Name: Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans za pomocą lipofilowego barwnika witalnego DiI (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji struktur kutikularnych Caenorhabditis elegans za pomocą barwnika DiI. Technika fluorescencyjna pozwala obserwować alae i struktury pierścieniowe w żywych nicieniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske oraz H-C. Hsiao za pomocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana z funduszy startowych Departamentu Medycyny Molekularnej i Komórkowej TAMHSC. Mikroskop konfokalny typu compound scope oraz tarcza wirująca zostały zakupione ze środków udostępnionych przez departament oraz Biuro Dziekana TAMHSC. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez National Center for Research Resources. Szczep pRF4 (rol-6(su1006)) był darem od A. Fire.

1. Przygotowanie barwnika DiI
<ol>
 <li>Przygotować roztwór zapasowy DiI (Biotium, Inc., Hayward, CA) o stężeniu 20 mg/mL w DMF. DiI jest światłoczuły, dlatego należy chronić go przed światłem, owijając naczynie folią aluminiową.</li>
 <li>Przygotować roztwór roboczy DiI, dodając 0,6 μL roztworu zapasowego DiI do 399,4 μL M9 dla każdej populacji. Powinno to zapewnić końcowe stężenie robocze 30 μg/mL DiI w M9. Procedurę tę można przeskalować w celu jednoczesnego barwienia wielu populacji. Należy chronić DiI przed światłem, owijając probówkę lub probówki folią aluminiową.</li>
</ol>
2. Przygotowanie nicieni
<ol>
 <li>Należy użyć szalki 60 mm zawierającej populację niekontaminowanych nicieni. Zwierzęta z szalki należy wypłukać roztworem 0,5% Triton X-100 w buforze M9, delikatnie mieszając płyn ruchem okrężnym po powierzchni szalki, aby odczepić wszystkie larwy i osobniki dorosłe. Wypłuczyny należy przenieść do sterylnej probówki 1,5 mL.</li>
 <li>Zwierzęta należy natychmiast odwirować przy 2000 rpm przez 30 sec. Należy usunąć i odrzucić jak największą ilość supernatantu, uważając, aby nie zaburzyć osadu zwierząt na dnie probówki.</li>
 <li>Aby zmniejszyć ilość pozostałego Triton X-100, należy wypłukać zwierzęta buforem M9, odwirować i usunąć supernatant. Krok ten należy powtórzyć raz.</li>
 <li>Do probówki należy dodać 400 μL roboczego roztworu DiI w buforze M9 i krótko wymieszać na wirówce vortex, aby resuspenderć zwierzęta w roztworze.</li>
 <li>Probówkę należy inkubować w temperaturze 20°C, potrząsając poziomo przez 3 godziny przy 350 rpm w warunkach ochrony przed światłem. W razie potrzeby zwierzęta można inkubować do 16 godzin w celu barwienia.</li>
 <li>Aby zmniejszyć ilość niezwiązanego barwnika, należy odwirować zwierzęta przy 2000 rpm przez 20 sec. Należy usunąć i odrzucić jak największą ilość supernatantu, nie zaburzając osadu zwierząt.</li>
 <li>Zwierzęta należy resuspenderć w 400 μL buforu M9 i wylać płyn na wolną od bakterii część szalki z agarem NGM zaszczepionej E. coli OP50. Należy pozwolić zwierzętom na regenerację przez co najmniej 30 minut. W czasie regeneracji zwierzęta powinny oddalić się od płynu barwiącego DiI i przejść na pożywkę. Krok ten redukuje fluorescencję tła pochodzącą od wolnego DiI.</li>
</ol>


