Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

W tym projekcie koncentrujemy się na opracowaniu i zastosowaniu nowatorskich strategii analitycznych, które pozwalają na bezpośrednią, ilościową i głęboką analizę funkcjonalności komórkowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Wychodząc poza czysty pomiar jednego punktu danych, staramy się lepiej zrozumieć i wykorzystać tę wielofunkcyjność, która wynika ze złożonych reakcji w gospodarzu i w tkance. Uzyskanie kompleksowego zrozumienia tych funkcji jest złożone, trudne i wymaga interdyscyplinarnego podejścia.

Jednym z wyzwań w tym kontekście jest zapewnienie, że zakres dynamiczny opracowanego testu jest odpowiedni do uchwycenia ilości i dynamiki wydzielanego białka, które mogą się znacznie różnić w zależności od próbek, preparatów i tkanek. Zakłócenie w regulacji odpowiedzi immunologicznej może wywołać różne zaburzenia, prowadzące do łagodnej gorączki, do potencjalnie zagrażających życiu powikłań. Wychodząc poza tradycyjne pomiary punktów końcowych, proponujemy bezpośredni pomiar dysregulacji i aktywacji komórek odpornościowych dynamicznie na poziomie pojedynczej komórki, aby uzyskać dodatkowy wgląd.

Tak więc cytokiny są zwykle wykrywane w określonym punkcie czasowym jako stężenie w supernatancie, procent aktywowanych komórek. Pomiar masowy w celu ilościowego określenia wydzielania każdej pojedynczej komórki, maskowanie niejednorodności komórkowej za pomocą pomiarów końcowych, które nie rozróżniają między wydzielaniem równoczesnym a wtórnym, pomijając dynamiczny aspekt odpowiedzi. Polifunkcjonalność komórkowa odnosi się do zdolności komórki odpornościowej do jednoczesnego wydzielania wielu cytokin.

Pozwala im to na przykład na precyzyjne dostrojenie reakcji na zagrożenia i dynamiczne mierzenie tej wielofunkcyjności, co oznacza, że w czasie może dać wgląd w różne niuanse odpowiedzi immunologicznej. Aby rozpocząć, umieść szklane szkiełko z otworami na czystej powierzchni stroną aktywowaną plazmą skierowaną do góry. Ostrożnie usuń warstwę ochronną z jednej strony dwustronnej taśmy klejącej w kierunku cięcia.

Dopasuj taśmę do krawędzi szkiełka i wywierconych otworów. Umieść taśmę na szkiełku podstawowym zaczynając od krótszej krawędzi i upewnij się, że jest dobrze przylegająca. Po usunięciu drugiej warstwy ochronnej z taśmy, należy umieścić drugi szkiełko tak, aby aktywowana powierzchnia była skierowana w dół.

Używając płaskiej deski, dociśnij do siebie dwa szklane szkiełka, jednocześnie przykładając siłę górnej części ciała przez 10 sekund. Odwróć komorę tak, aby otwory były skierowane w stronę użytkownika. Nałóż niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV w pierścieniu poniżej portu nano.

Wsuń port nano w dół otworu w szklanym szkiełku za pomocą mikrorurki i dodaj pierścień kleju utwardzanego promieniami UV wokół portu. Załadować jeden mililitr 1% roztworu przygotowanego w oleju fluorowanym do strzykawki. Wstrzyknąć roztwór przez filtr strzykawkowy z PTFE i igłę przymocowaną do mikrorurki z PTFE do komory obserwacyjnej.

Po minucie inkubacji za pomocą azotu pod ciśnieniem wypłukać roztwór powlekający pod wyciągiem. Używając innego zestawu strzykawki, przepłukać komorę wyłącznie olejem fluorowym. Na początek dodaj nanocząstki funkcjonalizowane streptawidyną do probówek do wykrywania TNF alfa, interleukiny jednej beta i interleukiny szóstej.

Rozcieńczyć streptawidynę i nanocząstki w równych objętościach PBS. Następnie dodać biotynylowane roztwory przeciwciał wychwytujących do probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 0,01% jednego milimolowego roztworu D-biotyny do każdej probówki i inkubuj przez pięć minut.

