Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Ogólnym celem tego systemu jest badanie wzajemnych interakcji sygnałowych i odpowiedzi między roślinami a mikropartnerami lub reakcji roślin na substancje chemiczne bądź czynniki abiotyczne w prostym układzie eksperymentalnym, który ściśle naśladuje środowisko naturalne. W niniejszym filmie przedstawiono współhodowlę roślin z bakterią Agrobacterium tumefaciens. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące interakcji roślin z mikroorganizmami, odpowiedzi mikroorganizmów lub roślin na stres oraz sygnalizacji molekularnej, w tym złożonych procesów sygnalizacji występujących już na początkowym etapie interakcji roślin z drobnoustrojami.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga ona zrozumieć naturę sygnalizacji i odpowiedzi w interakcjach mikrobowych roślin w prostym układzie, który obejmuje naśladowanie naturalnego środowiska. Choć metodę tę można stosować do uzyskania wglądu w interakcje roślin z pojedynczym gatunkiem mikroba, można jej również użyć do badania interakcji roślin z wieloma gatunkami mikrobów lub z czynnikami abiotycznymi. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas poszukiwania homeostazy sygnalizacji komórkowej podczas interakcji roślin z mikrobami, które ściśle naśladują sytuacje naturalne.

Aby rozpocząć eksperyment, nasiona muszą zostać wysterylizowane. W przypadku Arabidopsis thaliana należy połączyć około 200 nasion z 500 µL wody dejonizowanej w probówce do mikrowirówki, a następnie wymieszać zawartość probówki za pomocą vortexa z dużą prędkością. Probówkę należy wirować przy 9000 x g przez 30 sekund w laboratoryjnej mikrowirówce nakładkowej.

Za pomocą pipety usuń nadsącz wodny. Następnie dodaj do nasion 300 µL 2% podchlorynu sodu i wymieszaj je na wirówce typu vortex. Pozostaw mieszaninę do odstania w temperaturze pokojowej.

Po jednej minucie odwiruj nasiona w wirówce. Za pomocą pipety usuń roztwór podchlorynu sodu. Następnie dodaj do nasion 500 µL sterylnej, dejonizowanej wody i wymieszaj całość za pomocą wstrząsarki typu vortex.

Po odwirowaniu probówki usunąć wodę. Do nasion dodać 500 µL 70% etanolu i wymieszać całość na wirówce typu vortex. Po odczekaniu jednej minuty, aż nasiona opadną, odwirować probówkę.

Usunąć 70% etanol za pomocą pipety. Przemyć nasiona pięciokrotnie 500 µl sterylnej wody dejonizowanej. Następnie ponownie zawiesić wysterylizowane nasiona w 500 µl sterylnej wody ultraczystej.

Wlej 25 mililitrów połówki pożywki Murashige i Skoog, czyli pożywki MS z 0,4% phyto agaru, do każdej sterylnej, głębokiej szalki Petriego. Dla każdej szalki Petriego wytnij kwadrat z siatki ze stali nierdzewnej o wymiarach 90 milimetrów na 90 milimetrów. Zegnij rogi każdego kwadratu z siatki na tyle, aby siatka pasowała do wnętrza szalki Petriego.

Zegnij narożniki pod kątem 90 stopni względem głównej części siatki, aby narożniki mogły podtrzymywać siatkę, pozostawiając pod nią wystarczającą przestrzeń do rozwoju korzeni. Umieść wycięte kwadraty siatki w zlewce i przykryj je folią aluminiową. Sterylizuj kwadraty siatki w autoklawie, stosując 30-minutowy cykl suchego ciepła.

Po zestaleniu pożywki w szalkach Petriego i sterylizacji siatki, należy umieścić każdy kwadrat siatki na powierzchni stałej pożywki, zgiętymi rogami do dołu. Docisnąć siatkę tak, aby rogi wniknęły w pożywkę, a pozostała część siatki dotykała górnej powierzchni podłoża. Następnie, używając sterylnej pipety 200 µL, należy pobrać poszczególne sterylizowane powierzchniowo nasiona A thaliana i delikatnie przenieść każde nasiono na wierzch siatki.

Umieść nasiona w taki sposób, aby zachować odstępy odpowiednie dla danego gatunku roślin i potrzeb eksperymentalnych. Zamknij szalki Petri pokrywkami i oklej brzegi płytek porowatą taśmą chirurgiczną. Owiń nasiona folią aluminiową.

Przeprowadź stratyfikację nasion, umieszczając całą szalkę Petriego. Po dwóch dniach inkubuj nasiona w szalce Petriego w temperaturze od 22 do 24 °C przy 16-godzinnym fotoperiodzie przez 10 do 14 dni. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza wlej 18 ml autoklawowanej ciekłej pożywki MS do sterylnych cylindrycznych szklanych naczyń ze sterylnymi pokrywkami.

Następnie, używając sterylnej pęsety, ostrożnie przenieś każdy kwadrat siatki z siewkami w wieku od 10 do 14 dni z szalki Petri z pożywką półpłynną do hydroponicznego zbiornika cylindrycznego. Przedstawione tutaj siewki to lucerna. Uszczelnij pokrywy zbiorników, używając porowatej taśmy chirurgicznej.

