Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie autoimmunizacji, takie jak identyfikacja nieprawidłowości częstotliwości komórek i różnic w funkcjonowaniu, takich jak produkcja kluczowych cytokin w warunkach choroby autoimmunologicznej. Główną zaletą tej metody jest to, że może ona uchwycić szeroki repertuar lub różne typy komórek i różnice w funkcjach z łatwo dostępnej próbki krwi obwodowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym procesie mogą mieć trudności z uzyskaniem właściwego czasu etapów przetwarzania krwi, projektu panelu przeciwciał, samego procesu kodowania kreskowego i analizy wielowymiarowych danych z pojedynczych komórek.

To podejście immunologiczne jest szczególnie odpowiednie w przypadku chorób autoimmunologicznych, takich jak TRU, w których dysregulacja immunologiczna jest wszechobecna i widoczna we krwi obwodowej. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna dla wyjaśnienia czasu etapów, a także dla pokazania, w jaki sposób wiele próbek można oznaczyć kodami kreskowymi i połączyć je przed analizą cytometrii masowej. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść oznaczone okrągłe rurki polistyrenowe z pięcioma różnymi warunkami do przetwarzania krwi pełnej na stojaku.

Następnie dodaj jeden mililitr RPMI 37 stopni Celsjusza do każdej probówki. Następnie dodaj jeden mililitr krwi pełnej do każdej probówki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać z RPMI. Następnie dodać 10 mikrolitrów wstępnie rozcieńczonego ruksolitynibu do probówki oznaczonej T sześć plus pięć R i dokładnie wymieszać.

Umieść stojak z probówkami w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozpocznij odmierzanie czasu inkubacji. Aby przetworzyć próbkę T zero, należy odpipetować całą zawartość probówki T Zero do oznakowanej stożkowej probówki zawierającej 20 mililitrów buforu lizyzowego/stałego o temperaturze 37 stopni Celsjusza w stężeniu roboczym. Aby zoptymalizować regenerację komórek, przepłucz probówkę buforem lizy/fix i wymieszaj, odwracając stożkową rurkę.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić lizę i utrwalenie. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie zdekantuj supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze lodowatego PBS, aby rozbić osad.

Następnie napełnij stożkową rurkę do objętości 15 mililitrów PBS. Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze CSM, aby rozbić osad.

Następnie przenieś próbkę do znakowanej probówki mikrowirówkowej w celu barwienia przeciwciał. Korzystając z automatycznego licznika komórek, policz komórki za pomocą próbki o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie odessać supernatant, pozostawiając osad w około 60 mikrolitrach pozostałości. Trzymaj ten osad na lodzie do czasu, aż próbki z innych warunków zakończą przetwarzanie. W temperaturze T równej 30 minutom przenieść stojak na probówki do okapu do hodowli tkankowych.

Dodaj 10 mikrolitrów R848 w proporcji 0,1 grama na mikrolitr do probówki T six plus R848 i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj 10 mikrolitrów LPS w proporcji 0,01 mikrograma na mikrolitr do probówki T six plus LPS i dokładnie wymieszaj. Następnie dodaj cztery mikrolitry inhibitora transportu białek do probówek oznaczonych T sześć, T sześć plus pięć R i T sześć plus LPS i zwróć próbki do inkubatora, aż T będzie równe sześciu godzinom.

Próbki należy dokładnie mieszać pipetą P1000 co dwie godziny. Przy T równym dwóm godzinom dodaj cztery mikrolitry koktajlu inhibitora transportu białka do probówki T six plus R848. Wymieszać wszystkie próbki i umieścić stojak z powrotem w inkubatorze, aż T będzie równa sześciu godzinom.

W temperaturze T równej czterem godzinom wymieszać próbki jeszcze raz za pomocą pipety P1000. Przy T równym sześciu godzinom, przetwarzaj T sześć, T sześć plus LPS, T sześć plus R848 i T sześć plus pięć probówek z próbką krwi R, jak opisano dla próbki T zero. Następnie przechowuj granulki w resztkowej objętości CSM w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby przetworzyć je później.

Aby oznaczyć kreskowo zlizowane, utrwalone komórki, powoli rozmrażaj próbki z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na lodzie. Rozcieńczyć 10-krotny bufor perm do kodów kreskowych PBS w stosunku 1 do 10 i uzyskać wystarczającą ilość buforu na trzy mililitry na próbkę. Napełnij jedną niesterylną koryto CSM, a drugą jednym buforem do trwałej ondulacji do kodów kreskowych X.

Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek, dokładnie wymieszaj i przenieś do odpowiednich wstępnie oznakowanych probówek klastrowych z polipropylenu. Teraz weź próbkę o pojemności 10 mikrolitrów i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Znormalizuj liczbę komórek w każdej probówce klastra, usuwając objętość nadmiaru komórek.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze jednego bufora do trwałej ondulacji do kodów kreskowych X za pomocą pipety wielokanałowej i odwirować przy 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać supernatant.

