Name: Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Naucz się uzyskiwać wysokiej jakości kriosekcje całego oka królika do badań immunohistochemicznych siatkówki. Ta metoda minimalizuje artefakty tkankowe i poprawia wizualizację struktur retinalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Rosanny Calderon, Dominica Shaylera i Rosy Sierry za porady techniczne. Badanie to było częściowo wspierane przez nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki USC Keck School of Medicine z Research to Prevent Blindness (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), Research to Prevent Blindness Career Development Award (AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), oraz Fundacja Pamięci Edwarda N. i Delli L. Thome (AN, KG).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Południowej Kalifornii. Do opracowania tego protokołu wykorzystano czternaście (n = 14) królików z pasami holenderskimi w wieku od 4 do 6 miesięcy. Wykorzystano zarówno samce, jak i samice. Wszystkie zwierzęta ważyły od 2,0 do 2,5 kg. Wszystkie zwierzęta trzymano pojedynczo. Lista zalecanych materiałów i wyposażenia znajduje się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Preparat utrwalający.
	<ol>
		<li>Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Wymagane jest co najmniej 50 ml utrwalacza na oko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie środka krioprotekcyjnego.
	<ol>
		<li>Przygotować 30% wagowo (w/v) sacharozy w PBS. Umieścić na shakerze na co najmniej 15 minut, aby upewnić się, że sacharoza jest całkowicie rozpuszczona. Wymagane jest co najmniej 50 ml środka krioprotekcyjnego na oko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie narzędzia do preparacji.
	<ol>
		<li>Zbierz dwie pary kleszczy, jedną parę zakrzywionych nożyczek, jedno ostrze skalpela i naczynie do preparacji 100 mm i umieść je w pobliżu mikroskopu preparacyjnego. Przykładowa konfiguracja jest pokazana w Rysunek 1A.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Początkowa fiksacja
<ol>
	<li>Po enukleacji przezspojówkowej11, natychmiast umieść oko w co najmniej 50 ml 4% PFA w PBS na lodzie. Upewnij się, że oko jest całkowicie zanurzone. Jeśli pęcherzyki powietrza gromadzą się na zewnętrznej powierzchni oka, usuń je, delikatnie potrząsając.</li>
</ol>
3. Usuwanie rogówki i tęczówki
<ol>
	<li>Po 15 minutach usunąć oko z 4% PFA w PBS i umieścić je w naczyniu preparacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij naczynie PBS, aby zapobiec wysuszeniu oka.</li>
	<li>Usuń rogówkę.
	<ol>
		<li>Zacznij od wykonania nacięcia ostrzem chirurgicznym 1 mm przed rąbkiem, równolegle do płaszczyzny tęczówki, aby uniknąć przypadkowego przebicia leżących poniżej struktur (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Włóż zakrzywione nożyczki do początkowego nacięcia i kontynuuj cięcie obwodowe, pozostając 1 mm od rąbka. Użyj kleszczyków, aby ustabilizować oko podczas cięcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Po zakończeniu cięcia obwodowego usuń rogówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść rogówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej (RT) w celu krioochrony lub wyrzuć. Krioprotekcja jest zakończona, gdy rogówka opada, co zwykle trwa mniej niż 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń tęczówkę.
	<ol>
		<li>Zacznij od wykonania wstępnego cięcia zakrzywionymi nożyczkami przez tęczówkę. Całkowicie oddziel tęczówkę od reszty tkanki, przecinając obwodowo, podobnie jak w przypadku usuwania rogówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Po zakończeniu cięcia obwodowego usuń tęczówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść tęczówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioochrony lub wyrzuć jak powyżej. Krioochrona jest zakończona, gdy tęczówka opada, co zwykle zajmuje mniej niż 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zakończenie fiksacji
<ol>
	<li>Po usunięciu rogówki i tęczówki umieść oko w co najmniej 50 ml świeżo przygotowanego 4% PFA w PBS i umieść je na shakerze w celu delikatnego poruszenia. Upewnij się, że oko pozostaje zanurzone podczas mieszania.</li>
	<li>Utrzymywać oko w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Odkryliśmy, że 4% PFA zapewnia doskonałe barwienie IHC, jeśli jest używane między 16 h a 24 h w temperaturze 4 °C, z dłuższymi czasami utrwalenia, co skutkuje zwiększonym niespecyficznym barwieniem tła i maskowaniem epitopów.</li>
