Name: Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj techniki generowania jednowarstwowych modeli jelita bydlęcego z organoidów. Metoda umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen przy użyciu testów oporności elektrycznej i immunocytochemii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia (K01OD030515 i R21OD031903 do YMA) oraz WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (do GDD). Autorzy pragną podziękować rzeźni uczestniczącej w projekcie za dostarczenie bydła dawcy.

Developing 2D Monolayer Cultures from Bovine Intestinal Organoids

<ol><li>Min, S., Kim, S., Cho, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+tract+modeling+using+organoids+engineered+with+cellular+and+microbiota+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches.</a> Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).</li>
<li>Fitzgerald, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+sub-type+2a+increases+the+efficiency+of+Escherichia+coli+O157+transmission+between+animals+and+restricts+epithelial+regeneration+in+bovine+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids.</a> PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003(2019).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Vet Res. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+bovine-derived+small+and+large+intestinal+organoids%3A+In+vitro+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regene+Med%22%5BJournal%5D)">Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance.</a> J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002(2023).</li>
<li>Kvidera, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intentionally+induced+intestinal+barrier+dysfunction+causes+inflammation%2C+affects+metabolism%2C+and+reduces+productivity+in+lactating+Holstein+cows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows.</a> J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).</li>
<li>Crawford, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+directly+disrupt+the+bovine+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier.</a> Sci Rep. 12 (1), 14578(2022).</li>
<li>Heredia, N., García, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+as+sources+of+food-borne+pathogens%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Nutri%22%5BJournal%5D)">Animals as sources of food-borne pathogens: A review.</a> Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).</li>
<li>Naylor, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+follicle-dense+mucosa+at+the+terminal+rectum+is+the+principal+site+of+colonization+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+the+bovine+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host.</a> Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).</li>
<li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+epithelial+polarity%3A+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Rep. 26 (9), 2509-2520 (2019).</li>
<li>Pullinger, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+translocation+of+Salmonella+enterica+Serovar+Dublin+in+cattle+occurs+predominantly+via+efferent+lymphatics+in+a+cell-free+niche+and+requires+type+III+secretion+system+1+%28T3SS-1%29+but+not+T3SS-2%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2.</a> Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).</li>
<li>Nickerson, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+human+intestinal+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+for+the+study+of+enteric+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens.</a> Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321(2021).</li>
<li>Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+interactions+contribute+to+barrier+function+in+human+colon+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids.</a> Front Med. 9, 838975(2022).</li>
<li>Freire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+derived-organoids+provide+model+to+study+gluten+response+and+effects+of+microbiota-derived+molecules+in+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease.</a> Sci Rep. 9, 7029(2019).</li>
<li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), e0231423(2020).</li>
<li>Kogut, M. H., Arsenault, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Gut+health%3A+The+new+paradigm+in+food+animal+production%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production.</a> Front Vet Sci. 3, 71(2016).</li>
<li>Lingard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+a+self-assembling+peptide+hydrogel+as+a+Matrigel+alternative+for+3-dimensional+mammary+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture.</a> Biomater Adv. 160, 213847(2024).</li>
<li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurksen%2C+K+%22Permeability+Barrier%3A+Methods+and+Protocols%22">Permeability Barrier: Methods and Protocols</a>. , Springer protocols, Humana Press. (2011).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+epithelial%2Fendothelial+barriers+in+Transwells+and+microfluidic+bilayer+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices.</a> Micromachines. 10 (8), 533(2019).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659(2018).</li>
<li>Sanz-Fernandez, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+hindgut+to+improve+health+and+performance+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle.</a> Animals. 10 (10), 1817(2020).</li>
<li>Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+nutrition+symposium%3A+Productivity%2C+digestion%2C+and+health+responses+to+hindgut+acidosis+in+ruminants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants.</a> J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).</li>
<li>O'Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+microbiome+in+cattle+production+and+health%3A+Driver+or+passenger%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Animal+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger.</a> Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).</li>
<li>Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+Salmonella+and+Campylobacter+in+beef+cattle+from+transport+to+slaughter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter.</a> J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).</li>
<li>Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessible+luminal+interface+of+bovine+rectal+organoids+generated+from+cryopreserved+biopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues.</a> PLoS One. 19 (3), e0301079(2024).</li>
<li>Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-epithelium+interactions+and+inflammatory+responses+in+Salmonella+Dublin+infections+using+ileal+monolayer+models+derived+from+adult+bovine+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids.</a> Scientific Reports. 14 (1), 11479(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Zdrowie przewodu pokarmowego ma zasadnicze znaczenie zarówno dla produktywności, jak i ogólnego dobrostanu bydła16. Wykorzystując technologię jednowarstwową 2D pochodzącą z organoidów, naukowcy mogą teraz dokładniej naśladować złożoną strukturę nabłonka jelitowego bydła w warunkach in vitro 5. To innowacyjne podejście nie tylko odtwarza zróżnicowany skład komórkowy wyściółki jelita, w tym jego wielokomórkowe linie, ale także pozwala uchwycić kluczowe cechy funkcjonalne, takie jak wydzielanie śluzu i obecność mikrokosmków, które są niezbędne do zrozumienia fizjologii i patologii jelit3. Opracowanie dostosowanych do potrzeb protokołów hodowli segmentów jelita krętego i odbytnicy dało początek zaawansowanej platformie, która znacznie zwiększa możliwości badania zdrowia jelit bydła. To wyrafinowane podejście umożliwia szczegółowe badania interakcji między patogenami odzwierzęcymi a środowiskiem jelitowym bydła. Możliwość dokładnego odtworzenia i zbadania unikalnych aspektów ekosystemu jelitowego bydła in vitro jest znaczącym krokiem w kierunku opracowania ukierunkowanych strategii poprawy zdrowia zwierząt gospodarskich i ograniczenia rozprzestrzeniania się chorób odzwierzęcych.
