Name: Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj niezawodną metodę izolacji pierwotnych fibroblastów z tkanki pochwy ludzkiej, wykorzystującą mechaniczną i enzymatyczną dyssocjację. Protokół optymalizuje uzyski komórek od dawców przed- i pomenopauzalnych, wspierając badania nad patofizjologią wypadania narządów miednicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność wszystkim członkom Centrum Biologii Rozrodu im. Vincenta w Massachusetts General Hospital, a także Fundacji VIncent Memorial Hospital za ich hojne wsparcie. Specjalne podziękowania dla dr Bo Ruedy i jego laboratorium za cenne sugestie i użyczenie nam sprzętu laboratoryjnego.

Tkanka pochwy została pobrana od kobiet poddawanych operacji wypadania narządów miednicy. Tkanka pochwy pobrana po operacji została uznana za odpad i w przeciwnym razie zostałaby wyrzucona. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Massachusetts General Brigham.
1. Pobranie tkanki z pochwy od pacjentki
<ol>
	<li>Zdiagnozuj wypadanie narządów miednicy, zbierając wywiad i wykorzystując wyniki badania miednicy: W klinice uzyskano pomiary ilościowe wypadania narządów miednicy (POP-Q), które wykazały oznaki wypadania narządów miednicy.</li>
	<li>Stosuj następujące kryteria włączenia: powyżej 18 roku życia, historia objawowego wypadania narządów miednicy, wybór chirurgicznej korekcji wypadania narządów miednicy.</li>
	<li>Wyklucz następujące elementy: Kobiety w ciąży i pacjenci odmawiający oddania tkanki.</li>
	<li>Przytnij nadmiar tkanki pochwy jako niezbędny etap operacji wypadania narządów miednicy. Ten nabłonek pochwy jest wycinany w całkowitej grubości po następujących operacjach: kolporrhaphy przednia, kolporrhaphy tylna i colpocleisis.</li>
	<li>Przenieś tkankę do laboratorium w sterylnym kubku do pobierania próbek z normalną solą fizjologiczną lub pożywką DMEM/F12 (Gibco) bez surowicy. Trzymaj na lodzie.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie i trawienie tkanek
<ol>
	<li>Przygotowanie tkanek
	<ol>
		<li>Zmierz i przetnij tkankę tak, aby obejmowała całą grubość nabłonka pochwy, tworząc segmenty o długości około 1 cm2.</li>
		<li>Zapewnić precyzyjny pomiar rozmiaru biopsji 1 cm2, 
		UWAGA: Przeszacowanie wielkości biopsji tkanki może upośledzać trawienie tkanek.</li>
		<li>Przygotuj 2-3 dodatkowe biopsje pochwy o wymiarach 1cm2 każda od jednego dawcy i odłóż biopsje na bok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie mechaniczne
	<ol>
		<li>Umieścić biopsję pochwy na 10-centymetrowej szalce Petriego z hodowlą komórkową. Odpipetować 500-1 000 μl pożywki bez surowicy uzupełnionej 100 j./ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny Bonto do tkanki pochwy, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.</li>
		<li>Zmiel tkankę pochwy na małe fragmenty za pomocą dwóch sterylnych skalpeli (nr 11 lub nr 15) w obu rękach.</li>
		<li>Upewnij się, że końcówki ostrzy są prostopadłe do powierzchni tkanki. Wywieraj równy i równomierny nacisk na powierzchnię tkanki za pomocą dwóch skalpeli. Wykonuj naprzemienne ciągnięcie, aby pociąć tkankę na bardzo małe kawałki.</li>
		<li>Powtarzać tę technikę mielenia przy użyciu techniki dwóch skalpeli, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy 1-2 mm. 
		UWAGA: Trawienie mechaniczne przy użyciu tej techniki biopsji 1cm2 przy użyciu dwóch skalpeli powinno zająć około 15-20 minut.</li>
		<li>Dodać 2-3 ml bezsurowicowej pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 100 j./ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B do płytki, zawieszając zmieloną tkankę. Odpipetować roztwór zawierający fragmenty tkanek w górę i w dół, aby rozbić wszelkie grudki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie enzymatyczne
	<ol>
		<li>Przenieść roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj pożywkę DMEM/F12 bez surowicy do naczynia do hodowli tkankowej, w którym tkanka pochwy została zmielona, aby zebrać wszelkie pozostałe fragmenty tkanki. Przenieść roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki. Dodaj dodatkowe podłoża DMEM/F12 bez surowicy, aż całkowita objętość wyniesie 10 ml.</li>
		<li>Rozpuścić 5 mg liberazy w 1 ml jałowej wody (5 mg/ml). Przechowywać w 230 μl porcji w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca lub w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.</li>
		<li>Dodać 230 μl liberazy (zapas 13 U/ml) do probówki, o końcowym stężeniu 0,3 U/ml. 
