Name: Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Poznaj jednokomórkową analizę immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej. Ta metoda umożliwia badanie dysregulacji immunologicznej w chorobach autoimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Aimee Pugh-Bernard za jej intelektualny wkład i pomocne komentarze. Praca ta była wspierana przez Fundację Boettchera Webb-Waring Biomedical Research Award i nagrodę o numerze K23-1K23AR070897 od NIH dla Eleny W.Y. Hsieh. Otrzymała również nagrodę numer K12-HD000850 przyznaną przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver oraz Fundację Lucile Packard na rzecz Zdrowia Dziecka, Stanford CTSA UL1 TR001085 oraz Instytut Badań nad Zdrowiem Dziecka Uniwersytetu Stanforda.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB) Uniwersytetu Kolorado. Wszystkie opisane poniżej procedury powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, chyba że zaznaczono inaczej, z przefiltrowanymi końcówkami pipet i przefiltrowanymi wszystkimi odczynnikami.
1. Przygotowanie odczynników do obwodowego przetwarzania krwi pełnej
<ol>
	<li>Przygotować podstawowe porcje ruksolitynibu (10–15 μl/fiolkę do jednorazowego użytku) w temperaturze 10 mM, rozcieńczając liofilizowany odczynnik w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta (przechowywać w temperaturze -80 °C). Utrzymuj stężenia DMSO we wszystkich testach, w tym w niestymulowanych kontrolach, poniżej 0,2% (vol/vol).</li>
	<li>Przygotować podstawowe porcje R848 (resikwimod) (10–15 μl/fiolkę do jednorazowego użytku) w stężeniu 1 μg/μl, rozcieńczając liofilizowany odczynnik w sterylnej wodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotować podstawowe porcje lipopolisacharydów (LPS) (5 μl na fiolkę tylko do jednorazowego użytku) w stężeniu 1 μg/μl, rozcieńczając liofilizowany odczynnik w sterylnej wodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do barwienia komórek (CSM) przy użyciu PBS, 0,5% BSA i 0,02% NaN3.</li>
	<li>Zaopatrz się w koktajl inhibitorów transportu białek (PTI) i przygotuj go (tabela materiałów).</li>
	<li>Rozmrozić i rozcieńczyć fiolkę podstawową ruksolitynibu (10 mM) w stosunku 1:10 w sterylnym PBS (1 mM). Odstawić w temperaturze pokojowej do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Rozmrozić i rozcieńczyć fiolkę podstawową R848 (1 μg/μL) w stosunku 1:10 w sterylnym PBS (0,1 μg/μL). Odstawić w temperaturze pokojowej do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Rozmrozić i rozcieńczyć fiolkę podstawową LPS (1 μg/μl) w stosunku 1:100 w sterylnym PBS (0,01 μg/μl). Odstawić w temperaturze pokojowej do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Wstępnie podgrzej sterylny RPMI (bez L-glutaminy) w standardowej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (przez co najmniej 10 minut).</li>
	<li>Rozcieńczyć bufor lizy/utrwalający w stosunku 1:5 w przefiltrowanym ddH2O (stężenie robocze) na stole (nie musi być sterylny). 
	Uwaga: 1 ml krwi pełnej wymaga 20 ml stężenia roboczego buforu lizy/fix.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor lizujący/utrwalający dla 5 warunków po 1 ml krwi pełnej każdy (co najmniej 100 ml). Porcję 20 ml stężenia roboczego buforu liza/fix rozmieścić w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml na mililitr krwi pełnej (roztwór lizy/utrwalania przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebny). Oznaczyć warunki na stożkowych probówkach zawierających bufor lizy/utrwalający w następujący sposób: T0 (czas zerowy), T6 + 5R (czas 6 h z 5 μM ruksolitynibem), T6 + R848 (czas 6 godzin z 1 μg/ml R848), T6 + LPS (czas 6 godzin z 0,1 μg/ml LPS), T6 (czas 6 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylne probówki polistyrenowe z okrągłym dnem z nakrętkami i probówki do mikrowirówek o pojemności 1 ml należy oznaczyć tą samą nomenklaturą, co w kroku 1.10.</li>
</ol>
2. Stymulacja i przetwarzanie pełnej krwi obwodowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Umieść oznaczone okrągłe rurki styropianowe z kroku 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) na stojaku. 
	Uwaga: Wszystkie poniższe czynności są wykonywane w tym typie rury, chyba że określono inaczej. Zakryj probówki podczas przenoszenia między kapturem do hodowli tkanek a inkubatorem, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 37 °C RPMI (bez L-glutaminy) do każdej z probówek (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Kilkakrotnie odwróć probówkę do pobierania krwi, dodaj 1 ml krwi pełnej do każdej probówki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać z RPMI (rozcieńczenie RPMI zapobiega zbrylaniu się krwi podczas 6-godzinnego okresu inkubacji).</li>
	<li>Dodać 10 μl ruksolitynibu w proporcji 1:10 do T6 + 5R. Dokładnie wymieszać pipetą P1000. Umieścić stojak z probówkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i rozpocząć odmierzanie czasu inkubacji (T = 0).</li>