Niemniej jednak, aby zapewnić pomyślny rozwój monowarstw 2D przy użyciu organoidów jelitowych bydła, kluczowe znaczenie ma utrzymanie zdrowia i witalności zarówno organoidów, jak i ich zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ostrożne obchodzenie się i minimalizacja stresu mają zasadnicze znaczenie dla zachowania integralności i funkcjonalności komórek, które są niezbędne do efektywnego wzrostu organoidów, a następnie stworzenia działającej monowarstwy. Co więcej, uzyskanie jednolitej monowarstwy opiera się na udanej dysocjacji organoidów na pojedyncze komórki bez tworzenia dużych grudek. Takie grudki mogą zakłócać dystrybucję komórek i naruszać strukturę monowarstwy. Dlatego kluczowe znaczenie ma zastosowanie precyzyjnych technik płynnej dysocjacji, co skutkuje spójną zawiesiną pojedynczej komórki. Dodatkowo korzystne staje się zminimalizowanie zakłóceń podczas adhezji komórek i podczas wypłukiwania nadmiaru komórek nieprzylegających. Takie podejście jest szczególnie ważne dla rozwiązywania potencjalnych problemów z morfogenezą 3D, poprawiając w ten sposób ogólną jakość monowarstwy.
Zauważalnym wyzwaniem związanym z hydrożelami na bazie ECM, które są pochodzenia biologicznego, jest zmienność składu między partiami17. Chociaż nie zaobserwowano tego przy użyciu opisanych protokołów i materiałów, różnice w składzie ECM z partii na partię mogą stanowić wyzwanie dla pomyślnego opracowania monowarstw. Jeśli tworzenie monowarstwy jest zakłócone, gdy zmieniają się produkty ECM, marki lub numery partii, konieczne mogą być kroki optymalizacyjne w celu określenia odpowiedniego stężenia ECM wymaganego do powlekania wkładek do hodowli komórkowych.
Co więcej, dostosowanie pożywki hodowlanej do temperatury pokojowej przed wprowadzeniem jakichkolwiek zmian jest krytycznym krokiem, który pomaga złagodzić szok termiczny, chronić zdrowie komórek i utrzymać jakość zarówno kultur organoidowych, jak i jednowarstwowych. Delikatne praktyki mycia mają również zasadnicze znaczenie dla utrzymania integralności monowarstwy podczas jej formowania i późniejszych testów, a unikanie zakłóceń może zapobiec niedokładnościom wyników. Zastąpienie PBS zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) okazało się pomocne w minimalizowaniu oderwania monowarstwy, gdy stało się to problemem podczas wielokrotnego mycia lub długotrwałej ekspozycji na PBS, na przykład w testach przepuszczalności parakomórkowej. Wreszcie, dostosowanie pożywki hodowlanej do specyficznych potrzeb komórek z różnych segmentów przewodu pokarmowego, takich jak jelito kręte i odbytnica, ma zasadnicze znaczenie dla dokładnej replikacji w warunkach in vivo . Ta specyfika zapewnia optymalne zdrowie i funkcjonalność komórek, ułatwiając precyzyjne modelowanie fizjologii jelit bydła i interakcji z patogenami, podkreślając w ten sposób te kluczowe etapy badań nad organoidami.
Oprócz zastosowania delikatnej praktyki obchodzenia się z komórkami, budowanie dobrych kompetencji technicznych związanych z liczeniem komórek i pomiarami TEER ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego opracowania działającej monowarstwy 2D. Ponieważ zarówno zbyt niska, jak i zbyt wysoka gęstość wysiewu wynikająca odpowiednio z nadmiernego lub niedoszacowania komórek może prowadzić do upośledzonego wzrostu monowarstwy. Zaleca się dokładne przejrzenie liczby komórek i zapewnienie odpowiedniej gęstości wysiewu w sytuacjach, gdy podejrzewa się niedokładne zagęszczenie wysiewu. Dodatkowo, nieodpowiednie techniki pomiaru TEER mogą spowodować rozerwanie monowarstwy przez niezamierzone zarysowania elektrod. Ostrożne wprowadzenie elektrod do komory wierzchołkowej i zwrócenie szczególnej uwagi na utrzymanie ich pionowej orientacji względem powierzchni membrany może pomóc w ograniczeniu ryzyka przypadkowego uszkodzenia monowarstw.
