Name: Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj zaawansowaną platformę mikroprzepływową do pomiaru dynamiki wydzielania cytokin na poziomie pojedynczych komórek. Ta metoda umożliwia jednoczesny pomiar IL-6, TNF-α i IL-1β z ludzkich komórek PBMC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez grant #2021-349 z Obszaru Strategicznego Spersonalizowanego Zdrowia i Powiązanych Technologii (PHRT) z ETH Domain (Szwajcarskie Federalne Instytuty Technologii), grant startowy Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant #803,336) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant #310030_197619). Dodatkowo dziękujemy Guilhemowi Chenonowi i Jeanowi Baudry'emu za ich pracę i opracowanie wstępnego analizatora DropMap.

Microfluidic Droplet Assay for Single-Cell Cytokine Secretion Analysis

<ol><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+responses+and+inflammation-associated+diseases+in+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs.</a> Oncotarget. 9 (6), 7204-7218 (2017).</li>
<li>Cicchese, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+signals+controls+disease+and+limits+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology.</a> Immunol Rev. 285 (1), 147-167 (2018).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), e2004433(2021).</li>
<li>Rojas, J. M., Avia, M., Martín, V., Sevilla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10%3A+A+multifunctional+cytokine+in+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">IL-10: A multifunctional cytokine in viral infections.</a> J Immunol Res. 2017, 6104054(2017).</li>
<li>Kohanawa, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+effect+of+the+balance+between+TNF-%CE%B1+and+IL-6+in+the+granulomatous+and+inflammatory+response+to+Rhodococcus+aurantiacus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory effect of the balance between TNF-α and IL-6 in the granulomatous and inflammatory response to Rhodococcus aurantiacus infection in mice.</a> J Immunol. 177 (1), 642-650 (2006).</li>
<li>Geginat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+CD4+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human CD4 T cell subsets.</a> Front Immunol. 5, 630(2014).</li>
<li>Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+CD4%2B+T+cells+against+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human CD4+ T cells against microbes.</a> Ann Rev Immunol. 34 (1), 317-334 (2016).</li>
<li>Chetaille Nézondet, A. L., Poubelle, P. E., Pelletier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+cytokines+to+help+establish+diagnosis+and+guide+treatment+of+autoinflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">The evaluation of cytokines to help establish diagnosis and guide treatment of autoinflammatory and autoimmune diseases.</a> J Leukocyte Biol. 108 (2), 647-657 (2020).</li>
<li>Sims, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cytokine+storm+reflects+hyperinflammatory+endothelial+dysfunction+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cytokine storm reflects hyperinflammatory endothelial dysfunction in COVID-19.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 107-111 (2021).</li>
<li>Yasen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+heterogeneity+of+infiltrating+immune+cell+profiles+in+the+hepatic+cystic+echinococcosis+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the heterogeneity of infiltrating immune cell profiles in the hepatic cystic echinococcosis microenvironment.</a> Infection and Immunity. 89 (12), (2021).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+highlights+intratumor+heterogeneity+and+intercellular+network+featured+in+adamantinomatous+craniopharyngioma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing highlights intratumor heterogeneity and intercellular network featured in adamantinomatous craniopharyngioma.</a> Sci Adv. 9 (15), (2023).</li>
<li>Tanguay, S., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+ELISPOT+and+ELISA-based+assays+for+detection+of+individual+cytokine-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphokine+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells.</a> Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).</li>
<li>Bucheli, O. T. M., Sigvaldadóttir, I., Eyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+protein+secretion+in+immunology%3A+Technologies%2C+advances%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell protein secretion in immunology: Technologies, advances, and applications.</a> Eur J Immunol. 51 (6), 1334-1347 (2021).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+flow+cytometry+with+high-throughput+single+droplet+isolation+and+nucleic+acid+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery.</a> Lab Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+picoreactors+for+high-throughput+single-cell+encapsulation+and+phenotyping+via+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Double emulsion picoreactors for high-throughput single-cell encapsulation and phenotyping via FACS.</a> Anal Chem. 92 (19), 13262-13270 (2020).</li>
<li>Luo, X., Chen, J. Y., Ataei, M., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+compartmentalization+platforms+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic compartmentalization platforms for single cell analysis.</a> Biosensors. 12 (2), 58(2022).</li>
<li>Bounab, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single-cell+phenotyping+of+immune+cells+using+the+microfluidic+platform+DropMap%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic single-cell phenotyping of immune cells using the microfluidic platform DropMap.</a> Nat Protoc. 15 (9), 2920-2955 (2020).</li>
<li>Eyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+deep+phenotyping+of+IgG-secreting+cells+for+high-resolution+immune+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-cell deep phenotyping of IgG-secreting cells for high-resolution immune monitoring.</a> Nat Biotechnol. 35 (10), 977-982 (2017).</li>
<li>Gaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+rapid+microfluidics-assisted+antibody+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Versatile and rapid microfluidics-assisted antibody discovery.</a> mAbs. 13 (1), 198130(2021).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nat Biotechnol. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>De Jonghe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((spinDrop%3A+a+droplet+microfluidic+platform+to+maximise+single-cell+sequencing+information+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">spinDrop: a droplet microfluidic platform to maximise single-cell sequencing information content.</a> Nat Comm. 14 (1), 4788(2023).</li>
<li>Wheeler, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+forward+genetic+screening+of+astrocyte-microglia+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk.</a> Science. 379 (6636), 1023-1030 (2023).</li>
<li>Portmann, K., Linder, A., Oelgarth, N., Eyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+deep+phenotyping+of+cytokine+release+unmasks+stimulation-specific+biological+signatures+and+distinct+secretion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell deep phenotyping of cytokine release unmasks stimulation-specific biological signatures and distinct secretion dynamics.</a> Cell Rep Meth. 3 (7), 100502(2023).</li>
<li>Portmann, K., Linder, A., Eyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation-induced+cytokine+polyfunctionality+as+a+dynamic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stimulation-induced cytokine polyfunctionality as a dynamic concept.</a> eLife. 12, 89781(2023).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin Biochem Rev. 29, S49-S52 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+neurological+degeneration%3A+Inflammatory+cytokines+and+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New insight into neurological degeneration: Inflammatory cytokines and blood-brain barrier.</a> Front Mol Neurosci. 15, 1013933(2022).</li>
<li>Kim, P. S., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+responding+T+cells+in+cancer+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Features of responding T cells in cancer and chronic infection.</a> Curr Opin Immunol. 22 (2), 223-230 (2010).</li>
<li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networks+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Cosenza, M., Sacchi, S., Pozzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+release+syndrome+associated+with+T-cell-based+therapies+for+hematological+malignancies%3A+Pathophysiology%2C+clinical+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokine release syndrome associated with T-cell-based therapies for hematological malignancies: Pathophysiology, clinical presentation, and treatment.</a> Int J Mol Sci. 22 (14), 7652(2021).</li>
<li>Hu, B., Huang, S., Yin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+storm+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">The cytokine storm and COVID-19.</a> J Med Virol. 93 (1), 250-256 (2021).</li>
<li>Marcuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinflammatory+diseases+and+cytokine+storms-Imbalances+of+innate+and+adaptative+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoinflammatory diseases and cytokine storms-Imbalances of innate and adaptative immunity.</a> Int J Mol Sci. 22 (20), 11241(2021).</li>
</ol>

Konkretne aspekty, takie jak pomiary linii koralików komórek, zostały opatentowane.