	<li>Przetwarzaj próbkę T0 w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Odpipetować całą zawartość probówki T0 do oznakowanej stożkowej probówki zawierającej 20 ml buforu do lizy/utrwalenia o stężeniu roboczym 37 °C. Aby zoptymalizować regenerację komórek, przepłucz probówkę buforem lizy/fix o stężeniu roboczym. Wymieszaj, odwracając stożkową rurkę.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić lizę i utrwalenie. Po utrwaleniu wykonaj wszystkie kolejne kroki na blacie. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zdekantować supernatant. Ponownie zawieś komórki w 1 ml lodowatego PBS, aby rozbić osad, a następnie wypełnij stożek do objętości 15 ml PBS.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant. Powtórzyć pranie PBS (kroki 2.4.3–2.4.4), jeśli granulki są czerwone. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml CSM, aby rozbić osad, a następnie przenieść do znakowanej probówki mikrowirówkowej (krok 1.11) w celu barwienia przeciwciał. Pobrać próbkę o objętości 10 μl, aby zliczyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. 
		Uwaga: Ponieważ wszystkie komórki są utrwalone w tym momencie, nie jest konieczne dołączanie plamy żywotności.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, pozostawiając osad w ~60 μl resztkowej objętości. Przechowywać te granulki na lodzie do czasu zakończenia przetwarzania próbek z innych warunków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W T = 30 min przesunąć stojak na probówki (krok 2.3) do kaptura do hodowli tkankowych i wykonać następujące czynności.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl 0,1 μg/μl R848 do T6 + R848. Dokładnie wymieszać pipetą P1000.</li>
		<li>Dodaj 10 μl 0,01 μg/μL LPS do T6 + LPS. Dokładnie wymieszać pipetą P1000.</li>
		<li>Dodać 4 μl inhibitora transportu białek (zapas przy 500X) do T6, T6 + 5R i T6 + LPS (ale NIE do T6 + R848) i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze do T = 6 h. Dokładnie mieszać pipetą P1000 co 2 h. 
		Uwaga: R848 jest endoplazmatycznym agonistą TLR i dlatego wymaga czasowego opóźnienia w dodawaniu inhibitora transportu białka, aby umożliwić dostęp do docelowego receptora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przy T = 2 h dodać 4 μl koktajlu inhibitora transportu białek (zapas o wartości 500X) do probówki T6 + R848. Wymieszać wszystkie próbki za pomocą pipety P1000 i umieścić stojak z powrotem w inkubatorze do T = 6 godzin.</li>
	<li>Wymieszać próbki z P1000 jeszcze raz w temperaturze T = 4 h.</li>
	<li>W T = 6 h przetworzyć probówki z próbkami krwi T6, T6 + LPS, T6 + R848 i T6 + 5R zgodnie z opisem w kroku 2.4 dla próbki T0.</li>
	<li>Przechowywać granulki komórek w resztkowej objętości CSM w temperaturze -80 °C do przetworzenia w przyszłości. Alternatywnie przejdź do kodowania kreskowego i barwienia przeciwciał bez przechowywania.</li>
</ol>
3. Kod kreskowy zlizowanych/utrwalonych komórek krwi
<ol>
	<li>Próbki komórek zlizowanych/utrwalonych z magazynu w temperaturze -80 °C należy powoli rozmrażać na lodzie; maksymalnie 20 próbek można oznaczyć unikalnymi kodami kreskowymi i połączyć za pomocą tego systemu. Rozcieńczyć 10-krotny bufor trwałej ondulacji kodów kreskowych w stosunku 1:10 za pomocą PBS; zrobić wystarczającą ilość buforu dla ~ 3 ml na próbkę.</li>
	<li>Napełnij jedno niesterylne koryto CSM, a drugie buforem perm 1X do kodów kreskowych. Dodać 1 ml lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek, dokładnie wymieszać pipetą i przenieść do odpowiednich wstępnie znakowanych probówek klastrowych z polipropylenu.</li>
	<li>Pobrać próbkę o objętości 10 μl, aby policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Normalizuj liczbę komórek do 1,5–2 x 106 komórek na próbkę w każdej probówce zbiorczej: usuń i wyrzuć objętość nadmiaru komórek powyżej 2 x 106 komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml bufora trwałej ondulacji 1X do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.</li>
	<li>Ułóż probówki zbiorcze na stojaku w tej samej kolejności, jak wskazano na kluczu kodu kreskowego, tak aby próbka była zgodna z jej kodem kreskowym. Dodać 800 μl 1X bufor do trwałej ondulacji z kodowaniem kreskowym za pomocą pipety wielokanałowej do wszystkich próbek w probówkach zbiorczych bez dotykania osadu komórkowego końcówkami pipet (bez mieszania), aby zmniejszyć utratę komórek. Odłóż na bok stojak z rurkami klastrowymi.</li>
	<li>Usuń paski probówek 20-plex Pd Barcoding Kit z -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 μl bufora trwałej ondulacji 1X do kodów kreskowych, dokładnie wymieszaj i przenieś 120 μl zawieszonej mieszanki kodów kreskowych do odpowiednich próbek komórek w probówkach zbiorczych.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między poszczególnymi próbkami oznaczonymi kodem kreskowym. Inkubować probówki zbiorcze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby kody kreskowe mogły oznaczyć komórki.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml CSM.</li>
	<li>Odwirować i ponownie zawiesić w CSM, jak w kroku 3.8. 
	Uwaga: Każda próbka jest teraz oznaczona unikalnym kodem kreskowym, a próbki są gotowe do puli.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Za pomocą jednej pipety i tej samej końcówki przenieś wszystkie granulki komórek w ~70–80 μl resztkowej objętości do jednej rurki polistyrenowej. NIE wysuwaj końcówki pipety; Odłóż na bok pojedynczą pipetę z tą końcówką.</li>
	<li>Za pomocą wielokanałowej pipety i nowych końcówek dodaj ~100 μl CSM do każdej oryginalnej probówki aparatu udojowego, aby zmaksymalizować regenerację komórek. Za pomocą pojedynczej pipety z odłożoną na bok końcówką przenieś wszystkie granulki komórek w ~100 μl pozostałej objętości do tej samej probówki z polistyrenu.</li>
	<li>Dodaj CSM, aby uzupełnić rurkę z polistyrenu (~ 3 ml). Policz i zapisz numer komórki w zbiorczym zestawie kodów kreskowych. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Przystąp do barwienia próbek oznaczonych kodami kreskowymi tego samego dnia. 