</ol>
5. Zdejmowanie soczewek
<ol>
	<li>Następnego ranka usuń oko z 4% PFA w PBS i umieść je w naczyniu preparacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij naczynie PBS, aby zapobiec wysuszeniu oka.</li>
	<li>Zdejmij obiektyw.
	<ol>
		<li>Zacznij od ostrożnego uchwycenia torebki przedniej soczewki kleszczami. 
		UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naciskać ani nie ciągnąć soczewki kleszczami na siłę, ponieważ może to spowodować odwarstwienie siatkówki.</li>
		<li>Ostrożnie włóż nożyczki do tylnej komory z ostrzami zakrzywionymi do tyłu wzdłuż soczewki. Wykonaj wstępne cięcie przez zonule soczewek za pomocą zakrzywionych nożyczek. 
		UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naciskać ani nie ciągnąć na siłę zonuli nożyczkami, ponieważ może to spowodować odwarstwienie siatkówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Kontynuuj wykonywanie małych nacięć przez zonule soczewek w obwodzie. Wykonaj od trzech do pięciu cięć na godzinę zegarową.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy soczewka jest oddzielona od reszty tkanki, delikatnie chwyć przednią torebkę soczewki kleszczami i spróbuj delikatnie ją podnieść. Jeśli soczewka nie podnosi się natychmiast, nie próbuj ciągnąć więcej, ponieważ może to spowodować odwarstwienie siatkówki. Zamiast tego wykonaj więcej cięć przez pozostałe strefy soczewek i spróbuj ponownie.</li>
		<li>Po oddzieleniu od reszty tkanki umieść soczewkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji lub wyrzuć jak powyżej. Krioochrona jest zakończona, gdy soczewka opada, co zwykle trwa kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić oko w co najmniej 50 ml 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C w celu krioprotekcji. Krioprotekcja jest zakończona, gdy oko opadnie, co zwykle trwa 24-48 godzin. Aby przyspieszyć krioprotekcję, po 8-12 godzinach należy wymienić początkowy roztwór sacharozy na świeży i/lub trzymać oko w roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
6. Osadzanie
<ol>
	<li>Po zakończeniu krioprotekcji wyjmij oko z 30% roztworu sacharozy i umieść je w naczyniu separacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie obróć oko tak, aby było skierowane w dół, aby usunąć nadmiar roztworu sacharozy z wewnętrznej części oka. 
	UWAGA: Nie próbuj usuwać nadmiaru roztworu z wewnętrznej części oka chusteczką laboratoryjną, ponieważ chusteczka może przykleić się do ciała szklistego i spowodować odwarstwienie siatkówki.</li>
	<li>Trzymając oko skierowane w dół, delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu sacharozy z zewnętrznej części oka za pomocą chusteczki.</li>
	<li>Napełnij jednorazową formę do zatapiania związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na głębokość 0,5-1,0 cm. 
	UWAGA: Ta podstawa zapewnia, że oko nie dotknie dna formy, co przeszkadza w późniejszej kriosekcji.</li>
	<li>Umieść oko w jednorazowej formie do zatapiania skierowaną do góry. Powoli wypełnij wewnętrzną część oka OCT, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w oku. Jeśli utworzą się bąbelki, ostrożnie je usuń lub dociśnij do krawędzi formy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zakończ napełnianie jednorazowej formy do zatapiania za pomocą OCT. Upewnij się, że oko jest całkowicie zanurzone w OCT i nie dotyka wewnętrznych powierzchni formy ani nie jest wystawione na działanie powietrza. Owiń jednorazową formę do zatapiania zawierającą oko w OCT w parafilm; umieścić w temperaturze 4 °C na noc. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że krótsze okresy inkubacji nie pozwalają na całkowitą infiltrację OCT do ciała szklistego. W rezultacie warstwa sacharozy często pozostaje między siatkówką a OCT. Kiedy tak się dzieje, siatkówka często odrywa się lub całkowicie odrywa od reszty tkanki podczas kriosekcji, ponieważ zamrożona sacharoza prawdopodobnie zapewnia mniejsze wsparcie strukturalne niż zamrożony OCT, co utrudnia lub nawet uniemożliwia uzyskanie wysokiej jakości skrawków.</li>
	<li>Następnego ranka umieść formę do osadzania zawierającą oko w OCT w naczyniu preparacyjnym o średnicy 100 mm pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że tylna błona szklista wydaje się być uniesiona do góry od wewnętrznej siatkówki. 