Opisane tutaj metody oznaczania przepuszczalności parakomórkowej zostały zaadaptowane z poprzedniego protokołu18. Modyfikacje zgłoszonego protokołu, które obejmują wielokrotne pobieranie próbek w ciągu 120 minut i zastąpienie pobranej próbki podwielokrotności równą ilością PBS, mają na celu poprawę dokładności i wiarygodności wyników. Utrzymanie całkowitej objętości w komorze ma kluczowe znaczenie z kilku powodów: zachowuje równowagę osmotyczną, zapewnia integralność komórek, utrzymuje gradient stężeń niezbędny do dokładnej oceny przepuszczalności i zapobiega zmianom ciśnienia hydrostatycznego, które mogłyby wpływać na szybkość transportu. Ta praktyka uzupełniania komory podstawno-bocznej świeżym PBS odpowiadającym objętości pobranego PBS zawierającego znacznik fluorescencyjny ma kluczowe znaczenie dla zachowania tych warunków, umożliwiając dokładną i miarodajną ocenę przepuszczalności jednowarstwowej. Test przepuszczalności parakomórkowej służy jako uzupełnienie pomiaru TEER poprzez ocenę ruchu cząsteczek znacznikowych bezpośrednio przez monowarstwę. Co więcej, porównywanie wartości TEER w różnych laboratoriach może nie przynieść odpowiednich wniosków, ponieważ na wartości te może mieć wpływ wiele zmiennych, takich jak temperatura i specyficzne warunki, w których hoduje się komórki, w tym typy komórek, liczby pasaży i skład pożywkihodowlanej 19. Test przepuszczalności parakomórkowej zapewnia funkcjonalną ocenę in vitro skutecznej ekspresji adherenów i ścisłych połączeń w obrębie bariery nabłonkowej20.
Chociaż opracowanie monowarstw 2D z organoidów 3D stanowi znaczący postęp w technologii hodowli, ważne jest, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń związanych z monowarstwami 2D. Jedną z głównych wad jest to, że pozostaje to statycznym systemem hodowli, pozbawionym dynamicznej stymulacji występującej w środowisku in vivo . Ponadto modyfikacja zawartości tlenu w systemie hodowli stanowi wyzwanie ze względu na jego otwartą konfigurację obejmującą płytki hodowlane z pokrywkami, co sprawia, że jest on mniej odpowiedni do długotrwałej kohodowli z bakteriami beztlenowymi. Ograniczeniom tym można potencjalnie zaradzić, przyjmując bardziej dynamiczne platformy hodowlane, takie jak systemy mikroprzepływowe21, które oferują bardziej kontrolowane i fizjologicznie odpowiednie środowisko. Ponadto ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że chociaż obecne warunki hodowli są bogate w składniki odżywcze korzystne dla utrzymania wzrostu komórek macierzystych, mogą nie być optymalne dla indukowania fizjologicznego różnicowania komórek nabłonka. Ta rozbieżność podkreśla potrzebę optymalizacji w przyszłych badaniach, aby ściśle naśladować warunki in vivo i wspierać proces różnicowania. Usuwając te ograniczenia i udoskonalając te podejścia, zwiększa się użyteczność i możliwość zastosowania technologii hodowli organoidów, co przybliża nas do odtworzenia złożonej dynamiki i interakcji w przewodzie pokarmowym in vitro.
Protokół generowania monowarstw 2D z tkanek jelita krętego i odbytnicy bydła oferuje naukowcom cenny model in vitro interfejsu świetlnego zarówno nabłonka jelita cienkiego, jak i grubego. Model ten otwiera szerokie możliwości zastosowania w podstawowych badaniach nad żywieniem zwierząt, w szczególności w badaniu, w jaki sposób składniki odżywcze są wchłaniane w różnych warunkach. Godnym uwagi obszarem zainteresowania jest badanie zespołu nieszczelnego jelita, charakteryzującego się nieprawidłowym wzrostem przepuszczalności przewodu pokarmowego, często wywoływanym przez zmiany w diecie i ekstremalne temperatury otoczenia22,23. Co więcej, model ten służy jako niezbędne narzędzie do badania złożonych interakcji między mikrobiomem jelitowym a jego gospodarzem. Pozwala to na zbadanie, w jaki sposób mikroorganizmy komensalne mogą wpływać na zdrowie organizmu gospodarza, odnosząc się do kluczowego aspektu nauk weterynaryjnych i medycznych 1,24. Ponadto patogeny przenoszone przez żywność dla ludzi są często znajdowane jako komensale w różnych segmentach jelit bydła 8,9,25, protokół ten umożliwia szczegółowe badania specyficznych warunków, które pozwalają tym odzwierzęcym czynnikom rozwijać się w odpowiednich niszach.
