Wizualizacja struktur kutykularnych Caenorhabditis elegans za pomocą lipofilowego barwnika witalnego DiI

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja naskórka w przezroczystej, żywej morskiej elegancji przy użyciu czerwonego fluorescencyjnego lipofilowego barwnika barwnikowego oka. Osiąga się to poprzez przygotowanie populacji nicieni do barwienia. Następnie do populacji dodaje się rozcieńczone oko barwnikowe i pozwala się je na inkubację.

Następnie zwierzęta są odzyskiwane z roztworu barwiącego. Obrazowanie fluorescencyjne barwionego naskórka Dai pokazuje szczegóły na powierzchni, w tym struktury rozrodcze oka Ailey i Ann i inne zewnętrzne cechy morfologiczne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wizualizacji naskórka w tym przezroczystym organizmie, takimi jak bezpośrednie obrazowanie, fluorescencja, ekspresja transgenu, barwienie przeciwciał, mikroskopia elektronowa i znakowana aglutynina z kiełków pszenicy, jest to, że technika ta jest łatwa do wykonania, stosunkowo szybka i niedroga, a także zapewnia piękną rozdzielczość struktur kutykularnych u żywych zwierząt.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu dziedzinach, w których wykorzystuje się system modelu morskiej elegancji i jego naskórek, takie jak wydzielanie komórek i organizacja kutykul, rozwój komórek naskórka, heteroprzewlekłe szlaki genowe, odporność wrodzona, rozwój cech morfologicznych i ewolucja nicieni. Procedurę zademonstruje Robbie Schultz, doktorant z mojego laboratorium. Podczas pracy z D Eye należy pamiętać, że jest on wrażliwy na światło.

Zawsze chroń oko D przed światłem, owijając je folią. Noś również rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ DMF jest toksyczny, a DAI to samochód. Cyjanek Dai jest bardzo silny.

Rozcieńczenie robocze o standardowej mocy wynosi 30 mikrogramów na mililitr DII w M dziewięć, a pojedyncza populacja wymaga tylko 400 mikrolitrów rozcieńczenia roboczego. Zacznij od 60-milimetrowej płytki wypełnionej nieskażonymi nicieniami. Umyj zwierzęta z talerza w 1,5 mililitra 0,5%Triton X 100.

W buforze M nine delikatnie zamieszaj płyn okrężnymi ruchami, aby poluzować wszystkie larwy i dorosłe zwierzęta, a następnie przenieś płyn do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast zakręć zwierzętami przy 2000 RRP M przez 30 sekund, aby zebrać zwierzęta na dnie tuby. Wyrzuć jak najwięcej supernatantu, nie przeszkadzając zwierzętom.

Bądź ostrożny, nie bądź chciwy. Umyj zwierzęta jednym mililitrem M dziewięć. Odwirować i usunąć supernatant.

Powtórz pranie. Ponownie zakręć w dół i usuń supernatant. Następnie po 400 mikrolitrach po 30 mikrogramów na mililitr Dai w M nine do probówki.

Krótko obrócić rurkę, aby ponownie zawiesić zwierzęta. Następnie potrząsaj probówką w temperaturze 20 stopni Celsjusza w pozycji poziomej przez trzy do 16 godzin w temperaturze 350 RP M w chronionym świetle. Czas wykonania tych kilku ostatnich kroków jest ważny.

Po pierwsze, Triton X musi zostać zmyty, zanim usunie lipidy, które wiąże dai. Po drugie, zwierzęta muszą być barwione w roztworze barwnika do oczu wystarczająco długo, aby naskórek był równomiernie zabarwiony. Nieco później zwierzęta powinny mieć możliwość powrotu do zdrowia po jedzeniu wystarczająco długo, aby usunąć niezwiązane oko.

Pod koniec barwienia odkręć zwierzęta i usuń roztwór barwnika. Umyj zwierzęta jednym mililitrem M nine. Aby usunąć niezwiązany barwnik, obrócić zwierzęta i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić zwierzęta w 400 mikrolitrach buforu M nine i wlać je na wolną od bakterii porcję mikropłytki NGM. Wysiane OP 50 E Coli pozwalają zwierzętom na regenerację w ciemności przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż jeden dzień, ponieważ fluorescencja barwnika zanika w czasie rekonwalescencji. Zwierzęta powinny odczołgać się od płynu barwiącego barwnik na pokarm.