	UWAGA: To uniesienie do góry może zasłaniać widok siatkówki, utrudniając określenie orientacji.</li>
	<li>Aby lepiej określić orientację oka, ostrożnie chwyć tylną błonę szklistą z przodu i spróbuj odkleić ją kleszczami, aby odsłonić leżącą pod spodem siatkówkę podczas pobytu w OCT. 
	UWAGA: Czasami może być widoczny kanał hialoidalny, który przyczepia się do głowy nerwu wzrokowego i może być używany do celów orientacyjnych, ponieważ głowa nerwu wzrokowego znajduje się w górnej części siatkówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Nie jest konieczne całkowite usunięcie tylnej błony szklistej, ponieważ OCT już naciekł ciało szkliste, aby wyściełać wewnętrzną siatkówkę, a pozostała błona nie wpłynie na kriosekcję (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Tylną błonę szklistą należy usunąć tylko w celu orientacji, jeśli to konieczne. Inne opcje określania orientacji obejmują założenie szwu lub innego rodzaju znaku przed enukleacją.</li>
	<li>Przenieś oko do nowej formy do zatapiania z nowym OCT wypełnionym na głębokość 0,5-1,0 cm, a następnie wypełnij nowym OCT, jak w krokach 6.3-6,5, aby upewnić się, że końcowe podłoże do zatapiania jest wolne od zanieczyszczeń i/lub innych niedoskonałości, które mogły nagromadzić się w ciągu nocy. Jeśli to możliwe, delikatnie usuń OCT chusteczką również od wewnętrznej strony oka, chociaż nie jest to konieczne.</li>
	<li>Oznacz formę w celach orientacyjnych (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C). Zorientowanie oka z okiem skierowanym do góry w formie kriogenicznej zapewnia, że OCT wyścieli wewnętrzną siatkówkę. Kanał szklisty, który przyczepia się do głowy nerwu wzrokowego, jest ważnym punktem orientacyjnym dla określenia górnej części oka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść oznaczoną formę do zatapiania zawierającą oko w OCT na wierzchu suchego lodu. Upewnij się, że oko nie dotyka żadnej z wewnętrznych powierzchni formy do zatapiania ani nie jest wystawione na działanie powietrza. Upewnij się, że forma bezpośrednio dotyka suchego lodu, aby przyspieszyć proces zamrażania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Przenieść osadzone oko do zamrażarki o temperaturze -80 °C lub bezpośrednio do kriostatu w celu przekroju (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
</ol>
7. Kriosekcja
<ol>
	<li>Zamontuj blok tak, aby górna część oka była skierowana wyżej, a dolna część oka była skierowana niżej, z pozostałą rogówką i tęczówką skierowaną w prawo (jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 2E) lub w lewo (nie pokazano). Alternatywnie zamontuj blok w innej orientacji, zgodnie z potrzebami. W razie potrzeby rozbij formę, aby zmobilizować blok, ostrożnie odłamując każdą stronę formy pojedynczo i oznaczając blok bezpośrednio, aby nie stracić orientacji oka.</li>
	<li>Pozwól, aby blok zrównoważył się do temperatury w kriostacie przez 30-60 minut; -20 °C jest dobrym punktem wyjścia.</li>
	<li>Po zamontowaniu umieść świeże ostrze pod żądanym kątem, zwykle równolegle do pionowej osi oka.</li>
	<li>Ustaw grubość przekroju zgodnie z potrzebami: Dobrym punktem wyjścia są sekcje o grubości 10-20 μm. Przykład przekroju o grubości 14 μm jest pokazany w Rysunek 3A-C.
	<ol>
		<li>W powolny i kontrolowany sposób rozpocznij przecinanie bloku. Upewnij się, że ostrze tnie blok równolegle do pionowej osi oka. Jeśli nie, dostosuj kąt, pod jakim ostrze styka się z blokiem lub odpowiednio orientacją stage.</li>
		<li>Podczas krojenia bloku zapobiegaj marszczeniu lub zwijaniu się sekcji za pomocą szczotki. Szybko odwróć sekcję i delikatnie dociśnij ją w dół szczotką z długim włosiem, aby spłaszczyć sekcję i zminimalizować zmarszczki lub zwijanie się. Ułóż osobną szczotkę ze spiczastą końcówką, aby pomóc w manipulacji sekcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj sekcję do naładowanego szkiełka, powoli przesuwając suwak skierowany w dół w kierunku sekcji. Zapobiegaj składaniu się sekcji lub zniekształcaniu się w inny sposób podczas mocowania, delikatnie przesuwając szklaną prowadnicę po sekcji. 
	UWAGA: Nie najeżdżaj suwakiem bezpośrednio na sekcję ani nie dociskaj go do sekcji, ponieważ może to spowodować uszkodzenie lub zniekształcenie sekcji.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc przed przeniesieniem do zamrażarki w temperaturze -80 °C lub bezpośrednim zastosowaniem standardowego protokołu immunofluorescencji.</li>
</ol>