W trakcie tego badania zaobserwowano, że monowarstwy pochodzące z organoidów odbytniczych i krętych wymagają różnych warunków do pomyślnego rozwoju. W szczególności, gdy monowarstwy pochodzące z organoidów odbytniczych początkowo wysiewano na wkładkach do hodowli komórkowych przygotowanych z 2% hydrożelem na bazie ECM w pożywkach podstawowych przez 1 godzinę, zauważono duże i złuszczanie się komórek. Problem ten został rozwiązany poprzez przejście na specjalistyczne monowarstwowe podłoże hodowlane doodbytnicze i wydłużenie okresu inkubacji do nocy przed siewem, podczas gdy monowarstwy pochodzące z organoidów jelita krętego z powodzeniem opracowano przy użyciu krótszego protokołu przygotowania. Ponadto dodanie CHIR99021 do pożywki hodowlanej konsekwentnie poprawiało tworzenie monowarstw doodbytniczych26 , ale nie było konieczne w przypadku monowarstw jelita krętego27. Ponadto monowarstwy jelita krętego wymagały większej gęstości komórek do pomyślnego rozwoju w porównaniu z organoidami doodbytniczymi27. W tych zoptymalizowanych warunkach (Tabela 1) wielokrotnie opracowano monowarstwy, które utrzymują odporność na integralność bariery, co podkreśla znaczenie dostosowania warunków hodowli do określonego segmentu jelita.
Dostęp do modelu, który dokładnie odzwierciedla złożoność wielokomórkowej linii jelita in vivo , ma kluczowe znaczenie dla tych badań. Pozwala to naukowcom na dokładne naśladowanie naturalnych warunków środowiska jelitowego, zapewniając bardziej wiarygodną podstawę do eksperymentów. Dzięki temu protokołowi badacze są wyposażeni w solidny model, który zwiększa ich możliwości badawcze, potencjalnie prowadząc do przełomowych odkryć w ich dziedzinach nauki. Takie podejście nie tylko przyczynia się do zrozumienia zdrowia i chorób jelit, ale także pomaga w opracowywaniu strategii mających na celu poprawę zarządzania zwierzętami gospodarskimi i bezpieczeństwa żywności.

Hodowla komórek macierzystych nabłonka jelitowego w trójwymiarowych (3D) hodowlach, znanych jako organoidy jelitowe, stanowi znaczący postęp w technologii in vitro do badania funkcji jelit, odżywiania i interakcji z patogenami1,2. Te organoidy naśladują złożoną strukturę nabłonka jelitowego in vivo poprzez samoreplikację i organizowanie się w formacje 3D, które obejmują różne linie komórek jelitowych3. Ta cecha podkreśla ich znaczny potencjał w zakresie pogłębiania wiedzy na temat biologii jelit.
Rosnące zainteresowanie zastosowaniem technologii organoidów jelitowych u zwierząt hodowlanych wymaga udoskonalenia technik hodowli i konserwacji4,5. Znaczenie tej technologii podkreśla jej potencjalny wpływ na badanie zdrowia jelit zwierząt hodowlanych, które odgrywa kluczową rolę w ich produktywności, a w konsekwencji w ekonomice przemysłu spożywczego i zwierzęcego, wpływając na dobrostan zwierząt i koszty operacyjne6,7. W szczególności wykorzystanie kultur organoidów jelitowych do zbadania funkcji jelit bydła ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę ich rolę jako rezerwuarów odzwierzęcych patogenów jelitowych, takich jak Salmonella spp. i Escherichia coli (E. coli) O157:H78. Patogeny te są zlokalizowane w określonych segmentach jelita, co sprawia, że konieczne jest różnicowanie metod hodowli organoidów jelitowych w zależności od segmentu jelita, aby zwiększyć precyzję badań9.
Istotną przeszkodą w badaniu organoidów jelitowych jest ograniczony dostęp do powierzchni wierzchołkowej komórki nabłonkowej10. Podczas hodowli w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) komórki naturalnie orientują się tak, że powierzchnia podstawowa jest skierowana na zewnątrz, a powierzchnia wierzchołkowa jest skierowana do wewnątrz10. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono metody, które polegają na dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki i zasiewaniu ich w półprzepuszczalnych wkładkach do hodowli komórkowych. Ta konfiguracja ustanawia interfejs między powierzchnią wierzchołkową a przedziałem podstawno-bocznym. Protokół ten pokazuje, że komórki pochodzące z organoidów jelitowych bydła mogą tworzyć spójną monowarstwę 2D, o czym świadczą pomiary przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i testy przepuszczalności parakomórkowej. Dodatkowo, rozwój polaryzacji komórkowej z obrzeżami szczoteczek i ścisłymi połączeniami w komórkach jednowarstwowych 2D pochodzących z organoidów został potwierdzony za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii elektronowej, odzwierciedlając właściwości nabłonka jelitowego in vivo.
W tym badaniu jelito kręte reprezentuje przewód cienki, a odbytnica oznacza przewód pokarmowy gruby. Selekcje te opierają się na odpowiednich patogenach jelitowych, takich jak Salmonella spp., które mogą translokować jelito kręte11, oraz E. coli O157:H7, o których wiadomo, że głównie kolonizują odbytnicę9 u bydła. Wybór tych konkretnych segmentów jelit podkreśla konieczność dostosowania metod hodowli organoidów jelitowych do obszaru jelitowego w celu zapewnienia precyzji badań. Metody te szczegółowo opisują procedurę skutecznego hodowania jednowarstwowego interfejsu 2D pochodzącego z organoidów z tych segmentów jelita, zapewniając solidny model do badania zdrowia jelit bydła, infekcji patogennych i interakcji między mikrobiomem jelitowym a gospodarzem.