3. Montowanie i obserwacja preparatów
<ol>
 <li>Rozpuścić 4% agar w wodzie, używając autoklawu lub kuchenki mikrofalowej.</li>
 <li>Przygotować wielorazowe dystanse, które zapewnią jednorodną grubość podkładki agarowej, nakładając dwie warstwy taśmy laboratoryjnej na szkiełko przedmiotowe. Przygotować łącznie dwa takie szkiełka z dystansami.</li>
 <li>Umieścić czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy dwoma szkiełkami z dystansami. Nanieść pipetą około 150 μL (cztery krople) roztopionego 4% agaru na środek czystego szkiełka. Szybko przykryć roztopiony agar dodatkowym szkiełkiem, aby utworzyć podkładkę agarową. Ostrożnie zdjąć szkiełko przykrywowe, dbając o to, by podkładka pozostała wycentrowana na górnej powierzchni szkiełka montażowego.</li>
 <li>Nanieść pipetą około 5 μL środka znieczulającego dla nicieni (na przykład lewamisol w stężeniu 100 μM – 1 mM) na podkładkę.</li>
 <li>Umieścić 8 – 12 zwierząt w środku znieczulającym i przykryć szkiełkiem cover slip.</li>
 <li>Obserwować zwierzęta przy użyciu mikroskopu złożonego lub konfokalnego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu co najmniej 40x oraz filtr DSRed/TRITC (lub inny kompatybilny). Maksimum wzbudzenia fluorescencji DiI wynosi 549 nm, a maksimum emisji dla związanego barwnika wynosi 565 nm (Biotium, Inc., Hayward, CA).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
DiI barwi kutykulę dzikich oraz zmutowanych C. elegans. Powierzchnia kutykuli zawiera pierścienie oddzielone bruzdami obwodowymi, a w niektórych stadiach grzbietami podłużnymi zwanymi alae. Każde stadium rozwojowe posiada struktury kutykularne o odmiennym składzie2. Grbiety lub bruzdy zarówno alae, jak i pierścieni barwią się fluorescencyjnie, w zależności od składu powierzchni, przez wszystkie stadia larwalne i dorosłe i pozostają widoczne do jednego dnia po regeneracji przy użyciu tej metody. Czasami obserwuje się fluorescencyjne plamki w tle (Rycina 2F, G), lecz nie dzieje się to rutynowo (Rycina 1, Rycina 2A-E, H, I). Wszystkie obrazy zostały wykonane za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym lub, gdzie zaznaczono, szerokopolowego (wf) mikroskopu złożonego.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej C. elegans z zaznaczoną ekspresją komórkową, badanie lokalizacji białek." src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. DiI barwi kutykulę oraz neurony eksponowane na środowisko. Zwierzę w stadium L2. Powiększenie 630x. Części obrazu mozaikowego zostały zarejestrowane przy użyciu oprogramowania iVision-Mac (BioVision Technologies, Exton, PA). Obrazy połączono w programie Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Pasek skali = 10 μm. DiI barwi również fluorescencyjnie neurony sensoryczne amfid i fazmid odpowiednio w głowie i ogonie (strzałki zaznaczają niektóre z nich).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna włókien mięśniowych; schemat; analiza rozmieszczenia białek; strzałki wskazują miejsca." src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. DiI fluorescencyjnie barwi kutykulę C. elegans na wszystkich etapach rozwoju pozazarodkowego. Powiększenie 630x. Pasek skali = 10 μm. Barwienie zwierząt typu dzikiego w stadiach A) L1; B) L2; C) dauer; D) L3; E) L4; oraz F) dorosłych. Alae oraz grzebienie pierścieniowate są zabarwione fluorescencyjnie u zwierząt w stadium L1 i dauer (A, C). DiI barwi grzebienie pierścieniowate u zwierząt w stadium L2 (B). Rowki pierścieniowate są zabarwione u zwierząt w stadiach L3 i L4 (D, E). Rowki alae i pierścieni są zabarwione u zwierząt dorosłych (F-H). Alae składają się z dwóch, pięciu lub trzech grzebieni (odpowiednio u zwierząt w stadium L1, dauer lub dorosłych), które biegną wzdłuż ciała zwierzęcia (strzałki)16. Pierścienie tworzą obwodowe grzebienie wokół zwierzęcia (groty strzałek, F i J). Kutykula dorosłych zwierząt mutantów wykazuje umiarkowane defekty organizacji kutykularnej (G-H). G) Grzebienie alae są nieciągłe (wf). H) Nadliczbowe grzebienie alae są zrośnięte i rozgałęzione lub dwudzielne (wf). Mutanty genów kolagenu wykazują defekty organizacji alae i pierścieni (I-J). I) U zwierząt transgenicznych nadekspresujących pRF4 (rol-6(su1006)) grzebienie alae przebiegają pod kątem do długości ciała zwierzęcia. J) Pierścienie u zwierząt transgenicznych nadekspresujących pRF4 (rol-6(su1006)) wykazują nieregularny wzór. 
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna struktur nicieni; zaznaczone komórki nerwowe. Wynik eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zewnętrzne struktury morfologiczne wybarwione barwnikiem DiI. Powiększenie 630x. Paski skali = 10 μm. DiI uwidacznia również inne cechy zewnętrzne, w tym A) srom vulva dorosłego hermafrodyty, B) promienie i wachlarz ogona dorosłego samca oraz C) kolec ogona hermafrodyty (rozwidlony w tym tle mutacyjnym).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej C. elegans, z wyróżnionymi komórkami nerwowymi." src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Kutykula barwi się DiI dłużej niż neurony eksponowane na środowisko zewnętrzne. Powiększenie 630x. Pasek skali = 10 μm. Po dwóch godzinach barwienia neurony sensoryczne amfidu (nie pokazano) i fazmidu (strzałki) są odpowiednio zabarwione. W przeciwieństwie do nich, kutykula młodszych osobników jest zabarwiona tylko częściowo, w formie plam (grot strzałki).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Płukanie</td>
 <td>Roztwór barwiący (+ DiI)</td>
 <td>Czas inkubacji</td>
 <td>Kutikula zabarwiona</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>2 hrs</td>
 <td>nie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>3 hrs</td>
 <td>nie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>M9</td>
 <td>2 hrs</td>
 <td>częściowo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>M9</td>
 <td>3 hrs</td>
 <td>tak</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>H20</td>
 <td>2 hrs</td>
 <td>częściowo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>M9 + 0.5% Triton X-100</td>
 <td>H20</td>
 <td>3 hrs</td>
 <td>tak</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 
Tabela 1. Barwienie kutykuli w różnych warunkach. Przetestowano różne roztwory i czasy inkubacji w celu optymalizacji barwienia kutykuli u zwierząt. H20, sterylna woda destylowana. Barwienie częściowe oznacza niejednorodne barwienie kutykuli larwalnej (Rycina 4), podczas gdy kutykula osobników dorosłych barwi się konsekwentnie.