Ułóż probówki zbiorcze na stojaku w tej samej kolejności, jak wskazano na kluczu kodu kreskowego, tak aby próbka była zgodna z jej kodem kreskowym. Dodaj 800 mikrolitrów jednego bufora do trwałej ondulacji X do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej do wszystkich próbek w probówkach zbiorczych bez dotykania osadu komórkowego, aby zmniejszyć utratę komórek. Następnie odłóż na bok stojak z rurkami zbiorczymi.

Usuń paski probówek z palladowym zestawem do kodowania kreskowego 20 pleksów z minus 20 stopni Celsjusza i rozmroź w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów jednego bufora do trwałej ondulacji kodów kreskowych X, dokładnie wymieszaj i przenieś 120 mikrolitrów ponownie zawieszonej mieszanki kodów kreskowych do odpowiednich próbek komórek w probówkach zbiorczych. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między poszczególnymi próbkami oznaczonymi kodem kreskowym.

Inkubować probówki zbiorcze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby kody kreskowe mogły oznaczyć komórki. Po 30 minutach odwirować próbki w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić je w jednym mililitrze CSM.

Następnie odwirować i ponownie zawiesić w CSM. Następnie odwirować w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i zassać supernatant. Za pomocą jednej pipety i tej samej końcówki przenieś wszystkie granulki komórek w około 70 do 80 mikrolitrach resztkowej objętości do jednej rurki polistyrenowej.

Nie wysuwaj końcówki pipety. Odłóż na bok pojedynczą pipetę z tą końcówką. Za pomocą wielokanałowej pipety i nowych końcówek dodaj 100 mikrolitrów CSM do każdej oryginalnej probówki do aparatu udołowiowego, aby zmaksymalizować regenerację komórek.

Za pomocą pojedynczej pipety z odłożoną na bok końcówką przenieś wszystkie granulki komórek w 100 mikrolitrach pozostałej objętości do tej samej rurki polistyrenowej. Dodaj CSM, aby uzupełnić rurkę polistyrenową do około trzech mililitrów. Policz i zapisz numer komórki w zbiorczym zestawie kodów kreskowych.

Następnie odwirować w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i zassać supernatant. Przystąp do barwienia próbek oznaczonych kodami kreskowymi tego samego dnia. Ten schemat przedstawia przebieg pracy związany ze stymulacją i przetwarzaniem próbek krwi obwodowej, w tym przydział podwielokrotności próbek krwi, czas dodawania środków stymulujących, koktajl inhibitorów transportu białek oraz czasy inkubacji do lizy i utrwalenia krwinek czerwonych.

Wybór środków stymulujących będzie zależał od szlaków sygnalizacyjnych i cytokinowych, które są celem oceny. Po utrwaleniu i lizie RBC, poszczególne lizowane, utrwalone próbki komórek od zdrowego dawcy zostały oznaczone kodem kreskowym, oznaczone 26 przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym, przeniknięte i wybarwione 14 przeciwciałami przeciwko cytokinom. Poniżej przedstawiono ograniczoną strategię bramkowania reprezentującą identyfikację monocytów o wysokiej zawartości CD14.

Od lewej do prawej każda reprezentowana działka 2D jest podzbiorem populacji z populacji nadrzędnej, która jest bramkowana z działki 2D bezpośrednio po lewej stronie. Wykorzystując monocyty o wysokiej zawartości CD14 jako reprezentatywne w ośmiu podzbiorach komórek odpornościowych, przeprowadzono analizę cytometrii masowej na próbkach krwi obwodowej od zdrowego dawcy w czasie zero niestymulowanym i po stymulacji agonistą TLR LPS i R848 oraz aktywatorem limfocytów T PMA jonomycyną. Przedstawiono przykład indukcji cytokin w monocytach o wysokiej zawartości CD14 oraz wybrane cytokiny ze swoistością dla zastosowanego czynnika stymulującego.

R848 selektywnie indukuje podjednostkę IL-12p40 i MCP1 w monocytach o wysokiej zawartości CD14, podczas gdy LPS tego nie robi. W przeciwieństwie do tego, jonomycyna PMA nie indukuje cytokin w monocytach o wysokiej zawartości CD14. Po opanowaniu stymulacji krwi można wykonać w ciągu około siedmiu godzin, a etap kodowania kreskowego można wykonać w ciągu zaledwie około godziny.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o czasie wykonania kroków i odpowiednio zaplanować je z wyprzedzeniem. Po zastosowaniu tej procedury można rozważyć zmianę warunków stymulacji krwi w panelu cytometrii masowej w celu oceny odpowiedzi komórek odpornościowych, które są specyficzne dla własnych celów badawczych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać odpowiedzi cytokin z próbek krwi pełnej i jak połączyć wiele próbek w zestaw kodów kreskowych do analizy cytometrii masowej.