analizę obrazu w celu określenia proporcji populacji komórek między neuronami a astrocytami (Rysunek&#160;3A). Z całkowitej liczby komórek na model w reprezentatywnych kulturach, &#914;Neurony wykazujące pozytywny wynik w kierunku $\beta$-III tubuliny stanowią 49% &#177; 3% (średnia &#177; SEM), podczas gdy astrocyty wykazujące pozytywną ekspresję GFAP stanowią 30% &#177; 4% (średnia &#177; (SEM). Daje to stosunek astrocytów do neuronów wynoszący odpowiednio 1:1,5. Pozostawia to pozostałość w postaci 21% całkowitej liczby komórek na model, które nie wykazują barwienia dla żadnego z markerów komórkowych. Ponieważ analiza żywotności komórek wykazała, że w 4. dniu średnio 29% komórek nie jest żywotnych, prawdopodobne jest, że komórki te obumarły wewnątrz hydrożelu.
Ekspresja markerów komórkowych 
Morfologię biodrukowanych neuronów i astrocytów oceniono za pomocą immunostainingu z użyciem markera specyficznego dla typu komórek neuronalnych (&#914;-III tubuliny) i marker astrocytarny (GFAP). Na przedstawionych reprezentatywnych hodowlach immunobarwienie jest zlokalizowane w poszczególnych typach komórek, wykazując prawidłową morfologię komórkową, przy czym oba typy komórek wykazują wzrost wypustek komórkowych (Rycina 4A,B). Ponieważ struktury hydrożelu i komórek są trójwymiarowe, każdy obraz przedstawia jedynie jeden przekrój przez strukturę w Rycina 4A,B. Rycina 4C przedstawia połączony stos obrazów z całego hydrożelu, demonstrując lokalizację komórek w płaszczyznach X, Y i Z. Rycina 4D wykazuje immunostaining dla &#914;-tylko tubulina III; uwidaczniając drobniejsze wypustki neurytów wyrastające z skupisk ciał komórkowych. Aby dokładniej zbadać fenotyp neuronów glutaminergicznych, można przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne z użyciem GluR2, markera jonowego receptora glutaminergicznego. W obrębie Rycina 4Eobszar 4E.1 (wstawka) została wyróżniona, aby ukazać wyższą rozdzielczość punktowego barwienia wzdłuż pęczków neurytów. Potwierdza to zatem, że neurony w tej kokulturze wykazują fenotyp glutaminergiczny. Na wszystkich obrazach z barwienia immunohistochemicznego wokół skupisk komórek i neurytów widoczne są immunofluorescencyjnie zabarwione struktury niekomórkowe. Prawdopodobnie struktury te stanowią resztki zatrzymane w hydrożelu w połączeniu z niewielką ilością nieswoistego wiązania przeciwciał z hydrożelem. Jest to zjawisko oczekiwane w kulturach biodrukowanych, ponieważ w modelach z rusztowaniem 3D martwe komórki i resztki nie są usuwane podczas dokarmiania komórek. Reprezentacyjny obraz negatywnej kontroli barwienia immunohistochemicznego przedstawiono w Rycina uzupełniająca 2 do demonstracji niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych przez hydrożel.
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Neurony glutaminergiczne i astrocyty zostały wydrukowane biologicznie w macierzy hydrożelowej przy użyciu biodrukarki, a następnie obrazowane co 12 h za pomocą mikroskopu w polu jasnym. (A) Przykład obrazu w polu jasnym wykonanego z kultur komórkowych podczas analizy. Obraz przedstawia punkt czasowy 156 h, a pasek skali odpowiada 40 µm. (B) Średnia długość wypustek neurytowych (µm) z kultur, zmierzona przy użyciu pakietu NeuronJ dla programu ImageJ. Każdy punkt danych odpowiada n = 3 neurytom, a dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig03v2.jpg" /> 