Rabbit Eye Dissection and Cryosectioning for Immunohistochemistry Studies

<ol><li>Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeiffer%2C+RL+%22American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%2C+The+Biology+of+the+Laboratory+Rabbit%22">American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit</a>. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).</li>
<li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li>
<li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+models+of+ocular+diseases%3A+New+relevance+for+classical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology%2C+immunofluorescence%2C+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879(2021).</li>
<li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li>
<li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+whole+eyes%3A+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+in+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li>
<li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119(2022).</li>
<li>Baiza-Durán, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+%28PRO-169%29+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Retina+Vitreous%22%5BJournal%5D)">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32(2020).</li>
<li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li>
<li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Przed wdrożeniem powyższego protokołu stale napotykaliśmy trudności z przetwarzaniem tkanek oczu królika pod kątem IHC. Dostosowaliśmy kilka protokołów z oczu mniejszych zwierząt, takich jak myszy, ale stwierdziliśmy, że prowadzą one do nieodpowiedniego utrwalenia i trudności z sekcją tkanek. Istnieje kilka ważnych czynników, które pozwalają na uzyskanie spójnych, wysokiej jakości odcinków siatkówki królika.
Jedną z kwestii jest duży rozmiar kuli królika w porównaniu z innymi powszechnie używa...

Siatkówka składa się z kilku warstw wyspecjalizowanych komórek w oku, które razem pracują nad przekształcaniem światła w sygnały neuronowe. Ponieważ siatkówka odgrywa kluczową rolę w widzeniu, zrozumienie jej struktury i funkcji może dostarczyć cennych informacji na temat niektórych z najczęstszych przyczyn utraty wzroku, takich jak między innymi zwyrodnienie plamki żółtej i retinopatia cukrzycowa.
Króliki służą jako wygodny model zwierzęcy w badaniach siatkówki, ponieważ oferują kilka zalet w porównaniu z innymi modelami. Oczy królika są stosunkowo podobne anatomicznie do oczu ludzkich1,2. Na przykład króliki mają obszar o zwiększonej gęstości fotoreceptorów, znany jako pozioma smuga wzrokowa, która jest analogiczna do dołka środkowego u ludzi. Inne powszechnie używane modele zwierzęce, takie jak gryzonie, nie mają odpowiednika anatomicznego. Ponadto, w porównaniu z gryzoniami, unaczynienie siatkówki u królików jest dość podobne do tego u ludzi. Oczy królika są również stosunkowo duże. To sprawia, że są one szczególnie przydatne w badaniach, które obejmują podawanie leków lub interwencję chirurgiczną w obrębie ciała szklistego lub siatkówki, które w przeciwnym razie mogą być trudne lub niemożliwe w przypadku mniejszego oka3.
Immunohistochemia (IHC) jest szeroko stosowaną techniką do badania lokalizacji antygenów w tkance i ma szerokie zastosowanie w badaniach siatkówki4,5,6. Ponieważ siatkówka jest delikatną strukturą, uzyskanie użytecznych wyników za pomocą IHC wymaga starannego przetwarzania tkanek. Odwarstwienie siatkówki i inne artefakty tkankowe, takie jak pęknięcia lub fałdy siatkówki, często występują podczas przetwarzania i mogą zakłócać interpretację wyników. Pomyślne przetwarzanie zależy od wielu czynników, w tym manipulacji tkankami, rodzaju i czasu utrwalania, rodzaju podłoża do zatapiania i technik sekcji7,8,9,10. Pomimo zalet wykorzystania królików jako modelu zwierzęcego w badaniach siatkówki, istnieje bardzo niewiele protokołów opisujących skuteczne przetwarzanie tkankowe siatkówki królika. W artykule opisano wiarygodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości wycinków siatkówki z całych oczu królika do zastosowania w IHC.