<ol><li>Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+of+Caenorhabditis+elegans%3A+its+isolation+and+partial+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).</li>
<li>Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle+of+Caenorhabditis+elegans.+II.+Stage-specific+changes+in+ultrastructure+and+protein+composition+during+postembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development.</a> Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).</li>
<li>Hall, D., Altun, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+D+%22C.+elegans+Atlas%22">C. elegans Atlas</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).</li>
<li>Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sqt-1+gene+of+C.+elegans+encodes+a+collagen+critical+for+organismal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis.</a> Cell. 55, 555-565 (1988).</li>
<li>Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dpy-13%3A+a+nematode+collagen+gene+that+affects+body+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape.</a> Cell. 55, 567-576 (1988).</li>
<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+surface+proteins+of+wild+type+and+mutant+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).</li>
<li>Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+filaments+in+patterning+the+Caenorhabditis+elegans+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle.</a> Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).</li>
<li>Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zona+Pellucida+domain+containing+proteins%2C+CUT-1%2C+CUT-3+and+CUT-5%2C+play+essential+roles+in+the+development+of+the+larval+alae+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.%22%5BJournal%5D)">The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).</li>
<li>Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+collagen+genes.+Expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Genet. 16, 21-27 (2000).</li>
<li>Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+rol-6+gene%2C+which+interacts+with+the+sqt-1+collagen+gene+to+determine+organismal+morphology%2C+encodes+a+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen.</a> Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).</li>
<li>Thein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exoskeleton+collagen+COL-19%3A+an+adult-specific+marker+for+collagen+modification+and+assembly%2C+and+the+analysis+of+organismal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology.</a> Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).</li>
<li>McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+interacting+collagens+form+functionally+distinct+substructures+within+a+Caenorhabditis+elegans+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).</li>
<li>Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+expression+of+male+copulatory+bursa+surface+markers+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 103, 485-495 (1988).</li>
<li>Tong, Y. G., Burglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+for+dye-filling+of+sensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).</li>
<li>Singh, R. N., Sulston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li>
<li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+osm-6%2C+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148, 187-200 (1998).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda barwienia DiI umożliwia stosunkowo szybką i wygodną wizualizację kutykuli u C. elegans. Dzięki adaptacji i optymalizacji metody powszechnie stosowanej do obrazowania sensorycznych neuronów eksponowanych na środowisko zewnętrzne15,17, DiI może być wykorzystywane do fluorescencyjnego barwienia zarówno skrzydełek (alae), jak i struktur pierścieniowatych (ryciny 1 i 2), a także sromsika, ogona samca oraz kolca ogonowego hermafrodyty (rycina 3). Stwierdziliśmy, że skład roztworu ...

