Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Nicień Caenorhabditis elegans jest łatwy w uprawie, utrzymaniu, manipulowaniu i wykorzystywaniu w eksperymentach w nauczaniu nauk biologicznych, a także dla uczniów do realizacji ich projektów. Protokół ten zapewnia dwa łatwe i tanie testy, które opierają się na przezroczystości nicienia, a także na użyciu kolorowych barwników. Pierwszy protokół pozwala na badanie łańcuchów metabolicznych po różnych dietach, a drugi protokół pozwala na obserwację procesu starzenia się w krótkim czasie.

Te oba testy są interesujące dla celów edukacyjnych przy ograniczonych zasobach. Pierwszy test wykorzystuje przezroczystość robaka oraz fakt, że produkuje i przechowuje glikogen. Za pomocą płynu Lugola jodu możemy zafarbować robaki i sprawdzić, czy różne diety lub inne czynniki mogą modyfikować jego poziom.

Starzenie się jest procesem naturalnym, ale niektóre czynniki, takie jak promieniowanie ultrafioletowe, żywność i narażenie na chemikalia, mogą przyspieszyć ten proces. Bariera jelitowa jest modyfikowana przez środek, a nabłonek traci integralność, powodując wyciek substancji, którą robak przyjmuje, tak jak Nazywamy ten test testem Smerfów, ponieważ robaki stają się całkowicie niebieskie, gdy następuje zmniejszenie integralności jelit. Na początek przygotuj sześć pożywek do wzrostu nicieni lub płytek agarowych NGM.

Następnego dnia dodaj 200 mikrolitrów kultury Escherichia coli OP50 na płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jeden dzień. Po inkubacji dodaj 200 mikrolitrów 0,025 molowej D-glukozy do czterech płytek agarowych NGM i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Przenieś różne etapy od trzech do czterech kawałków Caenorhabditis elegans Bristol N2 z płytki agarowej NGM na nową płytkę NGM wysianą E. coli OP50.

Wysiaduj robaki C.elegans w temperaturze 20 stopni Celsjusza przy wilgotności ponad 95% przez trzy dni. Trzy dni później dodaj wodę destylowaną na talerz i za pomocą pipety Pasteura zbierz robaki. Przenieś zebrane robaki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i pozwól im osiadać grawitacyjnie przed usunięciem supernatantu z probówki.

Następnie dodaj wodę destylowaną do probówki. Gdy objętość probówki zmniejszy się do pięciu mililitrów, dodaj 10 mililitrów roztworu wybielającego i energicznie potrząsaj probówką przez około sześć minut. Następnie napełnij probówkę do pojemności 50 mililitrów buforem M9 i odwiruj przy 1,400G przez trzy minuty.

Usunąć supernatant do pięciu mililitrów i dodać 45 mililitrów buforu M9 do probówki. Po ostatnim praniu usuń supernatant do oznaczenia 15 mililitrów i przenieś pozostały płyn na płytkę. Obserwuj płytkę pod mikroskopem pod kątem uwalniania jaj i umieść ją w temperaturze 20 stopni Celsjusza przy wilgotności powyżej 95% przez 14 godzin.

Po inkubacji zbierz robaki do 15-mililitrowej probówki. Za pomocą pipety automatycznej dodaj 10 mikrolitrów zsynchronizowanych robaków do szkiełka mikroskopowego. Policz liczbę robaków i oblicz objętość potrzebną do uzyskania od 500 do 1 000 robaków na mikrolitr.

Przenieść 500 do 1 000 larw robaków w stadium pierwszym lub zsynchronizowanych L1 na płytki agarowe NGM, wcześniej przygotowane i wysiane E.coli OP50 i glukozą. Inkubuj płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż robaki osiągną stadium larwalne czwarte lub L4. Po 48 godzinach dodać bufor M9 na płytkę i za pomocą pipety Pasteura zebrać larwy L4. Przenieś zebrane larwy do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Zaprojektuj harmonogram testu dla trzech grup eksperymentalnych. Przenieś około 100 mikrolitrów zawiesiny ślimakowej z każdej grupy do 1,5 mililitrowej mikroprobówki zawierającej 400 mikrolitrów 5% roztworu jodu Lugola. Delikatnie mieszaj rurkę w mikserze przez pięć minut.

Po wyjęciu rurki z miksera poczekaj, aż robaki osadzą się grawitacyjnie. Umyj robaki trzykrotnie jednym mililitrem buforu M9. Po ponownym wymieszaniu robaków w 100 mikrolitrach buforu M9 przenieś około 50 mikrolitrów na szkiełko.

Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym wybierz tryb jasnego pola i obserwuj robaki. Zapisz obrazy zawierające co najmniej 10 robaków w grupie jako plik jpeg.

Na koniec oblicz zawartość glikogenu na podstawie barwienia jodem robaków. Obserwacje wizualne testu zawartości glikogenu wykazały, że robaki na czczo wykazywały słabsze zabarwienie w porównaniu z tymi karmionymi E. coli OP50 i tymi z E. coli OP50 i D-glukozą, które wykazywały najbardziej intensywne barwienie. Aby rozpocząć, przenieś 500 do 1 000 zsynchronizowanych robaków Caenorhabditis elegans etapu L1 na płytce agarowej NGM i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza do dnia testu.

Zaprojektuj harmonogram testów dla dwóch grup eksperymentalnych. Korzystając z bufora M9, zbierz robaki L4 i robaki dorosłe w danym dniu. Przenieś zebrane robaki do mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra i poczekaj, aż robaki osadzą się grawitacyjnie.

Umyj robaki trzykrotnie jednym mililitrem buforu M9, pozostawiając około 500 mikrolitrów w tubie po ostatnim myciu. Za pomocą pipety automatycznej dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny ślimakowej do szkiełka mikroskopowego i oblicz objętość wymaganą do uzyskania 100 robaków na mikrolitr. W nowej mikroprobówce dodaj objętość wymaganą na 100 robaków i 100 mikrolitrów 25% roztworu soli disodowej erioglaucyny.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów kultury E.coli OP50 i zwiększ objętość do 500 mikrolitrów za pomocą buforu M9. Inkubować probówkę przez trzy godziny z mieszaniem w mieszalniku, chroniąc ją przed światłem. Po inkubacji pozwól robakom osiadać grawitacyjnie, a następnie umyj je jednym mililitrem buforu M9, aż roztwór barwiący zostanie całkowicie usunięty.

Po ostatnim myciu ponownie zawieś robaki w 250 mikrolitrach buforu M9 i przenieś około 50 mikrolitrów na szkiełko. Umieść szkiełko nakrywkowe i inkubuj szkiełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby sparaliżować robaki. Używając mikroskopu stereoskopowego w trybie jasnego pola, policz całkowitą liczbę robaków i całkowitą liczbę barwionych robaków.

Test przepuszczalności jelit wykazał silną barierę jelitową u młodych robaków, zapobiegającą wyciekowi barwnika. W przeciwieństwie do tego, starzejące się robaki wykazywały wynaczynienie barwnika w całym ciele, co wskazuje na uszkodzenie błony jelitowej.