Uwalnianie i wydzielanie cytokin jest często badane w immunologii i medycynie klinicznej3. Niezrównoważone wydzielanie cytokin może prowadzić do szkodliwych skutków dla pacjentów cierpiących na infekcje, ale także w chorobach neurologicznych, stanach zapalnych lub nowotworach 26,27,28. Mimo że ich znaczenie dla zdrowia i choroby jest dobrze znane, badanie cytokin i ich komórek wydzielających pozostaje wyzwaniem, ponieważ obecne metodologie nie są w stanie dokładnie wykryć i określić ilościowo cytokin pochodzących z pojedynczej komórki w sposób rozdzielczy w czasie. Do przedstawionego tutaj przepływu pracy wykorzystano ustalony protokół stymulacji PBMC i zmierzono wydzielanie przez nie IL-6, TNF-α i IL-1β. Wybór stosowania PBMC zamiast indywidualnych, oczyszczonych subpopulacji wynikał z poprzedniego wniosku do badania zespołów uwalniania cytokin (CRS)23, stanu charakteryzującego się wysoce podwyższonymi stężeniami cytokin prozapalnych w osoczu, w tym IL-6, TNF-α i IL-1β29. Ponieważ CRS zwykle nie jest związany tylko z jedną populacją, użyliśmy PBMC tak, jak byłyby one obecne in vivo. Jednak subpopulacje komórkowe mogą być oczyszczane i oceniane indywidualnie, jeśli wymaga tego kwestia naukowa. Czas inkubacji, warunki stymulacji i zakresy testów dynamicznych zostały zoptymalizowane w celu pomiaru wydzielania trzech cytokin będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawiony tutaj przepływ pracy i dane pokazują, jak ustawiać, kalibrować, kwantyfikować, mierzyć i analizować czasowo rozdzielone wydzielanie pojedynczych komórek wielu cytokin. Protokół ten zawiera plan tego, w jaki sposób wielofunkcyjna analiza wydzielania cytokin może umożliwić dużą funkcjonalną i dynamiczną różnorodność cytokin wydzielanych przez pacjentów.
Kilka kluczowych aspektów opisanego protokołu testowego umożliwia unikalny odczyt biologiczny. Po pierwsze, enkapsulacja pojedynczej komórki w kropelkach mikroprzepływowych pozwoliła na ekstrakcję danych dla każdej pojedynczej komórki. Zdarzenia związane z enkapsulacją wielu komórek mogą być wykrywane i sortowane za pomocą analizy obrazu, w zależności od pytania badawczego. Po drugie, włączenie kilku niezależnych testów immunologicznych fluorescencyjnych w kropelkach i wyrównanie funkcjonalizowanych nanocząstek pozwoliło na ilościowy pomiar do trzech stężeń cytokin równolegle. To multipleksowanie umożliwiło analizę wzorców współwydzielania cytokin na poziomie pojedynczej komórki. Po trzecie, unieruchomienie kropelek pozwoliło na pomiar w czasie i korelację wydzielania cytokin dla każdej komórki wydzielającej oraz pozwoliło na odróżnienie wydzielania współobecnego od sekwencyjnego. Rozdzielczość czasowa w unikalny sposób dostarczyła danych na temat wzorców wydzielania i subpopulacji różnych typów wydzielaczy. Wreszcie, równoległa analiza obrazu umożliwiła efektywne wyodrębnianie i śledzenie dużych ilości danych z pomiarów na ponad 20 000 pojedynczych komórek. Ekstrakcja z pojedynczych krzywych wydzielania pozwoliła na dalsze odkrycie subpopulacji i funkcji fenotypowych.
Oprócz unikalnego odczytu, test ma również zalety techniczne w porównaniu ze standardową analizą cytokin. Dzięki niewielkim rozmiarom komór enkapsulacyjnych wynoszącym około 60 pl, bezwzględne ilości wydzielanych cytokin mogą być wykrywane bezpośrednio ze źródła biologicznego z limitami wykrywalności dopasowanymi do wydzielania komórkowego. Miniaturyzacja testu wykorzystuje również mniejsze ilości drogich bioodczynników. Co więcej, instalacja wymaga bardzo niewielkiej ilości specjalistycznego sprzętu, który często jest już dostępny w laboratoriach biologicznych i bioinżynieryjnych. Mikroskopy fluorescencyjne są szeroko dostępne, a pompy strzykawkowe są często używane w laboratoriach bioinżynieryjnych lub można je kupić po stosunkowo niskich kosztach. Jeśli obecna jest hodowla komórkowa, koszt pełnego sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia eksperymentów wynosi około 148 000 euro, z czego większość pochodzi z automatycznego mikroskopu epifluorescencyjnego (130 000 euro). Jednak taki instrument można często znaleźć w laboratoriach biologicznych, a reszta kosztów jest rozdzielana na pompę strzykawkową (13 000 euro, ale dostępne są tańsze alternatywy) i mniejszy sprzęt. Wytwarzanie chipa kropelkowego i komory obserwacyjnej jest bardzo dobrze opisane17 i może być wykonane poza środowiskiem pomieszczenia czystego z niezbędną infrastrukturą, taką jak piece i urządzenia do czyszczenia plazmowego obecne w większości laboratoriów bioinżynieryjnych. Alternatywnie, dostępni są różni dostawcy, którzy dostarczają zainteresowanym laboratoriom chipy generatora kropel. Ze względu na małe potrzebne objętości test jest opłacalny i prosty w konfiguracji.
Aby zapewnić najwyższy stopień odtwarzalności, zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych kroków dla sukcesu protokołu. Częstym problemem dla początkujących użytkowników jest ruch kropel podczas pomiaru. Chociaż oprogramowanie analityczne może do pewnego stopnia śledzić poszczególne kropelki, nadmierny ruch prowadzi do utraty rozdzielczości pojedynczej komórki i niedokładnych wyników. Ruchu można uniknąć, stosując odpowiednio szczelne komory pomiarowe, prawidłową wielkość kropel i rozmiary komór, krótki okres równowagi przed rozpoczęciem pomiaru oraz odpowiednie stężenie środka powierzchniowo czynnego. Kolejnym krytycznym krokiem jest dokładne ustawienie ostrości przed rozpoczęciem pomiaru. Niewłaściwe ogniskowanie prowadzi do znacznego obniżenia wartości relokacji fluorescencji i niedoszacowania ilości wydzielanej cytokiny. Wreszcie, w zależności od danego pytania i protokołu, prawidłowe wyczucie czasu między różnymi krokami ma ogromne znaczenie dla odtwarzalności. Szczególnie czas oczekiwania między napełnieniem komory a rozpoczęciem pomiaru powinien być stały, w przeciwnym razie okno pomiarowe wydzielanych cytokin może zostać pominięte.