		UWAGA: Aktywność liberazy może się różnić w zależności od partii. Rozmrozić każdą porcję bezpośrednio przed użyciem w łaźni wodnej. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.1-2.3 dla 2-3 dodatkowych biopsji dopochwowych tego samego dawcy. 
		UWAGA: Każdy roztwór zawierający fragmenty tkanek z pojedynczej biopsji należy przechowywać w oddzielnych stożkowych probówkach. Na przykład 4 biopsje pochwy w 4 probówkach. Jest to ważne dla optymalnego granulowania komórek po odwirowaniu.</li>
		<li>Inkubować probówki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, stale i energicznie mieszając, używając mieszalnika do próbek.</li>
		<li>Umieścić mieszalnik próbek w inkubatorzeCO2. Utrzymuj stałe poruszenie. (Ustawienia mieszalnika próbek: 25 obr./min ruchu obrotowego przez 5 s, 30° ruchu posuwisto-zwrotnego (obrót przechylony) przez 5 s i 2° ruchu wibracyjnego (wirowego) przez 3 s).</li>
		<li>Podczas inkubacji wirować probówki w odstępach 30 minut.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 5 minut. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1-2 ml pożywki DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B w celu rozcieńczenia enzymu liberazy. Energicznie pipetować, aż osad zostanie całkowicie zawieszony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Usuwanie niestrawionych fragmentów tkanek
	<ol>
		<li>Umieść sitko o pojemności 100 μm na sterylnym stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową z wielu biopsji tkanek tego samego dawcy należy połączyć ze sobą.</li>
		<li>Odcedzić zawiesinę tkankową/enzymatyczną, przeciskając ją tłokiem strzykawki o pojemności 5 ml. Powtarzaj ten krok, aż pozostałe fragmenty tkanki wydają się być całkowicie przeciśnięte. 
		UWAGA: Z fragmentów tkanki pochwy może znajdować się śluz, który nie jest w pełni przepuszczany przez sitko. Wyrzuć śluz za pomocą sitka do komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Łączenie kultur komórkowych
	<ol>
		<li>Zawiesina komórek z puli płytek z wielu biopsji pochwy (od tego samego dawcy) na szalce Petriego (60 mm x 15 mm).</li>
		<li>Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Obserwuj i potwierdź obecność nieprzylegających komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.</li>
		<li>Upewnij się, że ostrość mikroskopu znajduje się na spodzie płytki. 
		UWAGA: Na pierwszym planie może znajdować się wiele komórek odpornościowych. Mniejsza liczba fibroblastów zostanie przyczepiona do dolnej części płytki.</li>
		<li>Odczekaj 18-24 godziny przed zmianą pożywki do hodowli komórkowych, aby zapewnić odpowiednie przyleganie komórek.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę hodowlaną co trzy dni, aż do wystąpienia 80% konfluencji. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, rozwiń się do większej kolby lub zamroź porcje komórek do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mirin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+disparity+in+the+funding+of+diseases+by+the+U.S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Gender disparity in the funding of diseases by the U.S.</a> J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).</li>
<li>MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+pelvic+floor+disorders+and+their+relationship+to+gender%2C+age%2C+parity%2C+and+mode+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%22%5BJournal%5D)">The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery.</a> BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+show+differential+mechanoresponses+depending+on+surface+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Rorteau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+chronological+aging+features+in+culture+of+normal+human+dermal+fibroblasts+from+old+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors.</a> Cells. 11 (5), 858(2022).</li>
<li>Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+murine+vaginal+fibroblast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines.</a> MethodsX. 7, 101100(2020).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((comparative+characterization+of+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+and+without+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).</li>
<li>Ruiz-Zapata, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+fibroblastic+cells+from+women+with+pelvic+organ+prolapse+produce+matrices+with+increased+stiffness+and+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content.</a> Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).</li>
<li>Khan, M., Gasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+fibroblast+cultures+from+mouse+ear+and+tail+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues.</a> J Vis Exp. (107), e53565(2016).</li>
<li>Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+mechanical+loading+influences+the+expression+of+extracellular+matrix+and+cell+adhesion+proteins+in+vaginal+cells+derived+from+premenopausal+women+with+severe+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse.</a> Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).</li>