Następnie hoduj sadzonki w temperaturze od 22 do 24 °C przy 16-godzinnym fotoperiodzie i mieszaniu przy 50 rpm. Przed inokulacją dokładnie sprawdź zbiornik z sadzonkami pod kątem ewentualnych zanieczyszczeń. Pożywka w niezanieczyszczonych zbiornikach powinna być klarowna i przejrzysta.

Jeśli zbiorniki są zmętniałe z powodu kontaminacji, należy je odrzucić, a pozostałe zbiorniki ponumerować. Należy pobrać 20 µL pożywki hydroponicznej z każdego ponumerowanego zbiornika i nanieść ją na płytkę Petriego z bulionem Luria lub agarem LB. Płytkę należy inkubować w temperaturze 28 °C przez 28 godzin.

Należy niezwłocznie zaszczepić każdy ponumerowany zbiornik hydroponiczny, wprowadzając do niego 50 µL zawiesiny Agrobacterium tumefaciens. Sadzonki i bakterie A. tumefaciens należy poddać ko-kultywacji w temperaturze od 22 do 24 °C przy 16-godzinnym fotoperiodzie i wstrząsaniu z prędkością 50 rpm. Po 12 i 28 godzinach inkubacji należy zbadać płytkę z podłożem LB z naniesionymi próbkami, aby zweryfikować sterylność hydroponicznego podłoża wzrostowego.

W przypadku stwierdzenia zanieczyszczenia, nie należy używać odpowiadającego numerem zbiornika zaszczepionego bakteriami do dalszych analiz. Następnie należy oddzielić korzenie od zawiesiny bakteryjnej, podnosząc płytę z siatką. Jeśli korzenie mają być wykorzystane do późniejszych analiz, należy je odciąć, szybko opłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej i osuszyć na sterylnym papierze filtracyjnym.

W przypadku użycia liści lub innych tkanek, należy je wyciąć. Do analizy transkrypcyjnej roślin korzenie lub pędy należy natychmiast umieścić w ciekłym azocie. W przypadku analizy transkrypcyjnej bakterii należy przenieść 1,5 milliliters kultury ze zbiornika do współhodowli i odwirować komórki w celu uzyskania osadu.

Po odpowiedniej współuprawie należy użyć sterylnych nożyczek, aby oddzielić poszczególne korzenie boczne, czyli odgałęzienia korzenia głównego. Następnie korzenie należy opłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej, aby usunąć luźno związane materiały. Każdy korzeń należy zanurzyć w 30 µl wody na szkiełku przedmiotowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

Uszczelnij krawędzie szkiełka podstawowego lakierem do paznokci, aby chronić korzenie przed odwodnieniem. Następnie zwizualizuj przyleganie A. tumefacians do korzeni A. thaliana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po odpowiedniej współuprawie oddziel rośliny od podłoża hydroponicznego.

Sterylizuj 18 ml pożywki hydroponicznej, przepuszczając ją przez filtr o porach 0,2 µm do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Zamroź próbki w temperaturze -80 °C przez noc. Następnego dnia poluzuj nakrętki probówek stożkowych 50 ml i umieść je w liofilizatorze na 36 godzin.

Na koniec należy przystąpić do przechowywania lub obróbki próbek w celu analizy HPLC i wykrycia związków. W systemie współhodowli, bez sztucznie dostarczonych składników odżywczych, wzrastały bakterie A tumefacians c58. W przeciwieństwie do tego, w kulturze kontrolnej bez A thaliana nie zaobserwowano w zasadzie żadnego wzrostu bakterii.

Hydroponiczne systemy współhodowli mogą być wykorzystywane do badania przywierania bakterii do struktury korzenia, co przedstawiono na tej wizualizacji mikroskopowej, gdzie bakterie znakowane czerwoną fluorescencją PCherry zlokalizowano w strukturze korzenia rośliny, przyjmując typowy kształt przypominający kamienie lub filamenty. Profile ekspresji genów zarówno gospodarza roślinnego, jak i oddziałujących z nim mikroorganizmów można określić za pomocą QRTPCR. Po ośmiu godzinach współhodowli w komórkach eight tumefacians stwierdzono nadekspresję genów wirulencji.

Jednocześnie w korzeniach A thaliana stwierdzono różnicową ekspresję genów w odpowiedzi na kokultywację. Po 72 godzinach kokultywacji w sekretomie roślin zaszczepionych, w porównaniu z kontrolą, poziom 35 związków wzrósł, a 76 związków spadł. Technika ta otwiera przed badaczami możliwość analizy interakcji między rośliną a drobnoustrojami oraz badania wzajemnych odpowiedzi między rośliną a mikrobem lub partnerami w biomie mikrobiologicznym, a także odpowiedzi roślin na czynniki abiotyczne w prostym układzie, który ściśle naśladuje środowisko naturalne.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego materiału będą Państwo w stanie stworzyć system współuprawy roślin i mikroorganizmów w hydroponice, aby badać molekularne interakcje roślin i mikroorganizmów oraz odpowiedzi sygnałowe w bardziej naturalnym i łatwiejszym do kontrolowania środowisku.