Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Ogólnym celem tego systemu jest zbadanie wzajemnych interakcji sygnalizacyjnych i odpowiedzi między roślinami a mikropartnerami lub reakcji roślin na chemikalia lub czynniki abiotyczne w prostej konfiguracji eksperymentalnej, która ściśle naśladuje środowisko naturalne. Ten film przedstawia współuprawę roślin z bakterią Agrobacterium tumefaciens. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interakcji mikrobiologicznych roślin, reakcji mikroorganizmów lub roślin na stres oraz sygnalizacji molekularnej, w tym złożonej sygnalizacji nawet na początkowym etapie interakcji mikrobiologicznych rośliny.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga zrozumieć sygnalizację natury i reakcję na interakcje mikrobiologiczne rośliny, w prostej konfiguracji, która obejmuje naśladowanie środowiska naturalnego. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w interakcje roślin z pojedynczym gatunkiem drobnoustrojów, może być również wykorzystana do badania interakcji roślin z wieloma gatunkami drobnoustrojów lub z czynnikami abiotycznymi. Pomysł na tę metodę zrodził się podczas poszukiwania homeostazy sygnalizacji komórkowej podczas interakcji mikroorganizmów roślinnych, które ściśle naśladują sytuacje naturalne.

Aby rozpocząć eksperyment, nasiona należy wysterylizować. W przypadku Arabidopsis thaliana połącz około 200 nasion z 500 mikrolitrami dejonizowanej wody w mikroprobówce wirówkowej i wiruj probówkę z dużą prędkością. Odwiruj probówkę o masie 9000 x g przez 30 sekund w mikrowirówce stołowej.

Za pomocą pipety usunąć supernatant wodny. Następnie dodaj 300 mikrolitrów 2% podchlorynu sodu do nasion i wymieszaj je. Niech mieszanina osiądzie w temperaturze pokojowej.

Po minucie odwiruj nasiona. Za pomocą pipety usunąć roztwór podchlorynu sodu. Następnie dodaj 500 mikrolitrów sterylnej, dejonizowanej wody do nasion i zmieszaj mieszaninę.

Po odwirowaniu probówki usuń wodę. Dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu do nasion i wymieszaj mieszankę. Po pozostawieniu nasion na osiadanie przez minutę, odwiruj probówkę.

Usuń 70% etanolu za pomocą pipety. Umyj nasiona pięć razy 500 mikrolitrami sterylnej, dejonizowanej wody. Następnie ponownie zawieś wysterylizowane nasiona w 500 mikrolitrach sterylnej, ultra czystej wody.

Wlej 25 mililitrów pośredniej mocy Murashige i Skoog lub pożywki MS z 04% fitoagarem do każdej sterylnej, głębokiej szalki Petriego. Dla każdej szalki Petriego wytnij kwadrat siatki ze stali nierdzewnej o wymiarach 90 milimetrów na 90 milimetrów. Zegnij rogi każdej kwadratowej siatki na tyle, aby siatka zmieściła się wewnątrz płytki Petriego.

Zegnij rogi pod kątem 90 stopni do dużej części siatki, aby umożliwić podparcie siatki przez rogi, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca poniżej na rozwój korzeni. Pocięte kwadraty siatki włożyć do zlewki i przykryć folią aluminiową. Wysterylizuj kwadraty siatki przez autoklawowanie w 30-minutowym cyklu suchym.

Gdy podłoże zestali się na szalkach Petriego, a siatka jest sterylna, umieść każdy kwadrat siatki na wierzchu stałego podłoża z zagiętymi rogami skierowanymi w dół. Popchnij siatkę tak, aby rogi wnikały w medium, a większość siatki dotykała górnej powierzchni medium. Następnie użyj sterylnej pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyciągnąć pojedyncze, wysterylizowane powierzchniowo nasiona A thaliana i delikatnie przenieś każde nasiono na siatkę.

Umieść nasiona tak, aby były rozmieszczone w odstępach według gatunku rośliny i potrzeb eksperymentalnych. Uszczelnij szalki Petriego pokrywkami i umieść porowatą taśmę chirurgiczną wokół krawędzi płytek. Zawiń nasiona w folię aluminiową.

Rozwarstwij nasiona, umieszczając całą szalkę Petriego. Po dwóch dniach uprawiaj nasiona na szalce Petriego w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okresem zdjęciowym przez 10 do 14 dni. W wysterylizowanym okapie przepływowym wlej 18 mililitrów autoklawowanego płynnego podłoża MS do sterylnych cylindrycznych szklanych zbiorników ze sterylnymi pokrywkami.

Następnie za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie przenieś każdy kwadrat siatki z sadzonkami w wieku od 10 do 14 dni z szalki Petriego z półstałym podłożem do hydropoicznego cylindrycznego zbiornika. Pokazane tutaj sadzonki to lucerna. Uszczelnij pokrywy zbiorników za pomocą porowatej taśmy chirurgicznej.