<li>Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+primary+vaginal+fibroblasts+to+absorbable+and+nonabsorbable+implant+materials+coated+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Female+Pelvic+Med+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma.</a> Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).</li>
<li>Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+predictors+of+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse.</a> Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Waise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+isolate+human+fibroblasts+from+tissue+for+ex+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis.</a> Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).</li>
<li>Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+primary+foreskin+fibroblasts+to+study+cellular+damage+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction.</a> Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).</li>
<li>Da Silva Lara, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+Leading+to+Increased+Vaginal+Wall+Thickness+in+Women+with+Genital+Prolapse%3A+Impact+on+Sexual+Response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response.</a> J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).</li>
<li>Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oral+epithelial+thickness+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography.</a> Diagnostics. 9 (3), 90(2019).</li>
<li>Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+fibroblastic+differon+of+the+dermis%3A+role+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Wiele wcześniejszych badań opisywało, jak wyizolować pierwotne fibroblasty z ludzkiej pochwy 3,7. W kilku badaniach wykorzystano ludzką tkankę pochwy od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy. Chociaż kilka prac opisywało wykorzystanie tkanek od osób przed menopauzą i po menopauzie 7,11, nie opisano w nich wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznego izolowania fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie. Ściana pochwy jest grubsza u kobiet po menopauzie z wypadaniem narządów płciowych niż u kobiet przed menopauzą, co może odpowiadać za zwiększoną trudność z izolacją w tej populacji13. Skuteczna izolacja od dawców po menopauzie jest niezbędna do modelowania i badania choroby, ponieważ zaburzenia dna miednicy są najbardziej rozpowszechnione w grupach wiekowych po menopauzie lub starszych.
Opracowaliśmy protokół skutecznego i konsekwentnego pobierania i hodowli ludzkich fibroblastów pochwy od dawczyń w wieku 35-78 lat. Pochodzenie komórkowe pierwotnych komórek pochwy zostało potwierdzone przez biomarkery pochodzenia fibroblastycznego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.
Przedstawiona tu procedura izolacji fibroblastów pochwy umożliwia izolację i hodowlę pierwotnych komórek fibroblastów. Z naszego doświadczenia wynika, że zastosowanie wcześniej opublikowanych protokołów dla tkanki zwierzęcej9i ludzkiej 3,14,16 do dysocjacji komórek pierwotnych nie doprowadziło do ekstrakcji żadnych fibroblastów z próbek ludzkiej pochwy w tym badaniu14.
Postawiliśmy dwie prawdopodobne przyczyny wyzwań związanych z dysocjacją komórek od ludzkiej tkanki pochwy: (1) grubość skóry śluzowej jest większa u starszych dawców i w porównaniu z tkanką niebłonową od starszych dawców13,17, co utrudnia dysocjację komórek oraz (2) gęstość fibroblastów może być znacznie zmniejszona u osób starszych17.
Biorąc pod uwagę te wyzwania, istnieje kilka krytycznych kroków w tym protokole, które nie powinny być modyfikowane. Pierwszym krytycznym krokiem jest wdrożenie bardzo rygorystycznego trawienia mechanicznego. Tutaj stosujemy technikę dwóch skalpeli. Z naszego doświadczenia wynika, że zastąpienie nożyczkami w celu rozdrobnienia tkanki nie daje wystarczająco małych fragmentów, aby oddzielić fibroblasty od ludzkiej tkanki pochwy.
Innym krytycznym krokiem jest zebranie zawiesiny komórek i pobranie 3-4 biopsji pełnej grubości (1 cm2) od jednego dawcy. Jest to konieczne, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do dalszej hodowli. We wszystkich przypadkach pobraliśmy znacznie więcej tkanki niż 1cm2 , ponieważ nadmiar nabłonka pochwy jest przycinany jako niezbędna część operacji wypadania narządów miednicy. W tym badaniu połączyliśmy tylko zawiesiny komórek, które pochodziły od tego samego dawcy, ponieważ staraliśmy się zbadać i zróżnicować cechy komórkowe i proliferację między różnymi dawcami.
Nasz protokół ma wyraźną zaletę: trawienie mechaniczne i enzymatyczne prowadzi do lepszych plonów tkanki po menopauzie, ale nie ma negatywnego wpływu na próbki przed menopauzą.
Zdajemy sobie sprawę z kilku ograniczeń naszego protokołu. Dostęp do ludzkiej tkanki pochwy może być trudny w sytuacjach, gdy operacja wypadania pochwy nie jest wykonywana. Ograniczeniem może być również konieczność łączenia zawiesin komórkowych z wielu próbek biopsji tkanek.