Do ograniczeń prezentowanej technologii należy ograniczenie możliwości dalszego manipulowania komórkami po enkapsulacji. W związku z tym obecnie nie jest możliwe dodawanie lub usuwanie stymulantów, przeciwciał lub dodatkowych odczynników. Dodatkowo, ponieważ komórki są zamknięte w izolowanym bioreaktorze, podczas pomiaru nie mogą zachodzić żadne interakcje między komórkami (sygnalizacja kontaktowa lub parakrynna). To ograniczenie można częściowo przezwyciężyć dzięki wcześniejszej inkubacji masowej. Poza tym możliwe są również zwiększone efekty autokrynne wydzielanych cytokin i nie można ich określić ilościowo ani wykluczyć z całą pewnością, ponieważ mierzone są tylko wydzielane cytokiny wykryte przez przeciwciała. Tak więc odosobniony pogląd na wydzielanie cytokin musi być zawsze opisany w kontekście odpowiedniego pytania i zastosowania. Jednak to ograniczenie może być również wykorzystane do szczegółowego badania zamkniętych wielokrotności, dubletów i trojaczków, jeśli jest to interesujące. Zapewniłoby to interesującą konfigurację przydatną do badania kontaktów komórka-komórka lub pytań opartych na parakrynności. Wreszcie, również zakres dynamiczny testu jest ograniczony i wymaga dostosowania do konkretnego zastosowania. W tym przypadku dostosowaliśmy zakres dynamiczny testu do oczekiwanej wydzielanej ilości mierzonych cytokin.
Aby jeszcze bardziej zwiększyć możliwości i możliwości zastosowania testu, w przyszłości można będzie zająć się kilkoma osiągnięciami w aspektach biologicznych, technicznych i analizy danych. Od strony biologicznej pomiar dodatkowych cytokin, innych wydzielanych białek, markerów metabolicznych lub markerów powierzchniowych komórek można zintegrować poprzez dostosowanie testu. Co więcej, test ten można zintegrować z przepływem pracy wraz z innymi testami opartymi na komórkach w celu poszerzenia odczytów (np. barwienie cytometrią przepływową lub sekwencjonowanie). Ponadto można uprościć użyteczność testu, np. poprzez stworzenie zintegrowanego chipa mikroprzepływowego do tworzenia i obserwacji kropel, co potencjalnie umożliwi szersze zastosowanie poza laboratoriami bioinżynieryjnymi w warunkach klinicznych. Jeśli chodzi o analizę danych, ekstrakcję i śledzenie informacji z obrazów można rozszerzyć poprzez zwiększenie automatyzacji i wykorzystanie podejść opartych na uczeniu maszynowym, np. w celu wykrycia obecności i położenia komórki (komórek) oraz linii kulek w każdej kropli bez znakowania fluorescencyjnego. W ten sposób otworzyłoby się dodatkowe kanały fluorescencyjne, które można by wykorzystać do testów immunologicznych, co pozwoliłoby na równoległy pomiar jeszcze większej liczby cytokin.
Przedstawiony test oraz związane z nim protokoły i analizy mogą być stosowane w różnych potencjalnych przypadkach użycia związanych z dynamiką wydzielania cytokin. Dokładniej rzecz ujmując, test może potencjalnie odpowiedzieć na podstawowe pytania immunologiczne, takie jak identyfikacja profili wydzielania cytokin specyficznych dla typu komórki i aktywacji, polifunkcjonalność komórek wydzielających cytokiny lub czasowość i mechanizmy utrzymania równowagi cytokin. Co więcej, w zastosowaniach klinicznych platforma może umożliwić rozwikłanie zagadki roli cytokin podczas aktywnych lub przewlekłych reakcji zapalnych, jak zaobserwowano w przypadku COVID-1930, lub zapewnić narzędzie do stratyfikacji pacjentów i personalizacji leczenia w oparciu o unikalne sygnatury, takie jak w przypadku autozapalenia31. Podsumowując, ilościowa ocena wydzielania cytokin przez pojedyncze komórki w czasie jest bardzo potrzebną metodą, ponieważ wyjaśnia, w jaki sposób dany lek, infekcja, zmiana genetyczna lub stymulacja ex vivo indukuje określoną odpowiedź.

Infekcje często wywołują złożone reakcje gospodarza z udziałem wrodzonego i nabytego układu odpornościowego1,2. W odpowiedzi na infekcję lub rozpoznanie czynników zakaźnych komórki gospodarza mogą produkować szeroki zakres chemokin i cytokin, które są małymi białkami znanymi jako krytyczne przekaźniki i modulatory układu odpornościowego3. Cytokiny prozapalne są uwalniane wczesną fazie infekcji w celu zainicjowania odpowiedzi immunologicznej, a następnie pojawiają się cytokiny przeciwzapalne, które są kluczowe dla zapobiegania uszkodzeniom tkanek i późniejszym chorobom przewlekłym lub autozapalnym. Ta równowaga między eliminacją zagrożenia a ochroną tkanek objawia się jako szeroki repertuar cytokin pełniących różne funkcje podczas infekcji, co pozwala na precyzyjne dostrojenie odpowiedzi4,5. W tej mieszaninie można zaobserwować unikalne sygnatury w zależności od patogenu i indukowanych przez niego sygnałów, lokalizacji tkankowej oraz komórek odpornościowych, z których one pochodzą. Wydzielanie cytokin wydaje się jednak stanowić wielofunkcyjny proces biologiczny charakterystyczny dla każdej populacji komórek, zróżnicowany pod względem dynamiki sekrecji i indywidualnej odpowiedzi. Heterogeniczność ta jest opisywana w literaturze od wielu lat, na przykład wśród subpopulacji limfocytów T6,7, gdzie badania nad chorobami autozapalnymi i ciężkimi infekcjami COVID-19 wykazały dużą różnorodność funkcjonalną markerów zapalnych w obrębie poszczególnych pacjentów oraz między nimi8,9. Ostatnio pojawienie się sekwencjonowania pojedynczych komórek uwypukliło wysoką plastyczność i interakcje między subpopulacjami w mikrośrodowiskach odpornościowych, które nie były wcześniej widoczne, co wskazuje, że metody jednokomórkowe są niezbędne do uchwycenia tej heterogeniczności10,11. Podczas gdy opracowywane są nowe metody analizy transkryptomu, analiza fenotypowa pozostaje wyzwaniem, ponieważ wymaga jednoczesnych, ilościowych i rozdzielonych w czasie pomiarów sekrecji białek na poziomie pojedynczej komórki. Takie pomiary pozwalają badać tożsamość komórek wydzielniczych, ich dynamikę oraz wzorce sekrecji (wolne/szybkie, wczesne/późne, jednoczesne/sekwencyjne) dla określonego repertuaru lub panelu cytokin. Umożliwiając ilościowe badanie dynamiki uwalniania cytokin podczas odpowiedzi immunologicznej z rozdzielczością czasową, uzyskane w ten sposób informacje mogą pozwolić na zrozumienie zespołu komórkowego i indukowanej odpowiedzi.