	Uwaga: Normalne jest oczekiwanie ~20–30% utraty komórek w procesie kodowania kreskowego.</li>
</ol>
4. Barwienie zlosowanych/utrwalonych komórek krwi z kodami kreskowymi i przygotowanie do analizy na przyrządzie do cytometrii masowej
Uwaga: Każdy 1X miano przeciwciała barwiącego (1 μL przeciwciała na 100 μL reakcji barwienia), może zwykle zabarwić 3-4 x 106 komórek. Dlatego, gdy wszystkie próbki z kodami kreskowymi zostaną zebrane w jednej probówce, ilość przeciwciał musi zostać zwiększona w górę. Jeśli 20 próbek z kodem kreskowym wynosi 30 x 106 komórek, a każde miano 1X może zabarwić 3-4 x 106 komórek, próbka oznaczona kodem kreskowym wymaga tylko 10-krotnego miana, w przeciwieństwie do barwienia każdej próbki indywidualnie, co wymagałoby 20-krotnej ilości przeciwciała (1X na pojedynczą probówkę). Stężenie przeciwciała do liczby komórek powinno być starannie miareczkowane dla każdego pojedynczego koktajlu przeciwciał (nie omówione tutaj).
<ol>
	<li>Wybarwić komórki za pomocą przeciwciał (tabela materiałów) do barwienia powierzchni i indukcji cytokin.
	<ol>
		<li>Przygotuj koktajl barwienia powierzchniowego, obliczając ilość do dodania i uwzględniając błąd pipetowania (tj. w przypadku barwienia 20 próbek z kodami kreskowymi po 2 x 106 komórek w każdej próbce, wymagane jest 10-krotne barwienie mianem; w przypadku ostatecznych obliczeń objętości należy skompensować błąd pipetowania, sporządzając 10,5-krotny końcowy roztwór barwiący).</li>
		<li>Dodaj 10-krotnie większą objętość barwienia powierzchni do osadu komórek z kodem kreskowym. Aby zmniejszyć utratę komórek, za pomocą tej samej końcówki wymieszaj i zmierz objętość barwników powierzchniowych i osadów komórkowych.</li>
		<li>W oparciu o objętość komórek i koktajl barwiący dodać CSM do końcowej objętości barwienia wynoszącej 50 μl na liczbę próbek komórek (tj. w przypadku zestawu 20 próbek 50 μl X 20 = 1 ml). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Mieszać próbkę co 15 minut, aby zapewnić równomierne barwienie.</li>
		<li>Podczas inkubacji barwienia powierzchniowego przygotować bufor do trwałej ondulacji/płukania (tabela materiałów), rozcieńczając w stosunku 1:10 przefiltrowanym ddH2O. Przygotować objętości 2 ml do przepuszczania i 5 ml do przemywania . Przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.</li>
		<li>Uzupełnić probówkę do barwienia powierzchni CSM i odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić próbkę oznaczoną kodem kreskowym w 2 ml buforu Perm/Wash o temperaturze 4 °C i rozcieńczeniu 1:10. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20–30 minut, aby w pełni przepuszczalność komórek.</li>
		<li>Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
		<li>W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego postępuj zgodnie z podobnymi etapami barwienia (jak w przypadku barwienia powierzchni). Należy jednak użyć buforu do trwałej ondulacji/płukania w rozcieńczeniu 4 °C, 1:10 zamiast CSM, aby uzyskać całkowitą objętość barwienia, tak aby komórki pozostały w środowisku przepuszczalnym przez cały czas barwienia wewnątrzkomórkowego.</li>
		<li>Dodać wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał do barwionego powierzchniowo i przepuszczalnego osadu komórkowego (kroki 4.1.2–4.1.17). Doprowadzić całkowitą objętość barwienia do 50 μl na liczbę próbek komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Mieszać próbkę co 15 minut, aby zapewnić równomierne barwienie.</li>
		<li>Podczas barwienia wewnątrzkomórkowego należy przygotować roztwór interkalatora: 900 μL przefiltrowanego PBS + 100 μL przefiltrowanego 16% PFA (końcowe stężenie 1,6% PFA) + 0,2 μL 500 uM barwnika interkalatorowego (Tabela materiałów).</li>
		<li>Uzupełnij granulat komórkowy + wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał zimnym buforem 1:10 Perm/Wash.</li>
		<li>Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant. Uzupełnij rurkę do barwienia CSM. Policz i zapisz numer komórki. Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml roztworu interkalatora z kroku 4.9. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej w celu pełnej interkalacji lub przez noc w temperaturze 4 °C (próbki w roztworze interkalatora mogą pozostawać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia przed badaniem ich na przyrządzie do cytometrii masowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórki do przyrządu do cytometrii masowej.
	<ol>
		<li>Uzupełnić probówkę 3 ml przefiltrowanego ddH2O i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml przefiltrowanego ddH2O. Przepuścić tę zawiesinę przez filtr 100 μm w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń lub zagięć, które mogłyby potencjalnie zatkać przyrząd do cytometrii masowej.</li>
		<li>Policz i zapisz liczbę komórek po filtracji. Wirować przy 600 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór kulki kalibracyjnej (tabela materiałów), rozcieńczając go w stosunku 1:10 w przefiltrowanym ddH2O.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wybarwione komórki w wymaganej objętości rozcieńczonego roztworu kulek kalibracyjnych w stosunku 1:10, aby uzyskać stężenie komórek ~1 x 106 komórek/ml. 
	Uwaga: Dla CyTOF1 przy 45 μl/min zalecane optimum to 5 x 105 komórek/ml; dla Heliosa w dawce 30 μl/min, 7,5 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Kontynuuj badanie próbki na przyrządzie do cytometrii masowej9.</li>
</ol>