<table><tbody><tr><td><silny>Basal Średni</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>n/a</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1X</td></tr><tr><td>Organoid Culture Medium (suplementy do podłoża podstawowego)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788-5MG</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Suplement (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td>1X</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I człowiek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.5MG</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Mysz EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Murine Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>MP Biomedicals</td><td>194603</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>N-2 MAX Suplement na podłoża (100X)</td><td>R& D Systems</td><td>AR009</td><td>1X</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin Kondycjonowane medium</td><td>n/a</td> n<td>/d</td><td>10 vol/vol %</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>100 &micro; g / ml</td></tr><tr><td>R-Spondin-1 Kondycjonowane podłoże</td><td>n/a</td><td>nie dotyczy 20 obj./obj.%</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td>10 &mikro; M</td></tr><tr><td>Monolayer Culture Medium (Suplementy do pożywki do hodowli organoidów)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046-5MG</td><td>2,5 &micro; M</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>20 vol/vol %</td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2851-5MG</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCellTechnologies</td><td>72308</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mysia anty-E-kadheryna</td><td>BD Biosciences</td><td>560061</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td> 1<td>:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Cytiva</td><td>SH30574.02</td><td>2 w/vol %</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>nie dotyczy</td></tr><tr><td>Roztwór DAPI (1 mg / ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny&ndash; Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>bez</td></tr><tr><td>dodatku Roztwór paraformaldehydu (4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943K2</td><td>nie dotyczy</td></tr><tr><td>odczynnika przeciwblaknięcia ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>n/a</td></tr><tr><td>SNA, EBL, Fluoresceina</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1301</td><td>rozcieńczenie</td></tr> <tr><td>1:100Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16046.AE</td><td>0,3 obj./obj. %</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>n/d</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>VWR Life Science</td><td>K940-100ML</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Materiały i urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4 i mikro; m Wkładka do hodowli komórkowych</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sterylne sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td></td><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych Wirówka</td> do 655086 <td></td><td>Greiner Bio-One</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5910Ri</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Nabłonkowy miernik woltowo-omowy</td><td>Millipore</td><td>Millicell ERS-2</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8-X</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpecrtraMax i3x</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>iMed Scientific</td><td>-</td><td>#11</td></tr><tr><td>mieszalnik wirowy</td> ze stali węglowej <td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Oprogramowanie czytnika mikropłytek Leica Microsystems</td><td>LAS X 3.7.6.25997</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devces</td><td>SoftMax Pro 7.1.2</td><td></td></tr></tbody></table>

postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces

Postęp wiedzy na temat fizjologii przewodu pokarmowego i jego chorób zależy przede wszystkim od opracowania precyzyjnych, specyficznych dla gatunku modeli in vitro, które wiernie naśladują in vivo tkanki jelitowe. Jest to szczególnie istotne dla badania interakcji gospodarz-patogen u bydła, które jest znaczącym rezerwuarem patogenów stanowiących poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Tradycyjne organoidy 3D oferują ograniczony dostęp do powierzchni wierzchołkowej nabłonka jelitowego, co jest przeszkodą pokonaną przez pojawienie się kultur jednowarstwowych 2D. Kultury te, pochodzące z komórek organoidowych, zapewniają odsłoniętą powierzchnię świetlną dla bardziej dostępnych badań. W tym badaniu przedstawiono szczegółowy protokół tworzenia i utrzymywania jednowarstwowych kultur 2D z komórek organoidów jelita cienkiego i grubego bydła. Metoda ta obejmuje protokoły oceny integralności błony poprzez transepiteliczny opór elektryczny i przepuszczalność parakomórkową wraz z technikami barwienia immunocytochemicznego. Protokoły te stanowią podstawę do ustanowienia i scharakteryzowania jednowarstwowego systemu hodowli bydła 2D, przesuwając granice zastosowań tych metod w badaniach biomedycznych i translacyjnych o znaczeniu dla zdrowia publicznego. Zastosowanie tego innowacyjnego podejścia umożliwia opracowanie fizjologicznie istotnych modeli in vitro do badania zarówno normalnych, jak i chorobowych stanów fizjologii jelit bydła. Implikacje dla postępu biomedycznego i rolniczego są głębokie, torując drogę do skuteczniejszego leczenia dolegliwości jelitowych u bydła, poprawiając w ten sposób zarówno dobrostan zwierząt, jak i bezpieczeństwo żywności.

Niniejszy protokół pozwala na wiarygodne generowanie trwałych dwuwymiarowych monowarstw 2D pochodzących z bydlęcych organoidów jelitowych, wywodzących się z jelita cienkiego i grubego, co naśladuje złożoność nabłonka jelitowego in vivo. Metoda ta wykorzystuje dojrzałe organoidy rozwinięte z preparatów krypt jelitowych zdrowego bydła hodowanych w zoptymalizowanych warunkach. Co ciekawe, skuteczne i powtarzalne warunki dla 2D monowarstw pochodzących z organoidów są specyficzne dla danego odcinka jelita (Tabela 1). Potwierdza to znaczenie stosowania zoptymalizowanych technik hodowli dla interesującego nas odcinka jelita.