W standardowych protokołach cytokiny są zazwyczaj wykrywane w supernatancie zawiesin komórkowych oraz w surowicy za pomocą enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA), co pozwala na oznaczenie całkowitej ilości wydzielonych białek. Pomiary zbiorcze nie umożliwiają kwantyfikacji ilości cytokin produkowanych przez poszczególne komórki, co jest problemem szczególnie istotnym w przypadku heterogenicznych próbek komórkowych. Metody alternatywne, takie jak wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin, test ELISpot (enzyme-linked immunospot) lub testy z mikro trawieniem (np. Isoplexis), wykrywają cytokiny ekspresowane przez pojedyncze komórki, ale dostarczają jedynie pomiarów końcowych12,13. Oznacza to, że dynamika wydzielania oraz zmiany w profilu sekrecji komórkowej, które mogą wystąpić w czasie inkubacji, są pomijane. Dodatkowo pomiary końcowe nie pozwalają na rozróżnienie między jednoczesnym a sekwencyjnym wydzielaniem cytokin, przez co rzeczywisty zakres jednoczesnej polifunkcyjności komórek odpornościowych w zakresie sekrecji cytokin pozostaje niejasny przy zastosowaniu tych metod.
Rozdzielczość na poziomie pojedynczej komórki można osiągnąć, wykorzystując mikroprzepływy kropelkowe do generowania i przetwarzania fizycznych przedziałów o rozmiarach pikolitrowych, co pozwala na badanie komórek odpornościowych pod kątem ich unikalnych fenotypów sekrecji cytokin w skali pojedynczej komórki14,15. Przedziały te stanowią emulsje typu woda w oleju i mogą być generowane za pomocą chipów mikroprzepływowych16,17. Rzeczywiście, analizy mikroprzepływowe oparte na kropelkach wykazały niezwykłą wszechstronność, umożliwiając analizę różnych próbek i repertuarów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki oraz ich integrację z procesami wstępnymi (przetwarzanie komórek i odczynników) i późniejszymi (sortowanie pojedynczych komórek, proteomika lub sekwencjonowanie)18,19,20,21,22. W szczególności układy umożliwiające unieruchomienie kropli pozwalają na pomiar funkcjonalności pojedynczej komórki w czasie, co jest cenne w analizie sekrecji białek18. Ponadto integracja multipleksowych analiz ilościowych ułatwia dodatkowe badania w wcześniej niedostępnych wymiarach, w procesach takich jak współsekrecja oraz identyfikacja polifunkcyjnych komórek odpornościowych23,24.
W niniejszym protokole opisujemy proces analizy pojedynczych komórek z wykorzystaniem unieruchomionych kropelek, służący do detekcji, ilościowego oznaczenia i pomiaru czasowego wydzielania do trzech cytokin jednocześnie przez pojedyncze komórki17,23. Technologia ta umożliwia monitorowanie odpowiedzi cytokinowej w ponad 20 000 komórek równolegle.
Przedstawiony schemat obejmuje mikrofluidyczną enkapsulację pojedynczych komórek odpornościowych oraz funkcjonalizowanych nanocząstek w kroplach woda-w-olej o objętości 60 pL. Immobilizacja &gt;100 000 kropli w komorze obserwacyjnej oraz mikroskopia fluorescencyjna z rozdzielczością czasową umożliwiają pomiar dynamiki sekrecji cytokin wewnątrz każdej kropli oraz dla każdej cytokiny (Rycina 1A). W przypadku każdej pojedynczej komórki w kropli sekrecja cytokin jest mierzona za pomocą kanapkowego testu immunoenzymatycznego, w którym nanocząstki magnetyczne funkcjonalizowane specyficznym przeciwciałem wychwytującym wiążą wydzieloną cytokinę, co prowadzi do późniejszej relokacji i wiązania fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał detekcyjnych (Rycina 1B,C). Poprzez ustawienie nanocząstek magnetycznych w jednej linii tworzona jest linia koralików (beadline), wzdłuż której można ilościowo określić relokację fluorescencji w obecności cytokiny. Tutaj relokacja fluorescencji jest definiowana jako średnia intensywność fluorescencji na linii koralików podzielona przez średnią intensywność fluorescencji w pozostałej części kropli. Test ten można przeprowadzić w trybie multipleksowym dla kilku cytokin, mieszając partie nanocząstek o różnych funkcjonalizacjach oraz odpowiadające im przeciwciała detekcyjne znakowane w różnych kanałach fluorescencyjnych23, co skutkuje specyficznymi relokacjami fluorescencji w różnych kanałach. Za pomocą dostosowanego skryptu analitycznego można wyekstrahować wartości relokacji fluorescencji, a obrazy przekształcić w profile dynamiki sekrecji dla każdej pojedynczej komórki i cytokiny. W rezultacie uzyskane zestawy danych dostarczają licznych odczytów, takich jak ilościowy pomiar sekrecji w czasie, identyfikacja współwydzielających subpopulacji oraz rozkłady komórek w zależności od wydzielonych ilości, szybkości i kombinacji cytokin.
<img alt="Schemat analizy pojedynczych komórek; chip PDMS do produkcji kropel; detekcja cytokin; schemat konfiguracji testu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procedury i zasada testu. (A) Przegląd procedury analizy komórek wydzielających cytokiny po stymulacji. Suspensje pojedynczych komórek i nanocząsteczki magnetyczne są przygotowywane i zamykane w emulsjach olej/woda (kroplach) o objętości 60 pL. Krople są unieruchamiane, a nanocząsteczki ustawiane w polu magnetycznym przed pomiarem wykonywanym co 30 min przez maksymalnie 4 h. Na koniec analizowane są obrazy i wyodrębniane parametry dla każdej kropli, punktu czasowego i kanału fluorescencyjnego. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła17. (B) Zasada testu typu „sandwich” w kroplach. Funkcjonalizowane nanocząsteczki wiążą wydzielane cytokiny, co prowadzi do późniejszej relokacji znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał detekcyjnych na nanocząsteczki. Ta relokacja fluorescencji jest ilościowo określana i walidowana za pomocą eksperymentów kalibracyjnych przeprowadzonych z cytokinami rekombinantowymi. Mieszanie różnych funkcjonalizowanych nanocząsteczek umożliwia multipleksowe pomiary do trzech cytokin jednocześnie. (C) W eksperymentach z wykorzystaniem komórek krople są śledzone w czasie pomiaru, a komórki wydzielnicze są identyfikowane na podstawie wzrostu relokacji fluorescencji na nanocząsteczki w czasie. Schematy nie są zachowane w odpowiedniej skali. Rycina stworzona za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>008-FluoroSurfaktant</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfaktant-10G</td><td></td></tr><tr><td>2-Strumieniowy ekspres kropelkowy skupiający przepływ, 30 i mikro; m dysza, hydrofobowa obróbka powierzchni PFOS</td><td>Chipsy</td><td></td><td></td>Wunderli</tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20006</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html</td></tr><tr><td>Anty-ludzka IL-1&beta; (Mysz monoklonalna), AF647 z oznaczeniem własnym</td><td>PeproTech</td><td>500-M01B</td><td></td></tr><tr><td>ARcare92524 dwustronna taśma klejąca</td><td>Adhesvies Reasearch</td><td>ARcare92524</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm</td><td>Ademtech</td><td>Cat#03233</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowana koza Anti-Human IL-1&beta;</td><td>PeproTech</td><td>500-P21BGBT</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak</td><td>do komórek TPP</td><td>99002</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Zestaw do proliferacji komórek fioletowych</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>Roztwór do barwienia komórek</td></tr><tr><td>Chromafil Xtra Filtry strzykawkowe PTFE-45/25</td><td>Macherey-Nagel</td><td>729205</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-dołkowy przezroczysty płaski Dolna ultra-niska nasadka</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Countess Szkiełka komory do liczenia komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>Fluorochem</td><td>M02926</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14196-094</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S.