Następnie przytrzymaj magnes neodymowy blisko rurki, aby zebrać cząstki. Odrzucić klarowny supernatant i natychmiast ponownie zawiesić nanocząstki w mieszaninie pluronu F-127 i PBS i inkubować przez 30 minut. Po inkubacji cząstek przez 30 minut w buforze do przechowywania, wymieszać je, aby uzyskać jednolitą mieszaninę.

Bezpośrednio przed enkapsulacją połącz sprzężone nanocząstki dla interleukiny szóstej, TNF alfa i interleukiny jednej beta. Teraz umyj cząstki kompletnym medium za pomocą magnesu, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawieś kulki w kompletnym medium. Następnie dodaj przeciwciała wykrywające dla interleukiny szóstej, TNF alfa i interleukiny jednej beta, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 nanomolowców.

Na początek napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 500 mikrolitrami fazy ciągłej. Przymocuj mikrorurkę PTFE do igły o rozmiarze 27 0.75 cala. Zamontuj zestaw na strzykawce, a następnie na pompie strzykawkowej.

Następnie wybij otwór za pomocą 0,75 milimetra przebijaka do biopsji w środku wycięcia PDMS. Przeciągnij około trzech centymetrów rurki PTFE przez otwór w wycięciu i wepchnij zespół w górną część końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Uszczelnij złącze klejem utwardzanym promieniami UV na górze pipety i przymocuj drugą stronę rurki do igły o rozmiarze 23 i średnicy 1,25 cala.

Następnie napełnij dwie jednomililitrowe strzykawki 500 mikrolitrami lekkiego oleju mineralnego. Przymocuj dwie igły o rozmiarze 23 z niestandardowymi nasadkami i zamontuj je na pompie strzykawkowej. Za pomocą oprogramowania sterującego pompą strzykawkową odessać funkcjonalizowane nanocząstki i roztwór komórek do końcówek pipet faz wodnych.

Po oczyszczeniu przygotowanej komory obserwacyjnej należy zacisnąć komorę w drukowanym uchwycie komory wyposażonym w dwa magnesy neodymowe pod kątem 30 stopni. Teraz otwórz oba porty i włóż ręcznik papierowy do górnego portu, aby wchłonąć nadmiar fazy zewnętrznej podczas napełniania. Podłącz fazę ciągłą do górnego wlotu chipa mikroprzepływowego.

Następnie przepłukuj chip fazą ciągłą przez około 30 sekund przy natężeniu przepływu 1800 mikrolitrów na godzinę. Przymocuj końcówki pipet roztworów wodnych do dwóch środkowych wlotów chipa. Rozpocząć przepływ roztworu wodnego przy 200 mikrolitrach na godzinę dla każdego roztworu.

Gdy ciecz pojawi się na wylocie, rozpocznij przepływ fazy oleju fluorowanego z prędkością 800 mikrolitrów na godzinę. Poczekaj, aż ustalisz stabilną produkcję kropel, wskazywaną przez jednorodny szary błyszczący roztwór na wylocie. Następnie podłącz mikrorurkę PTFE do portu wylotowego, aby zebrać kropelki.

Za pomocą modułu tulejowego jednoczęściowego złącza dokręcanego na palce, skieruj je do komory obserwacyjnej. Po napełnieniu komory zatrzymaj przepływ i zamknij porty zaślepkami portów, dociskając palcami. Po wytworzeniu kropelki przepłucz chip olejem fluorowym, a następnie azotem, aby wydmuchać pozostałą ciecz

Zamontuj uchwyt komory na mikroskopie ze stolikiem w formacie płytki dołkowej. Następnie, używając obiektywu 10x, przełącz mikroskop na kanał jasnego pola. Skoncentruj się na unieruchomionych kropelkach w jasnym polu i przejdź do środka komory.

Następnie aktywuj system automatycznego ustawiania ostrości. Dostosuj płaszczyznę pomiaru na kanale jasnego pola tak, aby krawędzie kropel wyglądały jak ostre czarne okręgi, które można łatwo odróżnić od fazy olejowej i tła. Przejdź przez każdy z kanałów fluorescencyjnych, ustawiając dla nich optymalną płaszczyznę pomiaru.

W przypadku pomiarów relokacji skup się na agregacji nanocząstek w pięciu kanałach FITC, TRITC i cyjaniny.