Podsumowując, ten protokół pozyskiwania ludzkich fibroblastów pochwy będzie użytecznym narzędziem do przyszłych badań nad zaburzeniami dna miednicy, zwłaszcza u osób po menopauzie, a także ważnym dodatkiem do badań nad zdrowiem kobiet.

Nierówność płci w nauce i badaniach jest ciągłym problemem. Badania nad zaburzeniami, które dotykają głównie osoby płci żeńskiej, są niedofinansowane1. Wypadanie narządów miednicy mniejszej jest zaburzeniem silnie związanym z płcią żeńską. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy opadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie2. Niewiele wiadomo na temat interakcji komórkowych w kontekście tej patofizjologii, ani tego, jak czynniki na poziomie tkanek wpływają na powodzenie interwencji chirurgicznych3.
Komórki pierwotne, a nie linie komórkowe, są powszechnie uznawane za niezbędne dla translacyjnych badań klinicznych, zapewniając większą przydatność fizjologiczną4. Komórki pierwotne są pobierane bezpośrednio z tkanki ciała będącej przedmiotem zainteresowania i mogą bardziej precyzyjnie naśladować fizjologię in vivo. Izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy może być przydatna do badania biologicznych mechanizmów wypadania narządów miednicy mniejszej i modelowania choroby, biorąc pod uwagę kluczowe cechy dawcy, takie jak wiek i stan menopauzy. 
Wypadanie narządów miednicy często dotyka osoby starsze lub po menopauzie. Izolacja i proliferacja pierwotnych komórek fibroblastów w badaniu tego schorzenia jest wyzwaniem ze względu na zmniejszone populacje komórek i zdolność klonogenną od starszych dawców5. Z naszego doświadczenia wynika, że zastosowanie wcześniej opisanych protokołów dysocjacji tkanki pochwy nie pozwoliło na ekstrakcję żadnych fibroblastów ze standardowej biopsji tkankowej 1 cm2. 
Poprzez przegląd literatury stwierdziliśmy, że podobne badania zostały podzielone na dwie grupy: modele zwierzęce, takie jak mysie6, oraz modele ludzkie7,8. Podczas stosowania protokołu mysiego, użycie nożyczek do przetwarzania tkanek ludzkiej tkanki pochwy powodowało niewystarczające trawienie mechaniczne. Ekstrapolacja protokołów z wykorzystaniem tkanki mysiej i innych miejsc tkankowych9 nie powiodła się. 
Większość prac wykorzystujących próbki z ludzkiej pochwy wykorzystywała tkanki od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy7,10. Chociaż kilka artykułów opisywało wykorzystanie próbek zarówno od osób przedmenopauzalnych, jak i pomenopauzalnych11, nie opisywały one wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznej izolacji fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie. Izolacja i modelowanie choroby przy użyciu fibroblastów z tkanki pomenopauzalnej może być niezbędne do zrozumienia patofizjologii komórkowej wypadania narządów miednicy, ponieważ stan ten ma najwyższą częstość występowania u osób w dekadzie po menopauzie12. 
Opisujemy metodę izolacji i hodowli wzbogaconej fibroblastami zawiesiny jednokomórkowej z ludzkiej tkanki pochwy przy użyciu kombinacji dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. W tym artykule opisano niezawodny protokół, w jaki sposób można uzyskać ludzkie fibroblasty pochwy po menopauzie lub starzejące się. Potwierdzono, że izolowane komórki są fibroblastami w badaniu morfologicznym przy użyciu mikroskopii z kontrastem fazowym i immunofluorescencji (IF) w celu oceny ekspresji wimentyny, F-aktyny i aktyny α mięśni gładkich (α-SMA).

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Bio Techne</td><td>B23192</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (100 &mu; m)</td><td></td>Stożkowe probówki wirówkowe <td>ThermoFisher Scientific</td> 22363549 <td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel z piór nr 15</td><td>Socorex</td><td>FB.15</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NC1983075</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe o wysokiej czystości (50 ml)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik próbek HulaMixer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka fibronektyna DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY1918-05</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki Pro-Kolagen I alfa 1 DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY6220-05</td><td></td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05 401 119 001</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego, polistyren (100 mm x 20 mm)</td>Pipety serologiczne <td>Millipore Sigma</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>(10 ml)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki (5 ml)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-458</td><td></td></tr></tbody></table>

przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy

Tissue Processing and Isolation of Primary Fibroblasts from the Human Vagina

Wypadanie narządów miednicy jest zaburzeniem, które poważnie wpływa na jakość życia kobiet. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy spadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie. Operacja korygująca wypadanie narządów miednicy jest podstawowym leczeniem. Ostatnio rośnie zainteresowanie badaniem składu tkanek pacjentów z wypadaniem na poziomie komórkowym.