<table><tbody><tr><td>DiI (1,1&amp;rsquo;-dioctadecylo-3,3,3&amp;rsquo;,3&amp;rsquo;-tetrametylindokarbocyjaninę nadchlorczanową)</td><td>Biotium, Inc.</td><td>60010</td><td>Rozcieńczenie roztworu zapasowego:&lt;br/&gt;20 mg/mL w DMF&lt;br/&gt;rozcieńczenie robocze: 30 mg/mL</td></tr><tr><td>DMF (Dimetyloformamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (Oktylofenoksy-polyetoksyetanol)</td><td>VWR international</td><td>EM-9410</td><td></td></tr><tr><td>M9 (22mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 42mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 86mM NaCl, 1mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NGM (Pożywka do wzrostu nicieni)</td><td>IPM Scientific, Inc.</td><td>11006-501</td><td>Można przygotować zgodnie z protokołem agaru NGM&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>EMD Millipore</td><td>1.01614</td><td>4% w wodzie</td></tr><tr><td>Lewamizol (Wodorochlorek lewamizolu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>100 &amp;#x03BC;M - 1 mM lewamizolu, zależnie od potrzeb</td></tr><tr><td>Przedmiotowe szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR international</td><td>16005-106</td><td></td></tr><tr><td>Osłonki do szkiełek mikroskopowych</td><td>VWR international</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>A1m</td><td>Stosować obiektywy dostosowane do potrzeb eksperymentu</td></tr><tr><td>Filtr TRITC lub inny kompatybilny filtr</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49005</td><td>Zestaw filtrów napylanych ET - DSRed (TRITC/Cy3)</td></tr></tbody></table>

wizualizacja struktur kutykularnych caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego dii