Rycina 3: Do biodrukowania modeli komórkowych wykorzystano stężenie 20 milionów komórek/mL roztworu aktywatora. (A) Żywotność komórek obliczono przy użyciu barwników do komórek żywych/martwych (odpowiednio Calcein-AM i etydium homodimer-1). Wartości wskazują, że w 4 dniu 72% ± 1% (średnia ± SEM, n = 3) całkowitej liczby komórek na studzienkę są żywe, a 29% ± 2% (średnia ± SEM, n = 3) całkowitej populacji komórek na studzienkę są martwe. Przedstawione wartości stanowią średnią ± SEM. (B>) Procentowy udział populacji neuronów i astrocytów na studzienkę obliczono poprzez analizę obrazu barwień przedstawionych na Rycini 4. Neurony stanowią odsetek komórek wykazujących pozytywne barwienie na Β-III tubulinę w 7 dniu (49% ± 3%, średnia ± SEM, n = 3), natomiast astrocyty stanowią odsetek komórek wykazujących pozytywne barwienie na GFAP w 7 dniu (30% ± 4%, średnia ± SEM, n = 3). Przedstawione wartości stanowią średnią ± SEM. Wszystkie obrazy wykorzystane do obliczeń przedstawionych na Rycini 3 zostały wykonane w systemie obrazowania konfokalnego, a wszystkie analizy przeprowadzono na platformie analizy obrazu oraz w programie GraphPad Prism zgodnie z opisanymi metodami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Ekspresja markerów typów komórek neuronalnych w biodrukowanych 3D kokulturach neuronów glutaminergicznych i astrocytów w 7. dniu. (A,B) Barwienie immunofluorescencyjne markeru neuronalnego Β-III tubuliny oraz markeru astrocytów GFAP, obrazowanie wykonane na platformie mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 10x. Paski skali odpowiadają 10 µm. (C) Barwienie immunofluorescencyjne markeru neuronalnego β-III tubuliny i markeru astrocytów GFAP z jednoczesnym barwieniem Hoechst, widok w płaszczyźnie XYZ, obrazowanie wykonane w systemie konfokalnym przy powiększeniu 10x. Przygotowano na platformie analizy obrazów. Pasek skali odpowiada 10 µm. (D) Barwienie immunofluorescencyjne markeru neuronalnego β-III tubuliny z jednoczesnym barwieniem Hoechst, obrazowanie wykonane w systemie konfokalnym przy powiększeniu 20x. Pasek skali odpowiada 10 µm. (E) Barwienie immunofluorescencyjne markeru glutaminergicznego GluR2 z jednoczesnym barwieniem Hoechst, obrazowanie wykonane na platformie mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 10x. Pole 3E.1 przedstawia powiększone obszary barwienia GluR2. Pasek skali odpowiada 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo uzupełniające 1: Neurony glutaminergiczne i astrocyty zostały wydrukowane biologicznie w macierzy hydrożelowej przy użyciu biodrukarki, a następnie obrazowano je co 12 h za pomocą mikroskopu w świetle przechodzącym. Nagranie obrazów z mikroskopu w świetle przechodzącym wykonanych kultur komórkowych podczas analizy; punkty czasowe są wskazane w prawym dolnym rogu, a paski skali reprezentują 40 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary Video 1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Przykładowe obrazy analizy żywotności/śmierci biodrukowanych neuronów i astrocytów w 4. dniu. Barwienie kalceiną-AM przedstawione na zielono (48 nm) oraz barwienie etydinium homodimerem przedstawione na czerwono (647 nm). Obraz pokazano w rzucie płaszczyzny XYZ, utworzonym na platformie analizy obrazu. Pasek skali odpowiada 10 µm. (A) Obrazowanie wykonano przy użyciu konfokalnego systemu obrazowania przy powiększeniu 4x. (B) Obrazowanie wykonano przy użyciu konfokalnego systemu obrazowania przy powiększeniu 10x <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary Figure 1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Przykład obrazu kontroli negatywnej po barwieniu immunofluorescencyjnym. Pominięto przeciwciała pierwotne, a zielone (48 nm) i czerwone (647 nm) przeciwciała wtórne zastosowano zgodnie z protokołami immunobarwienia. Obraz przedstawiono w widoku płaszczyzny XYZ, utworzonym na platformie do analizy obrazów. Pasek skali reprezentuje 10 µm. Obrazowanie wykonano przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego przy powiększeniu 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary Figure 2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji 3D-drukowanych biologicznie kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC. Ten model kokultury, wygenerowany w rusztowaniu hydrożelowym w formatach 96- lub 384-dołkowych, wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i wzrost neurytów w ciągu 7 dni oraz pokazuje ekspresję markerów dojrzałości dla obu typów komórek.