&nbsp; Standardowy 2-200 i mikro; l</td><td>Eppendorf</td><td>30000889</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>A39259</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Poręczny płyn do mycia naczyń</td><td>Migros</td><td>5.01002E+11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080 HFE-7500</td><td></td></tr><tr><td>Olej 3M TM Novec</td><td>Fluorochem</td><td>B40045191</td><td></td></tr><tr><td>Idex F-120 Jednoczęściowe złącze, standardowe radełkowanie, naturalny PEEK, rurka o średnicy zewnętrznej 1/16", 10-32 stożek</td><td>Cole-Parmer</td><td>GZ-02014-15</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne IL-6 (MQ2-13A5 - szczur), FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-7069-81</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne IL-6 (MQ2-39C3), biotyna</td><td>ThermoFisher</td><td>13-7068-85</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum do nokautu</td><td>ThermoFisher</td><td>10828-010</td><td></td></tr><tr><td>Loctite AA 3491 utwardzalny klej UV</td><td>Henkel AG & Co</td><td>3491</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (76x26x1mm, przezroczyste białe)</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa do oleju mineralnego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>NanoPort Assembly Headless, 10-32 Coned, do 1/16" OD</td><td>Idex</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Neodymowy magnes blokowy</td><td>K& J Magnetics</td><td>BZX082</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140-122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0,2 &mikro; m filtrowane (10% roztwór w wodzie)</td><td>ThermoFisher</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne</td><td>Kimtech Science</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki PTFE 0,30 i razy; 0,76 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1191-9445</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki PTFE 0,56 i razy; 1,07 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1192-9445</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-1&beta;</td><td>Peprotech</td><td>Cat#200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-6</td><td>Peprotech</td><td>Cat#200-06</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka albumina surowicy (HSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>Cat#300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Stemple do biopsji wielokrotnego użytku o średnicy 0,75 mm i 6 mm</td><td>Stiefel</td><td>&nbsp; 504529 i 504532</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Standard LPS, E. coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Igły Sterican 23 G do mikrorurek o średnicy 0,56 mm</td><td>FisherScientific</td><td>15351547</td><td></td></tr><tr><td>Igły Sterican 27 G do mikrorurek o średnicy 0,30 mm</td><td>FisherScientific</td><td>15341557</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne TNF alfa (MAb11), PE</td><td>ThermoFisher</td><td>12-7349-81</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne TNF-alfa (MAb1), biotynylowane we własnym zakresie</td><td>ThermoFisher</td><td>14-7348-85</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%) do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Filtracja próżniowa "rapid"-Filtermax</td><td>TPP</td><td>99500</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna maszyna do cięcia Cameo 4</td><td>Silhouette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni Base 120 + 3x Niskociśnieniowe pompy strzykawkowe NEMESYS</td><td>Cetoni</td><td>NEM-B101-03 A</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II Automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny Ti2</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1</td><td></td></tr><tr><td>OKO Klatka laboratoryjna Inkubator, ciemne panele</td><td>OKO Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Fusion Cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hammatsu</td><td>C14440</td><td></td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>sola 80-10247</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infekcje, choroby autoimmunologiczne, pożądane i niekorzystne reakcje immunologiczne na leczenie mogą prowadzić do złożonej i dynamicznej odpowiedzi cytokin in vivo. Odpowiedź ta obejmuje liczne komórki odpornościowe wydzielające różne cytokiny w celu koordynowania reakcji immunologicznej. Jednak dynamika wydzielania, ilości i współwystępowanie różnych cytokin przez różne podtypy komórek pozostają słabo poznane z powodu braku odpowiednich narzędzi do ich badania. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący mikroprzepływową platformę kropelkową, która umożliwia ilościowy pomiar dynamiki wydzielania kilku cytokin równolegle na poziomie pojedynczej komórki z rozdzielczością czasową. Jest to możliwe dzięki enkapsulacji pojedynczych komórek w kropelkach mikroprzepływowych wraz z multipleksowanym testem immunologicznym do równoległej kwantyfikacji stężeń cytokin, ich unieruchomienia w celu dynamicznego obrazowania fluorescencyjnego oraz analizie odpowiednich obrazów w celu określenia wydzielanych ilości i dynamiki. Protokół opisuje przygotowanie funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, eksperymenty kalibracyjne, przygotowanie komórek oraz enkapsulację komórek i nanocząstek w kropelki do obrazowania fluorescencyjnego oraz późniejszą analizę obrazu i danych na przykładzie stymulowanych lipopolisacharydem ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Zaprezentowana platforma zidentyfikowała odrębne zachowanie wydzielania cytokin dla komórek pojedynczych i jednocześnie wydzielających, charakteryzując oczekiwaną heterogeniczność fenotypową w mierzonej próbce komórki. Co więcej, modułowy charakter testu pozwala na jego adaptację i zastosowanie do badania różnych białek, cytokin i próbek komórek, co potencjalnie prowadzi do głębszego zrozumienia wzajemnych zależności między różnymi typami komórek odpornościowych oraz roli różnych cytokin wydzielanych dynamicznie w celu kształtowania ściśle regulowanej odpowiedzi immunologicznej. Te nowe spostrzeżenia mogą być szczególnie interesujące w badaniach nad dysregulacją immunologiczną lub w identyfikacji populacji docelowych w terapii i opracowywaniu leków.

Przedstawiona funkcjonalna platforma do analizy pojedynczych komórek umożliwiła pomiar kilku parametrów. Po pierwsze, analogicznie do standardowych technik, na końcu pomiaru przedstawiono częstotliwość występowania komórek wydzielniczych (Rycina 4A). Po stymulacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) lipopolisacharydem (LPS) w stężeniu 1 µg/mL przez 6 h, 5,81% komórek wydzielało IL-6 (n= 1270), 4,55% TNFα (n= 995) i 6,06% IL-1β (n= 1326).
Aby określić ilość wydzielanych cytokin, opracowano krzywe kalibracyjne z zastosowaniem znanych stężeń cytokin rekombinowanych (Rysunek 4B). Krzywe kalibracyjne te umożliwiają ilościowe oznaczenie stężeń cytokin wewnątrz kropel w czasie. Przykładowo, średnie stężenie IL-6 wewnątrz kropel osiągnęło plateau po 90 min w przypadku PBMC stymulowanych LPS, podczas gdy średnie stężenie IL-1β wewnątrz kropel rosło szybciej od 90 min, co wykazuje dynamiczną rozdzielczość platformy oraz możliwość wydzielania subpopulacji komórek sekrecyjnych dla konkretnych cytokin (Rysunek 4C). Ponieważ stężenia zmieniają się pomiędzy punktami pomiarowymi, możliwe jest obliczenie dynamicznych wskaźników wydzielania dla poszczególnych cytokin. Biorąc pod uwagę średnią szybkość wydzielania każdej cytokiny (Rysunek 4D), komórki wydzielające IL-6 wykazywały stały spadek średniej szybkości wydzielania, podczas gdy komórki wydzielające TNFα i IL-1β wykazywały wzrost szybkości wydzielania po 90 min pomiaru oraz wtórny spadek po 150 min.