<table><tbody><tr><td>Naczynie hodowlane 100 mm</td><td>Corning</td><td>353025</td><td>Używane do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)</td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-106</td><td>Do utrwalania i krioochrony (krok 1)</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td>Do kriosekcji (krok 7)</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Używany do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Rozcieńczony 1:1,000 w buforze blokującym</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Używany do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)</td></tr><tr><td>Anty-Koza osła 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>Rozcieńczony 1:1,000 w buforze blokującym</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td>Rozcieńczony 1:1,000 w buforze blokującym</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Używane do preparacji (kroki 1.3, 3 i 5)</td></tr><tr><td>Szklana osłona prowadnicy</td><td>VWR</td><td>48404-453</td><td>Do kriosekcji (krok 7)</td></tr><tr><td>Kozioł anty-SOX2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2018</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:100 w buforze blokującym</td></tr><tr><td>Wysokoprofilowe jednorazowe ostrza kriostatu</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>14035838926</td><td>Do kriosekcji (krok 7)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Służy do usuwania nadmiaru PBS lub OCT (kroki 3 i 6)</td></tr><tr><td>Mysz anty-RPE65</td><td>Novus Bio</td><td>NB100-355SS</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:100 w buforze blokującym</td></tr><tr><td>OmniPur Sacharoza</td><td>Millipore</td><td>167117</td><td>Stosowany jako krioprotektant (krok 1.2)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 20% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15713</td><td>Stosowany jako utrwalacz tkanek (rozcieńczony do 4% w kroku 1.1)</td></tr><tr><td>Jednorazowa forma do zatapiania Peel-A-Away (głębokość 22x22x20 mm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A</td><td>Używany jako forma do zatapiania (krok 6)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>Używany do przygotowania utrwalacza (krok 1.1) i krioprotektantu (krok 1.2)</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 15</td><td>Pióro</td><td>08-916-5D</td><td>Używany do rozwarstwiania (kroki 1.3, 3 i 5)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Do kriosekcji (krok 7)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Używany jako podłoże do zatapiania (krok 6)</td></tr></tbody></table>

uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye

Ten protokół opisuje, jak uzyskać wysokiej jakości kriosekcje siatkówki u większych zwierząt, takich jak króliki. Po enukleacji oko jest na krótko zanurzane w utrwalaczu. Następnie usuwa się rogówkę i tęczówkę, a oko pozostawia się na noc w celu dodatkowego ustabilizowania w temperaturze 4 °C. Po utrwaleniu soczewka jest usuwana. Oko jest następnie umieszczane w kriomold i wypełniane podłożem do zatapiania. Po usunięciu soczewki podłoże osadzające ma lepszy dostęp do ciała szklistego i prowadzi do lepszej stabilności siatkówki. Co ważne, oko powinno być inkubowane w pożywce przez noc, aby umożliwić pełną infiltrację w całym ciele szklistym. Po całonocnej inkubacji oko zamraża się na suchym lodzie i poddaje sekcji. Można uzyskać całe skrawki siatkówki do wykorzystania w immunohistochemii. Standardowe protokoły barwienia mogą być wykorzystane do badania lokalizacji antygenów w tkance siatkówki. Przestrzeganie tego protokołu skutkuje wysokiej jakości kriosekcjami siatkówki, które mogą być stosowane w każdym eksperymencie z wykorzystaniem immunohistochemii.