Obecnie nie ma zgody co do wpływu wieku dawcy lub pacjenta na terapie komórkowe. Obecnie opublikowane protokoły izolacji fibroblastów pochwy albo koncentrują się na tkance przedmenopauzalnej, albo zaniedbują komentarz na temat wieku tkanki dawcy. Większość istniejących protokołów wykorzystuje modele zwierzęce. Konsystencja ludzkiej tkanki pochwy jest gęstsza niż tkanek stosowanych w większości protokołów. W tym badaniu ludzka tkanka pochwy została pozyskana głównie od starszych dawców, co prawdopodobnie przyczyniło się do niepowodzenia istniejących protokołów.
Celem tego badania jest opisanie standardowego protokołu niezawodnego pozyskiwania ludzkich fibroblastów pochwy, niezależnie od wieku dawcy i statusu menopauzy. Wyniki odtworzono przy użyciu tkanek pochodzących od dziewięciu różnych dawców, którzy przeszli operację wypadania narządów miednicy. Sześć pacjentek było po menopauzie, przy czym najstarsza dawczyni miała 78 lat. Średni wiek dawców tkanek wynosił 59 lat.
Tutaj opisujemy niezawodną metodę generowania wzbogaconej fibroblastami zawiesiny jednokomórkowej za pomocą kombinacji dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej oraz łączenia zawiesiny komórkowej w wielu biopsjach pochwy od jednego dawcy. Wiarygodna izolacja pierwotnych fibroblastów pochwy może być przydatna w badaniu wypadania narządów miednicy, a także interakcji mikrobiom-gospodarz.

Tkankę pochwy pobrano od 10 niezależnych dawców poddawanych operacji obniżenia narządów miednicy mniejszej. Zgodnie z opisanym protokołem, komórki wyizolowano z ludzkiej tkanki pochwy. Populacje komórek charakteryzowały się wydłużonym, płaskim i wrzecionowatym wyglądem. Podobnie jak w innych badaniach, zaobserwowano istotnie wolniejszą zdolność do podwajania liczby komórek oraz zmniejszoną zdolność klonogeniczną fibroblastów wraz z wiekiem dawcy. Różnice te były wyraźne przy porównaniu fibroblastów wyizolowanych od osób starszych (75-78 lat) z fibroblastami wyizolowanymi od osób młodych (35-47 lat). Komórki od dawców w średnim wieku wykazały profil pośredni (56-61 lat). Tempo proliferacji komórek oszacowano początkowo poprzez bezpośrednią wizualizację przy użyciu mikroskopu fazowo-kontrastowego, przy tej samej znanej gęstości wysiewu.
<img alt="Schemat procesu dysocjacji tkanki; obejmuje wirowanie, trawienie kolagenazą i zawiesinę komórkową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczna prezentacja protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Rysunek 1 przedstawia schematyczny przebieg protokołu dysocjacji i izolacji. Zastosowanie tych kroków pozwoliło na uzyskanie 90% skuteczności izolacji pierwotnych fibroblastów u dziewięciu z dziesięciu dawców, dostarczając liczbę komórek wystarczającą do ich pasażowania. Mediana wieku dawców wynosiła 59 lat.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Protokół (Autor, rok)</td>
			<td >Tkanka dawcy w oryginalnym protokole</td>
			<td >Liczba dawców</td>
			<td >Wiek dawcy w latach</td>
			<td >Uzyskane fibroblasty</td>
			<td >Morfologia</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Ruiz-Zapata et al., 2013</td>
			<td >Ludzka pochwa</td>
			<td >3</td>
			<td >56-78</td>
			<td >Nie</td>
			<td >N/D</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Khan et al., 2016</td>
			<td >Ucho i ogon myszy</td>
			<td >2</td>
			<td >48-65</td>
			<td >Nie</td>
			<td >N/D</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Waise et al., 2019</td>
			<td >Tkanka ludzka</td>
			<td >3</td>
			<td >56-75</td>
			<td >Nie</td>
			<td >N/D</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Nadalutti et al., 2020</td>
			<td >Ludzka skórka napletka</td>
			<td >1</td>
			<td >65</td>
			<td >Nie</td>
			<td >N/D</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Obecny</td>
			<td >Ludzka pochwa</td>
			<td >10</td>
			<td >35-79</td>
			<td >Tak</td>
			<td >Wrzecionowata</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Porównanie protokołów skutecznej izolacji ludzkich fibroblastów pochwy. Porównanie różnych istniejących protokołów z naszym, potwierdzone wynikami morfologicznymi.