Ponadto możliwe jest pogrupowanie komórek w subpopulacje w zależności od wydzielanych i współwydzielanych cytokin (Rysunek 4E). W tym przypadku IL-6 i TNFα są wydzielane pojedynczo przez odpowiednio 30,2% i 26,4% komórek wydzielających IL-6 lub TNFα, natomiast komórki wydzielające pojedynczo IL-1β stanowiły 68,8% wszystkich komórek wydzielających IL-1β. Dodatkowo można przeanalizować wpływ współwydzielania na stężenia wydzielanych cytokin oraz szybkość ich sekrecji (Rysunek 4F). Analizując komórki wydzielające IL-6, stwierdzono, że wydzielano różne ilości IL-6 w zależności od tego, czy komórki dodatkowo produkowały TNFα lub IL-1β. Podobnie rozkład średnich szybkości sekrecji w czasie pomiaru różnił się statystycznie pomiędzy komórkami wydzielającymi tylko IL-6 a komórkami wydzielającymi IL-6 wraz z TNFα (wyższe szybkości sekrecji) i IL-1β (niższe szybkości sekrecji IL-6).
<img alt="Analiza sekrecji cytokin; poziomy IL-6, TNFα i IL-1β; wykresy, wykresy kołowe; badanie indukcji LPS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki sekrecji IL-6, TNFα i IL-1β przez PBMC po 6 h stymulacji 1 µg/mL LPS. (A) Procent PBMC sekrecyjnych dla IL-6, TNFα i IL-1β na koniec 4 h pomiaru. (B) Multiplexowe krzywe kalibracyjne cytokin wygenerowane przy użyciu znanych stężeń cytokin rekombinowanych. Pozwala to na ilościowe określenie wyników eksperymentów komórkowych poprzez obliczenie stężenia cytokiny wewnątrz kropelki na podstawie wartości relokacji. Punkty dopasowano za pomocą nieliniowej jednofazowej krzywej asocjacyjnej, r2=0,9926 (IL-6), 0,9901 (TNFα), 0,9990 (IL-1β). (C) Średnie sekreowane stężenia IL-6, TNFα i IL-1β uwalniane przez sekrecyjne PBMC w ciągu 4 h czasu pomiaru. (D) Średnie szybkości sekrecji IL-6, TNFα i IL-1β w ciągu 4 h czasu pomiaru. (E) Względny procent komórek współsekrecyjnych wydzielających IL-6, TNFα lub IL-1β oraz ich kombinacje. Znormalizowano do wszystkich komórek sekrecyjnych wykrytych dla każdej cytokiny. (F) Średnie stężenia IL-6 w czasie pomiaru oraz rozkłady średniej szybkości sekrecji (log) dla komórek sekrecyjnych IL-6 z rozdzielczością współsekrecji (n=383 dla samych IL-6, n=531 dla IL-6 + TNFα, n=213 dla IL-6 + IL-1β oraz n=143 dla IL-6+TNFα+IL-1β). Różnice statystyczne w rozkładach szybkości sekrecji oceniono za pomocą dwustronnych, niezależnych, nieparametrycznych testów Kołmogorowa-Smirnowa z 95% poziomem ufności; przedstawiono wartości p. ** (p <0,002) i **** (p <0,0001). Linia ciągła reprezentuje medianę, a linia przerywana kwartyle. ncałkowita liczba komórek = 21 866. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Aby uzyskać dodatkowe informacje na poziomie pojedynczych komórek, do punktów stężenia w czasie dla każdej komórki i cytokiny można dopasować funkcję sigmoidalną (Rycina 5). Przykładowy zestaw danych stężenia w czasie dla jednej komórki oraz odpowiadające mu dopasowanie sigmoidalne przedstawiono na Rycynie 5A. W tym przypadku procedura dopasowania metodą najmniejszych kwadratów pozwala uzyskać następujące parametry: C, odpowiadające wartości górnego plateau krzywej, t50 określający przesunięcie czasowe krzywej od zera oraz nachylenie Hill’a m, opisujące stromość wzrostowej części krzywej sigmoidalnej, przy których osiągnięto wartości stężeń 10% i 90% w trakcie pomiaru. Z tych parametrów dopasowania można wyodrębnić niektóre deskryptory krzywej, zgodnie z wyjaśnieniami w kroku 7.12, otrzymując Cmax (najwyższą wartość stężenia w danych), tstart (czas rozpoczęcia sekrecji, zdefiniowany jako osiągnięcie 10% wartości stężenia górnego plateau) oraz SRlin (szybkość sekrecji podczas wzrostowej części krzywej).
Aby zaklasyfikować subpopulacje komórek, deskryptory krzywych uzyskane ze wszystkich dopasowań dla pojedynczych komórek podzielono na trzy kategorie dla każdego parametru: wartości Cmax pogrupowano jako niskie, średnie i wysokie, tstart na wczesne, średnie i późne, a SRlin na sekretory wolne, średnie i szybkie. Aby zilustrować tę klasyfikację, przedstawiono cztery przykładowe krzywe sekrecji pojedynczych komórek oraz odpowiadające im deskryptory krzywych (Rysunek 5A-D), gdzie krzywa A wykazuje charakterystykę wczesnego sekretora o niskim poziomie i średnim tempie, krzywa B reprezentuje wczesnego, wolnego sekretora o wysokim poziomie, krzywa C wczesnego, szybkiego sekretora o wysokim poziomie, a krzywa D wykazuje późną, niską sekrecję. Należy zauważyć, że wartości progowe dla tych kryteriów są specyficzne dla rodzaju komórek, cytokiny i parametrów testu i muszą być dostosowane do każdego pytania badawczego. Ponadto, w analizie tej uwzględniono jedynie sekrecję IL-6 przez PBMC po stymulacji 1 µg/mL LPS przez 6 h, co oznacza, że większość komórek była wczesnymi i wysokimi sekretorami, odpowiednio w 80% i 79% przypadków (Rysunek 5E-F). W odniesieniu do tempa sekrecji zaobserwowano odpowiedź bimodalną, w której 55% komórek wydzielających IL-6 to sekretory wolne, a 39% to sekretory szybkie (Rysunek 5G).
Aby dalej scharakteryzować zachowanie sekrecyjne, deskryptory krzywych dla każdej komórki naniesiono na wzajemne wykresy i wyodrębniono różne klastry (Rycyna 5H-J). Nie stwierdzono wyraźnej korelacji między tstart a Cmax (Rycina 5H): dwie największe populacje stanowiły wczesne komórki o niskiej sekrecji oraz komórki o wysokiej sekrecji niezależnie od momentu rozpoczęcia procesu. Analizując relację między tstart a SRlin (Rycina 5I), większość komórek okazała się wczesnymi komórkami o powolnej sekrecji, przy wyraźnej populacji wczesnych komórek o wysokiej sekrecji oraz niewielkiej liczbie komórek o powolnej/średniej sekrecji rozpoczynającej się późno. W odniesieniu do korelacji między SRlin a Cmax (Rycina 5J), niemal nie wystąpiły szybkie komórki o niskiej do średniej sekrecji, z wyjątkiem nieco liczniejszej populacji szybkich komórek o niskiej sekrecji. Ponadto odnotowano dużą populację szybkich komórek sekrecyjnych, której liczebność nie zależała od maksymalnego zmierzonego stężenia, oraz dwie populacje komórek o wysokiej sekrecji, które sekretowały albo powolnie, albo szybko. Podsumowując, można wywnioskować, że badanie zależności między deskryptorami krzywych dla poszczególnych komórek pozwala na znacznie bardziej szczegółową analizę i może potencjalnie przynieść nowe odkrycia biologiczne w pomiarach sekrecji na poziomie pojedynczych komórek.