W ciągu 1 dnia po wysianiu rozproszonych dojrzałych organoidów na wkładkę do hodowli komórkowej wydawało się, że uformowała się dwuwymiarowa warstwa pojedyncza (Rycina 2A). Jednakże, mimo tych początkowych pozorów, pomiary TEER dla monowarstw jelita krętego i odbytnicy pozostały na tym etapie niskie (Rysunek 1C). Ponadto analiza przepuszczalności parakomórkowej wykazała, że monowarstwa, już po 1 dniu hodowli, umożliwiała przenikanie znacznika FITC-dekstranu o masie 4 kDa przez warstwę komórkową (Rycina 1C). Do 3.rd dnia hodowli obie wersje dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z organoidów wykazywały znaczną maturację, o czym świadczyły zwiększone wartości TEER oraz oporność na znacznik FITC-dekstran 4 kDa; trend ten utrzymywał się do 5. dnia hodowli.
Szczególnie istotna jest zmienność międzygatunkowa; mimo niższych wartości TEER w przypadku kultur 2D monowarstw pochodzących z organoidów bydlęcych w porównaniu z odpowiednikami ludzkimi i psimi w podobnych warunkach12,13,14,15, integralność błony pozostaje zachowana. Wniosek ten wynika z prawidłowej odpowiedzi monowarstw w testach przepuszczalności, co sugeruje, że niskie wartości TEER w próbkach bydlęcych nie muszą oznaczać braku funkcji barierowej. Integralność ta jest kluczowa dla funkcjonalnej bariery nabłonkowej i zostaje skutecznie wykazana poprzez staranną interpretację wyników testów przepuszczalności wraz z pomiarami TEER.
Wizualizacja demarkacji komórkowej oraz dobrze rozwiniętych mikrokosmków na powierzchni apikalnej monowarstw 2D za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, wykazująca wyspecjalizowane struktury mikroanatomiczne, dodatkowo potwierdziła dojrzałość monowarstw 2D pochodzących zarówno z organoidów jelita krętego, jak i odbytnicy (Rycyna 2B). Ponadto barwienie immunofluorescencyjne monowarstw 2D potwierdziło obecność apikalnego rąbka szczoteczkowego, połączeń przylegających boczno-podstawnych oraz produkujących śluz komórek kubkowych w monowarstwach 2D pochodzących z organoidów jelita krętego (Rycina 3A) oraz odbytnicy (Rycina 3B). Wyniki te potwierdzają, że opracowana monowarstwa 2D charakteryzuje się złożonym składem i budową, nie tylko wykazując kluczowe cechy nienaruszonego nabłonka jelitowego, ale składając się z wieloliniowej populacji komórek.
Pomyślne wytworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy zależy od adhezji komórek do ECM oraz wzrostu do stanu konfluencji w celu stworzenia nienaruszonej warstwy nabłonkowej. Warto zauważyć, że nierównomierny rozkład ECM lub nieoptymalne warunki podczas inkubacji na wkładce do hodowli komórkowych mogą prowadzić do częściowego odklejenia się warstwy komórkowej, co jest szczególnie widoczne wzdłuż jej krawędzi (Rysunek 4Ai). Problem ten potęguje sytuacja, gdy komórki są wysiewane z gęstością wyższą niż optymalna lub gdy nie są one równomiernie rozłożone na powierzchni hodowli, co często wynika z niepełnej dysocjacji organoidów do zawiesiny pojedynczych komórek. Taki nierównomierny rozkład może prowadzić do powstania luk w monowarstwie i/lub do morfogenezy 3D na wkładce do hodowli komórkowych (Rysunek 4Aii). Z kolei zbyt mała gęstość wysiewu komórek może również skutkować niepowodzeniem lub opóźnieniem rozwoju monowarstwy w przewidzianym okresie hodowli, co nieumyślnie wpływa na wydajność późniejszych badań wykorzystujących system monowarstwy 2D (Rysunek 4Aiii). Ponadto kontaminacja systemu hodowli może prowadzić do powstania luk w monowarstwie, niszcząc wcześniej uformowaną konfluentną warstwę na późniejszym etapie hodowli (Rysunek 4Aiv). Stabilne wartości TEER oraz odpowiedź przepuszczalności parakomórkowej mogą zostać zaburzone przez uszkodzenia warstwy komórkowej wynikające z agresywnych technik mycia lub manipulacji, nawet jeśli wspomniane potencjalne przyczyny niepowodzeń nie wystąpiły przed tymi analizami (Rysunek 4B). Zatem ostrożne obchodzenie się z komórkami oraz ocena tworzenia się lub zakłóceń monowarstwy są kluczowe dla pomyślnego wytworzenia monowarstw 2D pochodzących z organoidów poprzez efektywne stosowanie strategii rozwiązywania problemów.