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development ...

Modelowanie komórek 3D to nowa dziedzina, która w ciągu ostatniej dekady gwałtownie się rozwinęła. Wykazano, że modele te zarówno ułatwiają wzrost neuronów, jak i dokładniej reprezentują fenotypy choroby. Uważamy jednak, że następuje zmiana w kierunku zwiększenia przepustowości tych modeli i konieczność uwzględnienia automatyzacji w programowaniu.Tradycyjne metody opracowywania kultur 3D mogą być pracochłonne i czasochłonne do ustalenia, ale biodruk 3D to technologia, którą można zastosować do zwiększenia skali tych procesów rozwoju. Technologia ta pozwala na sprawne i pozbawione błędów ludzkich tworzenie setek identycznych modeli. Protokół ten rozwija złożone kultury, ponieważ komórki nerwowe są hodowane w 3D w biologicznie aktywnych matrycach hydrożelowych.Ale co najważniejsze, protokół ten priorytetowo traktuje szybkość i wygodę w tworzeniu modeli, których może brakować w tej dziedzinie i może utrudniać wdrożenie w przemyśle. Protokół ten definiuje metodę bardzo efektywnego ustanawiania wielu kokultur 3D przy ograniczonym udziale użytkowników. Mamy nadzieję, że usunie to bariery w stosowaniu złożonych modeli hodowli komórkowych w testach wysokoprzepustowych i ułatwi dalsze badania wpływu hodowli 3D na typy komórek nerwowych.

three-dimensional-bioprinting-human-ipsc-derived-neuron-astrocyte

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje metodę generowania astrosfer z komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Polega na wzroście i proliferacji komórek macierzystych z pożywkami zawierającymi czynniki wzrostu i inhibitory kinaz. Komórki te następnie agregują się i różnicują w astrocyty, tworząc astrosfery.

Generowanie i utrzymywanie astrosfer przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film demonstruje procedurę kokulturacji astrocytów i neuronów w celu utworzenia sfer 3D. Te sfery 3D stanowią odrębną platformę do badania tworzenia synaps i integracji sieci neuronowych, służąc tym samym jako potencjalny model do badań w neuronauce rozwojowej, chorobach neurodegeneracyjnych i interwencjach neurofarmakologicznych.

Generowanie 3D sfer kokulturowych astrocytów i neuronów w celu indukowania tworzenia synaps

Wideo pokazuje proces tworzenia biodrukowanego konstruktu 3D przy użyciu astrocytów zawieszonych w roztworze biotuszu. Biodrukowany konstrukt, po usieciowaniu, ułatwia adhezję astrocytów i ich rozprzestrzenianie się, tworząc tkankę nerwowo-podobną.

Metoda biodruku 3D mysich astrocytów korowych

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Opisano metodę pomiaru trójwymiarowych odruchów przedsionkowo-ocznych (3D VOR) u ludzi z wykorzystaniem symulatora ruchu o sześciu stopniach swobody (6DF). Wzmocnienie oraz błąd ustawienia kątowego 3D VOR stanowią bezpośrednią miarę jakości funkcji przedsionkowej. Przedstawiono reprezentatywne dane uzyskane od zdrowych osób...

Trójwymiarowe badanie odruchu przedsionkowo-okulistycznego z wykorzystaniem platformy ruchowej o sześciu stopniach swobody

Poznaj protokół trójwymiarowego biodrukowania kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC w hydrogelowych rusztowaniach. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek i wzrost neurytów w ciągu siedmiu dni.

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

Przeglądaj więcej filmów