Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Naszym celem badawczym jest opracowanie solidnych technik generowania jednowarstwowych interfejsów jelitowych pochodzących z organoidów jelita cienkiego i grubego dorosłego bydła. Zastosowaliśmy multimodalne podejście analityczne, aby potwierdzić tworzenie się funkcjonalnej bariery nabłonkowej w obrębie ustalonych monowarstw. W przeciwieństwie do modeli trójwymiarowych, monowarstwy 2D oferują odsłoniętą, dostępną powierzchnię świetlną, która ma kluczowe znaczenie dla badania interakcji patogenów gospodarza.

Te monowarstwy odzwierciedlające jelito in vivo z wieloma liniami komórkowymi zapewniają teraz dostosowane protokoły do badania patogenów w określonych odcinkach jelita, takich jak nisze jelita cienkiego i grubego. Nasze badania pozwoliły na zidentyfikowanie zoptymalizowanych warunków hodowli w celu stworzenia i utrzymania monowarstw 2D z komórek organoidów organoidów jelita cienkiego i grubego bydła. Potwierdziliśmy tworzenie funkcjonalnych barier nabłonkowych w tych monowarstwach za pomocą transnabłonkowych rejestrów elektrycznych i testów przepuszczalności parakomórkowej, a także technik barwienia immunocytochemicznego.

Nasz protokół wypełnił lukę badawczą, koncentrując się na braku jednowarstwowych modeli bydła pochodzących z organoidów jelitowych. Modele te zostały dobrze przebadane na myszach i ludziach, jednak bydło, które jest głównym zagrożeniem dla patogenów jelitowych o poważnych konsekwencjach dla zdrowia publicznego, nie zostało odpowiednio zbadane. Nasze badania ustanawiają i charakteryzują jednowarstwowy system hodowli bydła 2D.

To innowacyjne narzędzie pozwala na badanie stanów normalnych i chorobowych fizjologii jelit bydła, a potencjalne zastosowania mogą zostać rozszerzone na badania biomedyczne i translacyjne o znaczeniu dla zdrowia publicznego. Zacznij od zakodowania macierzy zewnątrzkomórkowej na wkładkach do hodowli komórkowych w celu hodowli jednowarstwowej 2D pochodzącej z organoidów. Nałóż 100 mikrolitrów powłoki macierzy zewnątrzkomórkowej na komorę wierzchołkową każdej przygotowanej wkładki do hodowli komórkowej i załóż pokrywkę.

Następnie inkubuj płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. W przypadku komórek organoidów odbytniczych po inkubacji należy zastąpić powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej jednowarstwową pożywką hodowlaną doodbytniczą i inkubować przez noc. Po enzymatycznym roztrawieniu organoidów i przefiltrowaniu do pojedynczych komórek, odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant.

Następnie należy przygotować 200 mikrolitrów zawiesin komórkowych na wkładkę do hodowli komórkowej w jednowarstwowej pożywce hodowlanej. Pobrać 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zawierającą wkładki do hodowli komórkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową. Za pomocą odsysania próżniowego ostrożnie opróżnij komorę wierzchołkową każdej wkładki do hodowli komórkowej, aby uniknąć przerwania powłoki.

Ostrożnie nanieść 200 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki do komory wierzchołkowej każdej wkładki do hodowli komórkowej. Dodać 500 mikrolitrów odpowiednio uzupełnionej jednowarstwowej pożywki hodowlanej do komory podstawno-bocznej każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze, aby pobudzić adhezję i wzrost komórek, tworząc zlewającą się monowarstwę 2D na wkładce do hodowli komórkowej.

Zmieniaj pożywkę hodowlaną zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej co drugi dzień, zaczynając 48 godzin po wysiewie komórek. W celu barwienia immunofluorescencyjnego monowarstwy 2D pochodzącej z organoidów, ostrożnie wytnij membranę wkładki do hodowli komórkowej za pomocą ostrza skalpela i umieść wkładkę do hodowli komórkowej na szkiełku podstawowym. Dodaj nośnik montażowy na szkiełku nakrywkowym i umieść go na szklanym szkiełku przed obserwacją komórek.

Pewnego dnia po wysianiu zdysocjowanych dojrzałych organoidów na wkładkę do hodowli komórkowej wydawało się, że tworzy się monowarstwa 2D. Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła dobrze rozwinięte mikrokosmki i rozgraniczenie komórkowe na wierzchołkowej powierzchni monowarstw 2D pięć dni po wysiewie. Barwienie immunofluorescencyjne monowarstw 2D potwierdziło obecność wierzchołkowej granicy szczoteczki, podstawno-bocznych połączeń przylegających i komórek kubkowych wytwarzających śluz zarówno w monowarstwach 2D pochodzących z organoidów jelita krętego, jak i odbytnicy.

Aby rozpocząć, pobierz z inkubatora płytkę zawierającą wkładki do hodowli komórkowych z monowarstwami 2D pochodzącymi z organoidów. Usunąć jednowarstwową pożywkę hodowlaną zarówno z komory wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej wkładek do hodowli komórkowych, które mają być oceniane. Delikatnie umyj komorę wierzchołkową i podstawową dwa razy 200 i 500 mikrolitrami podgrzanego PBS.

Usunąć roztwór płuczący z komory wierzchołkowej i nanieść 200 mikrolitrów po 0,5 miligrama na mililitr, znacznik FITC-dekstran o stężeniu 4 kDa w PBS do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 20 minut. Następnie pobrać próbkę o wielkości 50 mikrolitrów z podstawowej komory bocznej inkubowanej płytki 24-dołkowej i przenieść ją na płytkę 96-dołkową kompatybilną z czytnikiem mikropłytek.

Umieścić 50 mikrolitrów świeżego PBS w podstawowej komorze bocznej studzienki, z której pobiera się próbki. Za pomocą wstępnie skalibrowanego czytnika mikropłytek natychmiast zmierz intensywność fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 495 nanometrów i długości fali emisji 535 nanometrów.