<img alt="Obrazy mikroskopowe tkanki jelita końcowego i odbytnicy; porównanie w dniach D1, D3; mikrografie świetlne i elektronowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka mikroskopowa dwuwymiarowych (2D) monowarstw pochodzących z organoidów jelita końcowego i odbytnicy bydła. (A) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii kontrastowej monowarstw 2D w 1. i 3. dniu (D1 i D3) hodowli na wkładce do hodowli komórkowej. Pasek skali = 100 µm. (B) Reprezentatywne obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej monowarstw 2D przy mniejszym (lewo) i większym (prawo) powiększeniu. Szczegółowa struktura powierzchni komórek, w tym mikrokosmki, jest widoczna zarówno w monowarstwie jelita końcowego (góra), jak i odbytnicy (dół). Lewy pasek skali = 10 µm, prawy pasek skali = 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopii konfokalnej; rozkład F-aktyny, E-kadheryny i markera SNA; porównanie tkanki jelita cienkiego (ileum) i odbytnicy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka immunofluorescencyjna dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z organoidów jelita cienkiego i odbytnicy. (A, B) Panel (A) przedstawia organoidy jelita cienkiego, a panel (B) organoidy odbytnicy. Po lewej stronie włókna F-aktyny są zaznaczone faloidyną (czerwony), co ilustruje architekturę cytoszkieletu i formowanie się apikalnego rąbka szczoteczkowego. Środkowy obraz przedstawia basolateralną lokalizację złączy przylegających, zaznaczonych E-kadheryną (zielony), co wskazuje na adhezję międzykomórkową i integralność monowarstwy. Po prawej stronie obecność produkujących mucynę komórek kubkowych zidentyfikowano za pomocą SNA (zielony), przy czym obraz z serii z-stack przedstawia apikalną sekrecję mucyny w monowarstwie jelita cienkiego. Jądra we wszystkich obrazach zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). Ponadto obrazy z serii z-stack we wszystkich panelach dodatkowo demonstrują powstanie pojedynczej warstwy komórkowej wewnątrz insertu hodowlanego. Pasek skali = 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe hodowli komórkowych i wykres TEER; ocena faz wzrostu i zmian przepuszczalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka suboptimalnego tworzenia dwuwymiarowej (2D) warstwy monowarstwowej. (A) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym pokazujące (i) częściowe oddzielenie monowarstwy wzdłuż krawędzi insertu do hodowli komórkowych; (ii) rozwój wypustek trójwymiarowych (3D) i powstawanie przerw w monowarstwie; (iii) niepełne lub opóźnione tworzenie monowarstwy z powodu gęstości zasiewu niższej niż optymalna, objawiające się płatowym przyleganiem komórek; oraz (iv) powstawanie przerw w uprzednio uformowanej monowarstwie 2D na późniejszym etapie, prawdopodobnie w wyniku podejrzenia kontaminacji. Paski skali = 100 µm. (B) Spadające wartości pomiarów TEER powiązane z rosnącymi profilami przepuszczalności po 3. dniu wskazują na brak możliwości ustanowienia stabilnych i funkcjonalnych barier nabłonkowych. Wyniki przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM) z jednego eksperymentu z dwoma powtórzeniami technicznymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Zróżnicowanie gęstości w kulturach organoidów jelita bydlęcego w hydrożelu opartym na ECM.Organoidy jelita bydlęcego hodowane w hydrożelu opartym na ECM; (A) wysoka gęstość i (B) niska gęstość. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/R1.Suppl%20Figure%201.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie danych sygnalacyjnych dawców tkanek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/R1.Dykstra.JoVE.SupplTable1_RE.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Advancing knowledge of gastrointestinal physiology and its diseases critically depends on the development of precise, species-specific in vitro models ...

Naszym celem badawczym jest opracowanie solidnych technik generowania jednowarstwowych interfejsów jelitowych pochodzących z organoidów jelita cienkiego i grubego dorosłego bydła. Zastosowaliśmy multimodalne podejście analityczne, aby potwierdzić tworzenie się funkcjonalnej bariery nabłonkowej w obrębie ustalonych monowarstw. W przeciwieństwie do modeli trójwymiarowych, monowarstwy 2D oferują odsłoniętą, dostępną powierzchnię świetlną, która ma kluczowe znaczenie dla badania interakcji patogenów gospodarza.Te monowarstwy odzwierciedlające jelito in vivo z wieloma liniami komórkowymi zapewniają teraz dostosowane protokoły do badania patogenów w określonych odcinkach jelita, takich jak nisze jelita cienkiego i grubego. Nasze badania pozwoliły na zidentyfikowanie zoptymalizowanych warunków hodowli w celu stworzenia i utrzymania monowarstw 2D z komórek organoidów organoidów jelita cienkiego i grubego bydła. Potwierdziliśmy tworzenie funkcjonalnych barier nabłonkowych w tych monowarstwach za pomocą transnabłonkowych rejestrów elektrycznych i testów przepuszczalności parakomórkowej, a także technik barwienia immunocytochemicznego.Nasz protokół wypełnił lukę badawczą, koncentrując się na braku jednowarstwowych modeli bydła pochodzących z organoidów jelitowych. Modele te zostały dobrze przebadane na myszach i ludziach, jednak bydło, które jest głównym zagrożeniem dla patogenów jelitowych o poważnych