<ol><li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+diseases%3A+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+public+health%22%5BJournal%5D)">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li>
<li>Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus%3A+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li>
<li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27306639">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).</li>
<li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+effector+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).</li>
<li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function%3A+the+T+helper+type+17+example%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li>
<li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+stories+on+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li>
<li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li>
<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li>
<li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry%3A+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li>
<li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li>
<li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li>
<li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li>
<li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li>
<li>Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li>
<li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li>
<li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li>
<li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425(2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li>
<li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li>
<li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li>
<li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy nowatorskie, jednokomórkowe, proteomiczne podejście do jednoczesnej oceny wielu typów komórek odpornościowych i wykrywania ich różnych zaburzeń cytokin w środowisku specyficznych dla pacjenta "patogennych" czynników krążących w osoczu krwi obwodowej. Metoda ta wykorzystuje obwodową krew pełną jako nośnik analityczny oraz cytometrię masową jako narzędzie do oceny nieprawidłowości fenotypowych i funkcjonalnych komórek odpornościowych. Metoda ta jest łatwo stosowana w badaniach na ludziach i myszach<...

Choroby autoimmunologiczne są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, dotykając 3-8% populacji. W Stanach Zjednoczonych choroby autoimmunologiczne są jedną z głównych przyczyn zgonów wśród kobiet w młodym i średnim wieku (w wieku <65 lat)1,2. Choroby autoimmunologiczne charakteryzują się niejednorodnym obrazem klinicznym i zróżnicowanymi procesami immunologicznymi. Spektrum heterogeniczności jest dobrze reprezentowane w różnych zaburzeniach, takich jak wspólne zajęcie reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) i choroba neurologiczna w stwardnieniu rozsianym (SM). Jednak ten poziom heterogeniczności jest również zilustrowany w pojedynczym zaburzeniu, takim jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE): niektórzy pacjenci mogą wykazywać patologię nerek, podczas gdy inni cierpią na zajęcie hematologiczne lub stawowe3.
Immunopatogeneza leżąca u podstaw zaburzeń autoimmunologicznych odzwierciedla kliniczną heterogeniczność, obejmującą auto- i hiperaktywację wielu wrodzonych i adaptacyjnych podzbiorów komórek odpornościowych oraz jednoczesną rozregulowaną produkcję cytokin. Chociaż cytokiny odgrywają kluczową rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych, zrozumienie ich specyficznej roli w mechanizmie choroby okazało się wyzwaniem. Cytokiny charakteryzują się plejotropią (jedna cytokina może mieć wiele skutków dla różnych typów komórek), redundancją (wiele cytokin może mieć ten sam efekt), dualnością (jedna cytokina może mieć działanie pro- lub przeciwzapalne w różnych warunkach) i plastycznością (cytokiny mogą być formowane w inną rolę niż jej "pierwotna" rola, w zależności od środowiska)4, 5,6. W związku z tym metody na poziomie populacji nie są w stanie rozróżnić heterogenicznych odpowiedzi komórkowych na to samo "środowisko cytokinowe". Podobnie, projekty badań, które koncentrują się na jednym konkretnym aspekcie układu odpornościowego (pojedynczy typ komórek lub cytokina), nie oferują globalnej oceny wszystkich elementów zaangażowanych w złożoną chorobę autoimmunologiczną. Chociaż badania oparte na surowicach odpornościowych na pacjentach dostarczyły ważnych informacji na temat autoimmunizacji, nie dostarczają one specyficznego źródła komórkowego wykrytych rozregulowanych cytokin.
Ostatnio opracowaliśmy proteomiczne podejście do pojedynczej komórki, aby jednocześnie oceniać wiele typów komórek odpornościowych i wykrywać ich różne zaburzenia cytokin w środowisku specyficznych dla pacjenta "patogennych" czynników krążących w osoczu krwi obwodowej. Opisany tutaj przepływ pracy charakteryzuje się wykorzystaniem nienaruszonych obwodowych próbek krwi pełnej, w przeciwieństwie do izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Pełna krew obwodowa stanowi najbardziej fizjologicznie istotny nośnik do badania ogólnoustrojowej choroby o podłożu immunologicznym, w tym 1) niejednojądrzastych komórek krwi często zaangażowanych w chorobę autoimmunologiczną (tj. neutrofile, płytki krwi) oraz 2) czynników krążących w osoczu, takich jak kwasy nukleinowe, kompleksy immunologiczne i cytokiny, które pełnią role aktywujące układ odpornościowy. W celu wychwycenia "wewnętrznie patogennej" rozregulowanej produkcji cytokin, próbki krwi obwodowej są przetwarzane natychmiast po pobraniu krwi (T0, czas zero) i po 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C (fizjologiczna temperatura ciała) z inhibitorem transportu białek przy braku jakiegokolwiek egzogennego stanu stymulującego (T6, czas 6 h), w celu wykrycia produkcji cytokin (akumulacja, T6-T0), który odzwierciedlałby "wewnętrzny" stan choroby (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W celu zbadania rozregulowanych procesów, które odzwierciedlają nadmierną lub niedostateczną aktywację szlaków sygnałowych zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne istotne dla choroby, próbki krwi obwodowej są traktowane (6 godzin inkubacji w temperaturze 37 °C z inhibitorem transportu białka) egzogennym stanem stymulującym, który odzwierciedla patogenezę choroby, takim jak agoniści receptora Toll-Like (TLR) w przypadku TRU (T6 + R848, Czas 6 godzin z 1 μg/ml R848), w celu wykrycia produkcji cytokin, która odzwierciedlałaby odpowiedź na kwasy nukleinowe (porównując T0 vs. T6 vs. T6 + R848, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W celu zbadania immunomodulacyjnego działania dostępnych środków terapeutycznych ex vivo, ponieważ odnoszą się one do precyzyjnych procesów rozregulowania układu odpornościowego u określonych pacjentów, próbki krwi obwodowej poddaje się działaniu inhibitora JAK o odpowiednim stężeniu terapeutycznym (tutaj, 5 μM ruksolitynibu; T6 + 5R, czas 6 godzin z ruksolitynibem 5 μM), w celu wykrycia zmian w "wewnętrznym" stanie choroby w odpowiedzi na lek (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, <silna klasa = "xfig" >Ryc. 1). Do tego badania wybrano inhibitor JAK, ponieważ wykazano, że inhibitory JAK są skuteczne w leczeniu zaburzeń autoimmunologicznych, takich jak RZS.
Aby jednocześnie ocenić opisane powyżej procesy rozregulowania w wielu podzbiorach komórek odpornościowych, próbki krwi obwodowej od pacjentów z TRU i zdrowych osób z grupy kontrolnej zostały przetworzone zgodnie z powyższym opisem i przeanalizowane za pomocą cytometrii masowej. Cytometria masowa, znana również jako cytometria-czas przelotu, oferuje analizę pojedynczych komórek ponad 40 parametrów bez problemów z nakładaniem się widm7,8,9. Technika ta wykorzystuje izotopy metali ziem rzadkich w postaci rozpuszczalnych jonów metali jako znaczniki związane z przeciwciałami, zamiast fluoroforów10. Dodatkowe szczegóły dotyczące platformy technologicznej cytometrii masowej (tj. strojenie i kalibracja, pobieranie próbek) można znaleźć w Leipold i wsp. oraz McCarthy i wsp.11,12 Wysokowymiarowość cytometrii masowej umożliwia jednoczesny pomiar wielu cytokin w podzbiorach wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych o ziarnistości pojedynczej komórki (Tabela materiałów).