Po obróbce tkanki można zastosować standardowy protokół immunofluorescencji w celu zbadania dowolnej liczby procesów biologicznych w siatkówce. Rysunek 3A-C przedstawia reprezentatywne obrazy fluorescencyjne przekroju siatkówki uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przekrój siatkówki poddano barwieniu immunocytochemicznemu zgodnie z wcześniej opisanym protokołem12.
Reprezentatywne przekroje siatkówki ...

Ten protokół opisuje niezawodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości kriosekcji całych oczu królika. Szczegółowo opisuje procedury sekcji, fiksacji, osadzania i cięcia oczu królika, które można łatwo dostosować do użycia w dowolnym badaniu wykorzystującym immunohistochemię w większych oczach.

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

Nasze badania koncentrują się na nowatorskich podejściach do regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki. Uważa się, że dysfunkcja nabłonka barwnikowego siatkówki odgrywa kluczową rolę w patofizjologii wielu chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej. Tak więc regeneracja tej warstwy komórek jest atrakcyjna z terapeutycznego punktu widzenia.Wizualizacja anatomii strukturalnej siatkówki za pomocą immunohistochemii ma szerokie zastosowanie w badaniach siatkówki. W naszym laboratorium stwierdziliśmy, że uzyskanie użytecznych wyników z oczu królika jest trudne ze względu na artefakty tkankowe, takie jak przyczepy siatkówki i fałdy siatkówki. Pomimo tych wyzwań istnieje bardzo niewiele protokołów, które opisują skuteczne przetwarzanie tkanek siatkówki królika.Protokół ten wprowadza kilka ważnych modyfikacji do standardowych technik przetwarzania tkanek, które skutkują doskonałymi sekcjami tkanki siatkówki królika. Badanie to może pozwolić naukowcom na uzyskanie lepszych wyników z ich badań, które obejmują zastosowanie immunohistochemii w modelach królików. Po wyłuszczeniu przezspojówkowym oka królika natychmiast umieścić w 50 mililitrach 4% paraformaldehydu i PBS na lodzie.Po 15 minutach przenieś oko do 100-milimetrowego naczynia preparacyjnego i napełnij naczynie PBS, aby zapobiec wysuszeniu oka. Pod mikroskopem preparacyjnym, przy użyciu ostrza chirurgicznego, zacznij wykonywać nacięcie jeden milimetr przed rąbkiem, utrzymując je równolegle do płaszczyzny tęczówki. Włóż zakrzywione nożyczki do początkowego nacięcia i kontynuuj cięcie obwodowo, zachowując milimetrową odległość od rąbka.Następnie usuń rogówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść rogówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji. Wykonaj wstępne cięcie zakrzywionymi nożyczkami przez tęczówkę.Następnie przeciąć obwodowo wokół oka, podobnie jak w przypadku usunięcia rogówki, aby oddzielić tęczówkę od reszty tkanki. Usuń tęczówkę kleszczami i delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką laboratoryjną. Umieść tęczówkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji.Po usunięciu rogówki i tęczówki umieść oko na 50 mililitrach 4% paraformaldehydu i umieść je na shakerze w celu delikatnego poruszenia. Pozostaw oko w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia umieść oko w naczyniu preparacyjnym i napełnij naczynie PBS.Pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby ostrożnie chwycić przednią torebkę soczewki. Następnie ostrożnie włóż nożyczki do tylnej komory, ustawiając ostrza z tyłu wzdłuż soczewki. Wykonaj wstępne cięcie przez zonule soczewek za pomocą zakrzywionych nożyczek.Kontynuuj wykonywanie małych nacięć na obwodzie przez strefy soczewek. Aby potwierdzić usunięcie soczewki, delikatnie chwyć przednią torebkę soczewki kleszczami i spróbuj ją podnieść. Po oddzieleniu umieść soczewkę w 30% roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej w celu krioprotekcji.Umieść oko w 50 mililitrach 30% sacharozy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 do 48 godzin w celu krioprotekcji. Aby przyspieszyć krioprotekcję, zastąp początkowy roztwór sacharozy świeżym po ośmiu do 12 godzinach. Po zakończeniu krioochrony oka królika przenieś je z 30% roztworu sacharozy do 100-milimetrowego naczynia preparacyjnego.Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie odwróć oko, aby usunąć nadmiar roztworu sacharozy z wewnętrznej części oka. Za pomocą chusteczki delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu sacharozy z zewnętrznej części oka. Napełnij jednorazową formę do zatapiania optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT na głębokość od 0,5 do jednego centymetra.Umieść oko w formie do zatapiania skierowaną do góry i powoli wypełniaj wewnętrzną część oka związkiem OCT, unikając tworzenia się pęcherzyków. Gdy oko jest zanurzone w związku OCT i nie dotyka wewnętrznych powierzchni formy, owiń formę do zatapiania w parafinie i przechowuj ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść formę do zatapiania w naczyniu rozwarstwiającym.Jeśli to możliwe, delikatnie usuń związek OCT z wnętrza oka za pomocą chusteczki. Przenieś oko do nowej formy do zatapiania wypełnionej świeżym związkiem OCT. Następnie napełnij formę tak, jak poprzednio, aby upewnić się, że końcowe podłoże do zatapiania jest wolne od zanieczyszczeń lub niedoskonałości.Oznacz formę w celach orientacyjnych. Ustaw oko do góry w formie kriogenicznej, tak aby związek OCT wyściełał wewnętrzną siatkówkę. Użyj głowy nerwu wzrokowego jako punktu orientacyjnego do określenia górnej części oka.Umieść oznaczoną formę do zatapiania na suchym lodzie, upewniając się, że oko nie dotyka wewnętrznych powierzchni formy ani nie jest wystawione na działanie powietrza. Zamontuj blok na kriostacie górną częścią oka skierowaną do góry, a dolną częścią w dół, a pozostałą rogówką i tęczówką skierowaną w prawo lub w lewo. Umieść świeże ostrze równolegle do pionowej osi oka, aby je przeciąć.Po pocięciu odcinków i wysuszeniu przez noc umieść szkiełko w zamrażarce w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Obrazy fluorescencyjne całej kriosekcji siatkówki oka królika wykazały jednolitą pigmentowaną warstwę nabłonka pigmentu siatkówki bez znacznego oderwania od leżącej nad nią warstwy fotoreceptorów. Obraz przekroju siatkówki w jasnym polu dodatkowo pokazuje nienaruszoną morfologię siatkówki wszystkich warstw.

