Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy

Badania nad zaburzeniami, które dotykają przede wszystkim osoby płci żeńskiej, są niedostatecznie zbadane i niedofinansowane. Wypadanie narządów miednicy mniejszej jest zaburzeniem silnie związanym z płcią żeńską. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy opadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie.

Niewiele wiadomo na temat interakcji komórkowych w kontekście tej patofizjologii ani tego, jak czynniki na poziomie tkanek wpływają na powodzenie interwencji chirurgicznych. Izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy może być przydatna do badania mechanizmów biologicznych leżących u podstaw wypadania narządów miednicy. Wypadanie narządów miednicy zwykle dotyka osoby starsze lub po menopauzie.

Izolacja i proliferacja pierwotnych fibroblastów Badania nad tym schorzeniem są trudne ze względu na zmniejszone populacje komórek i zdolność klonogenną starszych dawców. Większość prac wykorzystujących próbki pochwy ludzkiej wykorzystuje tkanki pochodzące od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy. Chociaż w kilku artykułach opisano wykorzystanie próbek zarówno od osób przedmenopauzalnych, jak i pomenopauzalnych, nie opisano w nich wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznego izolowania fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie.

Izolacja i modelowanie choroby przy użyciu fibroblastów z tkanki pomenopauzalnej może być niezbędne do zrozumienia patofizjologii komórkowej wypadania narządów miednicy, ponieważ stan ten ma najwyższą częstość występowania u osób w dekadzie po menopauzie, Opisujemy metodę izolacji i hodowli zawiesiny pojedynczej komórki wzbogaconej w fibroblasty z ludzkiej tkanki pochwy przy użyciu kombinacji dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. W tym artykule opisano niezawodny protokół, w jaki sposób można uzyskać ludzkie fibroblasty pochwy po menopauzie lub starzejące się. Pobrane tkanki poddano analizie histologicznej w celu potwierdzenia protokołu.

Zmierz i przytnij tkankę do wielkości około jednego centymetra kwadratowego. Zapewnij precyzyjny pomiar wielkości biopsji. Przygotuj dwie lub trzy dodatkowe biopsje pochwy, o wymiarach jednego centymetra kwadratowego od jednego dawcy i odłóż biopsje na bok.

Po umieszczeniu biopsji pochwy na szalce Petriego w hodowli komórkowej, zmiel tkankę pochwy na małe fragmenty, używając dwóch sterylnych skalpeli. Upewnij się, że końcówki ostrzy są prostopadłe do powierzchni tkanki. Wywieraj równy i równomierny nacisk na powierzchnię tkanki za pomocą dwóch skalpeli.

Wykonuj naprzemienne ciągnięcie, aby pociąć tkanki na bardzo małe kawałki. Powtarzaj tę technikę mielenia, używając dwóch skalpeli, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy od jednego do dwóch milimetrów. Dodaj dwa do trzech mililitrów pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy na płytkę, zawieszając zmieloną tkankę.

Odpipetować roztwór zawierający fragmenty tkanek w górę i w dół, aby rozbić wszelkie grudki. Przenieś roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj dodatkowe pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy, aż całkowita objętość wyniesie 10 mililitrów.

Przechowywać Liberazę w 230 mikrolitrach porcji do użycia. Dodać 230 mikrolitrów Liberace do probówki. Inkubować probówki przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, stale energicznie mieszając, używając mieszalnika do próbek.

Utrzymuj stałe poruszenie. Podczas inkubacji należy wirować probówki w odstępach 30-minutowych. Odwirowywać próbki przez pięć minut w temperaturze 3000 G. Usunąć i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w jednym do dwóch mililitrów pożywki do hodowli komórkowych z 10% płodową surowicą bydlęcą w celu rozcieńczenia Liberazy. Energicznie pipetować, aż osad zostanie całkowicie ponownie zawieszony. Odcedzić zawiesinę enzymów tkankowych, delikatnie pipetując roztwór przez sitko do komórek.

Ściągnąć zawiesiny komórek z wielu biopsji tkanek tego samego dawcy. Za pomocą tłoka sterylnej pięciomililitrowej strzykawki przecisnąć zawiesinę enzymów tkankowych na sitko. Powtarzaj ten krok, aż pozostałe fragmenty tkanki wydają się być całkowicie przeciśnięte.

Na jednej szalce Petriego pobrano zawiesinę komórek z wielu biopsji pochwy pobranej od tego samego dawcy. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Upewnij się, że ostrość mikroskopu znajduje się na spodzie płytki.

Niewielka liczba fibroblastów zostanie przyczepiona do dna. Oto schematyczne przedstawienie protokołu, podkreślające kluczowe kroki. Rysunek drugi przedstawia obraz z kontrastem fazowym zawieszonych komórek w dniu zero.

Rycina trzecia to obraz z kontrastem fazowym pierwotnych fibroblastów pochwy w 14 dniu hodowli w 100-krotnym powiększeniu z wyciągniętej zawiesiny trzech biopsji tkanek o powierzchni jednego centymetra kwadratowego. Tabela pierwsza przedstawia wyniki stosowania innych protokołów w celu próby izolacji fibroblastów pochwy w obecnym badaniu. Fibroblasty zidentyfikowano na podstawie dodatniego barwienia mentonu.

Analizę immunofluorescencyjną przeprowadzono na pokazanych tu tkankach pochwy przed menopauzą i po menopauzie. Zdjęcia zostały wykonane w powiększeniu 200x. Izolowane fibroblasty wybarwiono również aktyną alfa mięśni gładkich i aktyną F w próbkach tkanek przed menopauzą i po menopauzie.

Opracowaliśmy zoptymalizowany i niezawodny protokół izolacji pierwotnych fibroblastów z błony śluzowej pochwy u starszych dawczyń. Zastosowanie wcześniej opublikowanych protokołów dla tkanek zwierzęcych i ludzkich do dysocjacji komórek pierwotnych nie doprowadziło do ekstrakcji żadnych fibroblastów z próbek z ludzkiej pochwy w tym badaniu. Stawiamy dwie prawdopodobne przyczyny wyzwań związanych z dysocjacją komórek z ludzkiej tkanki pochwy.

Grubość skóry błony śluzowej jest większa u starszych dawców i w porównaniu z tkanką niebłonową błony śluzowej, a gęstość fibroblastów może być znacznie zmniejszona u osób starszych. Nie należy modyfikować kilku krytycznych kroków. Wdrożenie bardzo rygorystycznego trawienia mechanicznego przy użyciu techniki dwóch skalpeli i pobranie zawiesin komórkowych z trzech do czterech biopsji pełnej grubości jednego dawcy.

Nasz protokół ma wyraźną przewagę. Trawienie mechaniczne i enzymatyczne prowadzi do lepszych plonów tkanek po menopauzie, ale nie ma negatywnego wpływu na próbki przed menopauzą. Zdajemy sobie sprawę z kilku ograniczeń naszego protokołu.

Dostęp do ludzkiej tkanki pochwy może być trudny w sytuacjach, gdy operacja wypadania pochwy nie jest wykonywana, a konieczność pobierania zawiesin komórkowych z wielu próbek biopsji tkanek może również być ograniczeniem. Ten protokół wymagania ludzkich fibroblastów pochwy będzie użytecznym narzędziem do przyszłych badań nad zaburzeniami dna miednicy, zwłaszcza u osób po menopauzie, a także ważnym dodatkiem do badań nad zdrowiem kobiet.