Obecne konwencjonalne parametry kliniczne i laboratoryjne często nie są wystarczająco czułe lub specyficzne do wykrywania trwającej aktywności choroby lub odpowiedzi na specyficzne immunomodulatory13, odzwierciedlając potrzebę lepszego nakreślenia podstawowych zmian immunologicznych, które powodują zaostrzenia. Biorąc pod uwagę wszechobecność rozregulowania cytokin w chorobach autoimmunologicznych, ostatnio pojawiło się mnóstwo podejść do leczenia, które wykorzystują przeciwciała lub małocząsteczkowe inhibitory ukierunkowane na cytokiny lub białka sygnałowe zaangażowane w regulację produkcji cytokin. W swojej podstawowej formie, opisane tutaj podejście analityczne krwi obwodowej stanowi platformę do identyfikacji specyficznych dla pacjenta rozregulowanych podzbiorów komórek i ich nieprawidłowej produkcji cytokin w chorobie autoimmunologicznej z objawami ogólnoustrojowymi. Metodologia ta pozwala na personalizację wyborów terapeutycznych, ponieważ można zidentyfikować określone rozregulowane cytokiny, a określone opcje leczenia mogą być testowane ex vivo w celu oceny ich zdolności do immunomodulacji specyficznego dla pacjenta procesu chorobowego.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Stężenie magazynowe: 10 mM; Końcowa konc: 5 &mu; M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Stężenie magazynowe: 1 i mu; g/&mu; L; Końcowa konc.: 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Stężenie magazynowe: 1 &mu; g/&mu; L; Stężenie końcowe: 0,1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Sterylny PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix Buffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Stężenie magazynowe: 5X; Stężenie końcowe: 1X (rozcieńczony w ddH2O)</td></tr><tr><td>BD Bufor do trwałej trwałej eksploatacji/płukania BD</td><td>Biosciences</td><td>557885</td><td>Stężenie magazynowe: 10X; Stężenie końcowe: 1:10 (rozcieńczyć w ddH2O)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Stężenie zapasowe: >99,9%; Stężenie końcowe: 0,0002</td></tr><tr><td>Inhibitor transportu białek (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Stężenie magazynowe: 500X; Końcowe stężenie: 1X</td></tr><tr><td>Interkalator DNA</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Stężenie magazynowe: 500 &mu; M; Stężenie końcowe: 0,1 &mu; M</td></tr><tr><td>Cell Staining Media (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barcode Perm Płyn buforowy 201057</td><td></td><td></td><td>zapasów: 10X; Końcowa konc: 1X</td></tr><tr><td>20-plex Pd Zestaw kodów kreskowych</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Stan magazynowy: nie dotyczy; Końcowe stężenie: nie dotyczy</td></tr><tr><td>korektora TM Czteroelementowe koraliki kalibracyjne</td><td>Płyn</td><td>201078</td><td>Zapas Stężenie: 10X; Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>16% roztwór formaldehydu bez MeOH</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>Stężenie zapasowe: 16% (w/v); Stężenie końcowe: 1,6% (w/v)</td></tr><tr><td>Sterylne rurki z polistyrenu okrągłodennego</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Stężenie magazynowe: nie dotyczy; Końcowe stężenie: nie dotyczy</td></tr><tr><td>Rurki klastrowe z polipropylenu</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Zapas Stężenie: nie dotyczy; Końcowe stwierdzenie: nie dotyczy</td></tr><tr><td>przyrządu Helios CyTOF</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>Wszystkie roztwory, które mają być użyte w analizie CyTOF, muszą być wolne od zanieczyszczeń metalami. ddH2O jest używany do przygotowania wszelkich roztworów powinien mieć rezystywność co najmniej 18,0 M&Omega;. ddH2O i wszelkie samodzielnie przygotowane roztwory należy przechowywać w nowych plastikowych lub szklanych butelkach, które nigdy nie były sterylizowane w autoklawie.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Uwagi</td></tr><tr><td>Przeciwciała stosowane w cytometrii masowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Markery powierzchniowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Waga: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Masa: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Masa: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Masa: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Masa: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Masa: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-LY6</td><td>Masa: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Masa: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Masa: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Masa: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Masa: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Masa: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Masa: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Masa: 172</td></tr><tr><td>CD45 całkowita</td><td>biomasa</td><td>HI30</td><td>Masa: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Masa: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Masa: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Masa: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Masa: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Masa: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Masa: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Masa: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Masa: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Masa: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Masa: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Masa: 167</td></tr><tr><td><silne>cytokiny</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&alfa;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Masa: 147</td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>Masa: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>AS17</td><td>Masa: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Masa: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Masa: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>Masa: 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>BL168</td><td>Waga: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Masa: 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>Masa: 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>Masa: 170</td></tr><tr><td>IFN&alfa;</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>Masa: 175</td></tr><tr><td>IFN&gamma;</td><td>Biolegend</td><td>4S. B3</td><td>Masa: 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>Masa: 159</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Masa: 166</td></tr><tr><td>Uwaga: Jeśli producent jest podany jako Fluidigm, to przeciwciało zostało zakupione od Fluidigm z metalem wstępnie sprzężonym. Jeśli producent jest określony jako inny niż Fluidigm, przeciwciało to zostało samosprzężone przy użyciu znakowania MaxPar Multi-Metal Labeling&nbsp; Zestaw (Fluidigm Cat: 201300) zgodnie z protokołem producenta.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokiny odgrywają kluczową rolę w patogenezie chorób autoimmunologicznych. W związku z tym pomiar poziomu cytokin był przedmiotem wielu badań mających na celu zrozumienie dokładnych mechanizmów, które prowadzą do załamania samotolerancji i późniejszej autoimmunizacji. Dotychczasowe podejścia opierały się na badaniu jednego konkretnego aspektu układu odpornościowego (pojedynczego lub kilku typów komórek lub cytokin) i nie oferują globalnej oceny złożonej choroby autoimmunologicznej. Chociaż badania oparte na surowicach odpornościowych na pacjentach dostarczyły ważnych informacji na temat autoimmunizacji, nie dostarczają one specyficznego źródła komórkowego wykrytych rozregulowanych cytokin. Opisano tutaj kompleksowe podejście jednokomórkowe do oceny produkcji cytokin w wielu podzbiorach komórek odpornościowych, w kontekście "wewnętrznych" specyficznych dla pacjenta czynników krążących w osoczu. Takie podejście umożliwia monitorowanie specyficznego dla pacjenta fenotypu immunologicznego (markerów powierzchniowych) i funkcji (cytokin), zarówno w jego natywnym "wewnętrznym patogennym" stanie chorobowym, jak i w obecności środków terapeutycznych (in vivo lub ex vivo).