Dzięki przedstawionej powyżej analizie wyekstrahowano dynamikę sekrecji komórek współsekretujących (Rysunek 6). Dwie przykładowe krzywe pokazują różną dynamikę współsekrecji IL-6 i TNFα z dwóch pojedynczych komórek, z jednoczesnym rozpoczęciem sekrecji obu cytokin (Rysunek 6A) lub sekrecją sekwencyjną, w której pierwsza była sekretowana IL-6 (Rysunek 6B). Aby sklasyfikować wszystkie komórki współsekretujące, zdefiniowano opóźnienie sekrecji wynoszące 60 min, gdzie wszystkie komórki rozpoczynające sekrecję w tym przedziale uznano za sekretory jednoczesne, a wszystkie komórki z dłuższym opóźnieniem za sekretory sekwencyjne. Analiza ta pozwoliła również ustalić, która cytokina była sekretowana jako pierwsza. W przypadku IL-6 i TNFα w 76% komórek zaobserwowano głównie jednoczesną współsekrecję (Rysunek 6C), natomiast dla IL-6 i IL-1β współsekrecję sekwencyjną odnotowano w 86% komórek, przy czym w większości przypadków pierwszą sekretowaną cytokiną była IL-6 (Rysunek 6D).
Analizując czas rozpoczęcia sekrecji różnych cytokin dla wszystkich poszczególnych komórek współsekrecyjnych, w przeprowadzonych eksperymentach nie zaobserwowano wyraźnej korelacji między czasami rozpoczęcia sekrecji. W przypadku współsekrecji IL-6 i TNFα (Rysunek 6E) widoczna była większa pionowa grupa wokół 0 min, co odpowiadało częstszemu rozpoczynaniu procesu przez komórki od sekrecji IL-6. W przypadku współsekrecji IL-6 i IL-1β (Rysunek 6F) większość komórek zaczęła wydzielać IL-6 około rozpoczęcia pomiaru, podczas gdy IL-1β była wydzielana głównie później. Podsumowując, zaprezentowana tutaj analiza umożliwiła identyfikację różnych subpopulacji komórek wydzielniczych oraz złożonej dynamiki współsekrecji cytokin.
<img alt="Pomiar stężenia IL-6 w czasie; wykresy; szybkości sekrecji i analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Szczegółowa analiza różnych wzorców dynamiki sekrecji dla krzywych pojedynczych komórek wydzielających IL-6. (A) Reprezentatywne dane dotyczące stężenia cytokin w pojedynczych komórkach w czasie pomiaru wraz z dopasowaną krzywą sigmoidalną i wyznaczonymi parametrami. (B-D) Trzy przykładowe krzywe stężenia cytokin w pojedynczych komórkach dla różnych typów wydzielników cytokin zidentyfikowanych w przypadku sekrecji IL-6 po stymulacji LPS. (E-G) Procenty komórek wydzielających IL-6 zaklasyfikowanych do różnych typów wydzielników na podstawie następujących kryteriów (n=633): E. Cmax: niskie &lt;5 nM, wysokie &gt;19,5 nM, F. tstart: wczesne &lt;30 min, późne &gt;120 min, G. SRlin: powolne &lt;250 cząsteczek/s, szybkie &gt;750 cząsteczek/s. (H-J) Zależność między trzema deskryptorami krzywej sekrecji Cmax, tstart i SRlin dla każdej pojedynczej komórki (n=633). Duża populacja przy Cmax=20 nM wynika z osiągnięcia górnej granicy detekcji testu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres kinetyki wydzielania IL-6 i TNFα; typy współwydzielania; analiza statystyczna; badanie biologii komórki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wyodrębnianie wzorców współwydzielania z krzywych stężeń dla pojedynczych komórek. (A-B) Reprezentatywne krzywe stężeń dla pojedynczych komórek współwydzielających IL-6 i TNFα odpowiednio (A) symultanicznie oraz (B) sekwencyjnie. (C-D) Procent komórek wykazujących symultaniczne i sekwencyjne współwydzielanie odpowiednio IL-6 i TNFα (n=249) oraz IL-6 i IL-1β (n=72). Wydzielanie sekwencyjne zdefiniowano jako opóźnienie rozpoczęcia wydzielania cytokin przekraczające 60 min. Kolory wskazują, która z cytokin zaczęła być wydzielana jako pierwsza. (E-F) Zależność między czasami rozpoczęcia wydzielania różnych cytokin dla każdej wydzielającej komórki (nIL6-TNFα=249, nIL6-IL1β=72). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig06largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

W tym projekcie koncentrujemy się na opracowaniu i zastosowaniu nowatorskich strategii analitycznych, które pozwalają na bezpośrednią, ilościową i głęboką analizę funkcjonalności komórkowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Wychodząc poza czysty pomiar jednego punktu danych, staramy się lepiej zrozumieć i wykorzystać tę wielofunkcyjność, która wynika ze złożonych reakcji w gospodarzu i w tkance. Uzyskanie kompleksowego zrozumienia tych funkcji jest złożone, trudne i wymaga interdyscyplinarnego podejścia.Jednym z wyzwań w tym kontekście jest zapewnienie, że zakres dynamiczny opracowanego testu jest odpowiedni do uchwycenia ilości i dynamiki wydzielanego białka, które mogą się znacznie różnić w zależności od próbek, preparatów i tkanek. Zakłócenie w regulacji odpowiedzi immunologicznej może wywołać różne zaburzenia, prowadzące do łagodnej gorączki, do potencjalnie zagrażających życiu powikłań. Wychodząc poza tradycyjne pomiary punktów końcowych, proponujemy bezpośredni pomiar dysregulacji i aktywacji komórek odpornościowych dynamicznie na poziomie pojedynczej komórki, aby uzyskać dodatkowy wgląd.Tak więc cytokiny są zwykle wykrywane w określonym punkcie czasowym jako stężenie w supernatancie, procent aktywowanych komórek. Pomiar masowy w celu ilościowego określenia wydzielania każdej pojedynczej komórki, maskowanie niejednorodności komórkowej za pomocą pomiarów końcowych, które nie rozróżniają między wydzielaniem równoczesnym a wtórnym, pomijając dynamiczny aspekt odpowiedzi. Polifunkcjonalność komórkowa odnosi się do zdolności komórki odpornościowej do jednoczesnego wydzielania wielu cytokin.Pozwala im to na przykład na precyzyjne dostrojenie reakcji na zagrożenia i dynamiczne mierzenie tej wielofunkcyjności, co oznacza, że w czasie może dać wgląd w różne niuanse odpowiedzi immunologicznej. Aby rozpocząć, umieść szklane szkiełko z otworami na czystej powierzchni stroną aktywowaną plazmą skierowaną do góry. Ostrożnie usuń warstwę ochronną z jednej strony dwustronnej taśmy klejącej w kierunku cięcia.Dopasuj taśmę do krawędzi szkiełka i wywierconych otworów. Umieść taśmę na szkiełku podstawowym zaczynając od krótszej krawędzi i upewnij się, że jest dobrze przylegająca. Po usunięciu drugiej warstwy ochronnej z taśmy, należy umieścić drugi szkiełko tak, aby