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Kutikula C. elegans jest wysoce odporną strukturą otaczającą zewnętrzną część organizmu1-4. Kutikula nie tylko chroni zwierzę przed wpływem środowiska, ale także determinuje kształt ciała i odgrywa rolę w motyliczności4-6. Kutikula składa się z kilku warstw wydzielanych przez komórki epidermy, w tym z zewnętrznej warstwy lipidowej7.
Obwodowe fałdy w kutykuli, nazywane pierścieniami (annuli), tworzą wzór wzdłuż ciała zwierzęcia i są obecne na wszystkich etapach rozwoju8. Alae to fałdy podłużne, które występują w określonych fazach rozwoju, w tym w stadium L1, dauer oraz w stadium dorosłym2,9. Mutacje w genach wpływających na organizację kolagenu kutykularnego mogą zmieniać strukturę kutykuli oraz morfologię ciała zwierzęcia5,6,10,11. Chociaż obrazowanie kutykuli przy użyciu mikroskopii złożonej z optyką DIC jest możliwe, obecne metody uwydatniające struktury kutykularne obejmują ekspresję fluorescencyjnych transgenów12, barwienie przeciwciałami13 oraz mikroskopię elektronową1. Do wizualizacji glikoprotein kutykularnych stosowano również znakowaną aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA), jednak ma ona ograniczone możliwości w rozdzielaniu drobniejszych struktur kutykularnych14. Obserwowano barwienie powierzchni kutykuli przy użyciu barwników fluorescencyjnych, lecz nigdy nie zostało ono szczegółowo scharakteryzowane15. Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego lipofilnego barwnika DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na środowisko. Ten zoptymalizowany protokół barwienia DiI jest prostą i niezawodną metodą wysokorozdzielczej fluorescencyjnej wizualizacji pierścieni, alae, wulwy, ogona samca oraz kolca ogona hermafrodyty u C. elegans.

Przedstawiamy metodę wizualizacji kutykuli u żywych C. elegans z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego DiI (perchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny), który jest powszechnie stosowany u C. elegans do wizualizacji neuronów eksponowanych na działanie czynników zewnętrznych. Dzięki temu zoptymalizowanemu protokołowi alae oraz pierścieniowe struktury kutykularne zostają zabarwione przez DiI i poddane obserwacji przy użyciu mikroskopu złożonego.

Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI

Kutykula C. elegans to wysoce odporna struktura otaczająca zewnętrzną część organizmu1-4. Kutykula nie tylko chroni zwierzę przed...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja kutykuli u przezroczystych, żywych osobników C. elegans przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego Dye Eye. Jest to realizowane poprzez przygotowanie populacji nicieni do barwienia. Następnie do populacji dodaje się rozcieńczony Dye Eye i poddaje inkubacji.Następnie zwierzęta wyjmuje się z roztworu barwiącego. Obrazowanie fluorescencyjne kutikuli zabarwionej barwnikiem Dai ukazuje szczegóły powierzchni, w tym struktury rozrodcze Ailey i Ann eye oraz inne zewnętrzne cechy morfologiczne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wizualizacji kutikuli u tego przezroczystego organizmu, takimi jak bezpośrednie obrazowanie, fluorescencja, ekspresja transgenów, barwienie przeciwciałami, mikroskopia elektronowa i znakowana aglutynina z zarodków pszenicy, jest to, że metoda ta jest łatwa do przeprowadzenia, stosunkowo szybka i niedroga, a także zapewnia wysoką rozdzielczość struktur kutikularnych u żywych zwierząt.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w wielu dziedzinach wykorzystujących model systemowy C. elegans oraz jego kutykulę, takich jak sekrecja komórkowa i organizacja kutykuli, rozwój komórek naskórka, heterochroniczne szlaki genowe, odporność wrodzona, rozwój cech morfologicznych oraz ewolucja nicieni. Procedurę zademonstruje Robbie Schultz, doktorant z mojego laboratorium. Podczas pracy z barwnikiem DiI należy pamiętać, że jest on światłoczuły.Zawsze należy chronić D eye przed światłem, owijając je folią. Należy również stosować rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ DMF jest toksyczny, a DAI jest rakotwórczy. Cyjanek Dai jest bardzo silny.Standardowe stężenie roztworu roboczego to 30 µg/mL DII w M9; pojedyncza populacja wymaga zaledwie 400 µL roztworu roboczego. Należy rozpocząć od płytki 60 mm z populacją niekontaminowanych nicieni. Zwierzęta z płytki należy wypłukać w 1,5 mL 0,5% Triton X 100.W buforze M nine delikatnie zamieszaj ciecz kolistymi ruchami, aby odseparować wszystkie larwy i osobniki dorosłe, a następnie przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml. Natychmiast odwiruj zwierzęta z prędkością 2000 RRP M przez 30 sekund, aby zebrać je na dnie probówki. Odlej jak najwięcej nadsączu, uważając, aby nie poruszyć osadu ze zwierzętami.Należy zachować ostrożność i unikać pobierania zbyt dużej ilości materiału. Przemyć zwierzęta 1 mL buforu M9. Odwiruj i usuń nadsącz.Powtórz płukanie. Ponownie odwiruj próbkę i usuń nadsącz. Następnie do probówki dodaj 400 µL roztworu Dai o stężeniu 30 µg/mL w buforze M9.Krótko wymieszaj probówkę w vortexie, aby resuspender zwierzęta. Następnie inkubuj probówkę w pozycji poziomej w temperaturze 20 °C przez okres od 3 do 16 godzin przy 350 RPM w warunkach chronionych przed światłem. Czas trwania tych ostatnich kroków jest istotny.Po pierwsze, należy wypłukać Triton X, zanim usunie on lipidy, z którymi wiąże się barwnik. Po drugie, zwierzęta muszą być barwione w roztworze barwnika wystarczająco długo, aby kutykula została zabarwiona jednorodnie. Następnie zwierzętom należy pozwolić na regenerację na pożywce przez czas wystarczający do usunięcia niezwiązanego barwnika.Po zakończeniu barwienia odwirować zwierzęta i usunąć roztwór barwnika. Przemyć zwierzęta jednym mililitrem M9. Aby usunąć niezwiązany barwnik, odwirować zwierzęta i usunąć nadsącz.Ponownie zawiesić zwierzęta w 400 µL buforu M9 i przelać je na wolną od bakterii część mikroplatek NGM. Po zaszczepieniu bakteriami E. coli szczep OP50 pozostawić zwierzęta do regeneracji w ciemności przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż przez jeden dzień, ponieważ fluorescencja barwnika zanika w czasie regeneracji. Zwierzęta powinny odpełznąć z cieczy barwiącej na pożywkę.Zwierzęta te są łatwiejsze do obrazowania, ponieważ wykazują mniejszą fluorescencję tła pochodzącą z wolnego barwnika w oku. Należy rozpocząć od przygotowania podkładki agarowej na szkiełku przedmiotowym, stosując dwa dystanse w celu zapewnienia jednolitej grubości użytej podkładki agarowej.Dystans tworzy się poprzez nałożenie dwóch warstw taśmy laboratoryjnej na szkiełko przedmiotowe. Dystansy można wykorzystywać wielokrotnie. Następnie należy umieścić czyste szkiełko przedmiotowe wzdłuż między dwoma szkiełkami z dystansami i nanieść pipetą około 150 µL roztopionego agaru 4.Na środek czystego szkiełka przedmiotowego. Szybko przykryć stopione AER dodatkowym szkiełkiem umieszczonym prostopadle nad AER oraz obydwoma dystansami, aby utworzyć podkładkę agarową. Ostrożnie zsunąć szkiełko przykrywowe, utrzymując podkładkę wycentrowaną na górnej powierzchni szkiełka montażowego.Teraz nanieś pipetą 5 µL anestetyka dla nicieni na podkładkę, umieść od 8 do 12 zwierząt w anestetyku i delikatnie przykryj szkiełkiem podstawowym. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu co najmniej 40 x oraz filtr TRITC lub inny kompatybilny filtr. Maksimum wzbudzenia fluorescencyjnego barwnika Dye I wynosi 549 nm, a maksimum emisji 565 nm.W przypadku obrazowania związanych zgonów ta część protokołu jest najtrudniejsza. Pokazujemy, jak montować zwierzęta do obrazowania, jednak wymagane jest odpowiednie przeszkolenie w obsłudze mikroskopu konfokalnego lub złożonego, którego będziesz używać. Stwierdzono, że zastosowanie obiektywu o powiększeniu co najmniej 60 x jest optymalne dla rozdzielczości szczegółów uwidocznionych za pomocą zastosowanej metody barwienia.Każde z obrazów w tej sekcji zostało wykonane przy użyciu obiektywu 63 x w okresie pozazarodkowym C. elegans. Powierzchnia kutykuli jest podzielona pierścieniowo przez bruzdy okrężne, a w niektórych stadiach występują żebra podłużne nazywane ailey. Każde z obrazów w tej sekcji zostało wykonane przy użyciu obiektywu 63 x w okresie pozazarodkowym C. elegans.Powierzchnia kutykuli zawiera pierścienie oddzielone bruzdami okrężnymi, a w niektórych stadiach grzbietami podłużnymi zwanymi aley. Każde stadium rozwojowe posiada struktury kutykularne o odmiennym składzie i wzorach, w tym grzbiety lub bruzdy zarówno aley, jak i Aly, które barwi się fluorescencyjnie w zależności od składu powierzchni.W każdej z faz larwalnych oraz w stadium dorosłym, przy zastosowaniu tej metody barwienia, pozostają one widoczne do jednego dnia po odzyskaniu. Czasami obserwuje się fluorescencyjne plamki w tle, jednak nie dzieje się to rutynowo. Jest to kutykula dorosłych osobników mutantów wykazująca umiarkowane defekty organizacji kutykuli.Grzebienie ailey są nieciągłe i nadliczbowe. Grzebienie ailey są zlane i rozgałęzione lub dwudzielne, co stanowi powszechny marker transgeniczny. Dominujący allel roll six powoduje skręcanie kutykuli, co można zaobserwować w obrębie ailey i co może prowadzić do nieregularnego rozmieszczenia pierścieni.Barwnik Dai barwi również inne zewnętrzne struktury kutykuli, w tym dorosłego hermafrodytę, wulwę oraz wyniesienie i wachlarz ogona dorosłego samca; Dai może również uwydatnić subtelne defekty morfologii zewnętrznej, takie jak ten rozwidlony ogon, przy niewystarczającym barwieniu. Na przykład dwugodzinne barwienie prowadzi do niejednolitego zabarwienia kutykuli, choć neurony wystawione na działanie środowiska mogą zostać zabarwione. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, cały proces może zająć cztery godziny, nie licząc obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak barwić C. elegans barwnikiem Dai w celu obserwacji kutykuli i innych zewnętrznych struktur morfologicznych.