Rycina 1 przedstawia schemat stymulacji i przetwarzania próbek krwi obwodowej, w tym podział alikwotów próbki krwi, czas dodawania czynników stymulujących, koktajlu inhibitorów transportu białek oraz czasy inkubacji aż do lizy erytrocytów (RBC) i fiksacji. Wybór czynników stymulujących zależy od ścieżek sygnalizacyjnych i cytokinowych, których ocena jest planowana. Na przykład w opisanym tutaj protokole zastosowano agoniści TLR w celu oceny mechanizmów rozpoz...

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie autoimmunizacji, takie jak identyfikacja nieprawidłowości częstotliwości komórek i różnic w funkcjonowaniu, takich jak produkcja kluczowych cytokin w warunkach choroby autoimmunologicznej. Główną zaletą tej metody jest to, że może ona uchwycić szeroki repertuar lub różne typy komórek i różnice w funkcjach z łatwo dostępnej próbki krwi obwodowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym procesie mogą mieć trudności z uzyskaniem właściwego czasu etapów przetwarzania krwi, projektu panelu przeciwciał, samego procesu kodowania kreskowego i analizy wielowymiarowych danych z pojedynczych komórek.To podejście immunologiczne jest szczególnie odpowiednie w przypadku chorób autoimmunologicznych, takich jak TRU, w których dysregulacja immunologiczna jest wszechobecna i widoczna we krwi obwodowej. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna dla wyjaśnienia czasu etapów, a także dla pokazania, w jaki sposób wiele próbek można oznaczyć kodami kreskowymi i połączyć je przed analizą cytometrii masowej. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść oznaczone okrągłe rurki polistyrenowe z pięcioma różnymi warunkami do przetwarzania krwi pełnej na stojaku.Następnie dodaj jeden mililitr RPMI 37 stopni Celsjusza do każdej probówki. Następnie dodaj jeden mililitr krwi pełnej do każdej probówki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać z RPMI. Następnie dodać 10 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonego ruksolitynibu do probówki oznaczonej T sześć plus pięć R i dokładnie wymieszać.Umieść stojak z probówkami w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozpocznij odmierzanie czasu inkubacji. Aby przetworzyć próbkę T zero, należy odpipetować całą zawartość probówki T Zero do oznakowanej stożkowej probówki zawierającej 20 mililitrów buforu lizyzowego/stałego o temperaturze 37 stopni Celsjusza w stężeniu roboczym. Aby zoptymalizować regenerację komórek, przepłucz probówkę buforem lizy/fix i wymieszaj, odwracając stożkową rurkę.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić lizę i utrwalenie. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie zdekantuj supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze lodowatego PBS, aby rozbić osad.Następnie napełnij stożkową rurkę do objętości 15 mililitrów PBS. Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze CSM, aby rozbić osad.Następnie przenieś próbkę do znakowanej probówki mikrowirówkowej w celu barwienia przeciwciał. Korzystając z automatycznego licznika komórek, policz komórki za pomocą próbki o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie odessać supernatant, pozostawiając osad w około 60 mikrolitrach pozostałości. Trzymaj ten osad na lodzie do czasu, aż próbki z innych warunków zakończą przetwarzanie. W temperaturze T równej 30 minutom przenieść stojak na probówki do okapu do hodowli tkankowych.Dodaj 10 mikrolitrów R848 w proporcji 0,1 grama na mikrolitr do probówki T six plus R848 i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 10 mikrolitrów LPS w proporcji 0,01 mikrograma na mikrolitr do probówki T six plus LPS i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj cztery mikrolitry inhibitora transportu białek do probówek oznaczonych T sześć, T sześć plus pięć R i T sześć plus LPS i zwróć próbki do inkubatora, aż T będzie równe sześciu godzinom.Próbki należy dokładnie mieszać pipetą P1000 co dwie godziny. Przy T równym dwóm godzinom dodaj cztery mikrolitry koktajlu inhibitora transportu białka do probówki T six plus R848. Wymieszać wszystkie próbki i umieścić stojak z powrotem w inkubatorze, aż T będzie równa sześciu godzinom.W temperaturze T równej czterem godzinom wymieszać próbki jeszcze raz za pomocą pipety P1000. Przy T równym sześciu godzinom, przetwarzaj T sześć, T sześć plus LPS, T sześć plus R848 i T sześć plus pięć probówek z próbką krwi R, jak opisano dla próbki T zero. Następnie przechowuj granulki w resztkowej objętości CSM w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby przetworzyć je później.Aby oznaczyć kreskowo zlizowane, utrwalone komórki, powoli rozmrażaj próbki z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na lodzie. Rozcieńczyć 10-krotny bufor perm do kodów kreskowych PBS w stosunku 1 do 10 i uzyskać wystarczającą ilość buforu na trzy mililitry na próbkę. Napełnij jedną niesterylną koryto CSM, a drugą jednym buforem do trwałej ondulacji do kodów kreskowych X.Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek, dokładnie wymieszaj i przenieś do odpowiednich wstępnie oznakowanych probówek klastrowych z polipropylenu. Teraz weź próbkę o pojemności 10 mikrolitrów i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Znormalizuj liczbę komórek w każdej probówce klastra, usuwając objętość nadmiaru komórek.Następnie odwiruj komórki w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze jednego bufora do trwałej ondulacji do kodów kreskowych X za pomocą pipety wielokanałowej i odwirować przy 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać supernatant.Ułóż probówki zbiorcze na stojaku w tej samej kolejności, jak wskazano na kluczu kodu kreskowego, tak aby próbka była zgodna z jej kodem kreskowym. Dodaj 800 mikrolitrów jednego bufora do trwałej ondulacji X do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej do wszystkich próbek w probówkach zbiorczych bez dotykania osadu komórkowego, aby zmniejszyć utratę komórek. Następnie odłóż na bok stojak z rurkami zbiorczymi.Usuń paski probówek z palladowym zestawem do kodowania kreskowego 20 pleksów z minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów jednego bufora do trwałej ondulacji kodów kreskowych X, dokładnie wymieszaj i przenieś 120 mikrolitrów ponownie zawieszonej mieszanki kodów kreskowych do odpowiednich próbek komórek w probówkach zbiorczych. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między poszczególnymi próbkami oznaczonymi kodem kreskowym.Inkubować probówki zbiorcze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby kody kreskowe mogły oznaczyć komórki. Po 30 minutach odwirować próbki w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić je w jednym mililitrze CSM.Następnie odwirować i ponownie zawiesić w CSM. Następnie odwirować w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i zassać supernatant. Za pomocą jednej pipety i tej samej końcówki przenieś wszystkie granulki komórek w około 70 do 80 mikrolitrach resztkowej objętości do jednej rurki polistyrenowej.Nie wysuwaj końcówki pipety. Odłóż na bok pojedynczą pipetę z tą końcówką. Za pomocą wielokanałowej pipety i nowych końcówek dodaj 100 mikrolitrów CSM do każdej oryginalnej probówki do aparatu udołowiowego, aby zmaksymalizować regenerację komórek.Za pomocą pojedynczej pipety z odłożoną na bok końcówką przenieś wszystkie granulki komórek w 100 mikrolitrach pozostałej objętości do tej samej rurki polistyrenowej. Dodaj CSM, aby uzupełnić rurkę polistyrenową do około trzech mililitrów. Policz i zapisz numer komórki w zbiorczym zestawie kodów kreskowych.Następnie odwirować w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i zassać supernatant. Przystąp do barwienia próbek oznaczonych kodami kreskowymi tego samego dnia. Ten schemat przedstawia przebieg pracy związany ze stymulacją i przetwarzaniem próbek krwi obwodowej, w tym przydział podwielokrotności próbek krwi, czas dodawania środków stymulujących, koktajl inhibitorów transportu białek oraz czasy inkubacji do lizy i utrwalenia krwinek czerwonych.Wybór środków stymulujących będzie zależał od szlaków sygnalizacyjnych i cytokinowych, które są celem oceny. Po utrwaleniu i lizie RBC, poszczególne lizowane, utrwalone próbki komórek od zdrowego dawcy zostały oznaczone kodem kreskowym, oznaczone 26 przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym, przeniknięte i wybarwione 14 przeciwciałami przeciwko cytokinom. Poniżej przedstawiono ograniczoną strategię bramkowania reprezentującą identyfikację monocytów o wysokiej zawartości CD14.Od lewej do prawej każda reprezentowana działka 2D jest podzbiorem populacji z populacji nadrzędnej, która jest bramkowana z działki 2D bezpośrednio po lewej stronie. Wykorzystując monocyty o wysokiej zawartości CD14 jako reprezentatywne w ośmiu podzbiorach komórek odpornościowych, przeprowadzono analizę cytometrii masowej na próbkach krwi obwodowej od zdrowego dawcy w czasie zero niestymulowanym i po stymulacji agonistą TLR LPS i R848 oraz aktywatorem limfocytów T PMA jonomycyną. Przedstawiono przykład indukcji cytokin w monocytach o wysokiej zawartości CD14 oraz wybrane cytokiny ze swoistością dla zastosowanego czynnika stymulującego.R848 selektywnie indukuje podjednostkę IL-12p40 i MCP1 w monocytach o wysokiej zawartości CD14, podczas gdy LPS tego nie robi. W przeciwieństwie do tego, jonomycyna PMA nie indukuje cytokin w monocytach o wysokiej zawartości CD14. Po opanowaniu stymulacji krwi można wykonać w ciągu około siedmiu godzin, a etap kodowania kreskowego można wykonać w ciągu zaledwie około godziny.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o czasie wykonania kroków i odpowiednio zaplanować je z wyprzedzeniem. Po zastosowaniu tej procedury można rozważyć zmianę warunków stymulacji krwi w panelu cytometrii masowej w celu oceny odpowiedzi komórek odpornościowych, które są specyficzne dla własnych celów badawczych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać odpowiedzi cytokin z próbek krwi pełnej i jak połączyć wiele próbek w zestaw kodów kreskowych do analizy cytometrii masowej.