Zwierzęta te są łatwiejsze do zobrazowania, ponieważ mają mniejszą fluorescencję tła z wolnego oka barwnikowego. Zacznij od przygotowania podkładki rolniczej na szkiełku Aby zapewnić jednolitą grubość użytej podkładki rolniczej. Dwie przekładki.

Przekładka jest wykonywana przez nałożenie dwóch kawałków taśmy laboratoryjnej na szklane szkiełko. Przekładki mogą być używane w nieskończoność. Następnie ułóż czyste szkiełko wzdłuż między dwoma szkiełkami dystansowymi, odpipetuj około 150 mikrolitrów stopionego czteroagaru.

Na środku czystego szkiełka podstawowego. Szybko przykryj stopiony AER dodatkowym szkiełkiem umieszczonym prostopadle nad AER i obiema przekładkami, tworząc podkładkę agarową. Ostrożnie zsuń suwak pokrywy, trzymając podkładkę wyśrodkowaną na górze prowadnicy montażowej.

Teraz odpipetuj pięć mikrolitrów środka znieczulającego nicienie na podkładkę, zamontuj od ośmiu do 12 zwierząt w znieczuleniu i delikatnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym mikroskopu. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego wyposażonego w obiektyw o powiększeniu co najmniej 40 x i filtr trissy lub inny kompatybilny filtr. Maksimum wzbudzenia fluorescencyjnego oka barwnikowego wynosi 549 nanometrów, a jego maksimum emisji 565 nanometrów.

W przypadku matryc oprawionych obrazowanie jest najtrudniejszą częścią tego protokołu. Pokazujemy, jak montować zwierzęta do obrazowania, ale musisz być odpowiednio przeszkolony w zakresie lunety złożonej lub konfokalnej, której będziesz używać. Stwierdziliśmy, że użycie obiektywu o powiększeniu co najmniej 60 x najlepiej nadaje się do rozdzielczości szczegółów oświetlonych metodą barwienia.

Każde ze zdjęć w tej sekcji zostało zrobione przy użyciu obiektywu o powiększeniu 63x w elegancji embrionalnej pieczęci plakatu. Na powierzchni kutykuli znajdują się corocznie oddzielone od siebie bruzdami obwodowymi, a w niektórych stadiach podłużne grzbiety zwane ailey. Każde ze zdjęć w tej sekcji zostało wykonane obiektywem o powiększeniu 63x w postembrionalnej elegancji C.

Na powierzchni kutykuli znajdują się roczne, oddzielone bruzdami obwodowymi, a w niektórych stadiach podłużne grzbiety zwane alejkami. Każde stadium rozwojowe ma struktury naskórka o wyraźnych kompozycjach i wzorach, grzbiety lub bruzdy zarówno barwnika alejowego, jak i fluorescencyjnego. W zależności od składu powierzchni.

We wszystkich stadiach larw i osobników dorosłych przy użyciu tej metody barwienia pozostają one widoczne do jednego dnia po wyzdrowieniu. Czasami obserwuje się fluorescencyjne plamki tła, ale nie rutynowo. Jest to naskórek dorosłych zmutowanych zwierząt wykazujących umiarkowane wady organizacji naskórka.

Grzbiety Aileya są nieciągłe i nadliczbowe. Grzbiety Aileya są zrośnięte i rozgałęzione lub rozwidlone, co jest powszechnym markerem transgenicznym. Dominujący allel sześciocylindrowy rolki powoduje skręcenie naskórka, co można zaobserwować w guzie i może powodować nieregularne wzory pierścieni

Dai barwi również inne zewnętrzne struktury naskórka, w tym dorosły hermafrodyta, srom i uniesienie ogona dorosłego samca, a fan dai może również podkreślić subtelne defekty w zewnętrznej morfologii, takie jak ten rozwidlony ogon, niewystarczające zabarwienie. Na przykład dwugodzinne barwienie prowadzi do niejednolitego barwienia naskórka, chociaż neurony narażone na działanie środowiska mogą plamić Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech godzin, nie wliczając w to obrazowania, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zabarwić morską elegancję za pomocą oka do obserwacji naskórka i innych zewnętrznych struktur morfologicznych.