Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans
16 lutego 2024
Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.
Klasyczne badania powszechnie wykorzystują fluorescencyjne nienaruszone białka do wizualizacji transportu eksonów, ale endogenne zachowanie ładunku jest różne. Poziomy białek endogennych sprawiają, że wizualizacja jest trudna. Oferujemy pomysły na optymalizację warunków akwizycji w celu lepszej wizualizacji endogennego GFP Rab-3, który znakuje prekursory pęcherzyków synaptycznych.
Obfitość białek cytozolowych w polu transportu aksonalnego utrudnia wizualizację ich dynamiki przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten sugeruje zastosowanie etapu ablacji wraz z podejściami do etykietowania kontrolującego czasowo w celu przezwyciężenia tych wyzwań. Niedawno udało nam się zwizualizować transport aksonalny endogennego widma, optymalizując parametry akwizycji opisane w tym protokole, w połączeniu z naszym podejściem do etykietowania kontroli czasowej.
Pozwoliło nam to zidentyfikować pierwsze elementy maszyn, które pośredniczą w transporcie. Na początek wyjmij płytki pożywki dla nicieni z Caenorhabditis elegans wyhodowanymi na trawniku z bakteriami. Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś robaki do kropelki 0,5 milimolowego lewamizolu i inkubuj je przez 20 minut.
Odpipetować 12 mikrolitrów M9 medium do 10% plastra agarozowego na szkiełku podstawowym. Za pomocą wykałaczki do włosów zamontuj od 10 do 20 nicieni z kropli lewamizolu w kropli M9 na plastrze agarozy. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli i obróć ją o 45 stopni, aby zobrazować transport w aksonie DA-9.
Następnie uszczelnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym lepką wazeliną o konsystencji żelu. Na początek weź zjeżdżalnię Caenorhabditis elegans przygotowaną do obrazowania. Obserwuj szkiełko pod soczewką o powiększeniu od czterech do 20 razy, aby zlokalizować nicienie.
Zapamiętaj ich pozycje, a następnie przełącz się na obiektyw o powiększeniu 63-krotnym, aby uzyskać szczegółowe obrazowanie. Przechwyć początkowy obraz, aby ocenić parametry akwizycji. Monitoruj intensywność sygnału za pomocą histogramu intensywności i w razie potrzeby zwiększ intensywność lasera wzbudzenia.
Następnie, za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów, wybiel obszar aksonu, który ma być analizowany. Porównaj intensywność sygnału przed i po etapie wybielania, aby określić skuteczność wybielania. Grupowanie dwa na dwa służy do zwiększania intensywności sygnału poszczególnych zdarzeń transportowych.
Skróć czas ekspozycji i użyj rozdzielczości czasowej od 300 do 700 milisekund między kolejnymi punktami czasowymi, aby śledzić zdarzenia transportu RAB-3. Nagraj upływ czasu trwający od jednej do trzech minut w oparciu o intensywność sygnału i częstotliwość zdarzeń transportowych. Na początek nagraj film poklatkowy endogennego GFP RAB-3 w strefie asynaptycznej aksonu DA-9 u żywego Caenorhabditis elegans.
Zaimportuj plik z danymi poklatkowymi na Fidżi. Następnie sprawdź, czy podczas akwizycji obrazu nie ma ruchu lub lekkiego dryftu zwierzęcia lub segmentu aksonu. Użyj wtyczki StackReg z opcją transformacji sztywnego ciała, aby skorygować dowolny ruch lub dryfowanie.
Zastosuj narzędzie do linii segmentowej i dostosuj szerokość linii, aby dopasować ją do średnicy aksonu. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy ikonę linii segmentowanej, aby narysować linię wzdłuż segmentu aksonu do analizy. Teraz za pomocą wtyczki Fiji KymoReslice Wide wygeneruj kimograf, ustawiając maksymalną wartość intensywności na całej szerokości linii w ustawieniach parametrów.
Za pomocą narzędzia linii prostej śledź zdarzenia transportu w kimografie. Śledź poszczególne zdarzenia transportowe i zapisuj każdą linię w menedżerze ROI. Na Fidżi wybierz parametry pomiaru, takie jak powierzchnia, prostokąt ograniczający, średnia wartość szarości i średnica Fereta.
Następnie wklej tabelę wyników do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia. Pomnóż szerokość przez rozdzielczość kamery, aby uzyskać długość przebiegu w mikrometrach. Aby określić czas trwania zdarzenia ruchu, pomnóż wysokość przez czas akwizycji między kolejnymi punktami czasu.
