Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Weź płytkę wielodołkową z filtrami u podstawy.

Dodaj próbkę testową zawierającą różne cytokiny.

Dodaj różne zestawy mikrosfer różniących się wielkością i intensywnością wewnętrznej fluorescencji.

Każdy zestaw jest sprzężony z przeciwciałem skierowanym przeciwko określonej cytokinie.

Inkubować płytkę w ciemności pod wpływem mieszania.

Przeciwciała wiążą się z cytokinami docelowymi, unieruchamiając je na mikrosferach.

Zastosuj próżnię, aby usunąć niezwiązane cytokiny. Cytokiny związane z mikrosferą są zatrzymywane ze względu na mniejszy rozmiar porów błony.

Dodaj koktajl przeciwciał wykrywających sprzężonych z biotyną, które wiążą się z cytokinami związanymi z mikrosferą.

Dodać fluorescencyjną streptawidynę sprzężoną reporterowo i inkubować w ciemności pod wpływem mieszania. Streptawidyna wiąże się z biotyną, unieruchamiając reporter na kompleksie mikrosfery.

Usuń niezwiązane cząsteczki i ponownie zawieś mikrosfery.

Za pomocą cytometrii przepływowej zidentyfikuj związane cytokiny, określając rozmiar i fluorescencję wewnętrzną mikrosfer.

Aby określić ilość określonej cytokiny, zmierz intensywność fluorescencji reportera.

Aby przeprowadzić test, przed użyciem pozwól wszystkim odczynnikom ogrzać się do temperatury pokojowej.

W tej demonstracji zastosowano polipropylenowe płyty filtracyjne. Absolutnie konieczne jest, aby płytka była utrzymywana w pozycji pionowej podczas całej procedury oznaczania, w tym na etapach mycia, aby uniknąć utraty kulek.

Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną, dodając 100 mikrolitrów 1x buforu do płukania do każdej studzienki i pozostaw płytkę na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Usuń objętość bufora za pomocą kolektora próżniowego. Zetrzyj nadmiar bufora do mycia od spodu talerza, dociskając talerz do stosu czystych ręczników papierowych. Następnie umieść płytkę na odwróconej pokrywie talerza.

W przypadku próbek supernatantu do hodowli komórkowych dodać 25 mikrolitrów buforu do oznaczania do wszystkich studzienek. Dodaj 25 mikrolitrów każdego wzorca do standardowych studzienek. Na koniec dodaj 25 mikrolitrów każdej próbki do dołków na próbki. Wiruj zmieszane kulki przez 30 sekund. Następnie dodaj 25 mikrolitrów zmieszanych kulek do każdej studzienki, potrząsając butelką z koralikami z przerwami, aby uniknąć osiadania koralików.

Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt. Po uszczelnieniu owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę płyty, folią aluminiową. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek, zabezpiecz ją i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Nie odwracając, umieść płytkę na kolektorze próżniowym i zastosuj podciśnienie jak poprzednio. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 1x buforu do płukania do każdej studzienki.

Usunąć zawartość studzienek na płytce testowej przez filtrację próżniową. Zetrzyj nadmiar buforu myjącego z dna płytki za pomocą wkładki chłonnej lub ręczników papierowych przed powtórzeniem tego kroku jeszcze raz. Następnie dodaj 25 mikrolitrów przeciwciał wykrywających do każdej studzienki. Po uszczelnieniu płytki świeżym uszczelniaczem do płyt, owiń całą płytkę, łącznie z odwróconą pokrywą płyty, folią aluminiową.

Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Bez odkurzania dodaj 25 mikrolitrów odczynnika fikoerytryny streptawidyny bezpośrednio do każdej studzienki. Uszczelnij i zawiń płytkę jak poprzednio. Wtedy. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po dwukrotnym powtórzeniu kroku filtracji próżniowej, dodaj 200 mikrolitrów 1x buforu płuczącego do każdej studzienki. Zawieś koraliki na wytrząsarce talerzowej na 1 minutę. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś próbki z płytki filtracyjnej do probówek FACS w celu odczytania próbek na cytometrze przepływowym.