Następnie uprawiaj sadzonki w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okresem zdjęciowym i potrząsaniem z prędkością 50 obr./min. Przed inokulacją należy dokładnie zbadać zbiornik z sadzonkami pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia. Pożywka w niezanieczyszczonych zbiornikach powinna być klarowna i przezroczysta.

Jeśli zbiorniki są mętne z powodu zanieczyszczenia, wyrzuć je i ponumeruj resztę zbiorników. Pobrać próbkę 20 mikrolitrów pożywki hydroponicznej z każdego ponumerowanego zbiornika i umieścić ją na szalce Petriego z bulionem Luria lub agarem LB. Inkubuj naczynie w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 28 godzin.

Natychmiast zaszczepij każdy numerowany zbiornik hydroponiczny 50 mikrolitrami zawiesiny Agrobacterium tumefacians do każdego numerowanego zbiornika hydroponicznego. Współhoduj sadzonki i bakterię kurkutu A w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okresem zdjęciowym i wstrząsaniem przy 50 obr./min. Zbadaj nakrapianą płytkę LB po 12 i 28 godzinach inkubacji, aby zweryfikować sterylność hydroponicznej pożywki wzrostowej.

W przypadku jakiegokolwiek zanieczyszczenia nie należy używać odpowiedniego numerowanego zbiornika zaszczepionego bakteriami do dalszych testów. Następnie oddziel korzenie od zawiesiny bakteryjnej, podnosząc płytkę siatki. Jeśli używasz korzeni do kolejnych analiz, odetnij korzenie, szybko opłucz je w podwójnie destylowanej wodzie i wysusz na wysterylizowanej bibule filtracyjnej.

Jeśli używasz liścia lub innej tkanki, odetnij tkankę. W celu analizy transkryptu roślinnego korzenie lub pędy należy natychmiast zdeponować w ciekłym azocie. W celu analizy transkryptu bakteryjnego przenieś 1,5 mililitra kultury ze zbiornika do wspólnej uprawy i zagnieźdź komórki przez odwirowanie.

Po odpowiedniej wspólnej uprawie użyj sterylnych nożyczek, aby oddzielić poszczególne korzenie wtórne, boczne gałęzie korzenia głównego. Następnie opłucz korzenie w podwójnie destylowanej wodzie, aby usunąć luźno związany materiał. Zanurz każdy korzeń w 30 mikrolitrach wody na szkiełku mikroskopowym i przykryj go szklanym szkiełkiem nakrywkowym.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby chronić korzenie przed odwodnieniem. Następnie wizualizuj przyczepienie się tumefacjan A do korzeni A thaliana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po odpowiedniej wspólnej uprawie należy oddzielić rośliny od podłoża hydroponicznego.

Wysterylizuj 18 mililitrów podłoża hydroponicznego, przepuszczając je przez filtr porowy o wielkości 0,2 mikrona do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Próbki należy zamrozić w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia poluzuj nakrętki na 50-mililitrowych stożkowych rurkach i umieść je w maszynie do liofilizacji na 36 godzin.

Na koniec przystąp do przechowywania lub przetwarzania próbek do analizy HPLC i wykrywania związków. Bez sztucznie dostarczanych składników odżywczych A tumefacians c58 rósł w systemie kouprawy. W przeciwieństwie do tego, zasadniczo nie zaobserwowano wzrostu bakterii w kulturze kontrolnej bez A thaliana.

Hydroponiczne systemy kouprawy mogą być wykorzystywane do badania przyczepiania się bakterii do struktury korzeniowej, jak widać na tej mikroskopowej wizualizacji, gdzie bakterie znakowane czerwoną fluorescencją PCherry zostały zlokalizowane w strukturze korzenia rośliny o typowym kształcie przypominającym skałę lub włókno. Profile ekspresji genów zarówno słupków roślinnych, jak i oddziałujących drobnoustrojów można ustalić za pomocą QRTPCR. Po ośmiu godzinach wspólnej hodowli osiem komórek kurkumazjańskich wykazało regulację ekspresji genów wirulencji.

W tym samym czasie korzenie A thaliana wykazały zróżnicowaną ekspresję genów w odpowiedzi na współhodowlę. Po 72 godzinach wspólnej hodowli 35 związków zostało wzmocnionych, a 76 związków zmniejszyło się w sekretomie inokulowanych roślin w porównaniu z kontrolą. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami i badania wzajemnych reakcji między roślinami a mikroorganizmami lub partnerami biomów drobnoustrojów lub odpowiedzi roślin na czynniki abiotyczne w prostej konfiguracji, która ściśle naśladuje środowisko naturalne.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego z Tobą jesteś w stanie skonfigurować system kouprawy mikroorganizmów roślin w hydroponice, aby badać rośliny molekularne, interakcje mikrobiologiczne i reakcje sygnalizacyjne w bardziej naturalnym i łatwiejszym do opanowania środowisku.