aktywowana powierzchnia była skierowana w dół.Używając płaskiej deski, dociśnij do siebie dwa szklane szkiełka, jednocześnie przykładając siłę górnej części ciała przez 10 sekund. Odwróć komorę tak, aby otwory były skierowane w stronę użytkownika. Nałóż niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV w pierścieniu poniżej portu nano.Wsuń port nano w dół otworu w szklanym szkiełku za pomocą mikrorurki i dodaj pierścień kleju utwardzanego promieniami UV wokół portu. Załadować jeden mililitr 1% roztworu przygotowanego w oleju fluorowanym do strzykawki. Wstrzyknąć roztwór przez filtr strzykawkowy z PTFE i igłę przymocowaną do mikrorurki z PTFE do komory obserwacyjnej.Po minucie inkubacji za pomocą azotu pod ciśnieniem wypłukać roztwór powlekający pod wyciągiem. Używając innego zestawu strzykawki, przepłukać komorę wyłącznie olejem fluorowym. Na początek dodaj nanocząstki funkcjonalizowane streptawidyną do probówek do wykrywania TNF alfa, interleukiny jednej beta i interleukiny szóstej.Rozcieńczyć streptawidynę i nanocząstki w równych objętościach PBS. Następnie dodać biotynylowane roztwory przeciwciał wychwytujących do probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 0,01% jednego milimolowego roztworu D-biotyny do każdej probówki i inkubuj przez pięć minut.Następnie przytrzymaj magnes neodymowy blisko rurki, aby zebrać cząstki. Odrzucić klarowny supernatant i natychmiast ponownie zawiesić nanocząstki w mieszaninie pluronu F-127 i PBS i inkubować przez 30 minut. Po inkubacji cząstek przez 30 minut w buforze do przechowywania, wymieszać je, aby uzyskać jednolitą mieszaninę.Bezpośrednio przed enkapsulacją połącz sprzężone nanocząstki dla interleukiny szóstej, TNF alfa i interleukiny jednej beta. Teraz umyj cząstki kompletnym medium za pomocą magnesu, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawieś kulki w kompletnym medium. Następnie dodaj przeciwciała wykrywające dla interleukiny szóstej, TNF alfa i interleukiny jednej beta, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 nanomolowców.Na początek napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 500 mikrolitrami fazy ciągłej. Przymocuj mikrorurkę PTFE do igły o rozmiarze 27 0.75 cala. Zamontuj zestaw na strzykawce, a następnie na pompie strzykawkowej.Następnie wybij otwór za pomocą 0,75 milimetra przebijaka do biopsji w środku wycięcia PDMS. Przeciągnij około trzech centymetrów rurki PTFE przez otwór w wycięciu i wepchnij zespół w górną część końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Uszczelnij złącze klejem utwardzanym promieniami UV na górze pipety i przymocuj drugą stronę rurki do igły o rozmiarze 23 i średnicy 1,25 cala.Następnie napełnij dwie jednomililitrowe strzykawki 500 mikrolitrami lekkiego oleju mineralnego. Przymocuj dwie igły o rozmiarze 23 z niestandardowymi nasadkami i zamontuj je na pompie strzykawkowej. Za pomocą oprogramowania sterującego pompą strzykawkową odessać funkcjonalizowane nanocząstki i roztwór komórek do końcówek pipet faz wodnych.Po oczyszczeniu przygotowanej komory obserwacyjnej należy zacisnąć komorę w drukowanym uchwycie komory wyposażonym w dwa magnesy neodymowe pod kątem 30 stopni. Teraz otwórz oba porty i włóż ręcznik papierowy do górnego portu, aby wchłonąć nadmiar fazy zewnętrznej podczas napełniania. Podłącz fazę ciągłą do górnego wlotu chipa mikroprzepływowego.Następnie przepłukuj chip fazą ciągłą przez około 30 sekund przy natężeniu przepływu 1800 mikrolitrów na godzinę. Przymocuj końcówki pipet roztworów wodnych do dwóch środkowych wlotów chipa. Rozpocząć przepływ roztworu wodnego przy 200 mikrolitrach na godzinę dla każdego roztworu.Gdy ciecz pojawi się na wylocie, rozpocznij przepływ fazy oleju fluorowanego z prędkością 800 mikrolitrów na godzinę. Poczekaj, aż ustalisz stabilną produkcję kropel, wskazywaną przez jednorodny szary błyszczący roztwór na wylocie. Następnie podłącz mikrorurkę PTFE do portu wylotowego, aby zebrać kropelki.Za pomocą modułu tulejowego jednoczęściowego złącza dokręcanego na palce, skieruj je do komory obserwacyjnej. Po napełnieniu komory zatrzymaj przepływ i zamknij porty zaślepkami portów, dociskając palcami. Po wytworzeniu kropelki przepłucz chip olejem fluorowym, a następnie azotem, aby wydmuchać pozostałą ciecz.Zamontuj uchwyt komory na mikroskopie ze stolikiem w formacie płytki dołkowej. Następnie, używając obiektywu 10x, przełącz mikroskop na kanał jasnego pola. Skoncentruj się na unieruchomionych kropelkach w jasnym polu i przejdź do środka komory.Następnie aktywuj system automatycznego ustawiania ostrości. Dostosuj płaszczyznę pomiaru na kanale jasnego pola tak, aby krawędzie kropel wyglądały jak ostre czarne okręgi, które można łatwo odróżnić od fazy olejowej i tła. Przejdź przez każdy z kanałów fluorescencyjnych, ustawiając dla nich optymalną płaszczyznę pomiaru.W przypadku pomiarów relokacji skup się na agregacji nanocząstek w pięciu kanałach FITC, TRITC i cyjaniny.

microfluidic-approach-to-resolve-simultaneous-sequential-cytokine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej...

Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje kwantyfikację wielu celów cytokin jednocześnie w supernatantach hodowli tkankowej pobranych ze stymulowanych mysich splenocytów przy użyciu platformy testów immunologicznych opartych na multipleksie i cytometru przepływowego.

Multipleksowe profilowanie cytokin stymulowanych splenocytów myszy przy użyciu cytometrycznej platformy testów immunologicznych opartych na kulkach

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ten artykuł przedstawia protokół do zasiewania rzadkiej populacji komórek za pomocą końcówek pipet do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych w celu zapewnienia wyższej efektywności enkapsulacji komórek w kropelkach.

Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Poznaj zaawansowaną platformę mikroprzepływową do pomiaru dynamiki wydzielania cytokin na poziomie pojedynczych komórek. Ta metoda umożliwia jednoczesny pomiar IL-6, TNF-α i IL-1β z ludzkich komórek PBMC.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Przeglądaj więcej filmów