visualization-caenorhabditis-elegans-cuticular-structures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans przy użyciu lipofilowego barwnika witalnego DiI

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Ten film opisuje protokół barwienia lipidów w całych, utrwalonych robakach za pomocą barwnika Nile Red. Aby zobaczyć neutralne lipidy w rdzeniu kropelek lipidów, zobrazuj zielone widma emisji barwionego C. elegans.

Barwienie czerwienią nilową C. elegans: metoda wizualizacji kropelek lipidów u zwierząt utrwalonych

Tutaj opisujemy technikę używaną do wizualizacji genomowego DNA u stałych, nienaruszonych nicieni. Film zawiera przykładowy protokół liczenia chromatyny w niezapłodnionych oocytach C. elegans.

Utrwalanie etanolu i barwienie DAPI: metoda wizualizacji DNA u C. elegans

Po ekspozycji na specyficzne stresory środowiskowe, nicień Caenorhabditis elegans przechodzi intensywną plastyczność fenotypową, aby wejść w odporne na stres stadium młodociane.  Przedstawiono metody kontrolowanej indukcji i obrazowania neuroplastyczności w okresie dauera.

In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę wizualizacji struktur kutikularnych Caenorhabditis elegans za pomocą barwnika DiI. Technika fluorescencyjna pozwala obserwować alae i struktury pierścieniowe w żywych nicieniach.

Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans z użyciem lipofilowego barwnika witalnego DiI

Przeglądaj więcej filmów