Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Nasze badania koncentrują się na nowatorskich podejściach do regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki. Uważa się, że dysfunkcja nabłonka barwnikowego siatkówki odgrywa kluczową rolę w patofizjologii wielu chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej. Tak więc regeneracja tej warstwy komórek jest atrakcyjna z terapeutycznego punktu widzenia.

Wizualizacja anatomii strukturalnej siatkówki za pomocą immunohistochemii ma szerokie zastosowanie w badaniach siatkówki. W naszym laboratorium stwierdziliśmy, że uzyskanie użytecznych wyników z oczu królika jest trudne ze względu na artefakty tkankowe, takie jak przyczepy siatkówki i fałdy siatkówki. Pomimo tych wyzwań istnieje bardzo niewiele protokołów, które opisują skuteczne przetwarzanie tkanek siatkówki królika.

Protokół ten wprowadza kilka ważnych modyfikacji do standardowych technik przetwarzania tkanek, które skutkują doskonałymi sekcjami tkanki siatkówki królika. Badanie to może pozwolić naukowcom na uzyskanie lepszych wyników z ich badań, które obejmują zastosowanie immunohistochemii w modelach królików. Po wyłuszczeniu przezspojówkowym oka królika natychmiast umieścić w 50 mililitrach 4% paraformaldehydu i PBS na lodzie.

Po 15 minutach przenieś oko do 100-milimetrowego naczynia preparacyjnego i napełnij naczynie PBS, aby zapobiec wysuszeniu oka. Pod mikroskopem preparacyjnym, przy użyciu ostrza chirurgicznego, zacznij wykonywać nacięcie jeden milimetr przed rąbkiem, utrzymując je równolegle do płaszczyzny tęczówki. Włóż zakrzywione nożyczki do początkowego nacięcia i kontynuuj cięcie obwodowo, zachowując milimetrową odległość od rąbka.

Następnie usuń rogówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść rogówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji. Wykonaj wstępne cięcie zakrzywionymi nożyczkami przez tęczówkę.

Następnie przeciąć obwodowo wokół oka, podobnie jak w przypadku usunięcia rogówki, aby oddzielić tęczówkę od reszty tkanki. Usuń tęczówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść tęczówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji.

Po usunięciu rogówki i tęczówki umieść oko na 50 mililitrach 4% paraformaldehydu i umieść je na shakerze w celu delikatnego poruszenia. Pozostaw oko w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia umieść oko w naczyniu preparacyjnym i napełnij naczynie PBS.

Pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby ostrożnie chwycić przednią torebkę soczewki. Następnie ostrożnie włóż nożyczki do tylnej komory, ustawiając ostrza z tyłu wzdłuż soczewki. Wykonaj wstępne cięcie przez zonule soczewek za pomocą zakrzywionych nożyczek.

Kontynuuj wykonywanie małych nacięć na obwodzie przez strefy soczewek. Aby potwierdzić usunięcie soczewki, delikatnie chwyć przednią torebkę soczewki kleszczami i spróbuj ją podnieść. Po oddzieleniu umieść soczewkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji.

Umieść oko w 50 mililitrach 30% sacharozy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 do 48 godzin w celu krioprotekcji. Aby przyspieszyć krioprotekcję, zastąp początkowy roztwór sacharozy świeżym po ośmiu do 12 godzinach. Po zakończeniu krioochrony oka królika przenieś je z 30% roztworu sacharozy do 100-milimetrowego naczynia preparacyjnego.

Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie odwróć oko, aby usunąć nadmiar roztworu sacharozy z wewnętrznej części oka. Za pomocą chusteczki delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu sacharozy z zewnętrznej części oka. Napełnij jednorazową formę do zatapiania optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT na głębokość od 0,5 do jednego centymetra.

Umieść oko w formie do zatapiania skierowaną do góry i powoli wypełniaj wewnętrzną część oka związkiem OCT, unikając tworzenia się pęcherzyków. Gdy oko jest zanurzone w związku OCT i nie dotyka wewnętrznych powierzchni formy, owiń formę do zatapiania w parafinie i przechowuj ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść formę do zatapiania w naczyniu rozwarstwiającym.

Jeśli to możliwe, delikatnie usuń związek OCT z wnętrza oka za pomocą chusteczki. Przenieś oko do nowej formy do zatapiania wypełnionej świeżym związkiem OCT. Następnie napełnij formę tak, jak poprzednio, aby upewnić się, że końcowe podłoże do zatapiania jest wolne od zanieczyszczeń lub niedoskonałości.

Oznacz formę w celach orientacyjnych. Ustaw oko do góry w formie kriogenicznej, tak aby związek OCT wyściełał wewnętrzną siatkówkę. Użyj głowy nerwu wzrokowego jako punktu orientacyjnego do określenia górnej części oka.

Umieść oznaczoną formę do zatapiania na suchym lodzie, upewniając się, że oko nie dotyka wewnętrznych powierzchni formy ani nie jest wystawione na działanie powietrza. Zamontuj blok na kriostacie górną częścią oka skierowaną do góry, a dolną częścią w dół, a pozostałą rogówką i tęczówką skierowaną w prawo lub w lewo. Umieść świeże ostrze równolegle do pionowej osi oka, aby je przeciąć.

Po pocięciu odcinków i wysuszeniu przez noc umieść szkiełko w zamrażarce w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Obrazy fluorescencyjne całej kriosekcji siatkówki oka królika wykazały jednolitą pigmentowaną warstwę nabłonka pigmentu siatkówki bez znacznego oderwania od leżącej nad nią warstwy fotoreceptorów. Obraz przekroju siatkówki w jasnym polu dodatkowo pokazuje nienaruszoną morfologię siatkówki wszystkich warstw.