konsekwencjach dla zdrowia publicznego, nie zostało odpowiednio zbadane. Nasze badania ustanawiają i charakteryzują jednowarstwowy system hodowli bydła 2D.To innowacyjne narzędzie pozwala na badanie stanów normalnych i chorobowych fizjologii jelit bydła, a potencjalne zastosowania mogą zostać rozszerzone na badania biomedyczne i translacyjne o znaczeniu dla zdrowia publicznego. Zacznij od zakodowania macierzy zewnątrzkomórkowej na wkładkach do hodowli komórkowych w celu hodowli jednowarstwowej 2D pochodzącej z organoidów. Nałóż 100 mikrolitrów powłoki macierzy zewnątrzkomórkowej na komorę wierzchołkową każdej przygotowanej wkładki do hodowli komórkowej i załóż pokrywkę.Następnie inkubuj płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. W przypadku komórek organoidów odbytniczych po inkubacji należy zastąpić powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej jednowarstwową pożywką hodowlaną doodbytniczą i inkubować przez noc. Po enzymatycznym roztrawieniu organoidów i przefiltrowaniu do pojedynczych komórek, odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant.Następnie należy przygotować 200 mikrolitrów zawiesin komórkowych na wkładkę do hodowli komórkowej w jednowarstwowej pożywce hodowlanej. Pobrać 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zawierającą wkładki do hodowli komórkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową. Za pomocą odsysania próżniowego ostrożnie opróżnij komorę wierzchołkową każdej wkładki do hodowli komórkowej, aby uniknąć przerwania powłoki.Ostrożnie nanieść 200 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki do komory wierzchołkowej każdej wkładki do hodowli komórkowej. Dodać 500 mikrolitrów odpowiednio uzupełnionej jednowarstwowej pożywki hodowlanej do komory podstawno-bocznej każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze, aby pobudzić adhezję i wzrost komórek, tworząc zlewającą się monowarstwę 2D na wkładce do hodowli komórkowej.Zmieniaj pożywkę hodowlaną zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej co drugi dzień, zaczynając 48 godzin po wysiewie komórek. W celu barwienia immunofluorescencyjnego monowarstwy 2D pochodzącej z organoidów, ostrożnie wytnij membranę wkładki do hodowli komórkowej za pomocą ostrza skalpela i umieść wkładkę do hodowli komórkowej na szkiełku podstawowym. Dodaj nośnik montażowy na szkiełku nakrywkowym i umieść go na szklanym szkiełku przed obserwacją komórek.Pewnego dnia po wysianiu zdysocjowanych dojrzałych organoidów na wkładkę do hodowli komórkowej wydawało się, że tworzy się monowarstwa 2D. Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła dobrze rozwinięte mikrokosmki i rozgraniczenie komórkowe na wierzchołkowej powierzchni monowarstw 2D pięć dni po wysiewie. Barwienie immunofluorescencyjne monowarstw 2D potwierdziło obecność wierzchołkowej granicy szczoteczki, podstawno-bocznych połączeń przylegających i komórek kubkowych wytwarzających śluz zarówno w monowarstwach 2D pochodzących z organoidów jelita krętego, jak i odbytnicy.Aby rozpocząć, pobierz z inkubatora płytkę zawierającą wkładki do hodowli komórkowych z monowarstwami 2D pochodzącymi z organoidów. Usunąć jednowarstwową pożywkę hodowlaną zarówno z komory wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej wkładek do hodowli komórkowych, które mają być oceniane. Delikatnie umyj komorę wierzchołkową i podstawową dwa razy 200 i 500 mikrolitrami podgrzanego PBS.Usunąć roztwór płuczący z komory wierzchołkowej i nanieść 200 mikrolitrów po 0,5 miligrama na mililitr, znacznik FITC-dekstran o stężeniu 4 kDa w PBS do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 20 minut. Następnie pobrać próbkę o wielkości 50 mikrolitrów z podstawowej komory bocznej inkubowanej płytki 24-dołkowej i przenieść ją na płytkę 96-dołkową kompatybilną z czytnikiem mikropłytek.Umieścić 50 mikrolitrów świeżego PBS w podstawowej komorze bocznej studzienki, z której pobiera się próbki. Za pomocą wstępnie skalibrowanego czytnika mikropłytek natychmiast zmierz intensywność fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 495 nanometrów i długości fali emisji 535 nanometrów.

advancements-bovine-organoid-technology-using-small-large-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Niniejszy artykuł opisuje protokół hipertermii całego ciała u myszy, który może stymulować stany przypominające gorączkę przez okres od 12 do 24 hr.

Protokół długotrwałej hipertermii całego ciała u myszy

Rehabilitacja oddechowa jest powszechnie uznawana w leczeniu chorób układu oddechowego. Kluczowym elementem udanej rehabilitacji oddechowej jest przestrzeganie zalecanego treningu fizycznego. Celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu, w jaki technologia ciągłego śledzenia danych może być wykorzystana do precyzyjnego pomiaru przestrzegania zalecanej intensywności treningu aerobowego.

Wykorzystanie technologii ciągłego śledzenia danych do badania przestrzegania zaleceń dotyczących ćwiczeń w rehabilitacji pulmonologicznej

Poznaj techniki generowania jednowarstwowych modeli jelita bydlęcego z organoidów. Metoda umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen przy użyciu testów oporności elektrycznej i immunocytochemii.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Przeglądaj więcej filmów