obtaining-high-quality-cryosections-of-whole-rabbit-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł przedstawia metodę preparowania i inkubacji siatkówki królika oraz zapośredniczony przez cząsteczki transfer genów plazmidów kodujących GFP lub różne markery subkomórkowe do komórek zwojowych siatkówki.

Organotypowa hodowla siatkówki dorosłego królika

Króliki są powszechnie wykorzystywane do badania farmakokinetyki leków podawanych wewnątrzgałkowo. Opisano metodę prowadzenia badań farmakokinetycznych leków wewnątrzgałkowych z wykorzystaniem oczu królika.

Zastosowanie oczu królika w badaniach farmakokinetycznych leków dogałkowych

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.

Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

Ten rękopis przedstawia protokół histologicznego przygotowania preparatów z gałek ocznych gryzoni. Dzięki proponowanej metodzie wewnętrzną siatkówkę można łatwo zobrazować i ocenić pod mikroskopem świetlnym. Procedura jest przedstawiona dla gałek ocznych myszy i szczurów.

Przygotowanie i analiza preparatów histologicznych gałek ocznych szczurów i myszy w celu oceny siatkówki

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Jaja Xenopus laevis w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej, a także sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

Naucz się uzyskiwać wysokiej jakości kriosekcje całego oka królika do badań immunohistochemicznych siatkówki. Ta metoda minimalizuje artefakty tkankowe i poprawia wizualizację struktur retinalnych.

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Przeglądaj więcej filmów