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym raporcie przedstawiamy etapy barwienia i analizy w badaniu fenotypowania przeprowadzonym na świeżej krwi pełnej w celu zliczenia głównych populacji leukocytów wrodzonych i adaptacyjnych. Kładziemy szczególny nacisk na kwestie związane z wykonywaniem tych procedur w kontekście wieloośrodkowego badania klinicznego.

Wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej

Opisano kroki niezbędne do codziennego strojenia i optymalizacji wydajności cytometru masowego CyTOF. Omówiono uwagi dotyczące optymalnego przygotowania próbek oraz szybkości...

Cytometria masowa: Protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten film przedstawia metodę proteomiczną pojedynczej komórki, która wykorzystuje przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi do odrębnego kodowania kreskowego komórek. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne i cytometrię masową w celu oceny zmian immunologicznych fenotypowych i funkcjonalnych w ludzkich komórkach odpornościowych pochodzących z krwi pełnej.

Test kodów kreskowych do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej komórek odpornościowych

Immunofenotypowanie krwi pełnej jest niezbędne do monitorowania ludzkiego układu odpornościowego. Jednak liczba wymaganych odczynników i niestabilność określonych fluorochromów w wstępnie zmieszanych koktajlach wymaga codziennego przygotowywania odczynników. Tutaj pokazujemy, że półautomatyczne przygotowanie koktajlu przeciwciał barwiących pomaga ustalić wiarygodne immunofenotypowanie poprzez zminimalizowanie zmienności w dozowaniu odczynników.

Półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Ten protokół opisuje kompleksową metodę analizy cytometrii masowej (cytometria czasu przelotu [CyTOF]) do oceny zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (HCC). Podejście to ma na celu zapewnienie wglądu w krajobraz immunologiczny HCC, oferując głębsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i powiązanych mechanizmów immunologicznych.

Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

Protokół ten opisuje pobieranie i przechowywanie próbek krwi od noworodków i dzieci oraz zastosowanie scRNA-seq, proteomiki i spektralnej cytometrii przepływowej do charakteryzacji populacji komórek odpornościowych z tych próbek.

Mapowanie odporności niemowląt przy minimalnym układzie: Integracyjne profilowanie jednokomórkowe i wielokomórkowe

Poznaj jednokomórkową analizę immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej. Ta metoda umożliwia badanie dysregulacji immunologicznej w chorobach autoimmunologicznych.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Przeglądaj więcej filmów