Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego

Nasze intensywne systemy rolnicze opierają się na dużych nakładach nawozów i pestycydów. Jest to szkodliwe dla środowiska, a także niezrównoważone. Kluczowymi pytaniami w badaniach jest to, jak obniżyć ten nakład przy jednoczesnym utrzymaniu plonów naszych upraw.

Jednym z obiecujących sposobów na osiągnięcie tego celu jest zaopatrzenie roślin w pożyteczne mikroorganizmy na polu. Jednak, aby móc to zrobić z powodzeniem, musimy zrozumieć złożone chemiczne wzajemne oddziaływanie między partnerami. Badaliśmy tę interakcję, przyglądając się wysiękom z korzeni w naszym laboratorium.

Odkryliśmy, że wysięk korzeniowy jest bardzo dynamiczny. Różni się w zależności od etapów rozwoju gatunku roślin, a także dobowych punktów czasowych. Rośliny reagują również na obecność różnego rodzaju drobnoustrojów, zmieniając swój profil metaboliczny.

Ponieważ wysięki korzeniowe są składnikami odżywczymi i sygnałami dla społeczności drobnoustrojów, badanie profili wysięku ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rośliny wchodzą w interakcje z drobnoustrojami w swoim środowisku. Postępy w metabolomice, ale także w technologiach sekwencjonowania nowej generacji, naprawdę popchnęły naprzód dziedzinę interakcji mikrobiomu roślinnego. Oczywiście, potrzebny jest przepływ pracy metabolomicznej, aby wykryć związek lub związki będące przedmiotem zainteresowania w danym systemie.

Technologie sekwencjonowania nowej generacji są naprawdę niezbędne do zrozumienia struktury, ale także funkcji mikrobiomów roślinnych. Bardzo pomocne jest również stosowanie specjalistycznych systemów wzrostu lub uproszczonych systemów wzrostu, takich jak ten, który tutaj prezentujemy, aby zrozumieć mechanizmy molekularne interakcji mikroorganizmów roślinnych. Nasz system może być w pewnym sensie sterylny, ale możemy go również zaszczepić docelowymi mikroorganizmami.

Jednym z wyzwań, przed którymi stoimy, jest wykrycie metabolitów w niskim stężeniu w wysiękach. Jeśli tło jest niskie, łatwo to zrobić. Jeśli mamy o wiele bardziej złożone środowisko, takie jak gleba, to jest to trudniejsze.

Innym nierozwiązanym wyzwaniem jest to, że gdy dodamy do obrazu mikroby, nie jest możliwe rozróżnienie między związkami wytwarzanymi przez rośliny a przez mikroorganizmy. Opracowaliśmy system, który jest tani i dość łatwy. Jego sterylna konstrukcja pozwala na przeprowadzanie kolejnych eksperymentów.

obojętne metabolity roślinne, następnie rośliny zaszczepia się mikroorganizmami i tutaj oceniane są zmiany w profilu metabolitów. Pozwala również na wzrost różnych gatunków roślin przez dłuższy czas. Podsumowując, system ten doskonale nadaje się do wielu zastosowań.

Aby rozpocząć, dodaj 150 mililitrów czystych pięciomilimetrowych szklanych koralików do czystego słoika i zamknij pokrywkę. Przykryj zamknięty słoik wystarczającą ilością folii aluminiowej, aby ukryć połączenie pokrywki ze słoikiem i autoklaw w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut. Gdy sadzonki będą gotowe do przeniesienia do słoika, na sterylnej ławce zdejmij folię aluminiową i pokrywkę słoika.

Dodaj do słoika 35 mililitrów pożywki o połowie mocy Murashige i Skoog o pH od 5,7 do 5,9 i wymieszaj kulki, aby równomiernie pokryły się podłożem. Wprowadź trzy do pięciu sadzonek do słoika, upewniając się, że systemy korzeniowe są umieszczone między szklanymi koralikami. Dostosuj koraliki sterylnymi kleszkami lub łyżkami, aby przykryć korzenie i wyjąć liście z podłoża.

Przymocuj dwa paski taśmy mikroporowej o grubości 1,25 centymetra na górze słoika i delikatnie umieść pokrywkę na górze. Uszczelnij szczelinę między pokrywką a słoikiem taśmą z mikroporami o grubości 2,5 centymetra, aby zachować sterylność, umożliwiając jednocześnie wymianę powietrza, i umieść słoik w komorze wzrostowej. Gdy rośliny osiągną pożądany wiek, zdejmij ze słoika pokrywkę z taśmą z mikroporami.

Porcję 20 mikrolitrów pożywki wzrostowej na płytkę agarową LB w celu przeprowadzenia badania sterylności. Za pomocą pipety objętościowej o pojemności 25 mililitrów usuń jak najwięcej podłoża wzrostowego, nie uszkadzając korzeni. Dodaj 50 mililitrów pożywki zbiorczej wzdłuż ścianki słoika, aby zapobiec zwilżeniu liści.

Zamknij słoik pokrywką i inkubuj w sterylnych warunkach przez dwie godziny. Po inkubacji usunąć żądaną ilość pożywki zbiorczej do probówek. Zmierz wagę korzenia i pędu z rośliny w jednym słoiku, aby znormalizować wysięk korzeniowy według masy rośliny.

Rośliny Arabidopsis thaliana wyglądały zdrowo w dwóch różnych laboratoriach. System szklanych słoików okazał się odpowiedni dla różnych gatunków roślin i etapów rozwoju. Największą masę pędów miała pszenica, następnie sorgo i pomidor, podczas gdy sorgo miało największą masę korzeni, a następnie pszenica i Medicago truncatula.

Inokulacja Arabidopsis thaliana bakteriami komensalnymi nie zmieniła fenotypu rośliny, a zaszczepione bakterie utrzymywały się w systemie przez co najmniej 12 dni, z niewielkim wzrostem liczby jednostek tworzących kolonie.