Tabela 1 przedstawia wyniki zastosowania innych protokołów w próbach izolacji fibroblastów pochwy w niniejszym badaniu. Opracowaliśmy standardowy protokół izolacji pierwotnych fibroblastów z błony śluzowej pochwy u starszych dawców5.
Przetestowaliśmy kilka uznanych protokołów, w tym te wymienione w Tabeli 1, i nie odnotowaliśmy sukcesu w izolacji komórek przy ich zastosowaniu w naszym badaniu. Proponujemy następujące przyczyny tych ograniczeń.
Protokół opublikowany przez Ruiz i wsp.3 obejmuje zdrapywanie powięzi i cięcie tkanki na małe kawałki. W naszym doświadczeniu odróżnienie powięzi jest trudne, a próby zdrapywania mogą prowadzić do znacznego zmniejszenia wydajności komórek. Choć metoda ta jest prosta, brakuje w niej kluczowych szczegółów, co ogranicza jej możliwość generalizacji. Ponadto trawienie mechaniczne w tym protokole wydaje się niewystarczające dla tkanki pomenopauzalnej, która ma tendencję do bycia gęstszą.
Protokoły opublikowane przez Khan i współpracowników9 oraz Waise i współpracowników13 wykorzystują nożyczki do rozdrabniania tkanek, co nie wprowadza istotnych wielokierunkowych sił ścinających w porównaniu z techniką z użyciem skalpela. Według naszego doświadczenia metoda z użyciem nożyczek również nie była skuteczna.
Wreszcie, protokół opracowany przez Nadalutti i wsp.14, w którym zastosowano metodę eksplantacji, nie pozwolił nam na pomyślne uzyskanie fibroblastów. Metoda ta może być mniej skuteczna ze względu na charakter tkanki pomenopauzalnej, która może wymagać bardziej agresywnego przetwarzania mechanicznego i enzymatycznego w celu skutecznej dysocjacji fibroblastów.
<img alt="Obraz mikroskopowy kropel emulsji w wodzie, ilustrujący dyspersję do analizy wielkości cząstek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obraz w kontraście fazowym zawieszonych komórek w dniu 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek 2 przedstawia komórki w zawiesinie w dniu 0. zgodnie z naszym protokołem.
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowych; analiza morfologii fibroblastów w próbce tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obraz w kontraście fazowym pierwotnych fibroblastów pochwy w 14. dniu hodowli przy powiększeniu 100x, uzyskany z połączonej zawiesiny komórek z trzech biopsji tkankowych o powierzchni 1 cm2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina 3 przedstawia pierwotne fibroblasty przy powiększeniu 100x, pochodzące z połączonej zawiesiny komórkowej z 3 biopsji tkankowych o wymiarach 1 cm².
Tożsamość fibroblastów badano za pomocą technik immunofluorescencyjnych, zgodnie z wcześniejszym opisem z niewielkimi modyfikacjami. Aby zweryfikować pochodzenie komórkowe pierwotnych komórek pochwy, zastosowano swoiste biomarkery pochodzenia fibroblastycznego poprzez barwienie immunofluorescencyjne. Komórki zidentyfikowano jako fibroblasty na podstawie pozytywnego barwienia na vimentynę (Rysunek 4), F-aktynę oraz α-SMA w próbkach tkanek od kobiet przed i po menopauzie (Rysunek 5). Fibroblasty hodowano do momentu namnożenia przy wysokiej żywotności (&gt;90%) w celu wykorzystania ich w eksperymentach.
