Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Klasyczne badania powszechnie wykorzystują fluorescencyjne nienaruszone białka do wizualizacji transportu eksonów, ale endogenne zachowanie ładunku jest różne. Poziomy białek endogennych sprawiają, że wizualizacja jest trudna. Oferujemy pomysły na optymalizację warunków akwizycji w celu lepszej wizualizacji endogennego GFP Rab-3, który znakuje prekursory pęcherzyków synaptycznych.

Obfitość białek cytozolowych w polu transportu aksonalnego utrudnia wizualizację ich dynamiki przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten sugeruje zastosowanie etapu ablacji wraz z podejściami do etykietowania kontrolującego czasowo w celu przezwyciężenia tych wyzwań. Niedawno udało nam się zwizualizować transport aksonalny endogennego widma, optymalizując parametry akwizycji opisane w tym protokole, w połączeniu z naszym podejściem do etykietowania kontroli czasowej.

Pozwoliło nam to zidentyfikować pierwsze elementy maszyn, które pośredniczą w transporcie. Na początek wyjmij płytki pożywki dla nicieni z Caenorhabditis elegans wyhodowanymi na trawniku z bakteriami. Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś robaki do kropelki 0,5 milimolowego lewamizolu i inkubuj je przez 20 minut.

Odpipetować 12 mikrolitrów M9 medium do 10% plastra agarozowego na szkiełku podstawowym. Za pomocą wykałaczki do włosów zamontuj od 10 do 20 nicieni z kropli lewamizolu w kropli M9 na plastrze agarozy. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli i obróć ją o 45 stopni, aby zobrazować transport w aksonie DA-9.

Następnie uszczelnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym lepką wazeliną o konsystencji żelu. Na początek weź zjeżdżalnię Caenorhabditis elegans przygotowaną do obrazowania. Obserwuj szkiełko pod soczewką o powiększeniu od czterech do 20 razy, aby zlokalizować nicienie.

Zapamiętaj ich pozycje, a następnie przełącz się na obiektyw o powiększeniu 63-krotnym, aby uzyskać szczegółowe obrazowanie. Przechwyć początkowy obraz, aby ocenić parametry akwizycji. Monitoruj intensywność sygnału za pomocą histogramu intensywności i w razie potrzeby zwiększ intensywność lasera wzbudzenia.

Następnie, za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów, wybiel obszar aksonu, który ma być analizowany. Porównaj intensywność sygnału przed i po etapie wybielania, aby określić skuteczność wybielania. Grupowanie dwa na dwa służy do zwiększania intensywności sygnału poszczególnych zdarzeń transportowych.

Skróć czas ekspozycji i użyj rozdzielczości czasowej od 300 do 700 milisekund między kolejnymi punktami czasowymi, aby śledzić zdarzenia transportu RAB-3. Nagraj upływ czasu trwający od jednej do trzech minut w oparciu o intensywność sygnału i częstotliwość zdarzeń transportowych. Na początek nagraj film poklatkowy endogennego GFP RAB-3 w strefie asynaptycznej aksonu DA-9 u żywego Caenorhabditis elegans.

Zaimportuj plik z danymi poklatkowymi na Fidżi. Następnie sprawdź, czy podczas akwizycji obrazu nie ma ruchu lub lekkiego dryftu zwierzęcia lub segmentu aksonu. Użyj wtyczki StackReg z opcją transformacji sztywnego ciała, aby skorygować dowolny ruch lub dryfowanie.

Zastosuj narzędzie do linii segmentowej i dostosuj szerokość linii, aby dopasować ją do średnicy aksonu. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy ikonę linii segmentowanej, aby narysować linię wzdłuż segmentu aksonu do analizy. Teraz za pomocą wtyczki Fiji KymoReslice Wide wygeneruj kimograf, ustawiając maksymalną wartość intensywności na całej szerokości linii w ustawieniach parametrów.

Za pomocą narzędzia linii prostej śledź zdarzenia transportu w kimografie. Śledź poszczególne zdarzenia transportowe i zapisuj każdą linię w menedżerze ROI. Na Fidżi wybierz parametry pomiaru, takie jak powierzchnia, prostokąt ograniczający, średnia wartość szarości i średnica Fereta.

Następnie wklej tabelę wyników do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia. Pomnóż szerokość przez rozdzielczość kamery, aby uzyskać długość przebiegu w mikrometrach. Aby określić czas trwania zdarzenia ruchu, pomnóż wysokość przez czas akwizycji między kolejnymi punktami czasu.

Oblicz czas pauzy jako czas trwania między dwoma kolejnymi ruchami, w których prędkość wynosi zero. Znormalizuj łączną liczbę zdarzeń do całkowitej długości kimografu dla liczby zdarzeń na minutę i segmentu długości aksonu. Korzystając z narzędzia Kąt Fereta, kategoryzuj zdarzenia na transport następczy i wsteczny.

W przypadku kymografów generowanych przez narysowanie linii odcinkowej od bliższej do dystalnej należy użyć kąta Fereta, aby określić kierunkowość każdego zdarzenia.