Oblicz czas pauzy jako czas trwania między dwoma kolejnymi ruchami, w których prędkość wynosi zero. Znormalizuj łączną liczbę zdarzeń do całkowitej długości kimografu dla liczby zdarzeń na minutę i segmentu długości aksonu. Korzystając z narzędzia Kąt Fereta, kategoryzuj zdarzenia na transport następczy i wsteczny.
W przypadku kymografów generowanych przez narysowanie linii odcinkowej od bliższej do dystalnej należy użyć kąta Fereta, aby określić kierunkowość każdego zdarzenia.
Przegląd
To badanie koncentruje się na optymalizacji parametrów mikroskopii fluorescencyjnej w celu poprawy wizualizacji transportu aksonowego endogennych oznaczonych ładunków w żywych nicieniach. Podejście ma na celu rozwiązanie problemów związanych z obfitością białek cytozolowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Transport aksonowy
Tło
- Zachowanie endogennych ładunków różni się od zachowania fluorescencyjnych nienaruszonych białek.
- Wizualizacja białek endogennych może być wyzwaniem ze względu na ich poziomy.
- Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna ma problemy z dynamiką białek cytozolowych.
- Optymalizacja parametrów akwizycji jest kluczowa dla skutecznej wizualizacji.
Cel badania
- Poprawić wizualizację endogennego GFP Rab-3, który oznacza prekursory wezykul synaptycznych.
- Dostarczyć protokół optymalizacji warunków akwizycji mikroskopicznej.
- Poprawić zrozumienie dynamiki transportu aksonowego w żywych organizmach.
Zastosowane metody
- Optymalizacja parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wdrożenie etapów ablacji w procesie obrazowaniowym.
- Kontrola czasowa podejść do oznaczania w celu poprawy wizualizacji.
- Zastosowanie protokołu do wizualizacji endogennego transportu spektratem.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja transportu aksonowego endogennych ładunków.
- Ulepszone warunki obrazowań prowadziły do jaśniejszego obserwowania dynamiki.
- Wykazano skuteczność zaproponowanych strategii optymalizacji.
- Dostarczono wglądu w zachowanie białek endogennych w żywych neuronach.
Wnioski
- Optymalizacja parametrów mikroskopii jest niezbędna do badania transportu aksonowego.
- Kontrola czasowa i etapy ablacji poprawiają wizualizację endogennych ładunków.
- Ten protokół może być stosowany w dalszych badaniach w dziedzinie neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust visualization of axonal transport in living C. elegans enables high-confidence interrogation of neuronal cargo dynamics, supporting early discovery and mechanistic de-risking in neurobiology-focused pipelines. Optimized fluorescence microscopy parameters for endogenously labeled cargos address key challenges in signal detection and quantitative measurement, directly impacting assay development and target validation. These advances facilitate reproducible, quantitative workflows essential for translational neuroscience and neurodegeneration research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of endogenous cargo transport, reducing reliance on overexpression artifacts.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transport machinery components in live neuronal systems.
- Improves predictive confidence in target engagement and functional validation studies.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized acquisition and analysis parameters for reproducible transport assays.
- Facilitates quantitative measurement of transport events, run lengths, and directionality.
- Prepares validated imaging workflows for downstream compound screening or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant neuronal transport phenotypes in preclinical models.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to translational biomarker development.
- Supports risk-adjusted advancement of neurobiology programs by providing robust functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative, reproducible imaging of axonal transport in live model organisms.
- Discovery Biology: Provides high-content data for hypothesis testing and pathway clarification in neuronal transport.
- Screening: Delivers assay-ready imaging parameters and quantitative outputs for comparative studies.
- Analytics: Generates kymographs and transport metrics for statistical analysis of cargo dynamics.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant phenotypes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse neurobiology research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal transport studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of imaging-based assays.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiology and neurodegeneration programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and live imaging of model organisms.
- Demands access to high-resolution imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., Fiji).
- Necessitates cross-team standardization of acquisition and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different cargo types or neuronal subtypes.
- Signal intensity limitations of endogenous labeling must be addressed through protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:05
Handling and Preparation of Caenorhabditis elegans for Live Imaging
2:00
Visualizing Axonal Transport in a Live Caenorhabditis elegans Worm
3:20
Generating a Kymograph and Measuring Individual Transport Events in a Live Caenorhabditis elegans Worm