<img alt="Test immunofluorescencyjny: barwienie DAPI i wimentyną w próbkach komórek; rzędy obrazów oznaczające status menopauzy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Dodatnie barwienie wimentyny w fibroblastach pochwy. Wyizolowane pierwotne fibroblasty z tkanek kobiet przed i po menopauzie poddano analizie IF; obrazy wykonano przy powiększeniu 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopii fluorescencyjnej DAPI, α-SMA, F-aktyny w grupie przedmenopauzalnej i pomenopauzalnej, różnicowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65864/65864fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pozytywne barwienie F-aktyny i α-SMA w fibroblastach pochwy. Wyniki ekspresji białek w porównaniu z kontrolą IgG. Obrazy wykonano przy powiększeniu 200x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65864/65864fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół demonstruje niezawodną i skuteczną technikę izolowania pierwotnych fibroblastów z przedmenopauzalnej lub pomenopauzalnej ludzkiej tkanki pochwy. Istniejące protokoły izolacji fibroblastów pochwy nie uwzględniają wyzwań związanych z izolacją komórek z tkanki starczej. Tkankę pochwy pozyskano od kobiet po operacji wypadania narządów miednicy.

Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy

Pelvic organ prolapse is a disorder that seriously impacts the quality of life of women. It occurs when muscles and ligaments weaken and cause pelvic ...

Badania nad zaburzeniami, które dotykają przede wszystkim osoby płci żeńskiej, są niedostatecznie zbadane i niedofinansowane. Wypadanie narządów miednicy mniejszej jest zaburzeniem silnie związanym z płcią żeńską. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy opadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie.Niewiele wiadomo na temat interakcji komórkowych w kontekście tej patofizjologii ani tego, jak czynniki na poziomie tkanek wpływają na powodzenie interwencji chirurgicznych. Izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy może być przydatna do badania mechanizmów biologicznych leżących u podstaw wypadania narządów miednicy. Wypadanie narządów miednicy zwykle dotyka osoby starsze lub po menopauzie.Izolacja i proliferacja pierwotnych fibroblastów Badania nad tym schorzeniem są trudne ze względu na zmniejszone populacje komórek i zdolność klonogenną starszych dawców. Większość prac wykorzystujących próbki pochwy ludzkiej wykorzystuje tkanki pochodzące od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy. Chociaż w kilku artykułach opisano wykorzystanie próbek zarówno od osób przedmenopauzalnych, jak i pomenopauzalnych, nie opisano w nich wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznego izolowania fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie.Izolacja i modelowanie choroby przy użyciu fibroblastów z tkanki pomenopauzalnej może być niezbędne do zrozumienia patofizjologii komórkowej wypadania narządów miednicy, ponieważ stan ten ma najwyższą częstość występowania u osób w dekadzie po menopauzie, Opisujemy metodę izolacji i hodowli zawiesiny pojedynczej komórki wzbogaconej w fibroblasty z ludzkiej tkanki pochwy przy użyciu kombinacji dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. W tym artykule opisano niezawodny protokół, w jaki sposób można uzyskać ludzkie fibroblasty pochwy po menopauzie lub starzejące się. Pobrane tkanki poddano analizie histologicznej w celu potwierdzenia protokołu.Zmierz i przytnij tkankę do wielkości około jednego centymetra kwadratowego. Zapewnij precyzyjny pomiar wielkości biopsji. Przygotuj dwie lub trzy dodatkowe biopsje pochwy, o wymiarach jednego centymetra kwadratowego od jednego dawcy i odłóż biopsje na bok.Po umieszczeniu biopsji pochwy na szalce Petriego w hodowli komórkowej, zmiel tkankę pochwy na małe fragmenty, używając dwóch sterylnych skalpeli. Upewnij się, że końcówki ostrzy są prostopadłe do powierzchni tkanki. Wywieraj równy i równomierny nacisk na powierzchnię tkanki za pomocą dwóch skalpeli.Wykonuj naprzemienne ciągnięcie, aby pociąć tkanki na bardzo małe kawałki. Powtarzaj tę technikę mielenia, używając dwóch skalpeli, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy od jednego do dwóch milimetrów. Dodaj dwa do trzech mililitrów pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy na płytkę, zawieszając zmieloną tkankę.Odpipetować roztwór zawierający fragmenty tkanek w górę i w dół, aby rozbić wszelkie grudki. Przenieś roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj dodatkowe pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy, aż całkowita objętość wyniesie 10 mililitrów.Przechowywać Liberazę w 230 mikrolitrach porcji do użycia. Dodać 230 mikrolitrów Liberace do probówki. Inkubować probówki przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, stale energicznie mieszając, używając mieszalnika do próbek.Utrzymuj stałe poruszenie. Podczas inkubacji należy wirować probówki w odstępach 30-minutowych. Odwirowywać próbki przez pięć minut w temperaturze 3000 G. Usunąć i wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w jednym do dwóch mililitrów pożywki do hodowli komórkowych z 10% płodową surowicą bydlęcą w celu rozcieńczenia Liberazy. Energicznie pipetować, aż osad zostanie całkowicie ponownie zawieszony. Odcedzić zawiesinę enzymów tkankowych, delikatnie pipetując roztwór przez sitko do komórek.Ściągnąć zawiesiny komórek z wielu biopsji tkanek tego samego dawcy. Za pomocą tłoka sterylnej pięciomililitrowej strzykawki przecisnąć zawiesinę enzymów tkankowych na sitko. Powtarzaj ten krok, aż pozostałe fragmenty tkanki wydają się być całkowicie przeciśnięte.Na jednej szalce Petriego pobrano zawiesinę komórek z wielu biopsji pochwy pobranej od tego samego dawcy. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Upewnij się, że ostrość mikroskopu znajduje się na spodzie płytki.Niewielka liczba fibroblastów zostanie przyczepiona do dna. Oto schematyczne przedstawienie protokołu, podkreślające kluczowe kroki. Rysunek drugi przedstawia obraz z kontrastem fazowym zawieszonych komórek w dniu zero.Rycina trzecia to obraz z kontrastem fazowym pierwotnych fibroblastów pochwy w 14 dniu hodowli w 100-krotnym powiększeniu z wyciągniętej zawiesiny trzech biopsji tkanek o powierzchni jednego centymetra kwadratowego. Tabela pierwsza przedstawia wyniki stosowania innych protokołów w celu próby izolacji fibroblastów pochwy w obecnym badaniu. Fibroblasty zidentyfikowano na podstawie dodatniego barwienia mentonu.Analizę immunofluorescencyjną przeprowadzono na pokazanych tu tkankach pochwy przed menopauzą i po menopauzie. Zdjęcia zostały wykonane w powiększeniu 200x. Izolowane fibroblasty wybarwiono również aktyną alfa mięśni gładkich i aktyną F w próbkach tkanek przed menopauzą i po menopauzie.Opracowaliśmy zoptymalizowany i niezawodny protokół izolacji pierwotnych fibroblastów z błony śluzowej pochwy u starszych dawczyń. Zastosowanie wcześniej opublikowanych protokołów dla tkanek zwierzęcych i ludzkich do dysocjacji komórek pierwotnych nie doprowadziło do ekstrakcji żadnych fibroblastów z próbek z ludzkiej pochwy w tym badaniu. Stawiamy dwie prawdopodobne przyczyny wyzwań związanych z dysocjacją komórek z ludzkiej tkanki pochwy.Grubość skóry błony śluzowej jest większa u starszych dawców i w porównaniu z tkanką niebłonową błony śluzowej, a gęstość fibroblastów może być znacznie zmniejszona u osób starszych. Nie należy modyfikować kilku krytycznych kroków. Wdrożenie bardzo rygorystycznego trawienia mechanicznego przy użyciu techniki dwóch skalpeli i pobranie zawiesin komórkowych z trzech do czterech biopsji pełnej grubości jednego dawcy.Nasz protokół ma wyraźną przewagę. Trawienie mechaniczne i enzymatyczne prowadzi do lepszych plonów tkanek po menopauzie, ale nie ma negatywnego wpływu na próbki przed menopauzą. Zdajemy sobie sprawę z kilku ograniczeń naszego protokołu.Dostęp do ludzkiej tkanki pochwy może być trudny w sytuacjach, gdy operacja wypadania pochwy nie jest wykonywana, a konieczność pobierania zawiesin komórkowych z wielu próbek biopsji tkanek może również być ograniczeniem. Ten protokół wymagania ludzkich fibroblastów pochwy będzie użytecznym narzędziem do przyszłych badań nad zaburzeniami dna miednicy, zwłaszcza u osób po menopauzie, a także ważnym dodatkiem do badań nad zdrowiem kobiet.

tissue-processing-isolation-primary-fibroblasts-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Protokół hodowli eksplantów fibroblastów z biopsji wycinanych ze skóry ludzkiej jest technicznie niezawodną i prostą metodą pozyskiwania komórek skóry w ciągu 4-8 tygodni w celu zamrożenia około 15-20 milionów komórek o niskim numerze pasażu.

Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Poznaj niezawodną metodę izolacji pierwotnych fibroblastów z tkanki pochwy ludzkiej, wykorzystującą mechaniczną i enzymatyczną dyssocjację. Protokół optymalizuje uzyski komórek od dawców przed- i pomenopauzalnych, wspierając badania nad patofizjologią wypadania narządów miednicy.

Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy

Przeglądaj więcej filmów